一種低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法與應用,HMO是人乳中低聚糖中的主要成分。本方法利用低聚半乳糖GOS和唾液酸(N-Acetylneuraminicacid,Sia)通過CMP-Sia合成酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶,合成HMO類似物。低聚半乳糖(GOS)是利用β一半乳糖苷酶對乳糖進行水解及合成而得,它是母乳中低聚半乳糖的主要成分,一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1~7個半乳糖基,即(Gal)n-Glc/Gal(n=1-7)。本發(fā)明采用“一鍋雙酶法”合成了三種不同的GOS的唾液酸衍生物。解決了乳制品中唾液酸不足的問題,具有反應活性高,合成步驟簡單,產(chǎn)率高等優(yōu)點,是一種新型功能的低聚糖,具有廣闊的應用前景。
【專利說明】一種低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法
[0001]
【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于糖工程【技術領域】,涉及一種ΗΜ0類似物的酶合成方法,特別是涉及到 一種低聚半乳的唾液酸衍生物及其合成方法與應用。
【背景技術】
[0003] ΗΜ0在嬰兒的發(fā)育過程中起著非常重要的作用,ΗΜ0由唾液酸殘基部分和多糖兩 部分組成。人母乳中含量較多,嬰兒體內(nèi)的雙歧桿菌菌群的建立很大程度上依賴母乳中的 G0S成分。含有唾液酸殘基的低聚半乳糖廣泛存在于母乳中。唾液酸在嬰兒的早期生長中 發(fā)揮著重要的作用,唾液酸殘基具有抑制病毒,細菌和神經(jīng)毒素的功能,新生兒合成的唾液 酸很有限。因此,人乳中的唾液酸對于保證嬰兒正常的生長發(fā)育至關重要。
[0004] 低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,G0S)是一種具有天然屬性的功能性 低聚糖,其分子結(jié)構一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1~7個半乳糖基,即Gal-(Gal) n-Glc/Gal(n為0-6)。在自然界中,動物的乳汁中存在微量的G0S,而人母乳中含量較多, 嬰兒體內(nèi)的雙歧桿菌菌群的建立很大程度上依賴母乳中的G0S成分。
[0005] 唾液酸(Sialic acid,SA),是一類含9個碳原子的羧基化單糖酰化衍生物的總 稱,在人體的唾液酸主要為N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸兩種,大多由葡萄糖代謝 生成。唾液酸廣泛分布于真核細胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖鏈的最末端,是細胞膜上糖蛋 白、糖脂的重要成分。根據(jù)唾液酸與糖殘基的連接方式可將其分為α 2, 3-SA、α 2, 6-SA及 α 2, 8-SA三大類。血清唾液酸來源于細胞表面,以糖結(jié)合唾液酸和脂結(jié)合唾液酸兩種形式 存在。除硫酸化的糖類外,唾液酸是糖蛋白在生理pH條件下唯一帶凈負電荷的單糖。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明在低聚半乳糖的基礎上通過酶合成的方法,提供了一種新型的低聚半乳糖 的唾液酸衍生物以及他們的的制備和純化的方法。
[0007] 本發(fā)明的低聚半乳的唾液酸衍生物具有合成步驟簡便,產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定,轉(zhuǎn)化效率 高的特點,可以很好的解決乳制品中唾液酸缺乏或者含量不足的問題。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明公開了如下的技術內(nèi)容: 利用低聚半乳糖和唾液酸通過CMP-Sia合成酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶合成的ΗΜ0類似物,具 有如下的結(jié)構: Pmstl酶催化合成的2, 3-唾液酸連接的G0S唾液酸衍生物 Sia-a2,3-(Gal)n-Glc (n=l-7) Pd2, 6ST酶催化合成的2, 6-唾液酸連接G0S唾液酸衍生物 Sia-a2,6-(Gal)n-Glc (n=l-7) CSTII酶催化合成的2, 3/8-唾液酸連接的G0S唾液酸衍生物 (Sia-a2, 8)m-Sia-a2, 3-(Gal)n-Glc (n=l-7)。
[0009] 本發(fā)明進一步公開了 HMO類似物的合成方法,其特征在于按如下的步驟進行: (a) 酶法轉(zhuǎn)化:利用生物酶在一定條件下作用于低聚半乳糖溶液,生成低聚半乳糖的唾 液酸衍生物的混合物;其中所述的低聚半乳糖與生物酶的重量比例為: NMCSS/G0S=146ug/100mg ;PMSTl/G0S=172ug/100mg ; Pd2, 6ST/G0S=272ug/100mg ;CST II /G0S=616ug/100mg ; 所述生物酶指的是:CMP-Sia合成酶NMCSS和PMST1、Pd2, 6ST、CST II中的一種; (b) 酶分離:將反應產(chǎn)物煮沸終止反應,12000r/min離心20分鐘,分離變性的酶和反應 中的沉淀物,取上清液; (c) 底物和副產(chǎn)物的降解:將分離出的上清液用堿性磷酸酶處理,將反應中未完全反應 的CTP、CMP、CMP-Sia降解為胞苷,采用HPLC檢測; (d) 分離純化:將(c)制得的上清液,經(jīng)分離、凍干后,制得低聚半乳糖的唾液酸純化后 產(chǎn)物。
[0010] 其中步驟(a)中所述的生物酶指的是:以(Gal)n-Glc/Gal(n=l-7)作為底物;由 來源于微生物中的兩種酶通過"一鍋雙酶法"來催化合成反應,合成三種不同的低聚半乳糖 的唾液酸衍生物。
[0011] 所述作為底物的濃度為20mM/L ;PMST1、Pd2, 6ST催化的反應的CTP和Neu5Ac的 濃度為40mM,CST II催化的反應的CTP和Neu5Ac的濃度為lOOmM,pH8 Tris-Hcl的濃度為 100mM,Mg2.濃度為20mM反應的溫度為37。。,反應時間為l_2h。
[0012] 步驟(c)中HPLC的檢測以磷酸鹽緩沖液,C18柱,260nm吸收波長進行檢測;所述 的磷酸鹽緩沖液指的是:磷酸氫二鈉35. 8 g、磷酸二氫鉀13. 6g加水900ml溶解用氫氧化 鈉溶液,調(diào)節(jié)pH至7.0,加入1.61g四甲基溴化銨,加水至1000ml。
[0013] 步驟(d)中分離純化:用規(guī)格15mm IDX 100cm的Bio-gel P2色譜柱進行色譜分 離,以水為流動相,色譜分離的樣品上樣量為l_2mL,洗脫流速為0. 4-1 mL/min ;最優(yōu)的樣 品上樣量為lmL,洗脫流速為l-2mL/min,收集洗脫樣品。
[0014] 步驟(a)和(d)中還包括分離后的薄層層析檢測、合并遷移距離相同的產(chǎn)物的步 驟;其薄層層析檢測的步驟如下: 取0. 5 μ L洗脫液,薄層層析板點樣,在展層劑中展開,霧噴顯色劑后,于酒精燈上顯 色;上述展層劑由乙酸乙酯:甲醇:水按體積比4 :2 :1混合配制;顯色劑的配制為冰乙酸、 茴香醛、濃硫酸和乙醇,體積分別為5. 5ml、16ml、27ml和500ml。
[0015] 本發(fā)明優(yōu)選ΗΜ0類似物的合成方法,其特征在于: (1) 稱取 3 份低聚半乳糖(G0S) 100. 00mg、CTP163. 96mg、Neu5Ac 96. 25mg 溶于 5mL ddH20 中,分別向三個試管中加入 ImolTris-Hcl lmL,lmolMgCl2 200ul,NMCSS 150ug ; (2) 向試管一種加入172ug PmSTl,試管二中加入272ug Pd2,6ST,試管三中加入616ug Cst II,加水定容到10. 417ml,混勻,37°C水浴lh,TLC檢測反應進程; (3) 將反應后的溶液100°C煮5min,冷卻,12000r/min離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移到干凈 的試管中; (4) 分別向三個試管中的上清液中加入堿性磷酸酶450ug,37°C水浴4h,HPLC檢測反 應進度,色譜柱為C18柱,米用二兀梯度洗脫,磷酸鹽緩沖液和乙腈體積15%_90%,反應液 100°C煮5分鐘,冷卻,12000r/min離心lOmin,經(jīng)0. 22 μ m膜過濾冷凍干燥,通過BioGel P-2柱子除去雜質(zhì),TLC檢測收集產(chǎn)物真空干燥,得到GOS-Sia產(chǎn)物,經(jīng)色譜分析,純度達到 95%以上。
[0016] 本發(fā)明進一步公開了 ΗΜ0類似物在制備解決乳制品中唾液酸缺乏或含量不足方 面的應用。
[0017] 本發(fā)明采用"一鍋雙酶法"合成了三種不同的G0S的唾液酸衍生物,分別為:
【權利要求】
1. 利用低聚半乳糖和唾液酸通過CMP-Sia合成酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶合成的HMO類似物, 具有如下的結(jié)構: Pmstl酶催化合成的2, 3-唾液酸連接的G0S唾液酸衍生物 Sia-a2,3-(Gal)n-Glc (n=l-7) Pd2, 6ST酶催化合成的2, 6-唾液酸連接G0S唾液酸衍生物 Sia-a2,6-(Gal)n-Glc (n=l-7) CSTII酶催化合成的2, 3/8-唾液酸連接的G0S唾液酸衍生物 (Sia-a2, 8)m-Sia-a2, 3-(Gal)n-Glc (n=l-7)。
2. 權利要求1所述HMO類似物的合成方法,其特征在于按如下的步驟進行: 酶法轉(zhuǎn)化:利用生物酶在一定條件下作用于低聚半乳糖溶液,生成低聚半乳糖的唾液 酸衍生物的混合物;其中所述的低聚半乳糖與生物酶的重量比例為: NMCSS/G0S=146ug/100mg ;PMSTl/G0S=172ug/100mg ; Pd2, 6ST/G0S=272ug/100mg ;CST II /G0S=616ug/100mg ; 所述生物酶指的是:CMP-Sia合成酶NMCSS和PMST1、Pd2, 6ST、CST II中的一種; 酶分離:將反應產(chǎn)物煮沸終止反應,12000r/min離心20分鐘,分離變性的酶和反應中 的沉淀物,取上清液; 底物和副產(chǎn)物的降解:將分離出的上清液用堿性磷酸酶處理,將反應中未完全反應的 CTP、CMP、CMP-Sia降解為胞苷,采用HPLC檢測; 分離純化:將(c)制得的上清液,經(jīng)分離、凍干后,制得低聚半乳糖的唾液酸純化后產(chǎn) 物。
3. 權利要求1所述HM0類似物的合成方法,其中步驟(a)中所述的生物酶指的是:以 (Gal)n-Glc/Gal(n=l-7)作為底物;由來源于微生物中的兩種酶通過"一鍋雙酶法"來催化 合成反應,合成三種不同的低聚半乳糖的唾液酸衍生物。
4. 權利要求2所述HM0類似物的合成方法,其中所述作為底物的濃度為20mM/L ; PMST1、Pd2, 6ST催化的反應的CTP和Neu5Ac的濃度為40mM,CST II催化的反應的CTP和 Neu5Ac的濃度為lOOmM,pH8 Tris-Hcl的濃度為lOOmM,Mg2+濃度為20mM反應的溫度為 37°C,反應時間為l_2h。
5. 權利要求2所述HMO類似物的合成方法,其中所述步驟(c)中HPLC的檢測以磷酸 鹽緩沖液,C18柱,260nm吸收波長進行檢測;所述的磷酸鹽緩沖液指的是:磷酸氫二鈉35. 8 g、磷酸二氫鉀13. 6g加水900ml溶解用氫氧化鈉溶液,調(diào)節(jié)pH至7. 0,加入1. 61g四甲基 溴化銨,加水至1000ml。
6. 權利要求2所述HMO類似物的合成方法,其中所述步驟(d)中分離純化:用規(guī)格15mm IDX 100cm的Bio-gel P2色譜柱進行色譜分離,以水為流動相,色譜分離的樣品上樣量為 l-2mL,洗脫流速為0. 4-1 mL/min ;最優(yōu)的樣品上樣量為lmL,洗脫流速為l-2mL/min,收集 洗脫樣品。
7. 權利要求2所述HM0類似物的合成方法,其中所述步驟(a)和(d)中還包括分離后 的薄層層析檢測、合并遷移距離相同的產(chǎn)物的步驟;其薄層層析檢測的步驟如下 : 取0. 5 μ L洗脫液,薄層層析板點樣,在展層劑中展開,霧噴顯色劑后,于酒精燈上顯 色;上述展層劑由乙酸乙酯:甲醇:水按體積比4 :2 :1混合配制;顯色劑的配制為冰乙酸、 茴香醛、濃硫酸和乙醇,體積分別為5. 5ml、16ml、27ml和500ml。
8. 權利要求1所述HMO類似物的合成方法,其特征在于: (1) 稱取 3 份低聚半乳糖(GOS) 100. OOmg、CTP163. 96mg、Neu5Ac 96. 25mg 溶于 5mL ddH20 中,分別向三個試管中加入 ImolTris-Hcl lmL,lmolMgCl2 200ul,NMCSS 150ug ; (2) 向試管一種加入172ug PmSTl,試管二中加入272ug Pd2,6ST,試管三中加入616ug Cst II,加水定容到10. 417ml,混勻,37°C水浴lh,TLC檢測反應進程; (3) 將反應后的溶液100°C煮5min,冷卻,12000r/min離心lOmin,將上清液轉(zhuǎn)移到干凈 的試管中; (4) 分別向三個試管中的上清液中加入堿性磷酸酶450ug,37°C水浴4h,HPLC檢測反 應進度,色譜柱為C18柱,米用二兀梯度洗脫,磷酸鹽緩沖液和乙腈體積15%_90%,反應液 100°C煮5分鐘,冷卻,12000r/min離心lOmin,經(jīng)0. 22 μ m膜過濾冷凍干燥,通過BioGel P-2柱子除去雜質(zhì),TLC檢測收集產(chǎn)物真空干燥,得到GOS-Sia產(chǎn)物,經(jīng)色譜分析,純度達到 95%以上。
9. 權利要求所述1所述的HM0類似物在制備解決乳制品中唾液酸缺乏或含量不足方面 的應用。
【文檔編號】C12P19/18GK104232707SQ201410462676
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權日:2014年9月12日
【發(fā)明者】程劍松, 王鵬, 王園明 申請人:南開大學