專利名稱：Gos和多聚果糖的協(xié)同作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人的健康和營養(yǎng)領(lǐng)域。提供了益生元碳水化合物的新協(xié)同混合物，尤其是半乳寡聚糖(GOS，例如TOS)和多聚果糖(例如，菊粉)的混合物，以及含有這些的營養(yǎng)組合物。當(dāng)喂給奶瓶喂養(yǎng)或部分奶瓶喂養(yǎng)的嬰兒時(shí)，營養(yǎng)組合物具有有益的效果，當(dāng)具有腸問題如炎性腸病(IBD)或腸易激綜合征(IBS)的成人攝入時(shí)，也具有促進(jìn)健康的效果。
背景技術(shù)：
人大腸(通常分成盲腸，結(jié)腸和直腸)中的微生物菌叢在人的營養(yǎng)和健康中起著關(guān)鍵作用。細(xì)菌組成可以受到膳食攝入的影響和調(diào)節(jié)。穿過胃和小腸的碳水化合物通過細(xì)菌來代謝并形成作為主要代謝終產(chǎn)物的短鏈脂肪酸(SCFA)，如醋酸，丙酸，丁酸和戊酸，其隨后釋放至血液中。細(xì)菌發(fā)酵的其他終產(chǎn)物包括例如乳酸和琥珀酸。這些終產(chǎn)物的總量和組成(相對量)隨后對細(xì)菌生長，pH，排除致病物種等具有深遠(yuǎn)影響。有益影響微生物菌叢和人健康的一種方法是給予益生元。將“益生元”定義為“通過選擇性刺激結(jié)腸中一種或有限數(shù)量細(xì)菌的生長和/或活性來有益地影響宿主并因此改善宿主健康的不易消化的食品成分”(Gibson和Roberfroid 1995，J.Nutr.125，1401-1412)。為了歸類為益生元，化合物必須滿足的標(biāo)準(zhǔn)是1)在胃腸道的上部(胃，小腸)必須不被水解或吸收，2)必須通過結(jié)腸中一種或多種潛在有益細(xì)菌來選擇性發(fā)酵，3)必須改變結(jié)腸的微生物群接近更健康的組成和4)必須優(yōu)選誘導(dǎo)對受試者健康有益的效果。通常所用的益生元是所謂的不易消化的碳水化合物(或“可溶膳食纖維”)，其未經(jīng)消化而通過胃腸道上部進(jìn)入大腸。這些包括例如果糖低聚糖(FOS)，低多聚果糖，菊粉和轉(zhuǎn)半乳寡聚糖(TOS)。應(yīng)當(dāng)注意到在文獻(xiàn)中，不同術(shù)語的使用之間通常存在不一致性，如果糖低聚糖，菊粉，低多聚果糖和菊粉低聚糖，且相同的術(shù)語可以用于不同的化合物或組合物。
公知的有益菌，其受到益生元攝取的刺激，是乳酸細(xì)菌，如乳桿菌(Lactobacilli)和雙歧桿菌(Bifidobacteria)，且健康益處歸因于這種刺激作用。例如，已經(jīng)描述了菊粉和菊粉-型果聚糖，如低多聚果糖，對腸功能的有益效果(Jenkins等，1999，J.Nutrition 129，1431S-1433S)，且認(rèn)為這種效果是由促雙歧桿菌生長(bifidogenic)作用而引起的，其指的是對全部雙歧桿菌的選擇性生長刺激作用，通過糞便雙歧桿菌計(jì)數(shù)的體內(nèi)或體外來測量(參見，例如，Roberfroid，Am J Clin Nutr 2001，73(增刊)，406S-409S)。
人乳似乎也具有促雙歧桿菌生長作用，因?yàn)槟溉槲桂B(yǎng)的嬰兒中確認(rèn)的主要細(xì)菌是雙歧桿菌。相反，配方奶喂養(yǎng)嬰兒的細(xì)菌集群不是由雙歧桿菌占優(yōu)勢的而是細(xì)菌種更多樣(Harmsen等，2000，J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.30，61-67)。認(rèn)為人乳中發(fā)現(xiàn)的低聚糖引起了促雙歧桿菌生長或益制食品生元效果并以盡可能近似于人乳，尤其是具有與人乳相同或非常相似的益生元效果的方式來盡力改良嬰兒配制食品。這已經(jīng)通過將益生元加入嬰兒配方奶粉中來完成(Boehm等，Acta Paediatr.增刊，2003，441，64-67和Moro等，J PediatrGastroenterol Nutr 34，291-295)。例如，已經(jīng)描述了補(bǔ)充包括轉(zhuǎn)半乳寡聚糖(TOS)和菊粉HP的低聚糖混合物的牛奶配方奶粉來提高奶瓶喂養(yǎng)嬰兒中雙歧桿菌的糞便計(jì)數(shù)(Boehm等，2002，Arch Dis Child86，F(xiàn)178-F181)。
此外，已經(jīng)描述了在嬰兒配方奶粉中補(bǔ)充TOS和菊粉以具有促雙歧桿菌生長效果，并降低糞便pH(Boehm等，2003，上文；Moro等，2003，Acta Paediatr.增刊，44177-79；Marini等，2003，ActaPaediatr.增刊，44180-81；Boehm等，2002，Arch.Dis.Child Fetal.Neonata.編輯，86F178-F181；Moro等，2002，J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.34291-295；Schmelzle等，2003，J Pediatr.Gastroenterol.Nutr.36343-51)。
在益生元通過乳酸細(xì)菌發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生了有機(jī)酸并降低了pH。乳桿菌產(chǎn)生乳酸或乳酸和醋酸(短鏈脂肪酸；SCFA)。乳酸可以是L-或D-型的。另一方面，雙歧桿菌產(chǎn)生L-乳酸和醋酸，但不產(chǎn)生D-乳酸。雙歧桿菌(和其他乳酸細(xì)菌)通常不導(dǎo)致氣體如H2和CH4的產(chǎn)生。它們也不產(chǎn)生其他SCFA，如丙酸，丁酸，異丁酸，戊酸和異戊酸。SCFA如異丁酸和異戊酸的存在，表明碳水化合物被其他細(xì)菌種發(fā)酵，如梭狀芽孢桿菌(Clostridia)和擬桿菌(Bacteroides)或腸桿菌(Enterobacteriaceae)，或表明蛋白質(zhì)發(fā)酵(其中雙歧桿菌的能力差)。此外，其他腸細(xì)菌能夠產(chǎn)生醋酸或乳酸，如丙酸桿菌(Propionibacteria)，腸球菌(Enterococci)和小球菌(Pediocci)。
之前已經(jīng)報(bào)道了某些益生元碳水化合物的攝入提高了雙歧桿菌和/或乳桿菌的(相對)量。已經(jīng)觀察到伴隨的SCFA形成增加和pH降低。已經(jīng)報(bào)道了將益生元如菊粉或GOS引入膳食中時(shí)，還形成了氣體，其導(dǎo)致了不希望的癥狀如腸胃氣脹和腹痛。此外，已經(jīng)報(bào)道了不僅醋酸而且例如丁酸增加，這是不理想的。因此描述了由食用補(bǔ)充了某些益生元的營養(yǎng)物引起的一系列不利影響。
在母乳喂養(yǎng)嬰兒的結(jié)腸和糞便中，發(fā)現(xiàn)主要的SCFA是醋酸。此外，發(fā)現(xiàn)了高濃度的乳酸。這些(相對)量高于成人(其中乳酸的濃度通常是可忽略不計(jì)的)或標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒中所觀察到的那些。其次，母乳喂養(yǎng)嬰兒結(jié)腸和糞便中的丙酸且尤其是丁酸的濃度比成人中的低得多，甚至低于用標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒中的濃度。母乳喂養(yǎng)嬰兒中糞便的pH最低。如上所述，理想的是提供營養(yǎng)組合物，尤其是配方奶粉組合物，當(dāng)食用時(shí)，其導(dǎo)致腸微生物菌叢近似于母乳喂養(yǎng)嬰兒的。
已經(jīng)描述了SCFA和乳酸以及低結(jié)腸pH的許多健康效果。已經(jīng)描述了降低的pH和有機(jī)酸的存在具有抗致病效果，并提供了對酸耐受性細(xì)菌如乳酸細(xì)菌(包括雙歧桿菌)的有利條件。還描述了SCFA對腸壁的作用。SCFA是結(jié)腸細(xì)胞(colonocyte)的能量源，并因此有助于腸屏障的完整性。SCFA還涉及對蠕動，膽汁酸代謝，水吸收和細(xì)胞分化的影響(參見，例如EP1105002)。已知SCFA刺激粘液的產(chǎn)生并涉及礦物質(zhì)吸收和粘液產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者令人驚訝地發(fā)現(xiàn)GOS(尤其是TOS)和多聚果糖(尤其是菊粉)，當(dāng)一起給予時(shí)，提供了多種有益效果，其不能通過提高腸雙歧桿菌的數(shù)量來解釋，因此，其不是由現(xiàn)有技術(shù)中(例如，Boehm等，2002，上文)所述的TOS或菊粉HP促雙歧桿菌生長效果而引起的。尤其是，出人意料地發(fā)現(xiàn)，給予GOS和多聚果糖混合物后，所形成的SCFA總量增加，醋酸和乳酸的相對量增加，嬰兒糞便的pH降低，由此這些效果與雙歧桿菌增加的(相對)量無關(guān)。除了有益的SCFA量和分布特征以及增加量的乳酸，還觀察到氣體形成減少。此外，發(fā)現(xiàn)乳酸自身具有迄今未知的對結(jié)腸的有益效果，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其提高了前列腺素E1和前列腺素E2的分泌。這種效果之前只對SCFA，尤其是醋酸報(bào)道過(Willemsen等，2003，Gut 52，1442-1447)。包括乳酸的組合物，和包括刺激乳酸產(chǎn)生的益生元的組合物，因此可以用于刺激粘蛋白產(chǎn)生并支持粘膜屏障的完整性(粘液保護(hù))。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)乳酸降低了結(jié)腸肌肉的自發(fā)收縮和張力，導(dǎo)致痙攣和疼痛的緩解。
因此益生元組合物是新的，因?yàn)樗鼈儧]有或沒有顯著地提高雙歧桿菌的數(shù)量，而是確實(shí)導(dǎo)致SCFA總量的增加，SCFA分布特征的有益改變(醋酸增加，丁酸和丙酸減少)，乳酸增加(并導(dǎo)致有益收縮和張力減輕效果和粘液刺激效果)，糞便pH降低，氣體形成減少，和SCFA更漸進(jìn)的形成(包括結(jié)腸遠(yuǎn)側(cè)部分中的形成)，即，完整的發(fā)酵產(chǎn)物的最佳模式(更多L-乳酸，更少丁酸等)。所有這些改變使得結(jié)腸環(huán)境更類似于母乳喂養(yǎng)嬰兒的結(jié)腸環(huán)境。因此本發(fā)明的一實(shí)施方案中，在此提供了有效量的GOS和多聚果糖的混合物制備組合物的用途，所述組合物導(dǎo)致結(jié)腸環(huán)境基本上與母乳喂養(yǎng)嬰兒的相似。
當(dāng)共同給予時(shí)比單獨(dú)給予GOS或多聚果糖(例如，TOS或菊粉)時(shí)所發(fā)現(xiàn)的有益效果更顯著，表明GOS和多聚果糖的協(xié)同作用?，F(xiàn)有技術(shù)中，沒有進(jìn)行將給予TOS和菊粉的單獨(dú)效果與共同給予這兩種化合物直接相比較的研究，并且顯然這樣獨(dú)立的單獨(dú)研究不能相互比較且不適于鑒定協(xié)同效應(yīng)。
GOS和多聚果糖(例如，TOS和菊粉)這種新的協(xié)同相互作用，及其共同給予的體內(nèi)效果，導(dǎo)致含有合適(協(xié)同)量的GOS和多聚果糖的組合物的新用途，如治療或預(yù)防絞痛和/或腹部痙攣，腹脹，腸胃氣脹，腹痛，便秘，IBS，IBD，過敏和/或提高腸粘液保護(hù)。此外，含有乳酸(D-乳酸和/或L-乳酸，優(yōu)選L-乳酸)的組合物可以用于治療或預(yù)防這些癥狀或疾病中的一種或多種。
因此，出人意料地，益生元(GOS和多聚果糖)的特定混合物通過腸菌叢的發(fā)酵導(dǎo)致提高的和動力學(xué)有利的SCFA和乳酸形成以及改善的代謝終產(chǎn)物模式。結(jié)果，導(dǎo)致許多有益效果，如對粘液產(chǎn)生的效果，抗炎效果，對痛覺的效果和對腹部痙攣/絞痛的效果(都是通過結(jié)腸的松弛和自發(fā)收縮的減少)。含有這些益生元混合物的營養(yǎng)組合物還可以用于具有腸問題如IBD或IBS或由于營養(yǎng)不良腸屏障完整性降低的成人。
定義“多糖”指的是具有至少10個(gè)單元鏈長的單糖單元的碳水化合物鏈。相反，“低聚糖”具有少于10個(gè)單元的鏈長。
“聚合度”或“DP”指的是低聚糖或多糖鏈中糖單元的總數(shù)。“平均DP”指的是組合物中低聚糖或多糖鏈的平均DP，沒有考慮可能的單糖或雙糖(如果存在，優(yōu)選將其除去)。組合物的平均DP用于區(qū)分組合物。此外，組合物中的％糖單元，如％葡萄糖和％果糖單元是不同的。
“多聚果糖”或“多聚果聚糖”或“果糖多糖”指的是含有β連接的果糖單元鏈的具有10或更高聚合度的多糖碳水化合物，并包括例如菊粉(例如，菊粉IP)，果聚糖和/或“混合類型的多聚果聚糖”(參見下文)。
在此所用的“菊粉”或“非水解的菊粉”或“菊粉HP”指的是以葡萄糖為鏈端的果糖鏈，大部分鏈(至少90％，優(yōu)選至少95％)具有10或更高的聚合度(DP)。因此菊粉可以描述為GFn，其中G表示葡糖基單元，F(xiàn)表示果糖基單元，n是相互連接的果糖基單元的數(shù)目，n是9或更多。G/F比為約0.1∶0。然而，小部分的菊粉分子可以沒有末端葡萄糖單元。平均DP在此優(yōu)選為至少15，更優(yōu)選20或更高，如20，21，22，23，25，30，40，60，70，100，150或更高。菊粉中，通過β(1→2)鍵連接果糖單元。合適的菊粉是例如可購得的具有＞23平均DP的Raftiline(Orafti)。
“水解的菊粉”或“低多聚果糖”指的是以葡萄糖和果糖為鏈端的果糖鏈混合物，具有低于10的DP。因此，水解的菊粉可以描述為GFn鏈和Fn鏈的混合物(其中G是葡糖基單元，F(xiàn)是果糖基單元，且n＝1-8)。水解的菊粉是菊粉的(酶或酸)水解產(chǎn)物或部分水解產(chǎn)物，由β(1→2)果糖基-果糖鍵的斷裂而形成。術(shù)語水解的菊粉還包括合成制得或重組制得的具有相同結(jié)構(gòu)組成的菊粉。
“左聚糖(levan)”或“果聚糖(levulan)”或“菊芋糖”(levulin)“左旋聚糖(levulosan)”指的是由多聚果糖構(gòu)成的多糖，其中果糖單元由β(2→6)鍵連接。起始葡萄糖部分可以存在，但這不是必需的。聚合度高于10。
“混合類型的多聚果聚糖”中，由β(2→1)和β(2→6)鍵連接果糖單元?；旌项愋偷亩嗑酃厶鞘侵ф湹牟⒕哂校?0的DP。
“GOS”或“半乳寡聚糖”，或“轉(zhuǎn)半乳寡聚糖”或“TOS”指的是由半乳糖單元構(gòu)成的低聚糖，具有10或更低的DP，且平均DP為2，3，4，5或6。葡萄糖單元可以存在于鏈的還原端。優(yōu)選GOS含有至少2/3的半乳糖單元。最優(yōu)選的是具有β-(1→4)糖苷鍵的轉(zhuǎn)半乳寡聚糖(TOS)。這樣的GOS是例如發(fā)現(xiàn)于VivinalGOS(從Borculo DomoIngredients，Zwolle，Netherlands可購得)，包括具有β(1→4)糖苷鍵和β(1→6)糖苷鍵的半乳寡聚糖。
“SCFA”或“短鏈脂肪酸”指的是脂肪酸，具有至多C6的碳鏈長，作為細(xì)菌腸發(fā)酵的終產(chǎn)物產(chǎn)生，如醋酸(C2)，丙酸(C3)，丁酸和異丁酸(C4)，戊酸和異戊酸(C5)和其他。表述“iC4-5”指的是異丁酸，戊酸和異戊酸的總和。
“協(xié)同有效量”指的是當(dāng)共同給予時(shí)，賦予一種(或多種)特定生理效應(yīng)(如本文別處所述的)的GOS和多聚果糖(例如，TOS和菊粉)的量，借此共同給予的總效果顯著大于單獨(dú)給予GOS或多聚果糖效果的總和。例如，如果單獨(dú)給予GOS的效果是X，單獨(dú)給予多聚果糖的效果是Y，那么共同給予GOS和多聚果糖的效果大于X+Y，例如，共同給予1/2濃度的GOS加上1/2濃度的多聚果糖的效果大于1/2X+1/2Y的效果等。
兩種或多種物質(zhì)的“共同給予”指的是將這些物質(zhì)給予一個(gè)個(gè)體，以一種組合物或分開的組合物(藥盒部分；作為聯(lián)用的組合物)，同時(shí)給予(同時(shí))或在短的時(shí)間間隔內(nèi)給予(分開或連續(xù)使用，例如，在幾分鐘或幾小時(shí)內(nèi))。
“腸道”在此指的是直接遞送至患者的胃腸道(例如，口服或通過管子，導(dǎo)管或人造口)。
術(shù)語“含有”應(yīng)理解為指定所述部分、步驟或成分的存在，但不排除一個(gè)或多個(gè)其他部分、步驟或成分的存在。
“嬰兒”在此指的是0-36個(gè)月大的人，優(yōu)選0-18個(gè)月，或更優(yōu)選0-12個(gè)月。
“母乳喂養(yǎng)的嬰兒”指的是只用人母乳喂養(yǎng)的嬰兒?！胺腔虿糠帜溉槲桂B(yǎng)的嬰兒”是不只用人母乳喂養(yǎng)的嬰兒。這包括每天至少一瓶(約80ml)配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒。
“百分比”或“平均”通常指的是重量平均的百分比，除非另外指出或除非明顯地是指另一種基準(zhǔn)。
本發(fā)明的一實(shí)施方案中提供了含有合適(協(xié)同有效)量的GOS和多聚果糖的組合物的多種新用途。
根據(jù)本發(fā)明的用途和方法在此所述的各種用途中，患者優(yōu)選是人患者，更優(yōu)選是嬰兒，如新生嬰兒至12個(gè)月大的嬰兒。尤其是指奶瓶喂養(yǎng)的嬰兒或部分奶瓶喂養(yǎng)的嬰兒。或者，患者還可以是兒童，少年或成人。尤其是使用根據(jù)本發(fā)明的組合物可以預(yù)防和/或治療腸問題，如但不限于炎性腸病(IBD)，腸易激綜合征(IBS)，腸胃氣脹，腹部痙攣，絞痛，腹脹，腹痛等，其還可以導(dǎo)致疲勞，抑郁或喜怒無常。此外，可以提高粘膜產(chǎn)生和預(yù)防或治療由腸次最優(yōu)功能引起的過敏。可以提高由營養(yǎng)不良，外科手術(shù)，化療等引起的屏障功能削弱患者的腸屏障功能。
含有GOS和多聚果糖的組合物，如含有TOS和菊粉的組合物，一實(shí)施方案中，可以用于誘導(dǎo)在患者的大腸中產(chǎn)生SCFA和顯著提高給予后(腸和/或糞便)所產(chǎn)生的SCFA總量和/或顯著改變(腸和/或糞便)所產(chǎn)生的SCFA相對量，尤其是提高(腸和/或糞便)總SCFA中的醋酸相對量，和/或顯著提高所產(chǎn)生的腸乳酸(絕對和相對)量，和/或顯著降低或防止腸氣體產(chǎn)生，和/或?qū)CFA產(chǎn)生延伸至結(jié)腸遠(yuǎn)側(cè)部分，和/或顯著降低大腸中的pH和糞便pH。此外，可以降低相對于總SCFA的腸和/或糞便丁酸，異丁酸，戊酸和/或異戊酸的總和。給予后可以獲得這些效果，而對腸雙歧桿菌的總數(shù)和/或相對數(shù)量沒有顯著影響。在此提供了用于治療或預(yù)防與這些腸效果的一種或多種相關(guān)或由其引起的任何疾病或失調(diào)或不適的組合物。
本發(fā)明提供了半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備治療或預(yù)防腹脹，氣體形成，腹痛和/或腸胃氣脹的組合物的用途。再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備治療或預(yù)防過敏，濕疹或特應(yīng)性疾病的組合物的用途。再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備治療和/或預(yù)防絞痛和/或用于松弛結(jié)腸收縮，優(yōu)選緊張性收縮和/或位相性收縮的組合物的用途。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備治療或預(yù)防腸易激綜合征或炎性腸病的組合物的用途。再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備提高腸屏障功能和/或大腸中粘液產(chǎn)生的組合物的用途。
除非另外指出，(例如，SCFA，醋酸或乳酸)的“顯著提高”在此指的是與單獨(dú)給予GOS或多聚果糖(例如，菊粉)時(shí)產(chǎn)生的量相比較，至少5％，優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少20％，或更多的提高。相似地，除非另外指出，(例如，氣體形成)的顯著降低指的是與單獨(dú)給予多聚果糖(例如，菊粉)產(chǎn)生的量相比較，至少5％，優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少20％，25％，50％或更多(例如，70％，80％，90％，100％)的降低。
還可以測量作為GOS和多聚果糖組合物發(fā)酵產(chǎn)物所產(chǎn)生的SCFA總量的提高，表示為患者糞便樣品pH的顯著降低，反映出大腸中pH的體內(nèi)降低。在嬰兒中，發(fā)現(xiàn)共同給予TOS和多聚果糖(例如，菊粉)后，糞便pH降低至約5.8或更低，如pH5.6，5.5或5.4或5.2，而標(biāo)準(zhǔn)配制食品喂養(yǎng)的嬰兒的pH為約或高于pH6，如約pH5.9，6.8或甚至7.0。因此，pH的顯著降低指的是與標(biāo)準(zhǔn)配制食品喂養(yǎng)的嬰兒相比較，pH降低至少15％或0.9個(gè)單位。
共同給予合適量GOS和多聚果糖的另一有益效果是SCFA的組成顯著不同于給予GOS或多聚果糖時(shí)的。尤其是丁酸的相對量顯著降低，而醋酸的相對量顯著提高。因此，組合物不僅可以用于改變總SCFA量，而且改變了相對SCFA比例。在共同給予TOS和多聚果糖(例如，菊粉)的嬰兒中，相對SCFA水平更類似于母乳喂養(yǎng)嬰兒中發(fā)現(xiàn)的水平，醋酸∶丙酸∶丁酸比例通常為約80-85％∶10-15％∶1-5％，而標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒中的比例通常為約69-74％∶16-19％∶5-6％(如實(shí)施例中所示的)。因此，通過本發(fā)明的組合物尤其提高了醋酸的相對量，而降低了丙酸和丁酸的相對量。GOS和多聚果糖的共同給予導(dǎo)致醋酸∶丙酸∶丁酸比例比配制食品喂養(yǎng)嬰兒的更接近類似于母乳喂養(yǎng)的嬰兒(其產(chǎn)生了高水平的丁酸和丙酸和相對低水平的醋酸)。可以通過本領(lǐng)域已知的方法來測量對相對SCFA比例的效果，如給予后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的糞便樣品的氣相色譜，使用體內(nèi)研究或體外發(fā)酵系統(tǒng)，如例如實(shí)施例中所述的?！帮@著改變的SCFA組成”或“顯著提高含量的醋酸”指的是醋酸量(％總SCFA)至少為約4％，5％，10％，15％或更多，高于沒有給予GOS或多聚果糖時(shí)的或單獨(dú)給予GOS或多聚果糖時(shí)的。優(yōu)選丙酸和/或丁酸的相對量低于沒有給予GOS或多聚果糖時(shí)的或單獨(dú)給予GOS或多聚果糖時(shí)的。一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物適于將腸和/或糞便醋酸提高至高于總SCFA的約85％，如86％，87％，88％，90％或更多。
當(dāng)共同給予GOS和多聚果糖時(shí)觀察到的再一有益效果是與只給予GOS或只給予多聚果糖時(shí)發(fā)現(xiàn)的支鏈SCFA的比例相比較，支鏈SCFA的顯著降低。如在此所用的，“支鏈SCFA的顯著降低”指的是與沒有喂養(yǎng)益生元嬰兒中發(fā)現(xiàn)的濃度相比較降低至少70％，或?qū)е录S便中的比例低于總SCFA的1.5％。通過將支鏈SCFA，即異丁酸，加上異戊酸加上戊酸的總和除以總SCFA，即醋酸，加上丙酸，加上丁酸，加上異丁酸，加上異戊酸，加上戊酸等的總和可以測量支鏈SCFA相對于總SCFA的比例。
降低支鏈SCFA的比例對患者的健康是有益的，因?yàn)橹ф淪CFA是有害的。這表明較少的蛋白質(zhì)降解，蛋白質(zhì)降解是不希望的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)酵導(dǎo)致pH升高和有害物質(zhì)如H2S的形成。
丁酸的顯著降低指的是與沒有喂養(yǎng)益生元嬰兒中發(fā)現(xiàn)的濃度相比較降低至少50％，或?qū)е录S便中的比例低于總SCFA的4％。一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物適于降低腸(和/或糞便)丁酸，異丁酸，戊酸和異戊酸的總和，低于總SCFA的7％，如總SCFA的6.5％，6％，5％，4％或更低。
另一實(shí)施方案中，含有GOS和多聚果糖的組合物適于提高結(jié)腸內(nèi)的發(fā)酵持續(xù)時(shí)間。特別地，共同給予后細(xì)菌發(fā)酵在結(jié)腸最遠(yuǎn)側(cè)部分仍然是旺盛的，如通過結(jié)腸遠(yuǎn)側(cè)部分中產(chǎn)生SCFA所示的。在給予只含有GOS或只含有多聚果糖的組合物后，結(jié)腸遠(yuǎn)側(cè)部分中沒有產(chǎn)生或只產(chǎn)生非常少的SCFA。此外，共同給予后觀察到結(jié)腸開始處的快速發(fā)酵，這對于抗致病效果尤其重要，且這也是在母乳喂養(yǎng)的嬰兒中觀察到的?？偟恼f來，這表明組合物適于建立和/或維持患者整個(gè)結(jié)腸中相對平衡的發(fā)酵模式并將發(fā)酵和SCFA產(chǎn)生延伸至結(jié)腸的遠(yuǎn)端。SCFA，很可能還有其他發(fā)酵產(chǎn)物，尤其是乳酸，因此在整個(gè)結(jié)腸中，在結(jié)腸的開端，中部和末端產(chǎn)生。
再一實(shí)施方案中，以協(xié)同量共同給予GOS和多聚果糖可以用于顯著提高乳酸產(chǎn)生，這可以通過分析測試患者和對照患者的糞便樣品來再次測定，這些患者接受含有單獨(dú)GOS或單獨(dú)多聚果糖的組合物或沒有益生元的等價(jià)基礎(chǔ)組合物。“乳酸的顯著提高”指的是與沒有給予GOS或多聚果糖的患者相比較，共同給予含有GOS和多聚果糖組合物的患者產(chǎn)生至少5％，10％，20％或甚至50％或更多的乳酸。例如，喂養(yǎng)補(bǔ)充6g/lTOS/菊粉混合物(90％∶10％)標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉的嬰兒在16周產(chǎn)生約16％乳酸(作為總酸的％)，而標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒產(chǎn)生約0.6％乳酸，母乳喂養(yǎng)的嬰兒產(chǎn)生約35％乳酸。盡管比不上母乳喂養(yǎng)嬰兒產(chǎn)生的乳酸量，但補(bǔ)充TOS和菊粉混合物的標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生的顯著提高。如實(shí)施例中所示的，發(fā)現(xiàn)乳酸具有意想不到的有益效果。與醋酸相似，其提高了前列腺素E1和前列腺素E2產(chǎn)生并導(dǎo)致增強(qiáng)的上皮粘蛋白表達(dá)。腸粘膜在人健康中起重要作用，因?yàn)槠渥鳛閷垢腥静≡w，過敏原和致癌物的屏障。因此正面影響粘膜生長和/或完整性的組合物可用于幫助新生兒建立健康粘膜和幫助奶瓶喂養(yǎng)或部分奶瓶喂養(yǎng)嬰兒和患有由腸粘膜不完全功能引起或與其相關(guān)癥狀或疾病患者建立健康粘膜。例如，可以治療或預(yù)防腸問題，如炎性腸病(IBD，例如，結(jié)腸炎或節(jié)段性回腸炎)或腸易激綜合征(IBS)，或可以減少通過粘膜的病原體附著和/或進(jìn)入，或可以預(yù)防或減少其他免疫問題，如哮喘的產(chǎn)生。還可以預(yù)防或減少由營養(yǎng)不良，外科手術(shù)，化療等引起的腸屏障完整性的喪失。
此外，給予D-或L-乳酸后，自發(fā)收縮和腹部緊張以劑量依賴性方式顯著減輕。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以用于提高腸乳酸水平并因此治療或預(yù)防如腹痛，絞痛，腹部收縮，腹部緊張等的癥狀。
因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)乳酸本身具有未知的作用，所以本發(fā)明的再一目的是提供含有合適量乳酸的組合物，其可以用于治療或預(yù)防上述癥狀和疾病。一實(shí)施方案中，組合物只含有合適量的乳酸，而另一實(shí)施方案中，在此所述的GOS和多聚果糖組合物還包含乳酸來進(jìn)一步提高腸乳酸水平。根據(jù)本發(fā)明的一種這樣的組合物包含協(xié)同有效量的TOS和菊粉，并進(jìn)一步包含合適量的乳酸。一實(shí)施方案中，提供了適于將腸和/或糞便乳酸提高至高于約10mmol/kg糞便的組合物。
可以理解當(dāng)涉及糞便樣品分析時(shí)，這是實(shí)際體內(nèi)效果的間接測量。同樣，可以進(jìn)行體外測定，借此細(xì)菌群在體外生長并將合適量組合物加入培養(yǎng)物中。特別地，可以使用實(shí)施例中描述的體外發(fā)酵系統(tǒng)。
因此共同給予含有GOS和多聚果糖的組合物可以用于獲得以下的一種或多種生理效應(yīng)-總SCFA的顯著增加-pH的顯著降低-顯著改變的SCFA組成-支鏈SCFA的顯著減少-每mol產(chǎn)生的SCFA氣體產(chǎn)生的顯著降低-更長和更平衡的發(fā)酵，甚至包括結(jié)腸最遠(yuǎn)側(cè)部分的發(fā)酵，和/或-SCFA的高初始形成和/或結(jié)腸最近側(cè)部分中的乳酸形成-促進(jìn)結(jié)腸開端，中部和末端的SCFA產(chǎn)生-乳酸的顯著增加(絕對和/或相對)和/或-L-乳酸作為所形成總?cè)樗岜壤南鄬α康脑黾觾?yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)使用含有GOS和多聚果糖二者的組合物時(shí)，與給予只含有GOS或多聚果糖，或不含有GOS或多聚果糖的組合物時(shí)相比較，顯著改變至少2，3，4，5，6，7，8，9或所有這些效果。特別地，共同給予(協(xié)同有效量)GOS和多聚果糖后，至少2，3，4，5，6，7，8，9或所有這些效果顯著大于單獨(dú)給予GOS和多聚果糖的效果的總和。
因此，根據(jù)本發(fā)明的協(xié)同組合物在給予協(xié)同有效量后特別適于在嬰兒的大腸中建立和/或維持健康微生物菌叢。優(yōu)選實(shí)施方案中，嬰兒在出生后的頭幾周內(nèi)只喂養(yǎng)補(bǔ)充協(xié)同有效量GOS和多聚果糖的基礎(chǔ)組合物如配方奶粉。因此，優(yōu)選的組合物是嬰兒的膳食組合物。另一實(shí)施方案中，嬰兒只是部分喂養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的組合物。一實(shí)施方案中，組合物用于治療或預(yù)防選自以下的一種或多種癥狀氣體形成，腸胃氣脹，結(jié)腸炎，腹脹，腹部痙攣，腹痛，IBS，IBD，過敏和/或作為粘膜保護(hù)劑。因此，GOS和多聚果糖可以用于制備組合物或聯(lián)用的組合物，用于同時(shí)，分開或按序用于治療腸胃氣脹，過量氣體形成，結(jié)腸炎，腹脹，腹部痙攣，腹痛，IBS，IBD，過敏，降低的腸屏障功能和/或作為粘膜保護(hù)劑。這種情況下的患者可以是任何患者，從嬰兒，兒童，青少年至成人。無疑地，其中加入?yún)f(xié)同有效量GOS和多聚果糖的基礎(chǔ)組合物，將根據(jù)患者的年齡，給予方式和待治療或預(yù)防的主要癥狀而改變。對于嬰兒，例如基礎(chǔ)組合物優(yōu)選是液體或粉末形式的嬰兒或較大嬰兒(follow-on)配制食品，而對于成人，營養(yǎng)補(bǔ)充組合物(液體，半液體或固體)或管飼可能更合適。
優(yōu)選實(shí)施方案中，以適于顯著提高所形成腸SCFA總量和/或顯著改善腸SCFA組成(尤其是顯著提高醋酸相對于SCFA總量的百分比)和/或顯著提高乳酸產(chǎn)生和/或顯著降低腸pH和/或顯著減少腸氣體形成的協(xié)同有效量來共同給予GOS和多聚果糖。
提供了含有協(xié)同有效量GOS和多聚果糖的組合物用于治療和/或預(yù)防絞痛和/或腹部痙攣，腹脹和/或腸胃氣脹，腹痛，IBS，IBD和/或過敏的用途。還提供了該組合物用于提高粘膜保護(hù)和強(qiáng)化腸屏障的用途。可以理解不一定涉及一種組合物，而是GOS和多聚果糖可以存在于當(dāng)共同給予時(shí)提供協(xié)同有效量的分開的組合物中。
通過SCFA水平，分布特征和腸pH的這些改變，組合物能夠?qū)е乱韵碌囊环N或多種下游有益效果a)降低了SCFA產(chǎn)生部位的腸滲透性。這對于預(yù)防疾病和維持健康是重要的，尤其是預(yù)防過敏產(chǎn)生。共同給予GOS和多聚果糖導(dǎo)致更平穩(wěn)的發(fā)酵并將發(fā)酵延伸至結(jié)腸遠(yuǎn)側(cè)部分的發(fā)現(xiàn)在這方面是重要的，因?yàn)槟c的滲透性，包括結(jié)腸的遠(yuǎn)側(cè)部分，可以均勻地降低，并因此可以均勻地將腸維持于健康狀態(tài)。
b)增強(qiáng)了腸的運(yùn)動性或蠕動，其減輕或預(yù)防便秘，這是配制食品喂養(yǎng)的嬰兒中觀察到的常見問題。
c)降低自發(fā)收縮的量和結(jié)腸肌肉緊張，導(dǎo)致較少的痙攣和較少的腹痛。
d)提高鈣離子吸收，其對于患者的骨礦物化和骨發(fā)育是重要的，尤其如果患者是嬰兒的話。
e)可以減少健康下降的繼發(fā)性癥狀，如疲勞，抑郁和情緒波動，f)腸粘膜的粘液產(chǎn)生顯著增加，其提供了對抗病原體附著和群集的保護(hù)。特別地，發(fā)現(xiàn)乳酸水平與粘液產(chǎn)生正相關(guān)。因此根據(jù)本發(fā)明的組合物可以用于刺激粘液產(chǎn)生。
g)可以將膽汁代謝改變至母乳喂養(yǎng)嬰兒中觀察到的水平和/或模式。
h)沿著整個(gè)結(jié)腸抑制了腸致病微生物的生長。
因此含有協(xié)同有效量GOS和多聚果糖的組合物可以用于維持或建立(例如，在新生兒，早產(chǎn)兒或足月兒或非-或部分母乳喂養(yǎng)嬰兒或其他患者如成人中)一種或多種以上的生理效應(yīng)和維持或改善患者的健康，通過確保或建立健康的大腸環(huán)境和最佳的大腸活性。
特別地，通過給予本發(fā)明的組合物可以減輕、消除或預(yù)防疾病、失調(diào)或癥狀如絞痛和/或腹部痙攣，腹脹和/或腸胃氣脹，腹痛，IBS，IBD和/或過敏，腸病原菌感染(例如，細(xì)菌，病毒，真菌)，腹瀉，濕疹，過敏誘導(dǎo)的哮喘和其他特應(yīng)性疾病，和/或便秘的發(fā)生率，持續(xù)時(shí)間和/或嚴(yán)重程度。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以用于松弛結(jié)腸的收縮，優(yōu)選階段性和/或緊張性收縮。
根據(jù)本發(fā)明的組合物適于上述用途的組合物含有協(xié)同有效量的多聚果糖和GOS二者。該組合物含有3/97至97/3，優(yōu)選5/95至95/5，更優(yōu)選90/10至45/55比例的GOS/多聚果糖。在此包括所有這些端點(diǎn)之間的單個(gè)比例，如10/90，20/80，30/70，40/60，50/50，55/45，60/40，70/30，80/20，85/15，90/10等。
獲得(最佳)協(xié)同效果需要的劑量和GOS/多聚果糖比例可以根據(jù)組合物的類型以及給予的方法和頻率而改變。然而，以下給出了幾個(gè)實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易測定每個(gè)成分需要多大劑量來獲得最佳生理效應(yīng)和怎樣的GOS/多聚果糖比例是最合適的。例如，如果主要目的是為了提高口服含有GOS和多聚果糖組合物后的SCFA總水平，則本領(lǐng)域技術(shù)人員將制得各種組合物(包括GOS加上多聚果糖，GOS單獨(dú)，多聚果糖單獨(dú))并使用本領(lǐng)域已知的體內(nèi)或體外測試來比較它們誘導(dǎo)高SCFA水平的功效?？梢岳斫猱?dāng)涉及“日劑量”或“每天的劑量”時(shí)，這不意味著必須將該劑量一次給予患者。
例如，協(xié)同有效的嬰兒配制食品可以由含有約4g/l，5g/l或更多GOS和多聚果糖混合物的基礎(chǔ)組合物(例如，標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配制食品)，借此可以改變GOS與多聚果糖的比例，如本文別處所述的(例如，90％GOS∶10％多聚果糖)。
例如，多聚果糖是左聚糖和/或菊粉。用于組合物中的多聚果糖，如左聚糖或菊粉，可以如本領(lǐng)域已知的從天然來源(植物或細(xì)菌)提取或可以通過從頭合成或通過重組DNA技術(shù)來制得。例如在DeLeenheer(1996)，US6569488和US5968365中，已經(jīng)描述了菊粉的提取、大小分離和純化方法。例如已經(jīng)在US6559356中描述了重組生產(chǎn)方法。合成通常包括使用蔗糖分子和具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶。適用于組合物中的菊粉也已經(jīng)可以購得，例如，RaftilineHP，Ofafti。
植物菊粉通常具有比細(xì)菌菊粉低得多的聚合度(至多150，與細(xì)菌中的高達(dá)100,000相比較)。植物來源包括雙子葉物種，如菊科(Compsitae)。產(chǎn)生相對大量菊粉的物種實(shí)例是菊苣，蘆筍，大麗花，菊芋，大蒜和其他，主要在它們的根，球莖或塊莖中(參見，Kaur和Gupta，J.Biosci.2002，27，703-714)。因?yàn)閮?yōu)選菊粉不應(yīng)當(dāng)包含低多聚果糖，應(yīng)當(dāng)避免水解或在使用前應(yīng)當(dāng)除去存在的低多聚果糖和/或單糖或雙糖。
尤其優(yōu)選的是具有至少10，15，20，50，70，100，120，130，150，200，300，500或更高PD的多聚果糖?？梢运舛嗑酃?，如左聚糖，以避免與太長鏈相關(guān)的粘度問題，只要保持10或更高的PD。
還可以從天然來源如植物(例如，單子葉植物)，酵母，真菌，細(xì)菌獲得或化學(xué)或使用重組DNA技術(shù)制得左聚糖。
GOS可以從天然來源如植物(例如，菊苣，大豆)或細(xì)菌獲得，或可以如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的經(jīng)合成或通過重組DNA技術(shù)來制得。GOS可以是β半乳寡聚糖或α半乳寡聚糖或兩者的混合物。特別地，半乳糖殘基通過β(1-4)和β(1-6)糖苷健連接(轉(zhuǎn)GOS或TOS)。適用于組合物中的GOS也已經(jīng)可購得，例如，VivinalGOS，Borculo DomoIngredients，Zwolle，The Netherlands。GOS也可以得自乳糖，通過用β-半乳糖苷酶酶促處理乳糖或通過水解聚葡聚糖。優(yōu)選實(shí)施方案中，使用TOS。一實(shí)施方案中，優(yōu)選多聚果糖是菊粉HP，所以TOS和菊粉HP的組合也是在此的優(yōu)選實(shí)施方案。
所提供的其他組合物是含有合適量乳酸的組合物，尤其是用于上述的用途。乳酸的合適量可以改變，例如可以每天1至30克。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是食品組合物，食品補(bǔ)充組合物或藥物組合物。除了多聚果糖和GOS(和/或乳酸)，它們可以含有另外的成分。對于食品組合物或食品補(bǔ)充組合物，這些應(yīng)當(dāng)是食品級的和生理學(xué)上可接受的。“食品”指的是液體，固體或半固體膳食組合物，尤其是完全食品組合物(食品替代物)，其不需要另外的營養(yǎng)攝入或食品補(bǔ)充組合物。食品補(bǔ)充組合物不能完全替代通過其他方式攝入營養(yǎng)素。優(yōu)選的實(shí)施方案中食品和食品補(bǔ)充組合物是嬰兒食品或食品補(bǔ)充劑，用于早產(chǎn)兒的食品或食品補(bǔ)充劑，嬰兒食品，學(xué)走路孩子的食品等，優(yōu)選通過腸道給予，優(yōu)選每天口服幾次。食品或食品補(bǔ)充組合物特別適于非-或部分母乳喂養(yǎng)的嬰兒。此外，可以將組合物有益地給予處于對固體食品的適應(yīng)期的嬰兒或從母乳改為奶瓶喂養(yǎng)的嬰兒。組合物還可以是人乳強(qiáng)化補(bǔ)充劑的一部分。
一實(shí)施方案中，組合物是如本領(lǐng)域已知的嬰兒或較大嬰兒配制食品，尤其是如歐洲委員會指令91/321/EEC及其修訂中所述的，但可以改良以包含有效量的多聚果糖和GOS。嬰兒或較大嬰兒配制食品可以基于奶(牛奶，羊奶等)，嬰兒配方奶粉(IMF)或用于乳糖不耐受嬰兒的大豆或可以含有作為氮源的氨基酸，用于具有過敏或吸收相關(guān)問題的嬰兒。因此，可購得的嬰兒或較大嬰兒配制食品包含日推薦量的乳蛋白或大豆蛋白基料，脂肪，維生素，可消化的碳水化合物和礦物質(zhì)并可以是粉末，液體濃縮物或即可喂養(yǎng)的組合物。
改良的嬰兒或較大嬰兒配制食品的給予導(dǎo)致類似母乳喂養(yǎng)嬰兒的大腸環(huán)境，這可以通過糞便pH，細(xì)菌組成，SCFA產(chǎn)生和特征，氣體形成等的分析來測定。當(dāng)組合物是飲料時(shí)，優(yōu)選以每日基礎(chǔ)所食用或給予的體積(包括每日有效劑量)為約100至1500ml，更優(yōu)選約450至1000ml每天。當(dāng)配制食品是固體時(shí)，優(yōu)選以每日基礎(chǔ)所食用或給予的量(包括每日有效量)為約15至220g/天，優(yōu)選約70至150g/天的配制食品粉末。
對于嬰兒，每日有效量的GOS和多聚果糖為約1至30g/天，優(yōu)選約2至10g/天，優(yōu)選對于成人為約5至20g/天。
根據(jù)本發(fā)明的食品或食品補(bǔ)充組合物可以另外包含其他活性成分，如維生素(A，B1，B2，B3，B5，B12，C，D，E，K等)，益生菌(例如，雙歧桿菌，乳桿菌等)，其他益生元，纖維素，乳鐵蛋白，免疫球蛋白，核苷酸等?？梢源嬖诟鞣N量的營養(yǎng)物如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和其他碳水化合物(例如，可消化的碳水化合物，不可消化的碳水化合物，可溶或不可溶的碳水化合物)。通常嬰兒營養(yǎng)物中存在的不可溶不可消化的碳水化合物是大豆多糖，抗性淀粉，纖維素和半纖維素。通常用于嬰兒營養(yǎng)物中的可溶且可消化的碳水化合物是例如麥芽糖糊精，乳糖，麥芽糖，葡萄糖，果糖，蔗糖和其他單糖或雙糖或其混合物。組合物還可以包含其他無活性成分和載體，如例如，葡萄糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，淀粉，纖維素或纖維素衍生物，硬脂酸鎂，硬脂酸，糖精鈉，滑石，碳酸鎂等。組合物還可以包含水，電解質(zhì)，必需和非必需氨基酸，微量元素，礦物質(zhì)，纖維，甜味劑，調(diào)味料，色素，乳化劑和穩(wěn)定劑(如大豆卵磷脂，檸檬酸，單或雙甘油酯)，防腐劑，粘合劑，香料等。
適于組合物，尤其適于嬰兒食品或食品補(bǔ)充劑的脂質(zhì)是乳脂，植物脂質(zhì)，如低芥酸菜籽油，紅花油，向日葵油，橄欖油，魚油等，或其含有合適脂肪酸(多不飽和的和/或飽和的)的級分或其混合物。
適于組合物，尤其適于嬰兒食品或食品補(bǔ)充劑的蛋白質(zhì)包括酪蛋白，乳清，脫脂煉乳，大豆，牛肉，膠原蛋白，玉米和其他植物蛋白或水解蛋白，游離氨基酸等。優(yōu)選包含于嬰兒食品或食品補(bǔ)充劑組合物中的蛋白質(zhì)得到大量水解和/或部分水解來降低過敏風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明的嬰兒食品組合物優(yōu)選包含每日或每周膳食中必需的營養(yǎng)上有效量的所有維生素和礦物質(zhì)，如最小日推薦量。
一實(shí)施方案中，還可以基于(即，始于或包含)食品基料制得食品或食品補(bǔ)充組合物。例如，可以基于或包含乳制品，如發(fā)酵的乳制品，包括但不限于奶，酸奶基飲料或酪乳。這樣的組合物可以以本身已知的方法制備，例如，通過將有效量的多聚果糖和GOS或TOS加入合適的食品或食品基料中。其他合適的食品基料是植物基料，肉基料等。
根據(jù)本發(fā)明的食品或食品補(bǔ)充組合物可以用于治療和/或預(yù)防。這就是說可以在已經(jīng)診斷為胃腸道問題或疾病后，或者在癥狀發(fā)作之前(例如，高風(fēng)險(xiǎn)患者，可能產(chǎn)生胃腸道問題)將其給予患者。例如，如果觀察到與大腸的疾病或次最優(yōu)功能相關(guān)的病狀，如便秘，腸胃氣脹，過敏，絞痛，腹痛，腹部痙攣，IBD，IBS，組合物的給予將有助于重新建立健康的大腸環(huán)境或防止這樣癥狀的產(chǎn)生。
一實(shí)施方案中，預(yù)防性地給予組合物，來支持健康微生物菌叢的產(chǎn)生和/或健康的大腸環(huán)境?！敖】档拇竽c環(huán)境”指的是正常的腸生理機(jī)能和活性，尤其是營養(yǎng)物、水的正常吸收，粘膜對病原菌附著、群集和感染的抵抗力等，這可以通過糞便分析和氣體產(chǎn)生來測定。尤其指的是最佳的生理機(jī)能和活性。任何大腸的次最優(yōu)功能均導(dǎo)致所述的癥狀并可以通過糞便分析和/或氣體產(chǎn)生來測定。在此包括由次最優(yōu)功能引起的腸疾病或失調(diào)。
用于治療或預(yù)防腸失調(diào)或次最優(yōu)腸功能的癥狀如IBD，結(jié)腸炎，IBS和/或提高的屏障完整性的藥物組合物，可以包含其他生物活性成分，如藥物，生物活性蛋白或肽，益生菌和其他。對于食品或食品補(bǔ)充組合物所述的實(shí)施方案也適用于藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的組合物根據(jù)給予的方法可以是任何劑型，如液體，固體，半固體，片劑，飲料，粉末等。優(yōu)選口服給予患者，盡管對于一些用途，直腸或管飼(使用直接進(jìn)入胃，十二指腸，或小腸或大腸的管子)可能是合適的。
本發(fā)明的再一實(shí)施方案提供了制備根據(jù)本發(fā)明組合物的方法，通過將協(xié)同有效量的GOS(或TOS)和多聚果糖加入合適的組合物基料中，如上所述。
以下非限制性實(shí)施例描述了GOS和多聚果糖的協(xié)同效應(yīng)。除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施將使用分子生物學(xué)，藥物學(xué)，免疫學(xué)，病毒學(xué)，微生物學(xué)或生物化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)方法。這樣的技術(shù)描述于Sambrook和Russell(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA和Remington’s Pharmaceutica1 Sciences，Mark PublishingCompany，Philadelphia，Pa.，第17版(1985)，MicrobiologyALaboratory Manual(第6版)James Cappuccino，Laboratory Methodsin Food Microbiology(第3版)，W.Harrigan(作者)Academic Press，在此全部引入作為參考。


圖1用從嬰兒獲得的新鮮糞便體外發(fā)酵TOS，菊粉，TOS/菊粉9/1的混合物以及寡果糖和菊粉1/1的混合物48小時(shí)后醋酸，丙酸和丁酸的形成。
圖2用從嬰兒獲得的新鮮糞便體外發(fā)酵TOS，菊粉，TOS/菊粉9/1的混合物以及寡果糖和菊粉1/1的混合物48小時(shí)后，所形成的醋酸，丙酸和丁酸的相對量。對于每種測試?yán)w維，將所形成的醋酸加上丙酸加上丁酸的總和設(shè)定為100％。
圖3用從嬰兒獲得的新鮮糞便體外發(fā)酵TOS，菊粉，TOS/菊粉9/1的混合物以及寡果糖和菊粉1/1的混合物48小時(shí)后氣體的形成。所形成的氣體量(ml與所形成的總SCFA量)(每g纖維mmol)相關(guān)。
圖4SCFA(以摩爾為基準(zhǔn)90/5/5比例的醋酸/丙酸/丁酸)的混合物和L一乳酸的影響。
圖4A0，0.1，0.5，1和4mM SCFA混合物或L-乳酸對CCD18/T84共培養(yǎng)物(n＝6)中muc-2表達(dá)的影響。誤差棒表示SEM。在1和4mM SCFA混合物和0.5，1和4mM L-乳酸下的提高是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
圖4B0，50，100，250和500μM SCFA混合物或乳酸對CCD18細(xì)胞(n＝7)中自發(fā)PGE1和PEG2應(yīng)答的影響。誤差棒表示SEM。在100，250和500μM SCFA混合物和100μM L-乳酸下PGE1的增加是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。在100，250和500μM SCFA混合物和250μM L-乳酸下PGE2的增加是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(P＜0.05)。
圖5醋酸鈉和L-乳酸鈉對結(jié)腸遠(yuǎn)端和近側(cè)部分的自發(fā)收縮的影響?？瞻?設(shè)定為1g的張力)為0％。將加入40mM KCl后的張力設(shè)定為100％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1體外發(fā)酵研究表明對發(fā)酵模式的協(xié)同效應(yīng)
1.1材料和方法微生物從奶瓶喂養(yǎng)嬰兒的新鮮糞便中獲得微生物。收集1至4個(gè)月大嬰兒的新鮮糞便材料并在2小時(shí)內(nèi)放入防腐培養(yǎng)基中。
組合物/底物作為底物，使用9/1(w/w)比例的益生元(TOS；TOS(來自VivinalGOS，Borculo Domo Ingredients，荷蘭)和菊粉(來自O(shè)rafti的raftilinHP，比利時(shí))的混合物；菊粉；1/1(w/w)比例的寡果糖和菊粉混合物，或無(空白)。
培養(yǎng)基McBain & MacFarlane培養(yǎng)基緩沖的蛋白胨水3.0g/l，酵母提取物2.5g/l，粘蛋白(刷狀緣)0.8g/l，胰蛋白胨3.0g/l，L-半胱氨酸-HCl 0.4g/l，膽汁鹽0.05g/l，K2HPO4.3H2O 2.6g/l，NaHCO30.2g/l，NaCl 4.5g/l，MgSO4.7H2O 0.5g/l，CaCl20.228g/l，F(xiàn)eSO4.7H2O0.005g/l。將500ml斯科特瓶裝滿培養(yǎng)基并在121℃滅菌15分鐘。
緩沖培養(yǎng)基K2HPO4.3H2O 2.6g/l，NaHCO30.2g/l，NaCl 4.5g/l，MgSO4.7H2O 0.5g/l，CaCl20.228g/l，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.005g/l。用K2HPO4或NaHCO3將pH調(diào)節(jié)至6.3±0.1。將500ml斯科特瓶裝滿培養(yǎng)基并在121℃滅菌15分鐘。
防腐培養(yǎng)基緩沖蛋白胨20.0g/l，L-半胱氨酸-HCl 0.5g/l，巰基醋酸鈉0.5g/l，每升1片刃青天。用1M NaOH或HCl將pH調(diào)節(jié)至6.7±0.1。將培養(yǎng)基在微波中煮沸。向30ml血清瓶裝入25ml培養(yǎng)基并在121℃滅菌15分鐘。
將新鮮糞便與防腐培養(yǎng)基混合。新鮮糞便以這種形式可以在4℃保存幾個(gè)小時(shí)。
糞便懸浮液將糞便的保存溶液在13,000rpm離心15分鐘。除去上清液并將糞便與McBain & Mac Farlane培養(yǎng)基以1∶5的重量比混合。
發(fā)酵將3.0ml糞便懸浮液和85mg葡萄糖或益生元或沒有添加(空白)合并于瓶子中并徹底混合。抽取t＝0的樣品(0.5ml)。將所得到的2.5ml懸浮液放入裝滿60ml緩沖培養(yǎng)基的60ml瓶子中的透析管中。將瓶子蓋緊并在37℃溫育。在3，24和48小時(shí)用皮下注射器從透析管(0.2ml)或從分析緩沖液(1.0ml)中取出樣品并立即放在冰上來停止發(fā)酵。
短鏈脂肪酸和乳酸的測定參見實(shí)施例2。將測定值對空白來做校正。
氣體測定在t＝3，t＝24和t＝48，通過氣壓計(jì)(Druckmessumformer，Econtronic，德國)來測量60ml瓶子頂部空間中的氣壓，通過將6ml皮下注射器通過瓶子的橡膠蓋刺入并通過該注射器從頂部空間抽取氣體直至氣壓為0巴。注射器中的體積是所形成氣體的體積。將測定值對空白來做校正。
1.2結(jié)果使用以下樣品來進(jìn)行體外發(fā)酵1.)85mg TOS(來自VivinalGOS，Borculo Domo Ingredients，荷蘭)2.)85mg菊粉(RaftilinHP，來自O(shè)rafti，比利時(shí))3.)85mg TOS/菊粉，TOS/菊粉比例為9/1(w/w)和4.)85mg OF(raftiloseP95，來自O(shè)rafti，比利時(shí))/菊粉(raftilinHP)，OF/菊粉比例為1/1(w/w)。
所產(chǎn)生的SCFA總量圖1中顯示了結(jié)果。圖1顯示了TOS/菊粉混合物導(dǎo)致每g纖維的SCFA量顯著高于單個(gè)成分的，而且還高于低多聚果糖(OF)和菊粉混合物的。此外測試的是85mg比例為1/1的TOS/菊粉(數(shù)據(jù)未顯示)，其也提供了協(xié)同效應(yīng)。
L-和D-乳酸產(chǎn)生只在t＝3測定了L-和D-乳酸。表1表明在該時(shí)間點(diǎn)所形成的代謝終產(chǎn)物。
表1-體外發(fā)酵3小時(shí)后所形成的代謝終產(chǎn)物(mmol/g纖維)

此外，對于TOS/菊粉混合物，與單個(gè)成分TOS和菊粉相比較，觀察到乳酸的協(xié)同較多形成。與OF和菊粉的混合物相比較，乳酸百分比(基于總酸)和L-/D-乳酸比例在TOS/菊粉混合物中較高。
SCFA的相對量圖2顯示了48小時(shí)后發(fā)酵產(chǎn)物的模式。TOS/菊粉的混合物顯示出比單個(gè)成分顯著高的醋酸百分比，其還高于低多聚果糖(OF)和菊粉混合物的。母乳喂養(yǎng)嬰兒的糞便顯示出高百分比的醋酸，因此TOS/菊粉混合物導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物的模式最類似母乳喂養(yǎng)嬰兒的。
氣體形成圖3中顯示了結(jié)果。關(guān)于氣體形成，每mmol所形成的SCFA中，TOS和TOS/菊粉混合物形成最低量的氣體。菊粉和OF/菊粉混合物表明更高量的氣體形成。在TOS/菊粉混合物中每mmol所形成的SCFA中氣體量最低。
SCFA形成的動力學(xué)表2表明了SCFA形成的動力學(xué)。TOS/菊粉的組合在24至48小時(shí)之間仍然顯示出高的SCFA形成，表明在結(jié)腸遠(yuǎn)側(cè)部分中仍然形成SCFA并對結(jié)腸滲透性，粘液形成和抗致病效果等具有有益效果。同樣在頭3小時(shí)內(nèi)，形成最高量的SCFA，和人乳低聚糖的情況一樣(數(shù)據(jù)未顯示)。由于抗致病效果，結(jié)腸開端處的快速發(fā)酵是重要的。
表2SCFA形成(mmol)的動力學(xué)SCFA(校正的空白)

OF＝低多聚果糖實(shí)施例2使用TOS/菊粉的臨床研究醋酸的相對增加和丁酸的相對減少與雙歧桿菌的增加無關(guān)。TOS和菊粉具有協(xié)同效應(yīng)。
2.1材料和方法在懷孕的最后三個(gè)月，招募了63名已經(jīng)決定母乳喂養(yǎng)的孕婦和57名選擇不母乳喂養(yǎng)的孕婦。在分娩后3天內(nèi)登記正常出生體重的嬰兒，沒有先天性異常，先天病或胃腸道疾病。研究得到醫(yī)學(xué)中心倫理委員會，St.Radboud，Ni jmegen，荷蘭的批準(zhǔn)。在研究登記之前從雙親獲得書面的知情同意。
將已經(jīng)決定不母乳喂養(yǎng)母親的嬰兒隨機(jī)并雙盲分配到兩個(gè)配方組(OSF，OF)中的一個(gè)。標(biāo)準(zhǔn)配方組(SF；n＝19，接受常規(guī)的，無補(bǔ)充的嬰兒配方奶粉(Nutrilon I，Nutricia，荷蘭)。表3中給出了131g/l標(biāo)準(zhǔn)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)配方的主要組成數(shù)據(jù)。益生元配方組(OSF；n＝19)接受補(bǔ)充了6g/l轉(zhuǎn)半乳寡聚糖(TOS；Vivinal GOS，Borculo DomoIngredients，Zwolle，荷蘭)和菊粉(PF；RaftilineHP，Orafti活性食品配料，Tienen，比利時(shí))混合物的相同標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配制食品?；旌衔锇?0％TOS和10％菊粉(多聚果糖)。在研究階段的過程中隨意喂養(yǎng)研究配方。在研究過程中激勵決定母乳喂養(yǎng)的母親繼續(xù)母乳喂養(yǎng)并在需要時(shí)得到哺乳顧問的支持。在母乳喂養(yǎng)結(jié)束時(shí)，她們的嬰兒接受兩種配方中的一種。在每次探望過程中通過計(jì)數(shù)未使用配方罐的數(shù)量來評定順應(yīng)性并與所記錄的食品攝入的食用配方量相比較。
表3每升標(biāo)準(zhǔn)配方的組成

問卷在分娩之前收集母親的人口，臨床和人體測量數(shù)據(jù)。在分娩后第5天從母親獲得分娩的信息。在出生后第5，10，28天從問卷獲得嬰兒食品攝入，配方耐受性，糞便特征，健康和人體測量的信息，此后每四周一次直至研究結(jié)束。
糞便樣品在出生后第5，10，28天，請父母從他們的嬰兒獲取糞便樣品，此后每4周一次。由父母在排便后盡快地從尿布獲取樣品，收集于糞便容器(Greiner Labortechnik，荷蘭)中并立即存儲于-20℃，并在便攜式冰箱中轉(zhuǎn)運(yùn)至研究者的實(shí)驗(yàn)室。
糞便樣品的制備為了SCFA的測定，將1g樣品在冰水中融化，10X稀釋于MilliQ中，并使用stomacher(IUL Instruments，Barcelona，西班牙)均質(zhì)化10分鐘。將350μl均質(zhì)糞便與200μl 5％(v/v)甲酸，100μl1.25g/l2-乙基丁酸(Sigma-Aldrich，Zwijindrecht，荷蘭)和350μl MilliQ混合。將樣品在14,000rpm離心5分鐘以除去大的顆粒并將上清液存儲在-20℃。為了FISH分析和乳酸測量，將樣品在冰水中融化，10X(w/v)稀釋于磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4(PBS)中并使用stomacher均質(zhì)化10分鐘。將均質(zhì)糞便存儲于-20℃。
熒光原位雜交如所述的(Langendijk等，1995，Appl.Environ.Microbiol.613069-3075)進(jìn)行FISH分析，所述方法略有改變。將多聚甲醛固定的樣品施用于明膠涂敷的載玻片(PTFE涂敷的8-孔[1cm2/孔]載物片，CBN實(shí)驗(yàn)室供應(yīng)商，Drachten，荷蘭)上并空氣干燥。將干燥的樣品在96％的乙醇中脫水10分鐘。將含有10ng/l Cy3標(biāo)記的雙歧桿菌特異性探針Bif 164 mod(5’-CAT CCG GYA TTA CCA CCC)雜交緩沖液(20mm Tris-HCl，0.9M NaCl，0.1％SDS[pH7.1])預(yù)熱并加入干燥的樣品中。Bif 164 mod是探針S-G-Bif-a-0164-a-A-18的修飾形式(Langendijk等，1995，Appl.Environ.Microbiol.613069-3075)。將載玻片在50℃的黑暗潮濕箱中溫育過夜。雜交后，將載玻片在50ml預(yù)熱的洗滌緩沖液(20mM Tris-HCl，0.9M NaCl[pH7.2])中洗滌30分鐘并在MilliQ中簡單漂洗。為了將所有細(xì)菌染色，將樣品與PBS中的0.25ng/l 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在室溫溫育5分鐘。DAPI染色后，將載玻片在MilliQ中簡單漂洗，干燥，置于Vactashield(Vector Laboratories，Burlingame，CA，U.S.A)并蓋上蓋玻片。使用Olympus AX70落射熒光顯微鏡用自動圖像分析軟件(Analysis3.2，Soft Imaging Systems GmbH，Münster，德國)來自動分析載玻片。通過分析25個(gè)隨機(jī)選擇的顯微鏡位置來測定每個(gè)樣品中的雙歧桿菌百分比。在每個(gè)位置上，通過使用DAPI過濾裝置(SP100，Chroma Technology Corp.，Brattleboro，U.S.A.)計(jì)數(shù)所有的細(xì)胞和使用Cy3過濾裝置(41007，Chroma Technology，Brattleboro，U.S.A.)計(jì)數(shù)所有的雙歧桿菌來測定雙歧桿菌的百分比。
短鏈脂肪酸分析通過配備有火焰電離檢測儀的Varian 3800氣相色譜儀(GC)(Varian Inc.，Walnut Creek，U.S.A.)來定量測定短鏈脂肪酸(SCFA)，醋酸，丙酸，正丁酸，異丁酸和正戊酸。將0.5μl樣品在80℃注射于柱子(Stabilwax，15×0.53nm，膜厚度1.00μm，Restek Co.，U.S.A.)中，使用氦作為載氣(3.0psi)。注射樣品后，以16℃/分鐘的速度將烘箱加熱至160℃，接著以20℃/分鐘的速度加熱至220℃并最終維持于220℃的溫度1.5分鐘。注射器和檢測儀的溫度是200℃。將2-乙基丁酸用作內(nèi)標(biāo)。
乳酸分析將均質(zhì)糞便在冰上融化并在14,000rpm離心5分鐘。將100μl上清液在100℃加熱10分鐘來滅活所有的酶。通過酶來測定乳酸，使用含有D-和L-乳酸脫氫酶的L-乳酸檢測試劑盒(BoehringerMannheim，Mannheim，德國)。只在那些足夠大的糞便樣品中測定乳酸。
pH分析在-20℃存儲后，將糞便樣品融化并在室溫使用裝有Inlab 423pH電極(Mettler-Toledo，Columbo，U.S.A.)的Handylab pH計(jì)(ScottGlas，Mainz，德國)直接測量糞便中的pH。
數(shù)據(jù)分析在研究之前，功率計(jì)算表明為了檢測干預(yù)配方組和30％標(biāo)準(zhǔn)配方組之間的雙歧桿菌百分比差異，具有25％的SD，每組應(yīng)當(dāng)包括13名嬰兒。由于預(yù)計(jì)配方組中30％退出，研究中包括的嬰兒比計(jì)算的多。將統(tǒng)計(jì)包SPSS(版本11/0)用于結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。通過視覺觀察概率正態(tài)分布曲線來檢測所有值的正態(tài)性。使用方差分析測試組之間的雙歧桿菌百分比，pH，SCFA和乳酸相對量的差異顯著性。在顯著差異(p＜0.05)的情況中，此后(post hoc)使用Bonferroni檢驗(yàn)來比較組。因?yàn)椴豢赡茈p盲指定母乳和奶瓶喂養(yǎng)并確保適當(dāng)?shù)碾S機(jī)化，所以沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來比較母乳喂養(yǎng)與任何配方喂養(yǎng)組。只給出了該時(shí)間點(diǎn)嬰兒只喂養(yǎng)母乳時(shí)的母乳喂養(yǎng)組的數(shù)據(jù)。
2.2結(jié)果總地，包括120名嬰兒，57名嬰兒在出生后直接開始喂養(yǎng)配方奶粉并在配方組中等分。在出生后直接喂養(yǎng)母乳的63名嬰兒中，24名在16周大之前換成配方奶粉喂養(yǎng)，5名嬰兒退出。表4中顯示了研究對象的特征。配方組中，在出生后的頭16周內(nèi)，9名嬰兒退出研究(SF中4名，OSF組中5名)。退出的原因包括絞痛，懷凝牛奶過敏，便秘和實(shí)際問題。
表4-研究對象的特征

糞便雙歧桿菌表5和表5中的量中顯示了喂養(yǎng)組5天，10天，4，8，12和16周大糞便中的雙歧桿菌百分比。從所有年齡的總細(xì)菌計(jì)數(shù)看，OSF組傾向于具有比SF組高的雙歧桿菌％，但是差異不是統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。出人意料地，母乳喂養(yǎng)嬰兒中的雙歧桿菌百分比也相對低且和配方奶粉喂養(yǎng)組一致。
初步數(shù)據(jù)還表明BF和OSF組中乳桿菌的增加，但是糞便菌叢中乳桿菌的量至少比雙歧桿菌低至少一個(gè)數(shù)量級，整個(gè)模式的改變非常小。
pH結(jié)果表6中顯示了配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒糞便中所測量的pH值。在母乳喂養(yǎng)的嬰兒中發(fā)現(xiàn)了最低的pH。喂養(yǎng)OSF配方嬰兒糞便的糞便pH低于SF組(p＜0.045，所有年齡，除了第5天)。
SCFA結(jié)果以下表5中顯示了糞便中的SCFA總量。
表6中顯示了總SCFA中不同SCFA的百分比。發(fā)現(xiàn)配方組之間總SCFA濃度不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。此外，SCFA的量與其他喂養(yǎng)組的SCFA量相當(dāng)。然而，10天后，可以在喂養(yǎng)OSF或母乳嬰兒之間觀察到與喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉嬰兒相比較的SCFA分布特征的差異。當(dāng)與喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配方奶粉的嬰兒相比較時(shí)，喂養(yǎng)含有GOS和多聚果糖配方奶粉和喂養(yǎng)母乳的嬰兒具有較高的醋酸百分比和較低的丙酸，丁酸，iC4-6 SCFA百分比。
乳酸結(jié)果表5中顯示了所有組的乳酸濃度(mmol/kg糞便)。從5天大開始，與標(biāo)準(zhǔn)配方組相比較，OS配方(未顯示)和母乳組具有較高量的乳酸。乳酸的相對量(作為SCFA和乳酸總和的百分比)在母乳喂養(yǎng)嬰兒中最高而在標(biāo)準(zhǔn)配方喂養(yǎng)嬰兒中最低。喂養(yǎng)含有TOS/菊粉配方的嬰兒具有中間相對量的醋酸。16周OSF喂養(yǎng)嬰兒中的乳酸百分比(相對于總酸)顯著不同于SF嬰兒的。
表5-出生和16周大之間乳酸和總SCFA(mmol/kg糞便)以及雙歧桿菌(*1.1013kg/糞便)濃度、pH。平均值±SEM。除了pH，發(fā)現(xiàn)沒有顯著差異。

表6-出生和16周之間的SCFA(總SCFA的％)，乳酸(總酸的％)，雙歧桿菌％的相對量

與SF相比較，P＜0.05；SF＝標(biāo)準(zhǔn)配方喂養(yǎng)，OSF＝補(bǔ)充了GOS+菊粉的SF；BF＝母乳喂養(yǎng)。
上述證明了喂養(yǎng)該GOS和菊粉組合的嬰兒糞便中，降低了pH，形成了更多的乳酸，且所形成的酸(醋酸和乳酸)模式與母乳喂養(yǎng)嬰兒的更相似，且該效果不能歸因于雙歧桿菌的數(shù)量增加。
實(shí)施例3-乳酸和SCFA混合物對Muc-2，PGE1和PGE2表達(dá)的有益效果3.1材料和方法如Willemsen，LEM，Koetsier MA，van Deventer SJH，van TolEAF(2003)，Gut 521442-1447中所述的來分析乳酸和SCFA混合物的效果，具有以下的改進(jìn)測試了乳酸和90/5/5醋酸/丙酸/丁酸混合物。對于粘液產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)，使用CCD18和T84細(xì)胞共培養(yǎng)物，而對于PGE1和PGE2產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)，使用CCD18細(xì)胞的單培養(yǎng)物。
3.2結(jié)果90/5/5(醋酸/丙酸/丁酸)混合物中的SCFA和L-乳酸劑量依賴性地誘導(dǎo)CCD18和T84細(xì)胞共培養(yǎng)物中的MUC-2表達(dá)，如圖4A中可看到的。此外，CCD18細(xì)胞中PGE1和PGE2的濃度提高，如圖4B中可看到的。在所加入有機(jī)酸的較高濃度下，提高達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
實(shí)施例4乳酸對結(jié)腸收縮的效果4.1材料和方法將雄性Wistar大鼠(CKP/Harlan，Wageningen/Horst，荷蘭)飼養(yǎng)在受控溫度和光照周期的條件下并可自由攝取食物顆粒和飲水。用N2O，O2和異氟醚混合物來麻醉動物，打開腹部并立即取出結(jié)腸。將組織放入pH7.4的Krebs-Henseleit緩沖液(以mM計(jì)的組成118.0NaCl，4.75KCl，1.18MgSO4，2.5CaCl2，10葡萄糖，1.17KH2PO4和24.9NaHCO3)中。
將結(jié)腸切成遠(yuǎn)側(cè)和近側(cè)部分并用Krebs-Henseleit緩沖液沖洗，同時(shí)輕柔地?cái)D出糞便內(nèi)含物。為了盡可能地接近體內(nèi)條件，將1cm完整節(jié)段縱向連接于20ml含有Krebs-Henseleit緩沖液的水夾套(37℃)器官浴(Schuler，HSE，德國)中的等容測力傳感器(F30型372，HSE，德國)上，向緩沖液中連續(xù)充入95％O2-5％CO2。然后將節(jié)段逐漸拉伸至1g的靜止張力并使其平衡45分鐘，伴隨間歇的沖洗。通過傳感器放大器組件(HSE，德國)來放大靜止和響應(yīng)不同刺激的節(jié)段張力并在多筆記錄儀(Pikadenki，HSE，德國)上記錄。
將節(jié)段與40mM KCl溫育5分鐘并測量收縮性反應(yīng)。通過5分鐘間隔的三次連續(xù)洗滌來洗掉KCl。然后用高達(dá)100mM的遞增濃度的醋酸或L-乳酸鈉來溫育節(jié)段。酸溶液在蒸餾水中新鮮制備。將NaOH加入醋酸中來獲得中性pH。與脂肪酸的溫育結(jié)束時(shí)，加入40mM KCl來測定對KCl的收縮性反應(yīng)是否受到脂肪酸的影響。在新溫育之前，使節(jié)段在新鮮Krebs-Henseleit緩沖液中平衡45分鐘，伴隨間歇的洗滌。
實(shí)驗(yàn)方案由結(jié)腸的兩個(gè)近側(cè)和兩個(gè)遠(yuǎn)側(cè)部分組成。為了數(shù)據(jù)分析(n＝3)，將通過刺激誘導(dǎo)的收縮水平定義為5分鐘溫育后以g計(jì)的張力。從相同節(jié)段(近側(cè)或遠(yuǎn)側(cè))獲得的數(shù)據(jù)用于計(jì)算平均值，且每個(gè)節(jié)段作為其自身的對照樣品。
4.2結(jié)果如可從圖5中所看到的，醋酸鈉，且尤其是L-乳酸鈉降低了緊張性收縮的張力。結(jié)腸遠(yuǎn)側(cè)部分的松弛效果大于結(jié)腸近側(cè)部分的。
此外，當(dāng)加入醋酸鈉和L-乳酸鈉時(shí)，在結(jié)腸的近側(cè)部分自發(fā)收縮數(shù)量、位相性收縮降低，而在結(jié)腸的遠(yuǎn)側(cè)部分沒有觀察到效果。
然而，在25mM醋酸鈉和L-乳酸鈉存在或不存在時(shí)，結(jié)腸近側(cè)部分中作為對KCl應(yīng)答的緊張性收縮是類似的。在較高濃度下，甚至在加入KCl后，觀察到顯著松弛。
權(quán)利要求
1.半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備治療或預(yù)防腹脹，氣體形成，腹痛和/或腸胃氣脹的組合物的用途。
2.半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備治療或預(yù)防過敏，濕疹或特應(yīng)性疾病的組合物的用途。
3.半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備松弛結(jié)腸的收縮，優(yōu)選緊張性和/或位相性收縮的組合物的用途。
4.半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備治療或預(yù)防腸易激綜合征或炎性腸病的組合物的用途。
5.半乳寡聚糖和多聚果糖用于制備提高腸屏障功能和/或大腸粘液產(chǎn)生的組合物的用途。
6.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中-提高了腸和/或糞便短鏈脂肪酸水平，-提高了相對于總短鏈脂肪酸的腸和/或糞便醋酸水平，-提高了腸乳酸水平，-降低了腸和/或糞便pH，-降低了相對于總短鏈脂肪酸的腸和/或糞便丁酸，異丁酸，戊酸和/或異戊酸的總和，-減少了腸的氣體形成，而對腸雙歧桿菌的總數(shù)和/或相對數(shù)量沒有顯著影響。
7.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中半乳寡聚糖多聚果糖含量的比例為3∶97至97∶3，優(yōu)選5∶95至95∶5，更優(yōu)選90∶10至45∶55。
8.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中半乳寡聚糖是轉(zhuǎn)半乳寡聚糖和/或多聚果糖是菊粉。
9.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中多聚果糖是具有20或更高平均聚合度的菊粉。
10.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述組合物適于將糞便和/或腸pH降低至低于pH6，優(yōu)選至pH5.75或更低，且其中所述組合物適于口服施用于嬰兒。
11.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述組合物適于將腸和/或糞便乳酸提高至高于約10mmol/kg糞便，且其中所述組合物適于口服施用于嬰兒。
12.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述組合物適于將腸和/或糞便醋酸提高至高于約85％的總SCFA。
13.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中所述組合物適于將腸和/或糞便丁酸，異丁酸，戊酸和異戊酸的總和降低至低于7％的總SCFA。
14.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，用于促進(jìn)在結(jié)腸開端，中部和末端產(chǎn)生短鏈脂肪酸。
15.根據(jù)之前任一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中組合物是食品組合物或食品補(bǔ)充組合物，優(yōu)選是嬰兒營養(yǎng)物，更優(yōu)選是嬰兒或較大嬰兒配制食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及益生元領(lǐng)域。提供了含有協(xié)同有效量的多聚果糖和半乳寡聚糖(GOS)組合物的用途。
文檔編號A61K31/01GK1964638SQ200580018353
公開日2007年5月16日 申請日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月17日
發(fā)明者G·施佩爾曼斯, M·J·A·P·戈韋斯, J·克諾爾, E·A·F·范托爾 申請人:紐迪西亞公司