一種測定低聚半乳糖平均聚合度的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種測定低聚半乳糖平均聚合度的方法，包括：1）取低聚半乳糖樣品，用超純水溶解后用微孔濾膜過濾，得到待測液；2）使用鈣型陽離子交換柱對待測液進行高效液相色譜法檢測，并根據(jù)檢測結果算得到低聚半乳糖樣品中半乳糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖和聚合度為5及以上的多糖的百分比含量；3）使用氨基柱對待測液進行高效液相色譜法檢測，并根據(jù)檢測結果計算得到二糖中乳糖、半乳二糖和異乳糖的百分比含量；4）計算聚合度為2的低聚糖在總糖中的百分比含量；5)計算不同聚合度的低聚半乳糖組分在總低聚半乳糖中的百分比含量；6)計算所述低聚半乳糖樣品中低聚半乳糖的平均聚合度。本發(fā)明方法可準確檢測出低聚半乳糖的平均聚合度。
【專利說明】一種測定低聚半乳糖平均聚合度的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種測定平均聚合度的方法，尤其適用于測定低聚半乳糖的平均聚合 度。

【背景技術】
[0002] 低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，G0S)是一種功能性低聚糖，主要具有如 下的生理功能：促進雙歧桿菌的增值，改善礦物質元素的吸收和防止骨質減少，預防、治療 便秘；改善脂質代謝，降低血清膽固醇的含量；生成營養(yǎng)物質，改善營養(yǎng)狀況。我國衛(wèi)生部 已經批準G0S為新資源食品，允許添加在嬰幼兒食品、乳制品、飲料、焙烤食品、糖果中。
[0003] 在生產中，以乳糖為原料，通過β-半乳糖苷酶的轉糖苷作用生產的G0S，所以G0S 的分子結構一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接個半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/ Gal (η為(Γ6)。因此，商業(yè)化的G0S通常會是葡萄糖、半乳糖、乳糖、半乳二聚糖、半乳三聚 糖、半乳四聚糖和半乳五聚糖的混合物。影響形成的低聚糖結構和比例的主要因素依賴于 生產使用的β-半乳糖苷酶的來源和生產工藝。目前已經測得的G0S不同聚合度的糖苷鍵 結構式超過15種。
[0004] G0S組分較多，用外標法檢測G0S時，存在不清楚其中有幾種組分，購買不到標準 品等問題。所以，美國A0AC官方公布的標準方法--A0AC2001. 02中采用來源于米曲霉的 β -半乳糖苷酶把乳糖和G0S水解，利用離子色譜檢測水解前和水解后樣品中的半乳糖、乳 糖的含量，然后用總水解液中半乳糖含量減掉樣品中游離的半乳糖和乳糖水解來源的半乳 糖含量，計算出來源于G0S的半乳糖含量，再通過對樣品中G0S的平均聚合度計算得到樣品 中G0S的含量。在實際檢測中，由于G0S組分的復雜性，G0S的聚合度沒有辦法準確得到， 因此不適合實際使用。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種測定低聚半乳糖平均聚合度的方法，可準確檢測出低聚 半乳糖的平均聚合度。
[0006] 本發(fā)明提供了一種測定低聚半乳糖平均聚合度的方法，包括： 1) 取低聚半乳糖樣品，用超純水溶解后用微孔濾膜過濾，得到待測液； 2) 使用鈣型陽離子交換柱對待測液進行高效液相色譜法檢測，并根據(jù)檢測結果計算得 到低聚半乳糖樣品中半乳糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖和聚合度為5及以上的多糖的百分 比含量； 3) 使用氨基柱對待測液進行高效液相色譜法檢測，并根據(jù)檢測結果計算得到二糖中乳 糖、半乳二糖和異乳糖的百分比含量； 4) 由公式計算聚合度為2的低聚糖在總糖中的 百分比含量，式中：慫為聚合度為2的低聚糖在總糖中的百分比含量為半乳二糖在二糖 中的百分比含量;r#為異乳糖在二糖中的百分比含量為乳糖在二糖中的百分比含量； A為二糖在總糖中的百分比含量； 5) 由公式兄計算不同聚合度的低聚半乳糖組分在總低聚 半乳糖中的百分比含量，式中:兄為聚合度為η的低聚半乳糖組分在總低聚半乳糖中的百 分比含量&為聚合度為η的低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量為聚合度為2的 低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量;r,為聚合度為3的低聚半乳糖組分在總糖中的百 分比含量;A為聚合度為4的低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量;&為聚合度為5的 低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量； 6) 由公式十算低聚半乳糖樣品中低聚 半乳糖的平均聚合度，式中:/?為低聚半乳糖的平均聚合度;^為組分i的百分比含量，％ ; 為組分i的聚合度。
[0007] 在測定低聚半乳糖平均聚合度的方法的一種示意性實施方式中，所述使用鈣型 陽離子交換柱對待測液進行高效液相色譜法檢測的條件為：色譜柱為CH0-620分析柱，規(guī) 格為6. 5X300mm ;示差折光檢測器；流動相為超純水；色譜柱溫度為80°C ;流動相流量為 0. 5ml/min ;檢測器溫度為50°C ;進樣量為20 μ L ;在正式進樣檢測前，以超純水作為流動 相，以0. 5mL/min流速穩(wěn)定基線，當基線穩(wěn)定后即可進樣。
[0008] 在測定低聚半乳糖平均聚合度的方法的一種示意性實施方式中，所述使用氨基柱 對待測液進行高效液相色譜法檢測的條件為：色譜柱為氨基柱，規(guī)格為4. 6X 250mm ;示差 折光檢測器；流動相為乙腈：超純水=70 : 30 ;色譜柱溫度為35°C ;流動相流量為1. 0ml/ min ;檢測器溫度為40°C ;進樣量為20 μ L ;在正式進樣檢測前，以超純水作為流動相，以 1. OmL/min流速穩(wěn)定基線，當基線穩(wěn)定后即可進樣。
[0009] 本發(fā)明提供的一種測定低聚半乳糖平均聚合度的方法，可準確檢測出低聚半乳糖 的平均聚合度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 以下附圖僅對本發(fā)明做示意性說明和解釋，并不限定本發(fā)明的范圍。
[0011] 圖1是本發(fā)明第一實施例用CH0-620分析柱分析低聚半乳糖的色譜圖。
[0012] 圖2是本發(fā)明第一實施例用氨基柱分析低聚半乳糖的色譜圖。

【具體實施方式】
[0013] 為了對發(fā)明的技術特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結合以下實施例說明 本發(fā)明的【具體實施方式】。
[0014] 第一實施例。
[0015] 1材料與方法。
[0016] 1.1實驗材料 分別采購了 6份低聚半乳糖糖楽或糖粉樣品。氨基色譜柱（ZORBAX Carbohydrate，4. 6 mmX150 mm，70 --)，美國Agilent公司；CH0-620糖分析柱（6. 5X300mm)，上海安譜科學儀 器有限公司；超純水；乙腈(色譜純)，天津市天昊化工有限公司。
[0017] 1.2主要儀器 美國AgilentllOO高效液相色譜儀；自動進樣器；美國AgilentllOO示差折光檢測器； Millipore超純水處理裝置；電子分析天平。
[0018] 1.3實驗方法。
[0019] 1.3.1樣品處理 分別稱取低聚半乳糖原料l.OOOOg，用超純水溶解轉移到l〇〇mL容量瓶中，并稀釋到刻 度，搖勻，制成1%的樣品待測溶液，用〇. 2 μ m微孔濾膜過濾，得到待測液。
[0020] 1. 3. 2 CH0-620分析柱根據(jù)聚合度分析低聚半乳糖色譜條件 色譜柱為CH0-620分析柱（6. 5X300mm);示差折光檢測器；流動相為超純水；色譜柱 溫度為80°C ;流動相流量為0. 5ml/min ;檢測器溫度為50°C ;進樣量為20 μ L。在正式進樣 檢測前，以超純水作為流動相，以〇. 5mL/min流速穩(wěn)定基線，當基線穩(wěn)定后即可進樣。
[0021] 1. 3. 3氨基柱分析低聚半乳糖中二糖的組成色譜條件 色譜柱為氨基柱（4. 6X250mm);示差折光檢測器；流動相為乙腈：超純水=70 : 30; 色譜柱溫度為35°C ;流動相流量為1. 0ml/min ;檢測器溫度為40°C ;進樣量為20 μ L。在 正式進樣檢測前，以超純水作為流動相，以1. 〇mL/min流速穩(wěn)定基線，當基線穩(wěn)定后即可進 樣。
[0022] 1. 3. 4計算方法 采用面積歸一法完成低聚半乳糖樣品中各種組分相對百分含量的計算。
[0023] 2結果與討論。
[0024] 2. 1 CH0-620分析柱分析低聚半乳糖的結果 CH0-620分析柱使用Transgenomic樹脂作為填料，根據(jù)配體交換（ligand-exchange) 原理分析糖類物質，即糖分子端基異構碳上所帶羥基可被去質子化后帶上強的負電荷，這 些負電荷與Transgenomic糖柱的樹脂表面金屬離子所帶的正電荷之間的相互作用可使糖 分子被保留，低聚糖在洗脫時根據(jù)保留性質的強弱和分子量的大小達到分離。
[0025] 用CH0-620分析柱檢測時，以超純水作流動相。出峰順序依次是五糖(含聚合度5 以上的糖)、四糖、三糖、二糖、葡萄糖、半乳糖。用CH0-620分析柱分析低聚半乳糖的色譜圖 如圖1所示。采用面積歸一法，由儀器自帶的軟件系統(tǒng)計算6種商業(yè)化的低聚半乳糖原料 中各聚合度糖組分所占的比例，見表1。
[0026] 表1不同公司生產的低聚半乳糖原料的組成和比例

【權利要求】
1. 一種測定低聚半乳糖平均聚合度的方法，其特征在于，包括： 1) 取低聚半乳糖樣品，用超純水溶解后用微孔濾膜過濾，得到待測液； 2) 使用鈣型陽離子交換柱對所述待測液進行高效液相色譜法檢測，并根據(jù)檢測結果計 算得到所述低聚半乳糖樣品中半乳糖、葡萄糖、二糖、三糖、四糖和聚合度為5及以上的多 糖的百分比含量； 3) 使用氨基柱對所述待測液進行高效液相色譜法檢測，并根據(jù)檢測結果計算得到所述 二糖中乳糖、半乳二糖和異乳糖的百分比含量； 4) 由公式計算聚合度為2的低聚糖在總糖中的 百分比含量，式中： 慫為所述聚合度為2的低聚糖在總糖中的百分比含量； 為所述半乳二糖在所述二糖中的百分比含量； 為所述異乳糖在所述二糖中的百分比含量； 為所述乳糖在所述二糖中的百分比含量； &為所述二糖在總糖中的百分比含量； 5) 由公式兄計算不同聚合度的低聚半乳糖組分在總低聚 半乳糖中的百分比含量，式中： 兄為聚合度為η的低聚半乳糖組分在總低聚半乳糖中的百分比含量； Α為聚合度為η的低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量； Α為聚合度為2的低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量； r,為聚合度為3的低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量； &為聚合度為4的低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量； A為聚合度為5的低聚半乳糖組分在總糖中的百分比含量； 6) 由公式十算所述低聚半乳糖樣品中 低聚半乳糖的平均聚合度，式中： /?為低聚半乳糖的平均聚合度； 為.為組分i'的百分比含量，％; 為組分i的聚合度。
2. 如權利要求1所述的測定低聚半乳糖平均聚合度的方法，其中，所述使用鈣型陽離 子交換柱對所述待測液進行高效液相色譜法檢測的條件為：色譜柱為CH0-620分析柱，規(guī) 格為6. 5X300mm ;示差折光檢測器；流動相為超純水；色譜柱溫度為80°C ;流動相流量為 0. 5ml/min ;檢測器溫度為50°C ;進樣量為20 μ L ;在正式進樣檢測前，以超純水作為流動 相，以0. 5mL/min流速穩(wěn)定基線，當基線穩(wěn)定后即可進樣。
3. 如權利要求1所述的測定低聚半乳糖平均聚合度的方法，其中，所述使用氨基柱 對所述待測液進行高效液相色譜法檢測的條件為：色譜柱為氨基柱，規(guī)格為4. 6 X 250mm ; 示差折光檢測器；流動相為乙腈：超純水=70 : 30 ;色譜柱溫度為35°C ;流動相流量為 1. Oml/min ;檢測器溫度為40°C ;進樣量為20 μ L ;在正式進樣檢測前，以超純水作為流動 相，以1. OmL/min流速穩(wěn)定基線，當基線穩(wěn)定后即可進樣。
【文檔編號】G01N30/02GK104155389SQ201310176139
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月14日 優(yōu)先權日:2013年5月14日
【發(fā)明者】張志國, 王彩霞, 史玉東, 生慶海 申請人:內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司