專利名稱：生產(chǎn)高水平二十碳五烯酸的重組微生物宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及工程化重組微生物宿主細(xì)胞，其能夠以高濃度有效地產(chǎn)生二十碳五烯酸(ω-3多不飽和脂肪酸[“PUFA”])。
背景技術(shù)：
二十碳五烯酸[“ΕΡΑ ;順式-5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸；ω-3]的臨床和藥物價(jià)值是眾所周知的(美國(guó)專利申請(qǐng)公布2009-0093543-Α1 )。類似地，相對(duì)于從天然的微生物源或通過(guò)分離從魚(yú)油和海洋浮游生物生產(chǎn)ΕΡΑ，利用重組方法在微生物中生產(chǎn)EPA的優(yōu)點(diǎn)也是被充分認(rèn)可的。盡管文獻(xiàn)報(bào)道了負(fù)責(zé)EPA的生產(chǎn)的ω-3/ω-6多不飽和脂肪酸[“PUFA”]生物合成途徑的多個(gè)部分在其中被引入植物和非含油酵母的許多最近的例子，申請(qǐng)人的受讓人的主要努力聚焦在含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)(美國(guó)專利7，238，482 ;美國(guó)專利7，932，077 ;美國(guó)專利申請(qǐng)公布2009-0093543-Α1 ;美國(guó)專利申請(qǐng)公布2010-0317072-Α1)的使用上。含油酵母被定義為天然地能夠合成和積聚油的那些酵母(其中油的積聚為細(xì)胞干重的至少25%)，或經(jīng)過(guò)遺傳工程改造，使得它們變得能夠合成和積聚油的那些酵母(其中油的積聚為細(xì)胞干重的至少25%)。更具體地，美國(guó)專利7，932，077展示了通過(guò)表達(dá)下列基因:Λ9延伸酶、Λ8去飽和酶、Λ 5去飽和酶、Λ 17去飽和酶、Λ 12去飽和酶和C16/18延伸酶，在重組解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytic a)菌株中，占總脂肪酸[“TFA”]9%的EPA的生產(chǎn)而沒(méi)有Y -亞麻酸[“GLA”；gj-6]的共合成。美國(guó)專利申請(qǐng)公布2009-0093543-A1描述了通過(guò)表達(dá)下列基因:Λ 9延伸酶、Λ 8去飽和酶、Δ 5去飽和酶、Δ 17去飽和酶、Δ 12去飽和酶、C16/18延伸酶和二酰基甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶，在重組解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株中產(chǎn)生占TFA至多55.6%的EPA的優(yōu)化的重組解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株。美國(guó)專利申請(qǐng)公布2010-0317072-A1描述了進(jìn)一步優(yōu)化的重組解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株，其產(chǎn)生包含占TFA高至50%的EPA的微生物油，并且具有以TFA的重量百分比測(cè)量的EPA對(duì)以TFA的重量百分比測(cè)量的亞油酸至少3.1的比率。除了表達(dá)如美國(guó)專利申請(qǐng)公布2009-0093543-A1中所詳述的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的基因之外，這些改進(jìn)的菌株的特征還在于:I)包含至少一種復(fù)合酶，其中所述復(fù)合酶包含多肽，所述多肽具有至少一個(gè)脂肪酸Λ 9延伸酶，所述脂肪酸Λ 9延伸酶連接至少一個(gè)脂肪酸Λ 8去飽和酶[“DGLA合酶”]；2)任選地包含至少一種編碼酶的多核苷酸，所述酶選自丙二酰-Cok合成酶或?；?CoA溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶[“LPLAT”];以及3)包含至少一種過(guò)氧化物酶體生物合成因子蛋白，所述過(guò)氧化物酶體生物合成因子蛋白的表達(dá)已被下調(diào)。盡管有以上引用的公開(kāi)，就允許除高的總脂質(zhì)含量外，還有占總脂肪酸的高重量％的EPA生產(chǎn)，同時(shí)使中間體脂肪酸如亞油酸[“LA”; ω-6]的生產(chǎn)和最終的油產(chǎn)物中的副產(chǎn)物脂肪酸最小化的EPA商業(yè)生產(chǎn)而言，菌株的改善依然是必要的。通過(guò)工程化改良的優(yōu)化的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株，申請(qǐng)人已解決了上述問(wèn)題,其中所述改良使得能夠生產(chǎn)包含以干細(xì)胞重量的重量百分比測(cè)量的至少25重量％的EPA的微生物油。

發(fā)明內(nèi)容
在第一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及重組微生物宿主細(xì)胞，所述重組微生物宿主細(xì)胞產(chǎn)生油，所述油包含以干細(xì)胞重量的重量百分比測(cè)量的至少25重量％的二十碳五烯酸。在第二實(shí)施例中，本文公開(kāi)了油，所述油包含以總脂肪酸的重量百分比測(cè)量的至少45重量％的二十碳五烯酸。優(yōu)選地，上述的兩種油中任一種具有以總脂肪酸的重量百分比測(cè)量的二十碳五烯酸對(duì)以總脂肪酸的重量百分比測(cè)量的亞油酸至少2.4的比率。在第三實(shí)施例中，本文公開(kāi)了重組微生物宿主細(xì)胞，其包含:(a)至少一種包含多肽的復(fù)合酶，所述多肽具有至少一種Δ9延伸酶，所述Λ9延伸酶連接至少一種△ 8去飽和酶；(b)至少一種過(guò)氧化物酶體生物合成因子蛋白，所述過(guò)氧化物酶體生物合成因子蛋白的表達(dá)已被下調(diào)；和
·
(c)至少兩種多肽，所述多肽具有至少溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶[“LPAAT”]活性；(d)至少一種多肽，所述多肽具有至少磷脂:二?；视王；D(zhuǎn)移酶[“PDAT”]活性。在第四實(shí)施例中，所述重組微生物宿主細(xì)胞還可以包含至少一種突變?chǔ)?延伸酶多肽，其中所述突變?chǔ)?9延伸酶多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQ IDΝ0:1與SEQ ID NO: 3具有至少一個(gè)氨基酸突變的差異，所述突變選自:i)L35F 突變；ii)L35M 突變；iii)L35G 突變；iv)L35G突變和至少一種選自下列的其它突變:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；v)L35G、A21V、L108G 和 I179R 突變；vi) L35G、W132T 和 1179 突變；vii)L35G、S9D、Y84C 和 I179R 突變；viii)L35G、Y84C、I179R 和 Q244N 突變；ix)L35G、A21V、W132T、I179R 和 Q244N 突變；X) K58R 和 I257T 突變；
xi)D98G 突變；xii)L130M 和 V243A 突變；以及xiii)包含至少兩種突變的任何組合，其中所述突變選自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y 和 I257T。優(yōu)選地，所述至少一種突變?chǔ)?延伸酶多肽包含L35G取代，并且在與SEQ ID NO: 3的Λ 9延伸酶活性進(jìn)行比較時(shí)，所述突變?chǔ)?延伸酶多肽具有改善的Λ9延伸酶活性。優(yōu)選地，所述至少一種復(fù)合酶具有選自下列的特性:(a)選自下列的接頭:SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10;以及(b)基本上由選自下列的序列組成的氨基酸序列:SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO:16。優(yōu)選地，所述至少兩種溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶中的至少一種選自:(a)基本上由選自下列的序列組成的氨基酸序列:SEQ ID NO: 18、SEQ ID N0:20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 25;以及(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比對(duì)方法，在與選自SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO:22,SEQ ID NO:23的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少43.9%的氨基酸同一性，并且所述多肽還包含至少一種選自SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27的1-?；?sn_甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶家族基序。優(yōu)選地，所述至少一種磷脂:二?；视王；D(zhuǎn)移酶選自:(a)基本上由選自下列的序列組成的氨基酸序列:SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:30 ；以及(b)多肽，所述多肽基于Clustal W比對(duì)方法，在與選自SEQ ID N0:29和SEQ IDNO:30的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少90%的氨基酸同一性。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞屬于耶氏酵母屬(Yarrowia)。在第五實(shí)施例中，本發(fā)明涉及制備包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，其包括:a)培養(yǎng)本發(fā)明的任一個(gè)宿主細(xì)胞，其中產(chǎn)生包含二十碳五烯酸的微生物油；以及b)任選地回收所述步驟(a)的微生物油。在第六實(shí)施例中，本發(fā)明涉及進(jìn)一步加工由本發(fā)明的方法制備的油。牛物保藏下列生物材料保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection) (ATCC) (10801University Boulevard, Manassas, VA20110-2209),并具有下
列名稱、保藏號(hào)和保藏日期。
權(quán)利要求
1.重組微生物宿主細(xì)胞，所述重組微生物宿主細(xì)胞產(chǎn)生油，所述油包含以干細(xì)胞重量的重量百分比測(cè)量的至少25重量％的二十碳五烯酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組微生物宿主細(xì)胞，其中所述油包含以總脂肪酸的重量百分比測(cè)量的至少45重量％的二十碳五烯酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的重組微生物宿主細(xì)胞，其中所述油具有以總脂肪酸的重量百分比測(cè)量的二十碳五烯酸對(duì)以總脂肪酸的重量百分比測(cè)量的亞油酸至少2.4的比率。
4.重組微生物宿主細(xì)胞，包含: (a)至少一種包含多肽的復(fù)合酶，所述多肽具有至少一種Δ9延伸酶，所述Λ9延伸酶連接至少一種△ 8去飽和酶； (b)至少一種過(guò)氧化物酶體生物合成因子蛋白，所述過(guò)氧化物酶體生物合成因子蛋白的表達(dá)已被下調(diào)；和 (c)至少兩種多肽，所述多肽具有至少溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶[“LPAAT”]活性； (d)至少一種多肽，所述多肽具有至少磷脂:二?；视王；D(zhuǎn)移酶[“PDAT”]活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組微生物宿主細(xì)胞，還包含至少一種突變?chǔ)?延伸酶多肽，其中所述突變?chǔ)?9延伸酶多肽包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:3具有至少一個(gè)氨基酸突變的差異，所述突變選自: i)L35F突變； ii)L35M突變； iii)L35G突變； iv)L35G突變和至少一種選自下列的其它突變:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、1179M、1179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ； v)L35G、A21V、L108G和 I179R 突變； vi)L35G、W132T和 1179 突變； vii)L35G、S9D、Y84C和 I179R 突變； viii)L35G、Y84C、I179R和 Q244N 突變； ix)L35G、A21V、W132T、I179R和 Q244N 突變；x)K58R 和 I257T 突變； xi)D98G突變； xii)L130M和V243A突變；以及 xiii)包含至少兩 種突變的任何組合，其中所述突變選自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y 和 I257T。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組微生物宿主細(xì)胞，其中所述至少一種突變?chǔ)?延伸酶多肽包含L35G取代，并且在與SEQ ID N0:3的Λ 9延伸酶活性進(jìn)行比較時(shí)，所述突變?chǔ)?延伸酶多肽具有改善的Λ9延伸酶活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組微生物宿主細(xì)胞，其中所述復(fù)合酶具有選自下列的特性:(a)選自下列的接頭:SEQID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10;以及 (b)基本上由選自下列的序列組成的序列:SEQID NO: 12, SEQ ID N0:14和SEQ IDNO:16。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組微生物宿主細(xì)胞，其中所述至少兩種溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶選自: (a)基本上由選自下列的序列組成的序列:SEQID NO: 18, SEQ ID NO:20, SEQ IDNO: 22、SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 25;以及 (b)多肽，所述多肽基于ClustalW比對(duì)方法，在與選自SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:22和SEQ ID NO: 23的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少43.9%的氨基酸同一性，并且所述多肽還包含至少一種選自SEQ ID NO: 26和SEQ ID NO: 27的1-?；?sn_甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶家族基序。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組微生物宿主細(xì)胞，其中所述至少一種磷脂:二?；视王；D(zhuǎn)移酶選自: (a)基本上由選自下列的序列組成的序列:SEQID NO:29和SEQID NO:30 ;以及 (b)多肽，所述多肽基于ClustalW比對(duì)方法，在與選自SEQ ID NO:29和SEQ ID NO: 30的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少90%的氨基酸同一性。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組微生物宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞屬于耶氏酵母屬(Yarrowia)0
11.根據(jù)權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)所述的重組微生物宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含至少一種突變?chǔ)?5去飽和酶多肽，其中所述突變?chǔ)?5去飽和酶多肽選自: a)突變多肽，所述突變多肽包含:如SEQID NO: 180[HxGx]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID N0:180[HxGx]與 SEQ ID N0:181[HPGG]是不同的;以及如 SEQ ID NO: 182 [HxxxH]所示的氨基酸基序，其中SEQ ID N0:182[HxxxH]與SEQ ID NO: 183[HDASH]是不同的； b)突變多肽，所述突變多肽具有選自下列的氨基酸序列:SEQID N0:106[EgD5M或經(jīng)密碼子優(yōu)化的 EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO: 108 [EgD5R*_34gl58g347s]、SEQ ID NO:1 10 [EgD5S-36s157g]、SEQ ID NO:1 I 2 [ EaD5S-35 a I 58g ]、SEQ ID NO:299 [EgD5R*-34gl57g]、SEQ ID NO:30 I[EgD5R*_34gI 58a]、SEQ ID NO:303 [EgD5R*-34gl58g]、SEQ ID NO:329 [EgD5S-36s I 56e]、SEQ ID NO:331[EgD5S-36sl58a]、SEQ ID NO:333 [EgD5S_36s158g]、SEQ IDN0:363[EaD5S-35al58s]和 SEQ ID NO:365[EaD5S_35al59g]。
12.制備包含二十碳五烯酸的微生物油的方法，包括: a)培養(yǎng)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中產(chǎn)生包含二十碳五烯酸的微生物油；以及 b)任選地回收所述步驟(a)的微生物油。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中進(jìn)一步加工所述步驟(b)的回收的油。
全文摘要
本文公開(kāi)了含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的工程化菌株，其能夠產(chǎn)生微生物油，所述微生物油包含以干細(xì)胞重量的重量百分比測(cè)量的大于25重量%的二十碳五烯酸[“EPA”](ω-3多不飽和脂肪酸)。
文檔編號(hào)C12N15/54GK103249834SQ201180041064
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2011年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者S-P.洪, P.L.夏普, Z.薛, N.S.亞達(dá)夫, H.張, Q.朱 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司