專利名稱：抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移形式的毛細(xì)管滲透性的方法。
相關(guān)技術(shù)介紹花生四烯酸(AA)響應(yīng)于多種刺激如機械、熱、化學(xué)、細(xì)菌和其它刺激而從細(xì)胞膜中的磷脂釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物(類花生酸類化合物前列腺素和白三烯)以多種方式具有生物學(xué)重要性。大多數(shù)類花生酸類化合物趨于加重炎癥，疼痛，和發(fā)熱反應(yīng)，并且它們成為對于抗炎和鎮(zhèn)痛藥物的廣泛研究的靶標(biāo)。例如，抗炎類固醇如可的松通過抑制由膜磷脂生成花生四烯酸的磷脂酶而發(fā)揮作用。止痛藥如阿司匹林和布洛芬通過在一定程度上阻抑環(huán)加氧酶而起作用，所述環(huán)加氧酶控制花生四烯酸轉(zhuǎn)化成類花生酸，前列腺素，前列環(huán)素，和血栓烷。
此外，已知前列腺素和白三烯有助于在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中形成炎癥。盡管在過去三十年進(jìn)行了研究，但確切地前列腺素如何有助于炎癥仍然不清楚。相反地，最近利用白三烯受體拮抗劑的研究表明白三烯可能在此過程中發(fā)揮主要作用。
白三烯是有效的脂質(zhì)介體并且基于半胱氨酸基團(tuán)的存在或缺失而分成兩類。白三烯B4并不包含這種基團(tuán)，而白三烯C4，D4，E4和F4是半胱氨酸基白三烯。自從1980年代早期以來，已經(jīng)認(rèn)可這些化合物為炎癥引起劑(von Sprecher等，1993和Piper，1984)。
在1990年代，鑒定了被稱作″白三烯拮抗劑″的各種藥物，其能夠遏制和抑制白三烯在身體中的活性。在本文中以常規(guī)醫(yī)學(xué)意義使用的術(shù)語″白三烯拮抗劑″，指抑制，阻抑，或減弱或?qū)固烊淮嬖诘陌兹┑囊环N或多種亞型的濃度，活性或效應(yīng)的藥物。不過，這些白三烯拮抗劑能夠基于作用機制的差別而分成兩種不同的組，一種抑制5-脂加氧酶而另一種競爭性拮抗白三烯的受體。普侖司特，一種白三烯拮抗劑嚴(yán)格在白三烯C4和D4受體水平上起作用。
盡管已經(jīng)公開了用于治療腦炎的一些白三烯受體拮抗劑(例如，J63258-879-A，JO2-169583-A，WO 9959964-A1，EP-287-471-A)，推測所有公開的白三烯受體拮抗劑穿過血-腦屏障(BBB)，因為按照常識分子必須能夠穿過血-腦屏障以便減弱或抑制腦炎，或治療緣自腦炎的腦的病癥(Wilkinson等，2001)。由于到目前為止已知白三烯C4和D4受體拮抗劑并不穿過血-腦屏障，白三烯C4和D4受體拮抗劑之前從未用來治療或預(yù)防腦炎，除了白三烯受體拮抗劑普侖司特(ONO-1078)對于大鼠(Zhang等，2002)和小鼠(Zeng等，2001)中病灶性大腦局部缺血的神經(jīng)保護(hù)性作用。不過，白三烯C4和D4受體拮抗劑通常用于治療哮喘。白三烯C4和D4受體拮抗劑普侖司特在臨床上用作抗哮喘藥物并且已知具有稍許副作用。普侖司特并不穿過血-腦屏障，或至多在極小的水平上穿過血-腦屏障，類似其它拮抗劑如扎魯司特和孟魯司特。已經(jīng)提出這些化合物的其它藥品標(biāo)識外使用(off-label)用途，包括變應(yīng)性疾病的治療(Shih，美國專利號6,221,880)以及用于治療偏頭痛和簇集性頭痛(Sheftell等，美國專利號6,194,432)。Demopulos等，美國專利號6,492,332，也報告了白三烯受體拮抗劑在抑制腫瘤細(xì)胞黏附，疼痛和炎癥的方法和組合物中用作抗炎藥，其中將包括另一種藥劑的組合施用給進(jìn)行手術(shù)操作以去除腫瘤的患者，所述另一種藥劑抑制腫瘤細(xì)胞黏附/附著，和/或入侵和/或局部轉(zhuǎn)移。
白細(xì)胞轉(zhuǎn)移到急性或慢性炎癥位點包括在這些細(xì)胞和內(nèi)皮之間的黏附性相互作用。這種特異性黏附是由炎性刺激起始的級聯(lián)中的起始事件，所以它對于生物的調(diào)控型防御極為重要。在炎癥反應(yīng)期間參與白細(xì)胞和內(nèi)皮之間的相互作用的細(xì)胞黏附分子的類型目前有四種(1)選擇蛋白；(2)選擇蛋白的(糖類和糖蛋白)配體；(3)整聯(lián)蛋白；和(4)整聯(lián)蛋白配體，其是免疫球蛋白基因超家族的成員。
選擇蛋白是細(xì)胞-表面糖類結(jié)合蛋白，其介導(dǎo)在白細(xì)胞和血管內(nèi)皮表面之間的細(xì)胞黏附。例如，e-選擇蛋白與其在循環(huán)性嗜中性粒細(xì)胞表面表達(dá)的配體結(jié)合起始滾動(rolling)，一種在這些細(xì)胞募集到損傷或炎癥位點的早期步驟。
癌癥是在發(fā)達(dá)國家中死亡的主要原因。轉(zhuǎn)移，細(xì)胞由原發(fā)腫瘤擴(kuò)散到遠(yuǎn)端位點以及它們在那里的生長是癌癥最可怕的方面。這種擔(dān)心是有充分基礎(chǔ)的。盡管在早期診斷，外科手術(shù)技術(shù)，常規(guī)患者護(hù)理，和局部以及全身輔助治療中有顯著的改善，但大多數(shù)源自癌癥的死亡歸因于耐受常規(guī)治療的轉(zhuǎn)移。生長證據(jù)提示糖類介導(dǎo)的癌/腫瘤細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮上的選擇蛋白涉及廣泛種類的上皮癌的轉(zhuǎn)移，所述上皮癌包括胃癌，結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，肝癌，卵巢癌，頭頸癌，以及乳腺癌等。
轉(zhuǎn)移過程在

圖1中舉例說明，其中1)在最初的轉(zhuǎn)化事件中，腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞或多細(xì)胞生長必須是進(jìn)行性的。
2)如果腫瘤塊直徑超過2mm則必須發(fā)生廣泛的血管形成。
3)幾種血管生成因子的合成與分泌在由周圍宿主組織建立新毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。
4)宿主基質(zhì)被一些腫瘤細(xì)胞局部入侵可以通過幾種互不相斥的機制發(fā)生。薄壁小靜脈樣的淋巴通道提供了對于腫瘤細(xì)胞的滲透極小的抗性并且提供了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)最常見的途徑。
5)發(fā)生小腫瘤細(xì)胞團(tuán)聚物的脫附作用和栓塞。
6)在循環(huán)中存活的腫瘤細(xì)胞必須阻滯在器官的毛細(xì)胞血管床中。E-和p-選擇蛋白出現(xiàn)在激活的內(nèi)皮細(xì)胞中以便與腫瘤細(xì)胞通過唾液酸-Lewisx和唾液酸-Lewisa抗原相互作用。
7)發(fā)生外滲(Exravasation)和8)在器官軟組織內(nèi)的增殖實現(xiàn)了轉(zhuǎn)移過程。
惡性細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮表面涉及黏附受體家族，其類似參與炎性細(xì)胞補充到組織位點上的那些受體。選擇蛋白涉及內(nèi)皮細(xì)胞(EC)激活后的連續(xù)分子步驟的級聯(lián)。
選擇蛋白是在結(jié)構(gòu)上和功能上統(tǒng)一的細(xì)胞黏附分子。在結(jié)構(gòu)上，選擇蛋白的特征是包括與鈣依賴型凝集素(C-凝集素)具有同源性的結(jié)構(gòu)域，表皮生長因子(egf)-樣結(jié)構(gòu)域和一些補體結(jié)合樣的結(jié)構(gòu)域(Bevilacgua等，1989；Johnston等，1989；Lasky等，1989；Siegalman，等，1989；和Stoolman，1989)。在功能上，選擇蛋白分享介導(dǎo)細(xì)胞結(jié)合的共同能力，所述結(jié)合是通過在它們的凝集素結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞表面糖類配體之間的相互作用進(jìn)行的(Brandley，等，1990；Springer和Lasky，1991；Bevilacqua和Nelson，1993和Tedder等，1989)。
到目前為止在細(xì)胞黏附分子的選擇蛋白家族中有三種經(jīng)鑒定的成員L-選擇蛋白(也叫作外周淋巴結(jié)歸巢受體(pnHR)，LEC-CAM-1，LAM-1，gp90MEL，gp100MEL，gp110MEL，MEL-14抗原，Leu-8抗原，TQ-I抗原，DREG抗原)，E-選擇蛋白(LEC-CAM-2，LECAM-2，ELAM-I)和P-選擇蛋白(LEC-CAM-3，LECAM-3，GMP-140，PADGEM)。
經(jīng)常在人癌細(xì)胞上表達(dá)的糖類決定簇，唾液酸Lewisa(SLea)和唾液酸Lewisx(SLex)，充當(dāng)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的e-選擇蛋白的配體。這些糖類決定簇參與癌細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮上并且因而促進(jìn)癌的轉(zhuǎn)移。選擇蛋白是參與淋巴細(xì)胞補充的可誘導(dǎo)的內(nèi)皮表達(dá)型黏附分子。由這些分子介導(dǎo)的最初黏附通過幾種細(xì)胞因子的作用促進(jìn)整聯(lián)蛋白分子的激活。糖類配體在癌細(xì)胞表面上的表達(dá)程度與轉(zhuǎn)移的頻率密切相關(guān)聯(lián)。針對Slea或Slex的單克隆抗體阻抑腫瘤細(xì)胞(白血病，結(jié)腸癌，和組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞)黏附到EC和血小板上。選擇蛋白表達(dá)還經(jīng)常在乳腺癌內(nèi)皮細(xì)胞上得以上調(diào)。
P-選擇蛋白，也叫作GMP-140或PADGEM，是位于休眠的(未受刺激的)血小板和內(nèi)皮的分泌顆粒中的膜糖蛋白。當(dāng)介質(zhì)激活這些細(xì)胞時，p-選擇蛋白迅速重新分布到血漿膜中。選擇蛋白構(gòu)成結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的分子的家族。這些分子每一種所共有的結(jié)構(gòu)基序包括N-末端凝集素樣結(jié)構(gòu)域，后接EGF樣區(qū)域，一系列與補體結(jié)合蛋白中那些相關(guān)的共有重復(fù)序列，跨膜結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)尾區(qū)。當(dāng)P-選擇蛋白在激活的血小板和內(nèi)皮上表達(dá)時，它是嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的受體。這種特性有利于淋巴細(xì)胞在組織損傷區(qū)快速黏附到內(nèi)皮上以及在炎癥和出血位點上的血小板-白細(xì)胞相互作用。研究還發(fā)現(xiàn)p-選擇蛋白在許多組織部分結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上并且它結(jié)合到許多源自癌的細(xì)胞系成員的細(xì)胞表面上。與其它黏附分子作用相一致，p-選擇蛋白參與腫瘤轉(zhuǎn)移并且因此是阻抑黏附受體功能的藥物的靶標(biāo)。
支持選擇蛋白在轉(zhuǎn)移中的作用的研究是基于利用體外流動模型來將人結(jié)腸癌細(xì)胞系黏附于選擇蛋白之上進(jìn)行的。表達(dá)p-選擇蛋白的中國倉鼠卵巢細(xì)胞以及p-選擇蛋白的重組形式支持KM12-L4結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附和滾動，并且這種效應(yīng)被用神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理KM12-L4細(xì)胞所破壞。KM12-L4細(xì)胞通過PSGL-1-獨立型黏附途徑與p-選擇蛋白相互作用。還發(fā)現(xiàn)e-選擇蛋白-IgG嵌合體支持在液流下結(jié)腸癌細(xì)胞的依賴于唾液酸化部分的黏附。因而，在流動條件下唾液酸化部分參與選擇蛋白介導(dǎo)的人癌細(xì)胞黏附到IL-I-刺激的內(nèi)皮上。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)e-選擇蛋白介導(dǎo)的人結(jié)腸癌細(xì)胞結(jié)合到人和小鼠EC上的效力與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力相關(guān)聯(lián)。
最近的研究評估了e-選擇蛋白-唾液酸Lewisx(Slex)/唾液酸Lewisa(Slea)相互作用在介導(dǎo)兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞系，HT-29和COLO 201體外黏附到人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)上中的作用。結(jié)腸癌細(xì)胞系具有糖類表位的強烈表達(dá)并且確證了HT-29和COLO201細(xì)胞與IL-1-刺激的HUVEC的黏附可以被針對e-選擇蛋白的單克隆抗體所抑制。細(xì)胞與針對Slex的兩種不同抗體以及針對Lewis表位，Lex和Lea的抗體的預(yù)先溫育對于黏附并沒有顯著影響。針對Slea的三種抗體在它們抑制HT-29和COLO201細(xì)胞的黏附的能力上不同。因而，Slea表位對于主要由e-選擇蛋白介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附是重要的。
其它研究已經(jīng)證明用腫瘤壞死因子-α(TNF-alpha)預(yù)處理HUVEC增強COLO 205癌細(xì)胞系的結(jié)合。增強的附著與在4hr時發(fā)現(xiàn)的最大腫瘤細(xì)胞附著是濃度和時間依賴型的。這一結(jié)果與內(nèi)皮上黏附分子e-選擇蛋白的表達(dá)提高是一致的。在加入COLO 205之前將TNF-刺激的HUVECs與BBIl，一種抗-e-選擇蛋白mAb一起溫育導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞附著的完全抑制。這些研究確認(rèn)了針對e-選擇蛋白的特異性抗體抑制腫瘤細(xì)胞附著到內(nèi)皮細(xì)胞靶標(biāo)上的用途。其它研究發(fā)現(xiàn)用抗-p-選擇蛋白或抗-L-選擇蛋白單克隆抗體(即，MAb PB 1.3和MAb DREG-200)，或包含唾液酸Lewisx的寡糖(Slex-OS)預(yù)處理在抑制細(xì)胞黏附中是有效的。
利用源自人胰腺癌的SW1990細(xì)胞，類似的體外和體內(nèi)研究已經(jīng)確證的選擇蛋白在轉(zhuǎn)移過程中的作用。SW1990細(xì)胞也強烈地表達(dá)Slea和SLex抗原，CD44H，和β1整聯(lián)蛋白。這些細(xì)胞顯示與IL-1-激活的HUVECS和人腹膜間皮細(xì)胞的結(jié)合活性。通過用針對Slea和針對β1整聯(lián)蛋白的抗體處理抑制導(dǎo)致癌細(xì)胞植入內(nèi)皮細(xì)胞中的黏附。在動物研究中，用針對Slea和β1整聯(lián)蛋白的抗體處理每次都抑制在具有SW1990細(xì)胞的裸鼠中的肝轉(zhuǎn)移的發(fā)展并且延長它們的存活。
本文引用任何文獻(xiàn)并不意味著承認(rèn)這種文獻(xiàn)是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，或關(guān)于本申請的任何權(quán)利要求的可專利性的考慮材料。有關(guān)任何文件的內(nèi)容或日期的任何說明是基于申請時申請人所能獲得的信息，并不構(gòu)成承認(rèn)有關(guān)這種說明的正確性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過向需要其的并未，即未同時接受手術(shù)操作的受試者，或向需要其的未使用任何其它具有抗腫瘤細(xì)胞黏附，抗侵染或抗轉(zhuǎn)移性質(zhì)的化合物的受試者施用有效量的白三烯拮抗劑來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法。
本發(fā)明還提供了抑制腫瘤細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞的以經(jīng)內(nèi)皮遷移形式存在的毛細(xì)管滲透性的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選腫瘤細(xì)胞毛細(xì)管滲透性的抑制劑的方法。
附圖簡述圖1是轉(zhuǎn)移過程的示意圖。
圖2是描述ONO-1078(普侖司特)對于葡聚糖誘導(dǎo)的水腫的作用的圖解。
圖3是當(dāng)測量在膿毒病實驗期間大鼠的CSF變化時套管的位置示意圖。
圖4A和4B是顯示花生四烯酸(3.25μg/2μl)的施用引發(fā)兩個不同個體中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的圖解。圖4A是大鼠#1而圖4B是大鼠#2。
圖5是顯示普侖司特(490mg/kg，i.p.)對于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中由花生四烯酸(3.25μg/2μm)引發(fā)的炎癥的抑制作用的圖解。數(shù)據(jù)獲自四只大鼠。
圖6顯示在作為血腦屏障的部分的星形膠質(zhì)細(xì)胞之間具有其多個溝(由白色箭頭顯示)的中央毛細(xì)血管的外側(cè)表面。這些溝開放以提高毛細(xì)管滲透性并且在白血細(xì)胞和癌細(xì)胞的外滲中發(fā)揮重要作用。
圖7A-7C顯示外滲期間癌細(xì)胞形狀的變化。圖7A和7B是相同的，除了在圖7B中，一些用熒光標(biāo)記PKH67染色的癌細(xì)胞被一些畫出的白線勾畫出，例如，癌細(xì)胞1，2和3。觀察到在圖7B中列出的癌細(xì)胞1和癌細(xì)胞2為從中央毛細(xì)血管出來進(jìn)入CSF中的細(xì)胞的部分。癌細(xì)胞3正在穿過血腦屏障到CSF的中途并且它的形狀還不是方形的?？梢钥吹降暮谏男》綁K是嗜中性粒細(xì)胞，其粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上的p-選擇蛋白，整聯(lián)蛋白，和/或Ig-超家族CAM(細(xì)胞黏附分子)上。癌細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移在花生四烯酸施用到蛛網(wǎng)膜下隙后立即開始。白血細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移在花生四烯酸施用稍后發(fā)生，與癌細(xì)胞相比延遲了。圖7C全面圖示了癌細(xì)胞外觀變平的順序，使得它能夠穿過甚至是血腦屏障的狹窄開口。
圖8是在利用表1中的實驗程序向動物施用蒸餾水-PBS-鹽水之后，腫瘤或白血細(xì)胞(WBC)計數(shù)或CSF體積(μl)的時間作用圖表。
圖9是在將花生四烯酸(816ng/2μl)施用到蛛網(wǎng)膜下隙中后WBC計數(shù)和CSF體積(μl)的時間作用曲線圖。
圖10A-10C是在施用蒸餾水-腫瘤細(xì)胞(i.v.)-花生四烯酸(816ng/2μl)之后在蛛網(wǎng)膜下隙中測量的腫瘤細(xì)胞計數(shù)(圖10A)，CSF體積(圖10B)，和WBC計數(shù)(圖10C)的時間作用曲線圖。
圖11是在施用普侖司特(490mg/kg)-PBS-花生四烯酸(816ng/2μl)之后的腫瘤細(xì)胞計數(shù)的時間作用圖表。
圖12A-12C是對于腫瘤細(xì)胞外滲(圖12A)，花生四烯酸引發(fā)的癌細(xì)胞對CSF體積(μl)的影響(圖12B)，和花生四烯酸引發(fā)的癌細(xì)胞對白血細(xì)胞計數(shù)的影響(圖12C)的在時間作用曲線之下的面積圖。星號代表由ANOVA所分析的統(tǒng)計學(xué)顯著性，其中概率值p＜0.05為顯著的。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，包括向需要其的并未同時進(jìn)行諸如除去腫瘤的外科手術(shù)操作的受試者，或向需要其的未使用任何其它具有抗腫瘤細(xì)胞黏附，抗侵染或抗轉(zhuǎn)移性質(zhì)的化合物，如在美國專利6,492,332中所公開的那些化合物的受試者施用有效量的白三烯C4和D4受體拮抗劑，優(yōu)選普侖司特，或其藥用鹽。
在本文中以常規(guī)醫(yī)學(xué)意義使用術(shù)語″白三烯拮抗劑″來指抑制，阻抑，或減弱或?qū)固烊淮嬖诘陌兹┑囊环N或多種亞型的濃度，活性或效應(yīng)的藥物。白三烯拮抗劑典型地在受體水平上對抗白三烯的作用并且更加優(yōu)選在本文稱作″白三烯C4和D4受體拮抗劑″。
本文所用的術(shù)語″腫瘤″意指經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的塊，其至少部分特征是包含生成血管的血管系統(tǒng)。術(shù)語″腫瘤″寬泛地用來包括腫瘤實質(zhì)細(xì)胞以及支持性基質(zhì)，包括滲透腫瘤實質(zhì)細(xì)胞塊的生成血管性血管。盡管腫瘤通常是惡性腫瘤，即，具有轉(zhuǎn)移能力的癌癥，但腫瘤也可以是非惡性的，前提是新血管形成與腫瘤相關(guān)聯(lián)。本文所指的腫瘤細(xì)胞源自轉(zhuǎn)移性腫瘤。本文所用的術(shù)語″轉(zhuǎn)移″指繼發(fā)性腫瘤，其與原發(fā)腫瘤分離生長并且發(fā)源自分離的，轉(zhuǎn)運的細(xì)胞。
本發(fā)明人先前曾使用白三烯C4和D4受體拮抗劑，特別是，普侖司特研究過炎癥機制。通常，當(dāng)發(fā)生炎癥發(fā)應(yīng)時，各種細(xì)胞因子和其它炎癥介質(zhì)作用于局部血管，并提高內(nèi)皮CAM的表達(dá)。認(rèn)為這些促炎性(pro-inflammatory)細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)激活毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞上的p-選擇蛋白和e-選擇蛋白并且隨后起動白血細(xì)胞外滲過程，其接下來后跟步驟(1)滾動，(2)觸發(fā)，(3)吸住(arrest)/黏附，和(4)經(jīng)內(nèi)皮遷移。
炎癥的過程理解如下1)由傷害性刺激激活的巨噬細(xì)胞在組織中分泌TNF-α，白介素-1β和白介素-6。
2)在毛細(xì)血管中血管內(nèi)皮細(xì)胞通過TNF-α，和白介素-1β提高e-選擇蛋白的表達(dá)，并且通過組胺和凝血酶提高p-選擇蛋白的表達(dá)。
3)循環(huán)性白血細(xì)胞表達(dá)粘蛋白如PSGL-I或四糖唾液酸Lewis和唾液酸Lewisa和唾液酸Lewisx，其結(jié)合e-和p-選擇蛋白。這種結(jié)合介導(dǎo)白血細(xì)胞對血管內(nèi)皮的附著或束縛，讓細(xì)胞在血液流動的方向上滾動(rolling)。盡管在大鼠的中-空腸中p-選擇蛋白和唾液酸Lewis-依賴型變化是由白三烯C4/D4誘導(dǎo)的，白三烯受體拮抗劑并沒有效果。自從那時，就發(fā)展了有效的選擇蛋白抑制劑。
4)隨著白血細(xì)胞滾動，產(chǎn)生了趨化因子(白介素8，MIP-Iα/β，和MCP-I)和PAF，補體裂片(split)(C5a，C3a和C5b67)和各種N-甲酰肽。這些化學(xué)引誘物結(jié)合在白血細(xì)胞膜上的受體促發(fā)了與受體相關(guān)聯(lián)的G-蛋白介導(dǎo)的激活信號。這種信號誘導(dǎo)白血細(xì)胞膜中整聯(lián)蛋白分子的構(gòu)象變化，提高了它們對于內(nèi)皮上免疫球蛋白-超家族黏附分子(觸發(fā)性的)的親和性。
(5)隨后在整聯(lián)蛋白和免疫球蛋白-超家族CAMs之間的相互作用穩(wěn)定了白血細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，使得細(xì)胞能夠牢固地附著到內(nèi)皮細(xì)胞上(吸住/黏附)。
白血細(xì)胞隨后穿過血管壁遷移入組織中。經(jīng)內(nèi)皮遷移的步驟以及它是如何被引導(dǎo)的仍然在很大程度上未知。它們可能是通過白血細(xì)胞表面和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的CD31之間的分子結(jié)合，或通過白血細(xì)胞上的LFA-I和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(經(jīng)內(nèi)皮遷移)上的JAM的結(jié)合進(jìn)行介導(dǎo)的。
因而，白血外滲是由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的分子，趨化因子和黏附分子(選擇蛋白家族，整聯(lián)蛋白家族，和免疫球蛋白-超家族)之間的相互作用引發(fā)的順序反應(yīng)。不過，以前未知白三烯C4和D4在中央毛細(xì)血管的白血細(xì)胞外滲中發(fā)揮任何作用。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)白三烯C4和D4受體拮抗劑，普侖司特競爭性對抗白三烯C4和D4受體并且有效地抑制腦炎癥(中樞炎癥)和膿毒病(全身性炎癥)。
本發(fā)明人以前發(fā)現(xiàn)葡聚糖誘導(dǎo)的大鼠爪部水腫由普侖司特以劑量依賴型的方式抑制。以大約490mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給藥，普侖司特完全抑制葡聚糖誘導(dǎo)的爪部水腫。這提示白三烯C4和D4受體拮抗劑作用于毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中并抑制由葡聚糖誘導(dǎo)的毛細(xì)血管的增加的通透性。
白三烯C4和D4受體拮抗劑普侖司特的作用位點在毛細(xì)血管內(nèi)腔內(nèi)側(cè)(包括毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞)。因為普侖司特并不穿過或僅僅極小量穿過血腦屏障，普侖司特的抗炎效應(yīng)歸因于(提高的)毛細(xì)管滲透性的抑制以及包括白血細(xì)胞黏附到毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上和白血細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移的在毛細(xì)血管內(nèi)腔中的白血細(xì)胞外滲的抑制。因而，普侖司特抑制腦部炎癥，而不會穿過血腦屏障。在提高了血腦屏障通透性的腦部炎癥情況中，血漿中的普侖司特能夠穿過已經(jīng)提高了通透性的血腦屏障并且被遞送到發(fā)炎區(qū)域。
在一般的毛細(xì)血管中，普侖司特的作用位點基本上與中央毛細(xì)血管中的相同，即，普侖司特通過抑制毛細(xì)血管內(nèi)腔中的白血細(xì)胞外滲具有抗炎作用，所述外滲包括白血細(xì)胞黏附到毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，和白血細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移。不過，它可以更加廣泛地分布在外周組織中，因為與中央毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)相比，一般性毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)具有更多的開口，如細(xì)胞內(nèi)裂口，胞飲作用，和窗狀開口。
如下面給出的數(shù)據(jù)所證明的，普侖司特的作用機制在外周以及中樞，在毛細(xì)血管后微靜脈穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞，并且在炎癥過程的第一階段抑制通透性。炎癥反應(yīng)發(fā)生在三個不同的階段，每一個階段顯然是由不同的機制介導(dǎo)的1.急性短暫第一階段-血管舒張和提高的毛細(xì)血管滲透。
2.延遲的亞急性第二階段-白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的滲透(白血細(xì)胞外滲)；和3.慢性增殖第三階段-組織變性和纖維化。
在延遲的亞急性第二階段，有四個連續(xù)的重疊步驟(1)滾動，其中e-和p-選擇蛋白出現(xiàn)在激活的內(nèi)皮細(xì)胞上來通過唾液酸-Lewisx和唾液酸-Lewisa抗原與白細(xì)胞相互作用；(2)激活；(3)吸住/黏附；和(4)經(jīng)內(nèi)皮遷移。e-和p-選擇蛋白在轉(zhuǎn)移過程中還可以與腫瘤細(xì)胞相互作用，如在上面“相關(guān)技術(shù)介紹”部分所討論的。由于本發(fā)明人預(yù)期在炎癥的白血細(xì)胞外滲和轉(zhuǎn)移中的腫瘤(癌)細(xì)胞外滲之間有共同的機制，還可以使用抑制白血細(xì)胞外滲的白三烯拮抗劑，優(yōu)選白三烯C4和D4受體拮抗劑，來抑制在轉(zhuǎn)移過程中的腫瘤細(xì)胞外滲。
白三烯拮抗劑，優(yōu)選白三烯C4和D4受體拮抗劑并且最優(yōu)選普侖司特，可以用在本發(fā)明的方法中來抑制需要其的具有腫瘤的患者，或打算在將來以外科手術(shù)手段去除腫瘤的患者中的腫瘤轉(zhuǎn)移。本發(fā)明還通過引起白三烯拮抗劑接觸內(nèi)皮細(xì)胞以便由此阻抑腫瘤細(xì)胞黏附到接觸白三烯拮抗劑的內(nèi)皮細(xì)胞上和/或抑制腫瘤細(xì)胞以經(jīng)內(nèi)皮遷移形式存在的毛細(xì)管滲透性，來抑制腫瘤細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞，優(yōu)選毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，和/或抑制腫瘤細(xì)胞以經(jīng)內(nèi)皮遷移形式存在的毛細(xì)管滲透性。
用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選的白三烯C4和D4受體拮抗劑包括普侖司特(ONO-1078；Ono Pharmaceutical Company，Osaka，日本)，扎魯司特和孟魯司特或其藥用鹽和/或水合物。普侖司特，孟魯司特，和zalfirluka的化學(xué)結(jié)構(gòu)在下面顯示。
普侖司特 孟魯司特 扎魯司特藥用鹽包括堿金屬如鋰，鈉，鉀，等，堿土金屬如鎂，鈣，等，和鋁。其它合適的白三烯C4和D4受體拮抗劑的非限制性的實例包括化合物，8-[2-(E)-[4-(4-氟苯基)丁基氧]苯基]乙烯基]-4-氧代-2-[5-1H-四唑基]-4H-1-苯并呋喃鈉鹽(MEN-91507；Menarini)，CR-3465(Rottapharm)，KP-496(Kaken Pharmaceutical)，4-[6-乙酰基-3-[3-[(4-乙?；?3-羥基-2-丙基苯基)硫代]丙氧基]-2-丙基苯氧基]丁酸(MN-002；Kyorin Pharmaceutical；美國專利4,985,585)，和(R)-3-甲氧基-4-[1-甲基-5-[N-(2-甲基-4，4，4-三氟丁基)氨基甲?；鵠吲哚-3-基甲基]-N-(2-甲基苯基磺?；?苯甲酰胺(MCC-847；AstraZeneca；EP 531078)。
盡管普侖司特，白三烯C4和D4受體拮抗劑是用于本發(fā)明的方法中的最優(yōu)選的白三烯拮抗劑，在結(jié)構(gòu)上類似于普侖司特并且具有抑制腫瘤細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞和/或抑制毛細(xì)管滲透性以阻止腫瘤細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移的特性的另一組優(yōu)選的白三烯C4和D4受體拮抗劑化合物也包括在本發(fā)明的用途之中。該組優(yōu)選的化合物是具有通式(I)的化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氫，鹵素，羥基，氨基，羧基，硝基，氰基，低級烷基，低級烷氧基，低級烷酰基，低級烷酰氧基，低級烷氧基羰基，單或二低級烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或雜芳基；Q是羧基，低級烷氧基羰基，或tetrazoyl；X是氧、硫或-NR-(其中R是氫或低級烷基)；Z是氫或低級烷基；并且m是1-6的整數(shù)。
在式(I)的化合物中，其中R1，R2，R3，R4和R5是氫，Q是tetrazoyl，X和Y是氧，Z是氫并且m＝4的化合物是如下顯示的普侖司特。

式(I)的化合物的取代基另外如下定義鹵素是氟，氯，溴或碘；在術(shù)語“低級烷基”，″低級烷氧基″，″低級烷氧基羰基″，″單或二低級烷基取代的氨基″中適合的“低級烷基”可以是直鏈或支鏈的諸如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，叔丁基，戊基，已基，異已基，環(huán)丙基，環(huán)丁基，2-甲基環(huán)丙基，環(huán)丙基甲基，環(huán)戊基，環(huán)已基，等；在術(shù)語″低級烷?；逯械倪m合的″低級烷?；搴汀宓图壨轷Ｑ趸蹇梢允侵辨湹幕蛑ф湹幕蛲轷Ｑ趸沫h(huán)，例如，甲?；?，乙?；?，丙?；□；?，異丁?；祯；?，異戊?；?，新戊?；?，已酰基，環(huán)丙基羰基，環(huán)丁基羰基，2-甲基環(huán)丙基羰基，環(huán)已基羰基等；芳烷基是C7-C20的芳烷基原子團(tuán)，例如苯甲基，乙氧苯基，α-甲基苯甲基，二苯甲基三苯甲基，萘基甲基，等；芳基是C6-C14的芳基原子團(tuán)，例如苯基和萘基；和雜芳基是C3-C8的雜芳基并且是包含相同或不同的1-4個N原子，氧原子或硫原子的單環(huán)，多環(huán)或合并的環(huán)，例如，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-喹啉基，3-喹啉基，4-喹啉基，5-喹啉基6-喹啉基，7-喹啉基，8-喹啉基，2-吲哚基，3-吲哚基，4-吲哚基，5-吲哚基，6-吲哚基，7-吲哚基，2-聯(lián)糠酰，3-聯(lián)糠酰，2-tieril，3-tieril，2-吡咯烷基，3-吡咯烷基，2-咪唑基，4-咪唑基，5-咪唑基，2-噁唑基，4-噁唑基，5-噁唑基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，等除了優(yōu)選的白三烯C4和D4受體拮抗劑之外的白三烯拮抗劑/抑制劑的非限制性實例包括四唑衍生物作為白三烯D4和H1拮抗劑(EP0905133 A1)，噻唑基苯并呋喃衍生物(EP 0528337 A1)，喹啉衍生物作為白三烯D4拮抗劑，lipoxinA4和衍生物作為白三烯D4拮抗劑(美國專利5,079,261)，echinacea作為白三烯拮抗劑(WO 99/21007)，16羥甘碳四烯酸(WO 99/59964)的類似物，和抑制5-脂加氧酶的拮抗劑。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)白三烯C4和D4受體拮抗劑普侖司特是安全的(LD50＞2000mg/kg(p.o.)和(s.c.)在大鼠和小鼠二者中)。單次施用普侖司特(30mg/kg，100mg/kg，300mg/kg，1000mg/kg；p.o.)，以及重復(fù)施用普侖司特(30mg/kg/天，100mg/kg/天，300mg/kg/天，1000mg/kg/天；p.o.)持續(xù)三個月和六個月之后，與對照組的那些相比，大鼠顯示正常的行為，體重變化，和食物攝入。單次施用和重復(fù)施用普侖司特的尿檢和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果也是正常的。在施用(p.o.)后一小時達(dá)到普侖司特(以20mg/kg施用)的最大血液濃度并且保持至少5小時。不過，在施用這樣低劑量的普侖司特之后24小時沒有觀察到普侖司特(數(shù)據(jù)來自O(shè)no Pharmaceutical Company)。
如上所述，普侖司特的抗炎作用抑制p-選擇蛋白和/或e-選擇蛋白，內(nèi)皮細(xì)胞上的白細(xì)胞特異性細(xì)胞黏附分子(CAMs)的表達(dá)或?qū)乖诿?xì)血管內(nèi)腔中白血細(xì)胞外滲期間發(fā)揮重要作用的白三烯C4和D4受體。
根據(jù)本發(fā)明的方法，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的白三烯拮抗劑的有效劑量的大小可以隨著要治療的病癥嚴(yán)重性和給藥途徑而變化，所述給藥途徑優(yōu)選是口服的。因此，給藥最優(yōu)選全身給藥。劑量，或許是給藥頻率，也將根據(jù)年齡，體重，和個體患者的反應(yīng)而變化。通常，合適的白三烯拮抗劑口服每日劑量范圍可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易確定。例如，對于目前用于治療哮喘的已知白三烯抑制劑的合適劑量，見Physician′s Desk Reference，54thEdition，Medical Economics Company Inc.(2000)。對于白三烯C4和D4受體拮抗劑，可以適當(dāng)?shù)剡x擇口服每日劑量范圍。具體地對于普侖司特來說，可接受的劑量優(yōu)選100mg/天-2000mg/天，更加優(yōu)選200mg/天-1000mg/天，最優(yōu)選400mg/天-800mg/天。對于孟魯司特來說，劑量范圍優(yōu)選5mg/天-100mg/天，更加優(yōu)選5mg/天-50mg/天，最優(yōu)選10mg/天-20mg/天。對于扎魯司特來說，劑量范圍優(yōu)選10mg/天-300mg/天，更加優(yōu)選20mg/天-150mg/天，最優(yōu)選40mg/天-80mg/天。
另外推薦兒童，年齡65歲或更大的患者，以及有腎或肝功能損害的患者一開始接受低劑量，并且隨后基于個體反應(yīng)或血液中的劑量水平來逐步提高用量。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯而易見，在一些情況下使用這些范圍之外的劑量可能是必需的。另外，將要理解的是臨床醫(yī)師或治療醫(yī)師結(jié)合個體患者反應(yīng)將會知道如何以及何時調(diào)節(jié)，中斷，或終止治療。
對于大多數(shù)當(dāng)前已有的白三烯拮抗劑來說，目前最常用的劑型是口服劑型，因為需要溶于胃酸。劑型可以包括片劑，藥片，膠囊，軟膠囊，錠劑等。由于它們施用的便易性，片劑和膠囊代表了最有利的口服劑量單位形式，其中采用固體藥物載體。在患者無意識的情況下，給藥可以優(yōu)選通過向胃中加套管。如果需要，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的水性或非水性技術(shù)給片劑加包衣。至少一種當(dāng)前已有的白三烯C4和D4受體拮抗劑，即，順爾寧(孟魯司特)，可以進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。給藥可以一天進(jìn)行一次。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選毛細(xì)管滲透性抑制劑的方法，其中抑制腫瘤細(xì)胞由毛細(xì)血管到腦脊髓液的經(jīng)內(nèi)皮遷移。這種篩選方法包括首先向非人哺乳動物如大鼠，小鼠，沙鼠，狗，貓，兔，猴等施用可能的候選抑制劑化合物，短時間之后向非人哺乳動物靜脈內(nèi)施用腫瘤細(xì)胞，以及后來通過穿過腦硬腦膜實質(zhì)的套管向非人哺乳動物蛛網(wǎng)膜下隙施用引發(fā)毛細(xì)管滲透性提高的炎癥誘導(dǎo)劑。施用炎癥誘導(dǎo)劑后，收集腦脊髓液并將收集白蛛網(wǎng)膜下隙的從毛細(xì)血管中外滲入腦脊髓液中的腫瘤細(xì)胞量與對照相比較，所述對照沒有施用可能的抑制劑化合物，以確定可能的抑制劑化合物是否是腫瘤細(xì)胞毛細(xì)管滲透性的抑制劑。這種方法任選地包括測量收集的腦脊髓液的量(體積)，其中收集的腦脊髓液體積越大，毛細(xì)血管越有浸透性。優(yōu)選的非人哺乳動物是大鼠。
炎癥誘導(dǎo)劑的實例包括花生四烯酸，前列腺素，血栓烷，組胺，酵母，LPS，葡聚糖，緩激肽，角叉藻聚糖，白三烯，TNF-α，白介素-1β或白介素-6。其中，優(yōu)選低分子量化合物如花生四烯酸。
向非人動物施用潛在候選抑制劑化合物的方法并不特別受限，并且考慮例如，潛在候選抑制劑化合物的化學(xué)特性(如脂溶性等)，可以適當(dāng)?shù)剡x自已知的給藥方法，如口服給藥，皮下給藥，腹膜內(nèi)給藥，靜脈內(nèi)給藥，肌內(nèi)給藥，鼻(滴鼻劑)給藥，吸入，舌下給藥，栓劑給藥等。評估潛在候選抑制劑化合物是否能夠作用于覆蓋在毛細(xì)血管內(nèi)腔上的內(nèi)皮細(xì)胞以抑制提高的毛細(xì)管滲透性，并且通過測量腫瘤細(xì)胞計數(shù)和/或收集的腦脊髓液的量可以指導(dǎo)腫瘤細(xì)胞從毛細(xì)血管滲透到組織中。不過，優(yōu)選將腦脊髓液中的腫瘤細(xì)胞計數(shù)與腦脊髓液的量一起測量。此外，優(yōu)選隨時間收集腦脊髓液，例如，每30分鐘或一小時，并且相對于對照(沒有施用潛在候選抑制劑化合物)評估所述值。當(dāng)施用潛在候選抑制劑化合物抑制腦脊髓液的外滲并抑制如在對照中觀察到的腦脊髓液中白血細(xì)胞的存在時，則潛在候選抑制劑化合物可以被視為提高毛細(xì)管滲透性(特別是以腫瘤細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移形式)的抑制劑并且當(dāng)在導(dǎo)入炎癥誘導(dǎo)劑之前施用抑制劑化合物時，可以用作抑制提高的毛細(xì)管滲透性的預(yù)防劑。
現(xiàn)在已經(jīng)一般性介紹了本發(fā)明，通過參照下列實施例可以更加容易地理解它，所述實施例是通過例示的方式提供的并且并不意欲成為本發(fā)明的限制。給出實施例1-4以顯示白三烯C4和D4受體拮抗劑的抗炎效應(yīng)的作用模式是歸因于它的抑制毛細(xì)管滲透性的提高以及毛細(xì)血管內(nèi)腔中白血細(xì)胞外滲的能力，所述毛細(xì)血管內(nèi)腔包括毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。
實施例實施例1外周研究本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)葡聚糖誘導(dǎo)的大鼠爪部水腫由普侖司特以劑量依賴型的方式抑制。以大約490mg/kg的劑量，腹內(nèi)給藥普侖司特完全抑制葡聚糖誘導(dǎo)的爪部水腫(圖2)。
這提示LT拮抗劑可以作用于外周毛細(xì)血管中的內(nèi)皮細(xì)胞上并抑制由葡聚糖誘導(dǎo)的毛細(xì)血管通透性提高。盡管在毛細(xì)血管里內(nèi)皮細(xì)胞之間有許多開口如裂隙，窗狀開口和胞飲囊泡，普侖司特抑制毛細(xì)血管的通透性。由于腦毛細(xì)血管里的內(nèi)皮細(xì)胞因為緊密連接的存在而比其它毛細(xì)血管具有更少的開口，普侖司特可以比抑制一般性毛細(xì)血管的通透性更有效地抑制腦毛細(xì)血管的通透性。所以，預(yù)計這種機制也可以在CNS水平上發(fā)揮作用。
實施例2測量炎癥過程中的變化的測量為了研究白三烯拮抗劑在治療炎癥中的作用，發(fā)展了一種敏感和定量的方法來測量中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥。可以隨著時間監(jiān)測炎癥過程中的重要變化，因為由花生四烯酸引發(fā)的血腦屏障(BBB)的通透性和白血細(xì)胞(WBC)滲透到腦脊髓液(CSF)中都可以由相同的實驗動物進(jìn)行測量。特別地，利用這種方法研究白三烯C4和D4拮抗劑，普侖司特的作用。觀察到在炎癥過程中BBB的通透性以及由施用花生四烯酸作為傷害性刺激引發(fā)的白血細(xì)胞(WBC)的滲透的變化。
材料和方法以50mg/kg的劑量戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)(i.p.)麻醉雄性大鼠，大約350-400g。隨后將動物置于立體定位裝置中。剃刮從頭到頸的頂部的毛。用70％乙醇然后用10％providone-碘溶液對研究區(qū)域消毒。切開頸索上的皮膚和肌肉直到暴露頸椎。利用23G3/4針經(jīng)由小腦延髓池穿過硬腦膜制造一個孔。將2-3mm PE10套管(0.011″I.D.，0.007″厚，0.024″O.D.，6.5cm長)的一端插入頸索上的蛛網(wǎng)膜下隙從而避免損傷神經(jīng)組織(圖3)。用氰基丙烯酸膠將套管固定到外周組織上。用PE10的另一端來施用傷害性刺激，如花生四烯酸(AA；3.25μg/2μl)，并且隨后在11小時的實驗期間此后每三十分鐘收集腦脊髓液(CSF)。在插入套管后所述套管立即充滿了CSF。
灌注空氣以便將AA注入蛛網(wǎng)膜下隙。用外科手術(shù)針縫合肌肉和皮膚。隨后將大鼠從立體定位裝置上移除并放在加熱墊上，持續(xù)監(jiān)測。
在相互作用研究中，在施用花生四烯酸(AA)前三十分鐘，施用白三烯C4和D4拮抗劑，普侖司特(490mg/kg，i.p.)。如果麻醉的效應(yīng)看起來減弱了，則施用另外的0.05-0.1ml戊巴比妥(50mg/ml，i.p.)劑量。如果在實驗期間任何時候，動物看起來疼痛或痛苦，立即停止研究并將動物安樂死。
在實驗后，通過在化學(xué)通風(fēng)櫥中于密封的瓶中暴露于高濃度的氟烷氣體而將動物安樂死。
結(jié)果在向蛛網(wǎng)膜下隙施用花生四烯酸(3.25μg/2μl)后CSF的體積立即增加。CSF體積在3.5小時內(nèi)達(dá)到峰值(圖4A和圖4B)。在施用AA后4-5小時，它逐漸降低，但是觀察到它在11個小時的觀察期間于這一劑量水平上保持持續(xù)的水平。
在最初30分鐘內(nèi)未見到WBC滲透，這可能暗示了腦炎的急性短暫階段，但是隨后開始緩慢增強(圖4A和4B)。此后總的WBC計數(shù)和CSF的體積的變化平行起落。這提示延遲的亞急性階段，最大的特征是白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的滲透。在對照動物中既沒有觀察到提高的CSF也沒有觀察到提高的WBC計數(shù)。這是正常的狀態(tài)，因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的壓力極低(6-10mm Hg)并且在CSF中通常沒有WBCs。
在AA施用(3.25μg/2μl)前三十分鐘用白三烯C4和D4受體拮抗劑，普侖司特(490mg/kg i.p.)進(jìn)行預(yù)處理完全抑制了CSF體積的提高(n＝4)(圖5)。這顯示普侖司特阻抑腦毛細(xì)血管中內(nèi)皮細(xì)胞通透性，以及白血細(xì)胞滲透的提高。
實施例3.白三烯受體拮抗劑，普侖司特的效應(yīng)的研究在炎癥期間評估腦毛細(xì)血管中內(nèi)皮細(xì)胞通透性，以及白血細(xì)胞滲透的提高利用上述方法，有可能在相同動物中測量隨著時間通透性的變化。沒有其它方法能夠利用這種相同動物隨時間測量炎癥，并且作為結(jié)果，必須在某一時期處死至少四只動物(以取得統(tǒng)計學(xué)顯著性)。例如，如果必須在10小時內(nèi)每30分鐘研究炎癥的過程(每30分鐘n＝4)，那么將需要處死80只大鼠。注意到這種方法不僅提供了關(guān)于腦毛細(xì)血管通透性變化，還關(guān)于WBC滲透入CNS中的變化的信息是重要的。
為了利用這種方法獲得WBC滲透入CNS中的數(shù)據(jù)，只需要四只大鼠，避免了不同時期在個體動物之間的差異。只有這種方法可以定量地測量腦毛細(xì)血管的通透性，以及WBC滲透入CNS，并且可以提供炎癥過程的更加完全的描繪。
在本研究中，由同一大鼠在11小時內(nèi)每30分鐘測量腦脊髓液(CSF)的體積(μl)和CSF中白血細(xì)胞(WBC)計數(shù)。在戊巴比妥麻醉下將套管(PE10)的一側(cè)插入蛛網(wǎng)膜下隙，避免了神經(jīng)損傷(圖3)。如果腦組織受到損傷，則CSF的體積和WBC立即升高，而無需施用花生四烯酸。由于在正常大鼠的CSF中沒有WBC，只使用在插入套管后即刻在CSF中沒有WBC的大鼠。套管的另一側(cè)保持開放并且用于施用傷害性刺激(花生四烯酸，LPS，葡聚糖，等)并隨后在實驗過程中每30分鐘收集CSF。利用微量吸液管測量CSF體積并通過血球計的方法計數(shù)CSF中的WBC。
花生四烯酸(3.2μg/2μl)在施用后立即提高了CSF體積，其中在3.5小時內(nèi)達(dá)到最大體積100-120μl。盡管此后體積減小，但在施用后4.0-5.0小時期間每30分鐘保持60-80μl的CSF體積。在施用花生四烯酸的最初三十分鐘不能檢測WBC，但是隨后觀察到逐漸升高。WBC的升高或降低后接著CSF體積隨著時間的變化。
在將花生四烯酸應(yīng)用到蛛網(wǎng)膜下隙中之前三十分鐘腹膜內(nèi)施用普侖司特(490mg/kg)。普侖司特完全抑制了CSF體積和腦毛細(xì)血管通透性的提高，其標(biāo)志是WBC滲透。
該方法表征了如上所述的第一和第二炎癥階段，特征為局部血管舒張和毛細(xì)管滲透性提高的急性短暫階段(第一階段)和延遲的亞急性階段，其最主要的特征為白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的滲透(第二階段)。
不像具有裂口，窗狀開口和突出的胞飲囊泡的一般性毛細(xì)血管，腦毛細(xì)血管具有胞飲囊泡的相對缺失，線粒體數(shù)目的極大提高，和毛細(xì)血管中緊密連接的存在。已知白三烯受體拮抗劑以極小的水平穿過BBB，如果有的話。這些研究的發(fā)現(xiàn)提示白三烯受體拮抗劑在外周抑制腦毛細(xì)血管中內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。內(nèi)皮細(xì)胞彼此緊密并列并形成緊密連接。與一般性毛細(xì)血管上的內(nèi)皮細(xì)胞相比，在“內(nèi)側(cè)”腦毛細(xì)血管上的這些內(nèi)皮細(xì)胞不太可能滲漏，因為一般性毛細(xì)血管具有裂口通道，窗狀開口和突出的胞飲囊泡。
通過白三烯C4和D4受體拮抗劑治療腦炎癥可能歸因于在毛細(xì)血管內(nèi)腔和BBB之間的內(nèi)皮細(xì)胞的通透性的外周抑制。所以，這種降低腦毛細(xì)管滲透性和抑制WBC滲透入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能力在治療上可能比能夠穿過BBB或打開BBB以便讓藥物接近腦炎的藥物更加重要。一旦打開，BBB通透性將提高并有助于形成腦水腫，因為腦毛細(xì)血管的壓力高于顱內(nèi)壓。另外，血液成分滲透到中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡化了腦炎癥。
這些方法提供了如下的新發(fā)現(xiàn)(1)通過這些方法可以隨著時間定量測量炎癥過程(階段1和階段2)；和(2)普侖司特也抑制二次腦損傷。
實施例4普侖司特和其它抗炎藥物對于大鼠中外傷性腦損傷模型的影響已經(jīng)發(fā)現(xiàn)普侖司特的預(yù)處理導(dǎo)致大鼠局部缺血模型的更長存活，所述模型利用可逆的兩側(cè)頸動脈的30分鐘閉塞后接再灌注。當(dāng)在閉塞之前30分鐘施用普侖司特(450mg/kg i.p.)時4-5只大鼠的其中之一存活一周。
此外，通過在未經(jīng)閹割的狗(intact dog)中，用普侖司特預(yù)處理(以三種不同的劑量施用)來抑制由白介素-6引發(fā)的WBC向CSF的增加的滲透。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)白三烯C4和D4拮抗劑，普侖司特(450mg/kg.i.p.)完全抑制由花生四烯酸(3.25μg/2μl)導(dǎo)致的炎癥。這種炎癥是BBB的增加的通透性和WBC向CSF的增加的滲透的基礎(chǔ)。因此，白三烯C4和D4拮抗劑(普侖司特)有效用于治療炎癥。
實施例5在大鼠中對轉(zhuǎn)移的抑制的體內(nèi)研究在用在該研究中的實驗?zāi)Ｐ椭?，測量通過套管從來自蛛網(wǎng)膜下隙的CSF，白血細(xì)胞和癌細(xì)胞的體積。該實驗?zāi)Ｐ统洚?dāng)轉(zhuǎn)移的新的實驗?zāi)Ｐ汀?br> 為了測試對于轉(zhuǎn)移的抑制，在靜脈內(nèi)注射癌細(xì)胞之前，口服施用普侖司特(取代如在實施例2中進(jìn)行的腹膜內(nèi)抑制)。接著，在普侖司特施用后2小時，接著將花生四烯酸(AA)施用到蛛網(wǎng)膜下隙。每30分鐘測量CSF的體積，在CSF中的白血細(xì)胞計數(shù)和癌細(xì)胞計數(shù)。使用這種新的轉(zhuǎn)移實驗?zāi)Ｐ?，在CSF中癌細(xì)胞的不存在證實普侖司特抑制轉(zhuǎn)移。
材料和方法細(xì)胞和培養(yǎng)條件培養(yǎng)的人癌細(xì)胞系，Colo 201(結(jié)腸癌)和MKN74(肺癌)，和培養(yǎng)的大鼠癌細(xì)胞系RCN9購自Health Science Research Resources Bank(Rinku-minamihama 2-11，Sennan-shi，Osaka，590-0535，Japan)。人肺癌細(xì)胞系QG56由Dr.Yukito Ichinose，Department of Laboratory Medicine，KyusyuCancer Center，Hukuoka，Japan惠贈。將細(xì)胞在37℃和5％CO2，培養(yǎng)于添加了5％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，100單位青霉素，100μg/ml鏈霉素(Gibco Invitrogen Corp.，Grand Island，N.Y.，USA)的RPMI-1640(SIGMA，MO，USA)中。
動物RCN-9，一種來自Fisher 344雄性大鼠(體重400±50g)的結(jié)腸癌細(xì)胞系和Fisher 344雄性大鼠購自Sankyou Lab-Service Co。
化學(xué)品戊巴比妥鈉(Nembutal注射劑)，一種Abbott Laboratories(Abbott Park，IL，USA)的產(chǎn)物，和PKH67綠色熒光細(xì)胞連接試劑盒，一種Zynaxis CellScience Inc的產(chǎn)物購自Dainippon Pharmaceutical Co.(Osaka，Japan)。來自豬肝的花生四烯酸(鈉鹽)獲自Calbiochem(San Diego，CA，USA)。包含112.5mg/膠囊的普侖司特購自O(shè)no Pharmaceutical Co.(Osaka，Japan)。
雜由Natsume Seisakusyo Co.，供應(yīng)的聚乙烯管(SP10，I.D.0.28mm，O.D.0.61mm)，肝素鈉(5000單位/5ml)購自Shimizu Pharmaceutical Co.。
形態(tài)學(xué)研究用PKH連接試劑盒對癌細(xì)胞進(jìn)行染色。在體外研究中，使用熒光顯微鏡(Axiovert S 100；Zeiss)的癌細(xì)胞的形態(tài)外觀與用光學(xué)顯微鏡(OlympusCX21-22S-D)的癌細(xì)胞的形態(tài)外觀進(jìn)行比較。放大是63×0.5×215/11。
用戊巴比妥鈉(50mg/kg i.p.)對大鼠進(jìn)行麻醉。無論動物何時從麻醉中恢復(fù)(如果動物顯示任何種類的自發(fā)移動)，在實驗階段中，逐漸施用另外的戊巴比妥鈉來保持深度麻醉。
暴露股靜脈并且插入填充了0.002％的在鹽水中的肝素的聚乙烯管。聚乙烯管的另一端與三路活栓閥連接以進(jìn)行癌細(xì)胞的靜脈內(nèi)注射。接著，將動物置于立體定位裝置(由Narishige Scientific Instrument Lab生產(chǎn)的SRS-6型)中。剃刮從頭到頸的頂部的毛。用70％的乙醇對研究區(qū)域進(jìn)行消毒。暴露在頸椎上的皮膚和肌肉。使用18Gxl 1/2針，通過小腦延髓池穿過硬腦膜造成一個洞。將SP10管(5-6cm長)的一端(2-3mm)插入蛛網(wǎng)膜下隙。用氰基丙烯酸膠粘劑將套管固定于外周組織。使用SP10管的另一端來施用花生四烯酸(8.16ng/2μl鹽水)并且隨后每30分鐘收集腦脊髓液(CSF)，在體內(nèi)形態(tài)學(xué)研究中進(jìn)行1-2小時并且在相互作用研究中進(jìn)行8小時。
相互作用研究下面，設(shè)計這種研究來闡明普侖司特，白三烯C4和D4受體拮抗劑是否抑制腫瘤細(xì)胞從毛細(xì)血管外滲。
制備因為Onon的膠囊包含112.5mg的普侖司特，在口服施用前，立即用電動混合器將來自兩個膠囊的粉末攪拌在2.295ml的去離子水中。普侖司特的施用體積是5ml/kg(劑量＝490mg/kg)。
使用PBS將癌細(xì)胞的數(shù)量制備成在每只大鼠中嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量的1/100。因為體重(400±50g)，癌細(xì)胞的數(shù)量在1.88×104和2.43×104之間，并且將對于每只大鼠施用的癌細(xì)胞的體積調(diào)整為1ml。
將花生四烯酸溶解在鹽水中，并且每只大鼠施用816.25ng/2μl。
如下施用三種不同的處理；第一次處理是普侖司特(490mg/kg p.o.)或去離子水(p.o.)。
第二次處理是用癌細(xì)胞或PBS。
第三次處理是用花生四烯酸或鹽水。
第一次處理在花生四烯酸前2小時施用。第二次處理(癌細(xì)胞i.v.)在花生四烯酸前2-3分鐘施用。在第一次處理和第二次處理之間，將到股靜脈和到蛛網(wǎng)膜下隙的兩個套管插入在每只動物中。
在下面的表1中顯示實驗計劃。表的右側(cè)的數(shù)量對應(yīng)于表示結(jié)果的圖的數(shù)量。每組使用四只大鼠。
表1
測量在第三次處理后，測量CSF的體積(μl)，WBC計數(shù)和癌細(xì)胞計數(shù)，進(jìn)行8小時。
對于每只動物，計算在花生四烯酸后8小時的時間作用曲線下的面積并且使用非參數(shù)測試，Mann-Whiteney U-測試來分析普侖司特(490mg/kg)對腫瘤細(xì)胞計數(shù)，白血細(xì)胞計數(shù)和CSF的抑制作用，普侖司特(490mg/kg)完全抑制(面積為0)。為了分析作為外源物質(zhì)的人癌細(xì)胞是否影響大鼠中的免疫系統(tǒng)，使用在時間作用曲線下的面積和變量分析(Dunnet)，將每個參數(shù)，即白血細(xì)胞計數(shù)，腫瘤細(xì)胞計數(shù)和CSF體積分別與大鼠癌細(xì)胞(RCN9)與COLO201，MKN74，和QG56的相應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行比較。概率值p＜0.05是顯著的。
結(jié)果形態(tài)學(xué)研究在腦的中樞毛細(xì)血管的表面，存在充當(dāng)血腦屏障的許多溝(圖6)。白血細(xì)胞，以及癌細(xì)胞能夠來自血腦屏障的這些開口。
在體外研究中，在所有的癌細(xì)胞，即Colo201，MKN74，QG56，和RCN9中，可以通過細(xì)胞膜觀察到染色體。然而，在體內(nèi)研究中施用花生四烯酸后，在從毛細(xì)血管轉(zhuǎn)移到組織中后(在CSF的情況中)，那些細(xì)胞并沒有顯示任何染色體。在外滲過程中，癌細(xì)胞的形狀從球形改變?yōu)槠椒叫?圖7A-7C)。癌細(xì)胞在花生四烯酸處理后立即遷移，隨后是白血細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。還觀察到白血細(xì)胞在它們附著在毛細(xì)血管上，但不是在經(jīng)內(nèi)皮遷移后具有正方形(圖7A-7C)。如在圖7C中所顯示，似乎在開始它們的經(jīng)內(nèi)皮遷移之前，癌細(xì)胞黏附于在內(nèi)皮細(xì)胞上的CAM。這種現(xiàn)象可能對于癌細(xì)胞與對于白血細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞)是相同的，如通過附著于CAM或內(nèi)皮細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞的正方形所觀察到的(圖7A和7B)。存在四個粘著位點，給出正方形外觀。
相互作用研究無論是蒸餾水，PBS還是鹽水(蒸餾水-PBS-鹽水)都不具有任何效果(圖8)。盡管癌細(xì)胞存在于血管中，在沒有用花生四烯酸處理的情況下，在毛細(xì)管滲透性或在白血細(xì)胞或癌細(xì)胞，即，Colo201(蒸餾水-Colo201-鹽水)，MKN74(蒸餾水-MKN74-鹽水)，QG56(蒸餾水-QG56-鹽水)和RCN9(蒸餾水-RCN9-鹽水)的轉(zhuǎn)移中沒有發(fā)生增加，其中癌細(xì)胞被施用來取代PBS，但是具有在圖8中顯示的與PBS相同的反應(yīng)(沒有影響)。
毛細(xì)管滲透性在花生四烯酸后立即增加并且白血細(xì)胞的外滲在花生四烯酸處理(蒸餾水-PBS-花生四烯酸；圖9)后30分鐘立即開始。在8小時的觀察階段中觀察到這些現(xiàn)象，并且在時間作用曲線下的面積與對照的毛細(xì)管滲透性比較具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性(蒸餾水-PBS-鹽水)。
蒸餾水-Colo201-花生四烯酸；蒸餾水-MKN74-花生四烯酸；蒸餾水-QG56-花生四烯酸；和蒸餾水-RCN9-花生四烯酸的施用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞外滲(圖10A)，毛細(xì)管滲透性(圖10B)，和白血細(xì)胞(圖10C)的增加。
關(guān)于普侖司特本身，不存在任何作用。所述圖表與圖8相同，除了普侖司特取代蒸餾水。當(dāng)癌細(xì)胞在沒有花生四烯酸的情況下存在于血管中時，即普侖司特-Colo201-鹽水，普侖司特-MKN74-鹽水，普侖司特-QG56-鹽水，和普侖司特-RCN9-鹽水，普侖司特也不具有任何作用(與在圖8的圖表中相同的反應(yīng))。
然而，普侖司特的施用抑制由花生四烯酸的施用引發(fā)的增加的毛細(xì)管滲透性和白血細(xì)胞的外滲(圖11)。此外，當(dāng)存在腫瘤細(xì)胞時，普侖司特在施用花生四烯酸后，不僅明顯地抑制增加的毛細(xì)管滲透性，還抑制腫瘤細(xì)胞的外滲，即，Colo201(普侖司特-Colo201-花生四烯酸)，MKN74(普侖司特-MKN74-花生四烯酸)QG56(普侖司特-QG56-花生四烯酸)和RCN9(普侖司特-RCN9-花生四烯酸)，它們都顯示如在圖11中的反應(yīng)。
分析三種人癌細(xì)胞作為外源物質(zhì)對大鼠免疫系統(tǒng)的影響。分析RCN9關(guān)于腫瘤細(xì)胞外滲(圖12A)，CSF體積(圖12B)和WBC計數(shù)(圖12C)的結(jié)果，并且與來自Colo201(蒸餾水-Colo201-花生四烯酸)，MKN74(蒸餾水-MKN74-花生四烯酸)和QG56(蒸餾水-QG56-花生四烯酸)的結(jié)果進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)Colo201癌細(xì)胞而不是其它兩種類型的癌細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移與RCN9的經(jīng)內(nèi)皮遷移比較具有顯著的增加(圖12A)。然而，沒有觀察到關(guān)于RCN9(蒸餾水-RCN9-花生四烯酸)獲得的增加的毛細(xì)管滲透性和白血細(xì)胞計數(shù)分別與關(guān)于Colo201(蒸餾水-Colo201-花生四烯酸)，MKN74(蒸餾水-MKN74-花生四烯酸)和QG56(蒸餾水-QG56-花生四烯酸)獲得的那些具有顯著不同(圖12B和12C)。在MKN74(蒸餾水-MKN74-花生四烯酸)的情況中，與無癌細(xì)胞情況下的白血細(xì)胞的外滲(蒸餾水-PBS-花生四烯酸；圖9)相比，更早的觀察到白血細(xì)胞的外滲(在花生四烯酸后的30分鐘內(nèi)；圖10C)。
討論普侖司特，一種白三烯C4和D4受體拮抗劑，不穿過血腦屏障抑制了毛細(xì)管滲透性和白血細(xì)胞的外滲。這顯示普侖司特的作用方式是外周的并且來自包括內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)腔的血管的內(nèi)部。
形態(tài)學(xué)研究顯示兩種腫瘤細(xì)胞和白血細(xì)胞通過在中樞毛細(xì)血管中的血腦屏障的開口遷移和通過介于外周毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞之間的開口遷移。
癌細(xì)胞改變它們形狀，諸如形成纖細(xì)形狀和方形的形狀的能力對于它們從毛細(xì)血管向組織中的轉(zhuǎn)移是有益的。癌細(xì)胞的纖細(xì)形狀可以容易地通過開口，甚至即使所述開口實際上很窄，因為平伸的癌細(xì)胞的內(nèi)方角在起始通過窄開口的經(jīng)內(nèi)皮遷移中是有利的。
普侖司特抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的原理可能是由于保持所述開口閉合。事實上，在圖7A和7B中的觀察顯示，與仍舊附著于內(nèi)皮細(xì)胞的白血細(xì)胞相比，癌細(xì)胞開始遷移得更早。白血細(xì)胞開始外滲的起始時間可能被一些腫瘤細(xì)胞的存在所影響，如在本研究中的MKN74(圖10C)。
在本研究中，使用三種不同種類的人癌細(xì)胞和一種大鼠癌細(xì)胞。觀察到所有的四種不同的癌細(xì)胞從毛細(xì)血管的外滲，其中在8小時的人癌細(xì)胞Colo201的計數(shù)(＝面積)顯著增加，而其它兩種人癌細(xì)胞，即，MKN74和QG56的計數(shù)與RCN9沒有明顯不同。
由大鼠癌細(xì)胞(RCN9)獲得的增加的毛細(xì)管滲透性和增加的白血細(xì)胞計數(shù)與關(guān)于其它三種人腫瘤細(xì)胞獲得的毛細(xì)管滲透性和白血細(xì)胞計數(shù)相比，沒有明顯不同。這顯示作為外源物質(zhì)的人癌細(xì)胞可能僅對大鼠的免疫系統(tǒng)具有極少影響。然而，關(guān)于與在無MKN74(蒸餾水-PBS-花生四烯酸)情況下的起始時間相比，在存在MKN74(蒸餾水-MKN74-花生四烯酸；圖10C)的情況下，白血細(xì)胞的外滲的起始時間間隔縮短，在用花生四烯酸處理后毛細(xì)管滲透性立即增加和在花生四烯酸后30分鐘白血細(xì)胞的外滲的開始，圖9，提示對大鼠免疫系統(tǒng)的一些影響。這種縮短的時間間隔可能是受MKN74的外滲影響，其可能在血腦屏障中造成足夠大的開口以起始白血細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移。然而，分析在8小時內(nèi)如通過測量在時間作用曲線下的面積所顯示的總的效果，并未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性(圖12C)。
將套管插入靜脈中以將腫瘤細(xì)胞施用到血管中或施用到蛛網(wǎng)膜下隙中從而獲得從中樞毛細(xì)血管遷移的樣品諸如腫瘤細(xì)胞提供了研究肝腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方式。就目前所知，不存在位點諸如蛛網(wǎng)膜下隙，其中可以計數(shù)從毛細(xì)血管中遷移出來的白血細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。
已知癌細(xì)胞和白血細(xì)胞的表面被唾液酸Lewis所覆蓋，所述唾液酸Lewis是一種糖蛋白，其在物種之間具有差異，并且是對于內(nèi)皮細(xì)胞上的p-選擇蛋白和e-選擇蛋白的配體。因為在人癌細(xì)胞中的唾液酸Lewis可能不識別在內(nèi)皮細(xì)胞上的這些選擇蛋白，認(rèn)為人癌細(xì)胞可能不附著于內(nèi)皮細(xì)胞，并且因此，癌細(xì)胞難以遷移穿過毛細(xì)血管。
在本研究中，在用花生四烯酸處理后，對于所有的三種人癌細(xì)胞觀察到經(jīng)內(nèi)皮遷移，并且所述經(jīng)內(nèi)皮遷移通過在大鼠中用普侖司特預(yù)處理后被抑制。因此，可以研究人腫瘤細(xì)胞在大鼠中的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。
作為結(jié)論，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)1)普侖司特由于抑制毛細(xì)血管通透性而抑制了腫瘤細(xì)胞和白血細(xì)胞的外滲。
2)普侖司特由于其安全性和延長的作用而被用作抗-腫瘤轉(zhuǎn)移劑/藥物。
3)對于抗-癌轉(zhuǎn)移，抑制增加的毛細(xì)管滲透性是基本的。
4)因為人癌細(xì)胞可以從大鼠毛細(xì)血管遷移到組織中，可以將該動物模型用作藥物的抗-癌轉(zhuǎn)移性質(zhì)的測定。
現(xiàn)在已經(jīng)充分描述了本發(fā)明，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提和無過度實驗下，在較寬范圍的等價參數(shù)、濃度和條件范圍內(nèi)進(jìn)行相同的發(fā)明操作。
盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其具體的實施方案進(jìn)行了描述，要理解的是其可以作出進(jìn)一步的修改。本申請意欲包括任何改變，應(yīng)用或修改，它們通常遵循本發(fā)明的原理，并且包括與本發(fā)明公開內(nèi)容不同的這樣的改變，如來自與本發(fā)明領(lǐng)域相關(guān)的已知或習(xí)慣實踐，并且可以應(yīng)用于在后附的權(quán)利要求范圍內(nèi)提出的上文的必要技術(shù)特征。
將本文引用的所有的參考文獻(xiàn)，包括定期刊物文章或摘要，公開的或相應(yīng)的美國或外國專利申請，授權(quán)的美國或外國專利，或任何其它參考文獻(xiàn)完全并入本文作為參考，在引用的文獻(xiàn)中包括所有的數(shù)據(jù)、表、圖和正文。此外，在本文引用的參考文獻(xiàn)中引用的參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容也被并入本文作為參考。
對已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知的方法或常規(guī)方法的參考決不以任何方式承認(rèn)本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵤┓桨冈谙嚓P(guān)領(lǐng)域中被公開、教導(dǎo)或提示。
前述具體實施方案的描述是這樣充分地揭示了本發(fā)明的一般性質(zhì)，從而使其它人可以通過應(yīng)用本領(lǐng)域中的知識(包括本文引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)在不背離本發(fā)明的一般概念和不需過度實驗的情況下，容易地改進(jìn)和/或修改這些具體實施方案的各種應(yīng)用。因此，這些修改和改進(jìn)意欲基于本文提出的教導(dǎo)和指導(dǎo)，在公開的實施方案的等價物的含義和范圍內(nèi)。要理解的是，本文的措詞或術(shù)語是出于描述的目的而不進(jìn)行限制，因此本說明書的術(shù)語或措詞將由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文提出的教導(dǎo)和指導(dǎo)，結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識來解釋。
因此，如可以在上面的說明書和/或在下面的權(quán)利要求中發(fā)現(xiàn)的，后接功能陳述的表示方式“用來...的手段/方法(means to)”和“用來...的方式(means for)”或任何方法步驟語言意欲定義和覆蓋任何結(jié)合、物理、化學(xué)或電學(xué)組件或結(jié)構(gòu)，或任何方法步驟，其可以在目前或在未來存在，進(jìn)行列舉的功能，不管是否正好等價于上面的說明書公開的一種或多種實施方案，即，可以使用進(jìn)行相同功能的其它方式或步驟；并且這樣的表達(dá)方式將給出它們最寬泛的解釋。
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權(quán)利要求
1.一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括在不存在具有抗-腫瘤細(xì)胞黏附，抗侵入或抗-轉(zhuǎn)移性質(zhì)的任何其它化合物的情況下，向需要其的受試者施用有效量的白三烯拮抗劑，或其藥用鹽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述白三烯拮抗劑，或其藥用鹽經(jīng)口服進(jìn)行施用。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述白三烯拮抗劑是白三烯C4和D4受體拮抗劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述白三烯C4和D4受體拮抗劑是式(I)的化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氫，鹵素，羥基，氨基，羧基，硝基，氰基，低級烷基，低級烷氧基，低級烷酰基，低級烷酰氧基，低級烷氧基羰基，單或二低級烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或雜芳基；Q是羧基，低級烷氧基羰基，或tetrazoyl；X是氧、硫或-NR-(其中R是氫或低級烷基)；Z是氫或低級烷基；和m是1-6的整數(shù)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述白三烯C4和D4受體拮抗劑是普侖司特。
6.一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其包括向沒有同時進(jìn)行外科手術(shù)操作的需要其的受試者施用有效量的白三烯拮抗劑，或其藥用鹽。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述白三烯拮抗劑，或其藥用鹽經(jīng)口服進(jìn)行施用。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述白三烯拮抗劑是白三烯C4和D4受體拮抗劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述白三烯C4和D4受體拮抗劑是式(I)的化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氫，鹵素，羥基，氨基，羧基，硝基，氰基，低級烷基，低級烷氧基，低級烷?；?，低級烷酰氧基，低級烷氧基羰基，單或二低級烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或雜芳基；Q是羧基，低級烷氧基羰基，或tetrazoyl；X是氧、硫或-NR-(其中R是氫或低級烷基)；Z是氫或低級烷基；和m是1-6的整數(shù)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述白三烯C4和D4受體拮抗劑是普侖司特。
11.一種抑制腫瘤細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞和/或抑制以腫瘤細(xì)胞的經(jīng)內(nèi)皮遷移形式的毛細(xì)管滲透性的方法，所述方法包括使有效量的白三烯拮抗劑，或其藥用鹽與內(nèi)皮細(xì)胞接觸從而抑制毛細(xì)管滲透性和/或腫瘤細(xì)胞黏附到與白三烯受體拮抗劑接觸的內(nèi)皮細(xì)胞上。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述白三烯拮抗劑，或其藥用鹽經(jīng)口服進(jìn)行施用。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述白三烯拮抗劑是白三烯C4和D4受體拮抗劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述白三烯C4和D4受體拮抗劑是式(I)的化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氫，鹵素，羥基，氨基，羧基，硝基，氰基，低級烷基，低級烷氧基，低級烷?；?，低級烷酰氧基，低級烷氧基羰基，單或二低級烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或雜芳基；Q是羧基，低級烷氧基羰基，或tetrazoyl；X是氧、硫或-NR-(其中R是氫或低級烷基)；Z是氫或低級烷基；和m是1-6的整數(shù)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述白三烯C4和D4受體拮抗劑是普侖司特。
16.一種篩選對腫瘤細(xì)胞的毛細(xì)管滲透性的抑制劑的方法，所述方法包括首先向非人哺乳動物施用可能的候選抑制劑化合物；在施用所述可能的候選抑制劑化合物之后，將腫瘤細(xì)胞靜脈內(nèi)施用于非人哺乳動物；通過穿過腦硬腦膜插入其中的套管向非人哺乳動物蛛網(wǎng)膜下隙施用炎癥誘導(dǎo)劑，其中所述炎癥誘導(dǎo)劑是導(dǎo)致毛細(xì)管滲透性增加的藥劑；收集腦脊髓液；和通過將收集的從毛細(xì)管外滲的腫瘤細(xì)胞的腦脊髓液計數(shù)與沒有施用可能的候選抑制劑化合物的對照進(jìn)行比較，以確定所述可能的候選抑制劑化合物是否是腫瘤細(xì)胞毛細(xì)管滲透性的抑制劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述炎癥誘導(dǎo)劑選自由花生四烯酸，前列腺素，血栓烷，組胺，LPS，葡聚糖，緩激肽，角叉藻聚糖，白三烯，TNFα，IL-1β和IL-6組成的組。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述炎癥誘導(dǎo)劑是花生四烯酸。
19.權(quán)利要求16的方法，其還包括測量收集的腦脊髓液的量。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述非人哺乳動物是大鼠。
21.白三烯拮抗劑或其藥用鹽用于制備或生產(chǎn)藥物的應(yīng)用，所述藥物用于在不存在具有抗-腫瘤細(xì)胞黏附，抗-侵入或抗轉(zhuǎn)移性質(zhì)的任何其它化合物的情況下抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
22.按照權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中所述白三烯拮抗劑是白三烯C4和D4受體拮抗劑。
23.按照權(quán)利要求18的應(yīng)用，其中所述白三烯C4和D4受體拮抗劑是式(I)的化合物 其中R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氫，鹵素，羥基，氨基，羧基，硝基，氰基，低級烷基，低級烷氧基，低級烷?；?，低級烷酰氧基，低級烷氧基羰基，單或二低級烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或雜芳基；Q是羧基，低級烷氧基羰基，或tetrazoyl；X是氧、硫或-NR-(其中R是氫或低級烷基)；Z是氫或低級烷基；和m是1-6的整數(shù)。
24.按照權(quán)利要求23的應(yīng)用，其中所述白三烯C4和D4受體拮抗劑是普侖司特。
全文摘要
白三烯C4和D4拮抗劑用于通過作用于抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，由此阻止腫瘤細(xì)胞的外滲來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
文檔編號A61K31/405GK101022796SQ200580030730
公開日2007年8月22日 申請日期2005年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者野崎正子 申請人:炎癥研究中心有限公司