專利名稱：β-葡糖苷酶激活劑用于檢測和/或鑒定難辨梭菌的用途的制作方法
^-葡糖苷酶激活劑用于檢測和/或鑒定難辨梭菌的用途本發(fā)明涉及檢測和/或鑒定難辨梭菌(Clostridium difficile)的方法。其還涉及對難辨梭菌具有特異性的包含3葡糖苷酶激活劑的反應(yīng)培養(yǎng)基。難辨梭菌(C.difficile)是革蘭氏陽性芽孢桿菌，其是完全厭氧的且形成孢子。難辨梭菌是嚴(yán)重程度不定的腸疾病的病因:中度或爆發(fā)性腹瀉、假膜性結(jié)腸炎或中毒性巨結(jié)腸，這些病癥自身可以成為膿毒癥的原因。難辨梭菌通過經(jīng)口攝入對胃酸耐受且在腸中萌發(fā)的孢子來傳染。結(jié)腸的共生菌落的失衡能使難辨梭菌增殖，這產(chǎn)生成為結(jié)腸炎病因的毒素。在許多情況下，共生菌落的失衡歸因于服用抗生素。難辨梭菌可以被認(rèn)為是無害的環(huán)境微生物，其在某些條件下變成機會致病菌。難辨梭菌的無癥狀消化系統(tǒng)攜帶者在成年人群中估計為3%，但在抗生素治療或在高流行性單位停留之后達(dá)到個體的15%至25%。通常觀察到高攜帶水平，從住院患者的20%至40%高達(dá)至幼兒的50%至70%。能夠早期且迅速的診斷是預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥和有效醫(yī)療護(hù)理的關(guān)鍵要素。診斷基于對毒素的尋找并基于培養(yǎng)。毒素直接從糞便的分離是難辨梭菌的產(chǎn)毒菌株存在的優(yōu)異標(biāo)記。參考方法在于通過細(xì)胞培養(yǎng)來尋找致細(xì)胞病變作用(在英語中，CTA表示細(xì)胞毒活性)。該方法非常靈敏，但未被標(biāo)準(zhǔn)化，并且需要專門的技術(shù)人員和幾天的響應(yīng)時間。已經(jīng)開發(fā)了 ELISA型免疫酶試驗，其檢測單獨的毒素A或者毒素A和B。獲得結(jié)果的時間降低了。然而，推薦將用于檢測毒素的免疫學(xué)技術(shù)與細(xì)菌培養(yǎng)組合以分離難辨梭菌菌株?？稍谟杀旧暾埲虽N售的難辨梭菌瓊脂上采用該培養(yǎng)，然后通過生物化學(xué)方法(例如API 20A試條(gallery)或快速ID32A試條)來鑒定難辨梭菌菌落。然而，通過試條鑒定必須使要鑒定的細(xì)菌的純培養(yǎng)物在合適的生長培養(yǎng)基上，以獲得足夠的生物質(zhì)(3至4McFarland)，這在最好的情況下耗時48小時(從采樣開始24至72小時的分離培養(yǎng)(這僅給出了假定的檢測)，然后24至72小時的培養(yǎng)以產(chǎn)生足夠的生物質(zhì))。然后，對于ID32A試條，在孵育4小時后進(jìn)行試條的讀數(shù)，對于20A試條，在孵育24至48小時之后進(jìn)行試條的讀數(shù)。最終，可以使用分子生物技術(shù)進(jìn)行診斷。然而，這些技術(shù)并非目前常用的。通過本申請人為了改善在細(xì)菌培養(yǎng)物中直接鑒定難辨梭菌而進(jìn)行的工作，本申請人證明，￠-葡糖苷酶酶底物的使用可以容易且快速地鑒定難辨梭菌。所述￠-葡糖苷酶底物的使用在申請W02009/092982中描述為減少獲得難辨梭菌鑒定結(jié)果所用的時間。早期且迅速地鑒定在樣品中可能存在的難辨梭菌仍是主要目的，并且本申請人已經(jīng)通過更特別地尋求加快酶活性的顯示來繼續(xù)從事其工作。因此，本申請人已經(jīng)出乎預(yù)料地證明，包含￠-葡糖苷酶底物和通式Ar-P-D-吡喃葡糖苷的￠-葡糖苷酶激活劑的反應(yīng)培養(yǎng)基使難辨梭菌在樣品中被迅速鑒定，換言之，這樣的培養(yǎng)基使至少一些難辨梭菌菌株的酶活性被更早地檢測，在所述通式中，Ar-對應(yīng)于芳環(huán)或多個毗連的芳環(huán)。Ar-P-D-葡糖苷化合物的使用使3-葡糖苷酶被激活并且能觀察到難辨梭菌菌落的明顯更強的著色。有利地，所述Ar- ^ -D-葡糖苷化合物具有遠(yuǎn)優(yōu)于其他P -D-葡糖苷衍生物(例如纖維二糖(4-0-^-D-吡喃葡萄糖基-D-葡萄 糖)或甲基-D-葡萄糖)的難辨梭菌P -葡糖苷酶激活能力。
已知的是，通式Ar- ^ -D-葡糖苷的化合物能用作P -葡糖苷酶底物，在所述通式中，Ar表示至少一種同素環(huán)的或雜環(huán)的芳環(huán)。該用途報道于申請W02009/092982(如上)中。同樣,HiIdebrand和Schroth報道了熊果苷或氫醌P -D-卩比喃葡糖苷作為碳源以0.5%重量/體積(換言之，5g/l)的濃度與葡萄糖組合用于反應(yīng)培養(yǎng)基中。由色譜方法測定的熊果苷在氫醌中的水解是丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的P -葡糖苷酶活性的標(biāo)記(Hildebrand 和 Schroth, Applied Microbiology, 1964; 12 (6):487-491)。這阻礙了本領(lǐng)域技術(shù)人員將Ar- ^ -D-葡糖苷化合物作為P -葡糖苷酶激活劑用于反應(yīng)培養(yǎng)基中以檢測或鑒定難辨梭菌，因為他們會發(fā)現(xiàn)其自身與旨在顯示靶微生物的酶活性的底物競爭。最后，現(xiàn)有技術(shù)報道了口服給予的熊果苷被排泄和代謝在尿中，并且由于其利尿和抗菌性質(zhì)可以加以使用(Schindler等人，2002; J.Clin.Pharmacol.; 42 (8): 920-927; Siegers 等人,2003, Phytomedicine; 10 (Suppl4): 58-60)。這樣的用途也阻礙了將熊果苷用于反應(yīng)培養(yǎng)基中以檢測細(xì)菌。在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，給出下列定義以更好地理解本發(fā)明。它們不以任何方式進(jìn)行限制。反應(yīng)培養(yǎng)基應(yīng)理解為包含微生物的代謝表達(dá)和/或生長所必須的所有成分的培養(yǎng)基。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以是固體的、半固體的或液體的。固體培養(yǎng)基應(yīng)理解為凝膠化的培養(yǎng)基。瓊脂是微生物學(xué)中常見的用于培養(yǎng)微生物的凝膠劑，但可以使用明膠、瓊脂糖或者其他天然或人造的凝膠劑。許多制劑是可商購的，例如Columbia瓊脂、Trypcase-大豆瓊月旨、MacConkey 瓊脂、Sabouraud 瓊脂，或更一般來說例如在 Handbook of MicrobiologicalMedia(CRC Press)中描述的那些。本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基必須允許難辨梭菌生長。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以包含一種或多種組合的成分，例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素等。所述培養(yǎng)基還可以包含著色劑。作為指示，可以例舉依文思藍(lán)、中性紅、羊血、馬血、諸如氧化鈦的遮光劑、硝基苯胺、孔雀石綠、亮綠、一種或多種代謝指示劑、一種或多種代謝調(diào)節(jié)劑等作為著色劑。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以為顯示培養(yǎng)基、或者培養(yǎng)顯示培養(yǎng)基。在第一種情況下，微生物的培養(yǎng)在接種之前進(jìn)行，在第二種情況下，檢測和/或鑒定培養(yǎng)基還構(gòu)成了培養(yǎng)培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可使用鴦鴦平板(b1-biote),其可以容易地比較兩種包含不同底物或不同選擇性混合物的培養(yǎng)基，并且在其上已沉積了相同的生物樣品。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以包含難辨梭菌菌株的一種或多種生長激活劑。生長激活劑應(yīng)理解為刺激微生物生長的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉血液、血清和蛋黃。非限制性地提及，0.1%至10%的濃度特別適于本發(fā)明。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以包含一種或多種還原劑。還原劑應(yīng)理解為通過中和在培養(yǎng)基中存在的溶解的氧來促進(jìn)厭氧細(xì)菌生長的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉半胖氨酸、丙酮酸鹽、去氧酶(I’ Oxyrase)、亞硫酸鈉、二硫酸鹽、組氨酸和硫化亞鐵。非限制性地提及，0.05g/l至50g/l、優(yōu)選0.lg/1至2g/l的濃度特別適于本發(fā)明。

所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以包含一種或多種難辨梭菌孢子萌發(fā)誘導(dǎo)劑。孢子萌發(fā)誘導(dǎo)劑應(yīng)理解為促進(jìn)難辨梭菌從孢子狀態(tài)到植物狀態(tài)的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉牛磺膽酸鈉。非限制性地提及，0.lg/1至10g/l、優(yōu)選lg/1至5g/l的濃度特別適于本發(fā)明。
所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以包含一種或多種選擇性藥劑。選擇性藥劑應(yīng)理解為能阻止或減緩除靶微生物之外的微生物生長的任何化合物。非限制性地提及，5mg/l至5g/l的濃度特別適于本發(fā)明?？梢岳e抗生素和抗真菌劑作為選擇性藥劑?？股貞?yīng)理解為能阻止或減緩細(xì)菌生長的任何化合物。特別地，它們屬于頭孢菌素、氨基糖苷、多肽、磺酰胺和喹諾酮。作為指示，特別可以例舉抗生素頭孢噻肟、頭孢他唆、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢泊肟、氨曲南、慶大霉素、甲氧芐啶、妥布霉素、拉氧頭孢、磷霉素、D-環(huán)絲氨酸、多粘菌素、多粘菌素-E和諸如萘啶酸的喹諾酮?？拐婢鷦?yīng)理解為能阻止或減緩酵母或霉菌生長的任何化合物。作為指示，可以特別例舉兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和環(huán)己酰亞胺。通常，所述反應(yīng)培養(yǎng)基還可包含可以通過能被直接或間接檢測到的信號來檢測靶微生物的酶活性或代謝活性的底物。對于直接檢測，該底物可與用作熒光或發(fā)色標(biāo)記的部分連接。對于間接檢測，本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基還可包含PH指示劑，其對由底物消耗而導(dǎo)致的PH變化敏感并顯示靶微生物的生長。所述pH指示劑可以是發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)?？梢岳e中性紅、苯胺藍(lán)和溴甲酚藍(lán)作為發(fā)色團(tuán)的實例。所述熒光團(tuán)包括例如4-甲基傘形酮、羥基香豆素衍生物或試鹵靈衍生物。能鑒定難辨梭菌的3 -葡糖苷酶底物應(yīng)理解為在適合的生長條件下導(dǎo)致難辨梭菌著色的底物。特別地，可以提及2-羥基苯基-￠-葡糖苷(鄰苯二酚-￠-葡糖苷)；品紅_匍糖昔(5_漠_6_氣_3_ D引噪氧基_匍糖昔)；DHF_0 -匍糖昔(二輕基黃酮-葡糖苷);七葉苷(七葉亭-葡糖苷)(Esculetine-beta glucoside) ;CHE_3-葡糖苷(3，4-環(huán)己烯并七葉亭-葡糖苷)(3, 4Cyclohexenoesculetine-beta glucoside)；8-羥基喹啉-0 -葡糖苷；X-0 -葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-P -葡糖苷)；玫瑰紅-3 -葡糖苷(Rose-beta glucoside) (6_氯_3_卩引哚氧基-旦_葡糖苷);6_溴_3_ 口引哚氧基 葡糖苷；藍(lán)色-￠ -葡糖苷(Blue-beta glucoside) (5_溴_3_吲哚氧基_ 3 _葡糖苷);6~氟-3- 1 丨哚氧基--匍糖苷；菌素-P -匍糖苷；對硝基苯基_ P _匍糖苷；4甲基傘形麗-3 _ 葡糖昔(4Methylumbelliferyl_beta glucoside)、對蔡酌■苯甲醇葡糖苷、吲哚氧基-N-甲基-P -葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-P -葡糖苷、萘基-￠-葡糖苷；氨基苯基-￠-葡糖苷；二氯氨基苯基-￠-葡糖苷、AldolTM-P-葡糖苷(B10SYNTH, Lukas M.Wick, Alexander Bayer, Christophe ffeymuth, GiinterSchabert, Vanessa Pfister, Aysel Aslan, Urs P.Spitz, “Novel Chromogenic EnzymeSubstrates” , ASM General Meeting, 2009, Philadelphia, 1-091/285)。所述反應(yīng)培養(yǎng)基還可以包含酶激活劑。酶激活劑應(yīng)理解為用于激活酶消化過程(換言之，用于降低顯示酶活性所用的孵育時間和/或增加所述酶活性)的化合物。本發(fā)明的￠-葡糖苷酶激活劑具有通式Ar-P-D-葡糖苷，其中Ar-表示芳環(huán)。我們通過芳環(huán)表示不飽和化合物，即，具有雙鍵并包含一個或多個毗連的同原子的環(huán)或雜原子的環(huán)，每個環(huán)具有5至7個頂點。以非限制性的方式，可以提及熊果苷(氫醌-D-葡糖苷)、4_甲基傘形酮-P -D-葡糖苷、4-氨基苯基-0 -葡糖苷、水楊苷(2-(羥基甲基)苯基-P -D-葡糖苷)和七葉苷(6，7- 二羥基香豆素-P -葡糖苷)。這些化合物中的一些為^ -葡糖苷酶底物。對于本發(fā)明，它們被認(rèn)為是激活劑，因為它們可以降低檢測用作底物的化合物的水解所必需的孵育時間，或者它們可以增進(jìn)這種水解。因此，令人驚訝地，本發(fā)明的酶底物和激活劑的組合可以具有比分別使用這些化合物時更早和/或更強的酶活性檢測?？梢悦黠@地證明化合物對具有延遲的和/或微弱的￠-葡糖苷酶活性的某些難辨梭菌菌株的激活能力，如果所述化合物和所述底物的組合與僅以至少等于組合的底物和激活劑的摩爾濃度總和的摩爾濃度使用激活劑的底物時相比能使檢測更早和/或更強的話。生物樣品旨在表示從用于分析的實體分離的一小部分或少量。其可以為得自生物流體樣本的臨床樣品，或得自任何類型的食物的食物樣品。因此，該樣品可以為液體的或固體的。以非限制性的方式，可以提及全血、血清、血漿、尿或糞便樣品、鼻、喉、皮膚、傷口或腦脊液的臨床樣品；來自水、諸如牛奶或果汁的飲料、酸乳、肉、蛋、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚等的食物樣品；源自動物飼料的食物樣品，例如特別是來自骨粉的樣品。該樣本可以原樣使用，或可以在分析之前根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行富集、提取、濃縮或純化型的配制。在接觸所述樣品之后，使所述反應(yīng)培養(yǎng)基在合適溫度(通常為20° C至50° C、優(yōu)選為30° C至40° C)下孵育。優(yōu)選地，所述孵育根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)在厭氧生活中(換言之，在不存在氧氣的情況下)進(jìn)行。因此，本發(fā)明涉及反應(yīng)培養(yǎng)基，其包含至少一種P -葡糖苷酶底物和濃度低于5g/I的不同于所述底物的通式A r-P-D-葡糖苷的化合物，其中Ar-表示芳香化合物。所述化合物Ar-0 -D-葡糖苷的濃度優(yōu)選為0.3g/l至1.5g/l。所述通式Ar- ^ -D-葡糖苷的化合物優(yōu)選選自熊果苷或氫醌-P -葡糖苷、4-甲基傘形酮-P -葡糖苷、4-氨基苯基-P -葡糖苷、水楊苷或2-(羥基甲基)苯基-P -D-葡糖苷、七葉苷或6，7- 二羥基香豆素-P -葡糖苷。所述化合物Ar- ^ -D-葡糖苷優(yōu)選為熊果苷。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述￠-葡糖苷酶底物選自茜素-￠-葡糖苷、品紅-P -葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-P -葡糖苷)、DHF- ^ -葡糖苷、3HF- P -葡糖苷和CHE- P -葡糖苷(3，4-環(huán)己烯并七葉亭-P -葡糖苷)和B10SYNTH公司的ALDOL P -葡糖苷(Wick 等人.2009.ASM General meeting - Philadelphia (PA, USA))。所述 3 -葡糖苷酶底物的濃度為25mg/l至1000mg/l,優(yōu)選為50mg/l至400mg/l。根據(jù)本發(fā)明，所述酶激活劑為水解產(chǎn)物與所述酶底物的水解產(chǎn)物不同的酶底物。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所述酶激活劑是其產(chǎn)物在所述反應(yīng)培養(yǎng)基中不能由肉眼檢測到的酶底物，而前述酶底物的水解產(chǎn)物則可以。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基還包含難辨梭菌孢子萌發(fā)激活齊U，所述激活劑優(yōu)選為?；悄懰徕c，濃度為0.lg/1至10.0g/l，優(yōu)選為1.0g/1至5.0g/1。本發(fā)明涉及檢測和/或鑒定難辨梭菌的方法，其包括下列步驟:a)使可能包含難辨梭菌的樣品與包含至少一種P -葡糖苷酶底物和不同于所述底物的通式Ar-P-D-葡糖苷的化合物的反應(yīng)培養(yǎng)基接觸，其中Ar-表示芳香化合物；b)孵育，以及c)檢測所述P -葡糖苷酶底物的水解，所述水解指示難辨梭菌的存在。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的方法在步驟a)中采用諸如上文定義的培養(yǎng)基。
根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，在本發(fā)明的方法的步驟b)中采用的孵育是在厭氧生活中進(jìn)行的。本發(fā)明涉及通式Ar-P -D-葡糖苷的化合物作為P _葡糖苷酶激活劑在反應(yīng)培養(yǎng)基中的用途。優(yōu)選地，所述化合物的濃度低于5g/l，優(yōu)選為0.3g/l至1.5g/l。優(yōu)選地，所述化合物選自:熊果苷或氫醌-3 -D-葡糖苷、4-甲基傘形酮-@ -D-葡糖苷、4-氨基苯基-0 -葡糖苷、水楊苷或2-(羥基甲基)苯基-P -D-葡糖苷、七葉苷或6，7- 二羥基香豆素-葡糖苷。更優(yōu)選地，所述化合物為熊果苷。優(yōu)選地，所述反應(yīng)培養(yǎng)基為用于檢測和/或鑒定難辨梭菌的培養(yǎng)基。以說明的方式給出下列實施例，這些實施例決非限制性的。它們將使本發(fā)明能被更好地理解。實施例1:證明熊果苷對葡糖苷酶底物的激活作用1.培養(yǎng)基和微生物在存在或不存在CHE-P-葡糖苷的情況下，在包含不同濃度的熊果苷的培養(yǎng)基上試驗了由本申請人收集的8種難辨梭菌菌株。然后在24小時時進(jìn)行培養(yǎng)皿的讀數(shù)。培養(yǎng)基的組成如下: 所有培養(yǎng)基共用的難辨梭菌ChromID 基質(zhì):
權(quán)利要求
1.反應(yīng)培養(yǎng)基，其包含至少一種￠-葡糖苷酶底物和濃度低于5g/l的不同于所述底物的通式Ar- ^ -D-葡糖苷的化合物，其中Ar-表示芳香化合物。
2.權(quán)利要求1的反應(yīng)培養(yǎng)基，其中所述化合物Ar-P-D-葡糖苷的濃度為0.3g/l至1.5g/l o
3.權(quán)利要求1或2的反應(yīng)培養(yǎng)基，其中所述化合物Ar-^ -D-葡糖苷選自氫醌-P -D-吡喃葡糖苷、4-甲基傘形酮-P -葡糖苷、4-氨基苯基-0 -葡糖苷、水楊苷或2-(羥基甲基)苯基-P -D-葡糖苷、七葉苷或6，7- 二羥基香豆素-P -葡糖苷。
4.權(quán)利要求1至3中任一權(quán)利要求的反應(yīng)培養(yǎng)基，其中所述化合物Ar-P-D-葡糖苷為Jf旨果昔。
5.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求的反應(yīng)培養(yǎng)基，其中所述￠-葡糖苷酶底物選自茜素-￠-葡糖苷、品紅-￠-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-￠-葡糖苷)、DHF-P-葡糖苷、3HF- ^ -葡糖苷和CHE- ^ -葡糖苷(3，4-環(huán)己烯并七葉亭-P -葡糖苷)以及ALDOL P -葡糖苷。
6.權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求的反應(yīng)培養(yǎng)基，其中所述P-葡糖苷酶底物的濃度為 25mg/l 至 1000mg/l,更優(yōu)選為 50mg/l 至 400mg/l。
7.權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求的反應(yīng)培養(yǎng)基,其還包含難辨梭菌(Clostridiumdifficile)孢子萌發(fā)激活劑。
8.權(quán)利要求7的反應(yīng)培養(yǎng)基，其中所述難辨梭菌孢子萌發(fā)激活劑為?；悄懰徕c。
9.權(quán)利要求7或8的反應(yīng)培養(yǎng)基，其中牛磺膽酸鈉的濃度為0.lg/1至10g/l，優(yōu)選為lg/1 至 5g/l。
10.檢測和/或鑒定難辨 梭菌的方法，其包括下列步驟: a)使可能包含難辨梭菌的樣品與包含至少一種3-葡糖苷酶底物和不同于所述底物的通式Ar- ^ -D-葡糖苷的化合物的反應(yīng)培養(yǎng)基接觸，其中Ar-表示芳香化合物； b)孵育； c)檢測所述3-葡糖苷酶底物的水解，所述水解指示難辨梭菌的存在。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在步驟a)中采用的培養(yǎng)基為權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求的培養(yǎng)基。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中在步驟b)中采用的孵育是在厭氧生活中進(jìn)行的。
13.熊果苷作為￠-葡糖苷酶激活劑在反應(yīng)培養(yǎng)基中的用途。
14.熊果苷作為￠-葡糖苷酶激活劑在難辨梭菌檢測和/或鑒定培養(yǎng)基中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少一種β-葡糖苷酶底物和不同于所述底物的通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物的反應(yīng)培養(yǎng)基，其中Ar-表示芳香化合物。根據(jù)本發(fā)明，這樣的培養(yǎng)基可用于檢測和/或鑒定難辨梭菌(C.difficile)的方法中。
文檔編號C12N3/00GK103080299SQ201180041835
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者M·塞利耶, D·哈利米, S·奧倫加 申請人:生物梅里埃公司