專利名稱：?jiǎn)苇h(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物及其制備方法和用途。具體涉及含一個(gè)長(zhǎng)鏈烴取代基的單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物、含有該類化合物的提取物、提取分離并純化獲取該類化合物的方法以及所述提取物和化合物用于制備細(xì)胞周期抑制劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、細(xì)胞增殖抑制劑、癌細(xì)胞殺傷劑和抗腫瘤劑的用途。
背景技術(shù)：
單環(huán)飽和環(huán)己酮類化合物系指在環(huán)己烷酮的碳骨架上連有不同取代基的一系列化合物。該類化合物骨架結(jié)構(gòu)單一，主要因取代基種類和取代位置的不同而形成不同的化合物。其中，含一個(gè)長(zhǎng)鏈烴取代基的取代單環(huán)飽和環(huán)己酮類化合物有些已有文獻(xiàn)報(bào)道。如文獻(xiàn)S.R.Johns，etal.，Campnosperma Exudates.The optically active long-chain5-hydroxyclohex-2-enones and long-chain bicycle[3.3.1]nonane-3，7-dionesAust.J.Chem.，40，79-96，1987曾記載了幾個(gè)含一個(gè)長(zhǎng)鏈烴基(十七個(gè)碳或十九個(gè)碳)的取代單環(huán)飽和環(huán)己酮類化合物。但上述文獻(xiàn)記載的化合物均為人工轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。迄今已知的該類化合物不僅數(shù)目少、取代類型有限，而且有關(guān)該類化合物的抗腫瘤活性以及具有與本發(fā)明化合物相同取代類型的含一個(gè)長(zhǎng)鏈烴取代基的單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物至今未見報(bào)道。
南酸棗Choerospondias axillaries(Roxb.)Burtt et Hill為漆樹科南酸棗屬植物，其樹皮和果實(shí)入藥，樹皮主治瘡瘍、湯火傷、陰囊濕疹，鮮果則消食滯，治食滯腹痛，果核醒酒解毒，治風(fēng)毒起疙瘩成瘡或瘍癰(江蘇新醫(yī)學(xué)院編，中藥大辭典，上冊(cè)，上海，上海人民出版社，1977年，第397-398頁和第1564頁)。干燥果實(shí)已作為中藥“廣棗”收入我國(guó)2000年版藥典(國(guó)家藥典委員會(huì)，中華人民共和國(guó)藥典，一部，北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2000年，第32頁)。南酸棗中的黃酮、酚酸、有機(jī)酸、氨基酸、甾體等多種類型的化學(xué)成分已有報(bào)道，南酸棗粗提物、總黃酮或單體化合物的抗菌、抑制血小板聚集等多種活性也已有研究報(bào)道(熊冬生等；南酸棗植物在藥物方面的研究概況及其應(yīng)用前景廣東藥學(xué)，2000年第10卷第5期，第8-10頁)。但南酸棗的抗腫瘤活性及其活性成分尤其是本發(fā)明涉及的單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類活性成分至今未見研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種具有細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)以及對(duì)癌細(xì)胞直接殺傷等抗腫瘤活性的含一個(gè)長(zhǎng)鏈烴取代基的單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物。
本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)南酸棗的粗提物對(duì)癌細(xì)胞有很好的殺傷性細(xì)胞毒、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期抑制及對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制等抗腫瘤活性，遂對(duì)其活性成分進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)南酸棗粗提物中的下列式I所示單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物具有上述的抗腫瘤活性 其中，環(huán)己酮的六元環(huán)取4C1椅式構(gòu)型；R1、R2、R3、R4、R5、R6為氫、羥基、氨基、甲氧基或任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-20烴基，并且，R1-R6中至少一個(gè)為所述的任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-C20烴基，其余至少三個(gè)為選自羥基或甲氧基的含氧取代基。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種提取物，其特征在于其中包含至少一種式I所示的單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽 其中，環(huán)己酮的六元環(huán)取4C1椅式構(gòu)型；R1、R2、R3、R4、R5、R6為氫、羥基、氨基、甲氧基或任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-20烴基，并且，R1-R6中至少一個(gè)為所述的任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-C20烴基，其余至少三個(gè)為選自羥基或甲氧基的含氧取代基。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及式I所示單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽 其中，環(huán)己酮的六元環(huán)取4C1椅式構(gòu)型；R1、R2、R3、R4、R5、R6為氫、羥基、氨基、甲氧基或任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-20烴基，并且，R1-R6中至少一個(gè)為所述的任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-C20烴基，其余至少三個(gè)為選自羥基或甲氧基的含氧取代基。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及制備上述提取物的方法，所述方法包括用醇或含水醇對(duì)有關(guān)植物原料、例如南酸棗進(jìn)行提取，得粗浸膏即提取物。
本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及制備上述式I化合物的方法，所述方法包括用醇或含水醇對(duì)有關(guān)植物原料、例如南酸棗進(jìn)行提取得粗浸膏后，再經(jīng)分離純化得到式I化合物。
本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及含有作為活性成分的式I單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物以及一種或多種藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的第六個(gè)方面涉及式I單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物用于制備細(xì)胞周期抑制劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、細(xì)胞增殖抑制劑、癌細(xì)胞殺傷劑和抗腫瘤劑的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及下列式I單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽 其中，環(huán)己酮的六元環(huán)取4C1椅式構(gòu)型；R1、R2、R3、R4、R5、R6為氫、羥基、氨基、甲氧基或任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-20烴基，并且，R1-R6中至少一個(gè)為所述的任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-C20烴基，其余至少三個(gè)為選自羥基或甲氧基的含氧取代基。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及下列式I單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽
其中，R1和R2為羥基或(Z)-14-烯十九烷基，R3、R4、R5、R6為羥基或氫。
在本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，式I中的R1為(Z)-14-烯十九烷基，R2、R4、R6為羥基，R3、R5為氫。
在本發(fā)明另一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，式I中的R2為(Z)-14-烯十九烷基，R1、R3、R6為羥基，R4、R5為氫。
含有上述式I化合物的提取物及純的式I化合物可通過如下方法制備用醇或含水醇對(duì)有關(guān)植物材料、例如南酸棗進(jìn)行提取，得粗浸膏即提取物，然后再?gòu)拇纸嘀蟹蛛x純化而得到式I化合物。
根據(jù)本發(fā)明，上述方法中所采用的醇是乙醇；所述含水醇是60～95％的含水乙醇；所述分離純化包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的天然產(chǎn)物分離純化的常規(guī)方法和手段，如液液萃取、柱層析、薄層層析、高效液相層析及重結(jié)晶等。其中柱層析、高效液相和重結(jié)晶精制可反復(fù)進(jìn)行多次。
本發(fā)明采用麗絲胺羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)法和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)特征的方法，測(cè)試了式I化合物對(duì)小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞、人大腸癌HCT-15細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人卵巢癌A2780細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)以及對(duì)癌細(xì)胞的直接殺傷等作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，式I化合物通過抑制細(xì)胞周期周轉(zhuǎn)、誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡或直接的殺傷等方式顯示出抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性，從而具有抗腫瘤作用。
本發(fā)明式I化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。
本發(fā)明中的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”可以是藥用無機(jī)或有機(jī)鹽。本發(fā)明式I中具有堿性基團(tuán)的化合物可以與無機(jī)酸形成藥用鹽，例如硫酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽；也可與有機(jī)酸形成藥用鹽，例如乙酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽等。本發(fā)明式I中具有酸性基團(tuán)的化合物可以與堿金屬或堿土金屬形成藥用鹽，優(yōu)選但不限于鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽或鈣鹽。
本發(fā)明化合物可以單獨(dú)或以藥物組合物的形式給藥。給藥途徑可以是口服、非腸道或局部給藥。藥物組合物可根據(jù)給藥途徑配成各種適宜的劑型。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲(chǔ)器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。
當(dāng)口服用藥時(shí)，本發(fā)明化合物可制成任意口服可接受的制劑形式，包括但不限于片劑、膠囊、水溶液或水懸浮液。其中，片劑使用的載體一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂。膠囊制劑使用的稀釋劑一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水懸浮液制劑則通常是將活性成分與適宜的乳化劑和懸浮劑混合使用。任選地，以上口服制劑形式中還可加入一些甜味劑、芳香劑或著色劑。
當(dāng)皮膚局部施用時(shí)，本發(fā)明化合物可制成適當(dāng)?shù)能浉唷⑾磩┗蛩獎(jiǎng)┲苿┬问?，其中將活性成分懸浮或溶解于一種或多種載體中。軟膏制劑可使用的載體包括但不限于礦物油、液體凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蠟和水；洗劑或霜?jiǎng)┛墒褂玫妮d體包括但不限于礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、吐溫60、十六烷酯蠟、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、芐醇和水。
本發(fā)明化合物還可以無菌注射制劑形式用藥，包括無菌注射水或油懸浮液或無菌注射溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發(fā)油也可用作溶劑或懸浮介質(zhì)，如單甘油酯或二甘油酯。
另外需要指出，本發(fā)明化合物使用劑量和使用方法取決于諸多因素，包括患者的年齡、體重、性別、自然健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況、化合物的活性強(qiáng)度、服用時(shí)間、代謝速率、病癥的嚴(yán)重程度以及診治醫(yī)師的主觀判斷。優(yōu)選的使用劑量介于0.01-100mg/kg體重/天。
本發(fā)明式I化合物還可作為抑制細(xì)胞周期或誘發(fā)細(xì)胞凋亡的低分子生物探針用于生命科學(xué)研究中。當(dāng)把式I化合物作為細(xì)胞周期抑制劑或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑用于生命科學(xué)研究時(shí)，可溶于甲醇或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應(yīng)用。


圖1是化合物I在甲醇溶液(40μg/ml)中的紫外吸收光譜；圖2是化合物I的紅外吸收光譜(KBr)；圖3是化合物I在氘代氯仿中的1H核磁共振譜；圖4是化合物I在氘代氯仿中的13C核磁共振譜；圖5是化合物I在甲醇溶液(1.0mg/ml)中的圓二色散(CD)光譜；圖6是化合物II在甲醇溶液(40μg/ml)中的紫外吸收光譜；圖7是化合物II的紅外吸收光譜(KBr)；圖8是化合物II在氘代甲醇中的1H核磁共振譜；圖9是化合物II在氘代甲醇中的13C核磁共振譜；圖10是化合物II在甲醇溶液(1.0mg/ml)中的圓二色散(CD)光譜；圖11是小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞用化合物I處理17小時(shí)后測(cè)得的流式細(xì)胞直方圖；圖12是小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞用化合物II處理17小時(shí)后測(cè)得的流式細(xì)胞直方圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。
在以下實(shí)施例中，以下稱為化合物I的本發(fā)明化合物經(jīng)核磁共振等鑒定具有如下結(jié)構(gòu)式I化合物，其中，六元環(huán)取4C1構(gòu)型(絕對(duì)構(gòu)型為3S4R6R)，R1為(Z)-14-烯十九烷基，R2、R4、R6為羥基，R3、R5為氫；以下稱為化合物II的本發(fā)明化合物經(jīng)核磁共振等鑒定具有如下結(jié)構(gòu)式I化合物，其中，六元環(huán)取4C1構(gòu)型(絕對(duì)構(gòu)型為3S4S6S)，其中R2為(Z)-14-烯十九烷基，R1、R3、R6為羥基，R4、R5為氫 碳環(huán)及長(zhǎng)鏈上的阿拉伯?dāng)?shù)字表示相應(yīng)碳原子的標(biāo)位。
在化合物的結(jié)構(gòu)研究中，熔點(diǎn)用北京天地宇科技有限責(zé)任公司X-4型精密顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定，溫度未校正。比旋光度用JSASCO P-1020型旋光儀測(cè)定。正負(fù)離子TOF-MS和HR-TOF-MS分別用美國(guó)ABI公司API 3000型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和英國(guó)Micromass公司LCT型質(zhì)譜儀測(cè)定，紫外光譜用Shimadzu UV2501PC型紫外分光光度儀測(cè)定，紅外光譜用Nicolet Magna-IRTM550型紅外光譜儀測(cè)定，核磁共振譜用JEOLEclips-600型超導(dǎo)核磁共振儀(600MHz1H-NMR，150MHz13C-NMR)測(cè)定。圓二色散(CD)光譜用JASCO J-810Spectropolarimeter測(cè)定。
實(shí)施例1.化合物I的提取與分離精制第一步驟含有化合物I的提取物的制備取南酸棗的干燥樹皮(3.2kg)粉碎后用乙醇25升室溫浸提，每次浸泡7天，共提4次。合并提取液，濃縮干燥，得乙醇提取物750g。將乙醇提取物750g懸浮于3升水中，依次用氯仿(3升)、乙酸乙酯(3升)、正丁醇(3升)各萃取4次，分別得到氯仿提取物60g、乙酸乙酯提取物310g、正丁醇提取物300g和水層殘留物80g。其中，氯仿提取物為含化合物I的提取物。
第二步驟含化合物I的層析粗組分的制備氯仿提取物(60g)干法上減壓硅膠柱(柱床7.5cm×18.5cm)，用石油醚(P)-丙酮(A)、甲醇溶劑系統(tǒng)進(jìn)行洗脫。通過增加石油醚(P)中丙酮(A)的用量來梯度遞增洗脫溶劑的極性或更換成甲醇來加大洗脫溶劑的極性。根據(jù)薄層檢測(cè)及活性測(cè)試結(jié)果合并餾份，得到6個(gè)組分Fr-1(3.2g，VP∶VA＝100∶1洗脫部分)、Fr-2(2.3g，VP∶VA＝50∶1洗脫部分)、Fr-3(2.0g，VP∶VA＝10∶1洗脫部分)、Fr-4(10.8g，VP∶VA＝5∶1洗脫部分)、Fr-5(13.6g，VP∶VA＝2∶1洗脫部分)和Fr-6(25g，甲醇洗脫部分)。將Fr-5(13.6g)干法上減壓硅膠柱(5.0cm×22cm)，用氯仿(C)-乙酸乙酯(Ac)、丙酮、甲醇系統(tǒng)洗脫，根據(jù)薄層檢測(cè)及活性測(cè)試結(jié)果合并餾份，得到6個(gè)組分Fr-5-1(4.1g，VC∶VAc＝8∶1洗脫部分)、Fr-5-2(980mg，VC∶VAc＝4∶1洗脫部分)、Fr-5-3(3.7g，VC∶VAc＝2∶1洗脫部分)、Fr-5-4(1.1g，乙酸乙酯洗脫部分)、Fr-5-5(1.8g，丙酮洗脫部分)、Fr-5-6(0.8g，甲醇洗脫部分)。其中，F(xiàn)r-5-3為含化合物I的層析粗組分。
第三步驟化合物I的純化和精制將Fr-5-3(3.7g)上Sephadex LH-20柱(柱床3.8cm×36cm)，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，得到主要含化合物I的層析組分。該組分在RP-18反相分析高效液相層析(203nm檢測(cè))中，當(dāng)用甲醇洗脫時(shí)，在保留時(shí)間8分鐘處給出含化合物I的洗脫組分。經(jīng)相同條件RP-18反相制備高效液相層析(203nm檢測(cè))分離，用甲醇洗脫并收集相應(yīng)洗脫組分，得到化合物I粗品。該化合物I粗品在用80％甲醇洗脫的RP-18反相分析高效液相(203nm檢測(cè))中，在保留時(shí)間72分鐘處給出化合物I的單一洗脫峰。經(jīng)相同條件RP-18反相制備高效液相層析(203nm檢測(cè))分離，用80％甲醇洗脫并收集的相應(yīng)洗脫組分，濃縮并經(jīng)氯仿-甲醇中重結(jié)晶得化合物I純品104mg。
化合物I白色結(jié)晶型粉末，熔點(diǎn)75.1-76.2℃，[α]D31+37.7°(c1.0，CHCl3)，分子式C25H46O4。正離子TOF-MSm/z428[M+NH4]+，411[M+H]+，393[M+H-H2O]+，375[M+H-2H2O]+；負(fù)離子TOF-MSm/z455[M-H+HCOOH]-，445[M+Cl]-，391[M-H-H2O]-；正離子HR-TOF-MSm/s實(shí)測(cè)值411.3475[M+H]+，計(jì)算值411.3474([M+H]+)。UVλmaxnm(logε)in MeOH201(3.64，末端吸收)。IR(KBr)vmaxcm-13394，3282(OH)，2920，2850(CH3&CH2)，1718(CO)，1465，1332，1166(C-O)，1070，1004，651。CDλmaxnm(mdeg)in MeOH at 1.0mg/ml317(-21.3715)，283.7(+58.3594)，206.6(-30.5037)，202.6(-1.16184)。1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表1。
表1 化合物I在氘代氯仿中的600MHz1H及400MHz13C核磁共振數(shù)據(jù)a)

a)表中信號(hào)根據(jù)DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC、PFG HMBC及NOE差譜解析結(jié)果予以歸屬。b)該欄中的代號(hào)分別表示在PFG1H-1H COSY譜中與同一行標(biāo)位中的氫核給出偶合相關(guān)信號(hào)的氫核。c)該欄中的代號(hào)分別表示在PFG HMBC譜(lrJCH＝8.3或4Hz)中與同一行標(biāo)位中的氫核給出HMBC偶合相關(guān)信號(hào)的碳原子。d)、e)、f)該信號(hào)因與其它信號(hào)相互重疊而未能予以確切歸屬。h)、i)帶有相同上標(biāo)的兩個(gè)信號(hào)之間信號(hào)歸屬可互換。
化合物I的NOE差譜測(cè)試分析結(jié)果當(dāng)照射Ha-2時(shí)，在He-2、Ha-7、Hb-7上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射H-3時(shí)，在He-2、H-4、Ha-5、He-5、3-OH上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射Ha-5時(shí)，在H-3、H-4、He-5上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射Ha-7時(shí)，在Ha-2、He-5、Hb-7、Hb-8、H-9上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射He-7時(shí)，在Ha-7上觀測(cè)到NOE信號(hào)。
實(shí)施例2.化合物II的提取與分離精制第一步驟含有化合物II的提取物的制備參照實(shí)施例1中的第一步驟，同法操作，由6公斤南酸棗原料獲得了含化合物II的主要提取物即氯仿提取物110克。
第二步驟含化合物II的層析粗組分的制備取含化合物II的氨仿提取物60克，干法上減壓硅膠柱(柱床7.5cm×18.5cm)，用石油醚(P)-丙酮(A)、甲醇溶劑系統(tǒng)進(jìn)行洗脫。通過增加石油醚(P)中丙酮(A)的用量來梯度遞增洗脫溶劑的極性或更換成甲醇來加大洗脫溶劑的極性。根據(jù)薄層檢測(cè)及活性測(cè)試結(jié)果合并餾分，得到6個(gè)組分Fr-1(3.3g，VP∶VA100∶1洗脫部分)、Fr-2(2.1g，VP∶VA＝50∶1洗脫部分)、Fr-3(2.2g，VP∶VA＝10∶1洗脫部分)、Fr-4(11.0g，VP∶VA＝5∶1洗脫部分)、Fr-5(14.0g，VP∶VA＝2∶1洗脫部分)和Fr-6(24.5g，甲醇洗脫部分)。將Fr-5(14.0g)干法上減壓硅膠柱(柱床5.0cm×22cm)，用氯仿(C)-乙酸乙酯(Ac)、丙酮、甲醇系統(tǒng)洗脫，根據(jù)薄層檢測(cè)及活性測(cè)試結(jié)果合并餾分，得到6個(gè)組分Fr-5-1(4.3g，VC∶VAc＝8∶1洗脫部分)、Fr-5-2(1.0g，VC∶VAc＝4∶1洗脫部分)、Fr-5-3(3.8g，VC∶VAc＝2∶1洗脫部分)、Fr-5-4(1.0g，乙酸乙酯洗脫部分)、Fr-5-5(1.9g，丙酮洗脫部分)、Fr-5-6(0.9g，甲醇洗脫部分)。其中，F(xiàn)r-5-5為含化合物II的層析粗組分。
第三步驟化合物II的純化和精制將Fr-5-5(1.9g)用適量氯仿-甲醇(1∶1)溶解，上SephadexLH-20柱(柱床3.8cm×36cm)，用氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，按洗脫順序依次得到組分Fr-5-5-1(0.8g)、Fr-5-5-2(0.4g)和Fr-5-5-3(0.7g)?；衔颕I主要集中在Fr-5-5-2中，因此，將Fr-5-5-2通過制備硅膠薄層層析(氯仿-甲醇7∶1展開)分離，得到化合物II的粗品(230mg)。該化合物II粗品在RP-18反相分析高效液相層析(203nm檢測(cè))中，當(dāng)用83％甲醇洗脫時(shí)，在保留時(shí)間59分鐘處給出化合物II的單一洗脫峰，遂進(jìn)行相同條件放大實(shí)驗(yàn)分離精制，經(jīng)RP-18反相制備高效液相層析(203nm檢測(cè))分離，收集相應(yīng)洗脫組分，濃縮并經(jīng)甲醇中重結(jié)晶操作得到化合物II純品135mg。
化合物II白色結(jié)晶型粉末，熔點(diǎn)92-94℃，[α]D31+31.4°(c1.0，CHCl3)，分子式C25H46O4。正離子TOF-MSm/z428[M+NH4]+，411[M+H]+，393[M+H-H2O]+，375[M+H-H2O]+；負(fù)離子TOF-MSm/z469[M-H+CH3COOH]-，455[M-H+HCOOH]-，445[M+Cl]-，391[M-H-H2O]-；正離子HR-TOF-MSm/z實(shí)測(cè)值411.3487[M+H]+，計(jì)算值411.3474([M+H]+)。UVλmaxnm(logε)in MeOH200(3.69，末端吸收)。IR(KBr)vmaxcm-13383(OH)，2922，2850(CH3&CH2)，1726(CO)，1465，1457，1366，1080(C-O)，699，644，621。CDλmaxnm(mdeg)in MeOHat 1.0mg/ml319.5(-16.6417)，284.4(+107.044)，210.6(+9.10091)，204.8(+30.7266)。1H及13C NMR數(shù)據(jù)見表2。
表2 化合物II在氘代甲醇中的600MHz1H及400MHz13C核磁共振數(shù)據(jù)a)

a)表中信號(hào)根據(jù)DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC、PFG HMBC及NOE差譜解析結(jié)果予以歸屬。b)該欄中的代號(hào)分別表示在PFG1H-1H COSY譜中與同一行標(biāo)位中的氫核給出偶合相關(guān)信號(hào)的氫核。c)該欄中的代號(hào)分別表示在PFG HMBC譜(lrJCH＝8.3或4Hz)中與同一行標(biāo)位中的氫核給出HMBC偶合相關(guān)信號(hào)的碳原子。d)、f)、g)該信號(hào)因與其它信號(hào)相互重疊而未能予以確切歸屬。e)、i)帶有相同上標(biāo)的兩個(gè)信號(hào)之間信號(hào)歸屬互換。
化合物II的NOE差譜測(cè)試分析結(jié)果當(dāng)照射He-2時(shí)，在Ha-2和H-3上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射H-3時(shí)，在He-2和Ha-5上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射H-4時(shí)，在Ha-2和He-5上分別觀測(cè)到NOE；當(dāng)照射Ha-5時(shí)，在H-3、He-5、Ha-7、Hb-7上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射He-5時(shí)，在H-4、Ha-5、Ha-7上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射Ha-7時(shí)，在He-5、Hb-7、Ha-8、H-9上分別觀測(cè)到NOE信號(hào)；當(dāng)照射He-7時(shí)，在Ha-5、Ha-7、Ha-8、H-9上觀測(cè)到NOE信號(hào)。
實(shí)施例3.生物活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法被測(cè)樣品溶液的配制分別取上述實(shí)施例1中分離精制的化合物I和實(shí)施例2中分離精制的化合物II，精密稱取適量，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測(cè)活性。
細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)活性測(cè)試采用小鼠乳腺癌tsFT210細(xì)胞系、人大腸癌HCT-15細(xì)胞系、人宮頸癌HeLa細(xì)胞系、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系、人卵巢癌A2780細(xì)胞系。
細(xì)胞用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32℃(tsFT210細(xì)胞)或37℃(HCT-15、HeLa、MCF-7和A2780細(xì)胞)于通入5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試方法(麗絲胺羅丹明B法即SRB法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人大腸癌HCT-15細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人卵巢癌A2780細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，每孔加入2微升不同濃度的樣品或空白溶液，37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細(xì)胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無細(xì)胞周期抑制，細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征。繼而吸去上清液并往每孔細(xì)胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小時(shí)，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室溫靜置30分鐘。用1％醋酸水清洗4次，除去未結(jié)合的游離SRB染料。每孔加入150微升Tris緩沖液(10mmol/L，pH10.5)溶解蛋白結(jié)合染料并利用MD公司產(chǎn)SPECTRA MAX Plus型酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在520nm處的光密度(OD)值。在同一塊96孔板中樣品的每個(gè)濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對(duì)照，取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白對(duì)照-OD樣品)/OD空白對(duì)照×100％式計(jì)算每個(gè)濃度下的細(xì)胞增殖抑制率(IR％)。
流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的tsFT210細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔0.5毫升接種于24孔板中，每孔加入5微升不同濃度的樣品溶液，32℃下培養(yǎng)17小時(shí)。取藥物作用下培養(yǎng)后的細(xì)胞，首先在光學(xué)顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態(tài)學(xué)變化，判斷有無細(xì)胞周期抑制，細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，必要時(shí)進(jìn)行拍照。繼而將細(xì)胞分別從24孔板轉(zhuǎn)移至1.5毫升Eppendorf離心管中，4℃下3000轉(zhuǎn)/分離心3分鐘，吸去上清液，加0.5毫升磷酸緩沖溶液(PBS)震蕩洗滌一次，相同條件下離心收集細(xì)胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克檸檬酸納和200毫克NP-40)，4℃下染色30分鐘后，加入150微升PBS稀釋，用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定細(xì)胞中DNA的含量分布。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物I和化合物II對(duì)人癌細(xì)胞增殖的抑制活性在SRB法測(cè)試中，化合物I和化合物II對(duì)人大腸癌HCT-15細(xì)胞的細(xì)胞增殖均顯示了一定的抑制活性，不同濃度的化合物I和化合物II對(duì)人大腸癌HCT-15細(xì)胞增殖的抑制活性測(cè)試結(jié)果見表3。
表3 化合物I和化合物II抑制人大腸癌HCT-15細(xì)胞增殖的SRB法測(cè)試結(jié)果

在SRB法測(cè)試中，化合物I對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人卵巢癌A2780細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖也顯示出不同程度的抑制活性，不同濃度的化合物I對(duì)這些人癌細(xì)胞增殖的抑制活性測(cè)試結(jié)果見表4。
表4 化合物I抑制人癌細(xì)胞增殖的SRB法測(cè)試結(jié)果

表3和表4結(jié)果表明，在SRB法測(cè)試中，化合物I和化合物II對(duì)所測(cè)試的癌細(xì)胞均顯示了不同程度的抑制癌細(xì)胞增殖的抗癌活性。
流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析結(jié)果將tsFT210細(xì)胞用不同濃度的化合物I和化合物II處理后用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果表明化合物I在每毫升3.1微克至每毫升12.5微克的濃度范圍內(nèi)主要表現(xiàn)出細(xì)胞周期抑制活性，將tsFT210細(xì)胞的細(xì)胞周期抑制在G0/G1期；而當(dāng)濃度超過每毫升12.5微克以上時(shí)，主要呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性，在sub-G0/G1區(qū)均檢測(cè)到明顯的凋亡峰，且隨濃度增高，凋亡峰愈加顯著；當(dāng)濃度在每毫升50微克以上時(shí)，開始檢測(cè)到一定的壞死性細(xì)胞毒活性?；衔颕I則在每毫升6.2微克至每毫升25微克的濃度范圍內(nèi)主要將tsFT210細(xì)胞的細(xì)胞周期抑制在G0/G1期，在每毫升25微克以上時(shí)同時(shí)還顯示較弱的G2/M期抑制活性，當(dāng)濃度在每毫升50微克以上時(shí)開始呈現(xiàn)一定的S期抑制活性，當(dāng)濃度在每毫升100微克或在該濃度以上時(shí)出現(xiàn)壞死性細(xì)胞毒活性。上述流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)結(jié)果與下述顯微鏡下觀測(cè)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果基本吻合。
形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察到，tsFT210細(xì)胞當(dāng)用每毫升12.5微克的化合物I和25微克的化合物II處理時(shí)較少數(shù)量的細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征，當(dāng)用每毫升25微克以上的化合物I處理時(shí)，視野中絕大多數(shù)呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)即雪花瓣?duì)罴?xì)胞或膜裹著細(xì)胞碎片；而用50微克以上的化合物II處理時(shí)，視野中凋亡細(xì)胞的數(shù)目也有所增加，但化合物II誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的活性比化合物I明顯地弱很多。當(dāng)用每毫升50微克以上的化合物I和化合物II處理時(shí)，有一部分癌細(xì)胞開始呈不同程度的典型的壞死性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，且隨著化合物I和II的濃度增加，壞死性細(xì)胞毒活性也增強(qiáng)，表明化合物I在高濃度時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞具有一定的直接殺傷性細(xì)胞毒活性。
結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物I和化合物II可通過抑制細(xì)胞周期、誘發(fā)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡或?qū)Π┘?xì)胞的直接殺傷性細(xì)胞毒活性來發(fā)揮其抑制癌細(xì)胞增殖的抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的化合物可作為抗腫瘤劑用于腫瘤的治療，也可作為誘發(fā)細(xì)胞凋亡或抑制細(xì)胞周期的低分子探針用于探索生命現(xiàn)象本質(zhì)的生命科學(xué)研究中。
權(quán)利要求
1.提取物，其特征在于其中含有至少一種式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽類 式I其中，環(huán)己酮的六元環(huán)取4C1椅式構(gòu)型；R1、R2、R3、R4、R5、R6為氫、羥基、氨基、甲氧基或任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-20烴基，并且，R1-R6中至少一個(gè)為所述的任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-C20烴基，其余至少三個(gè)為選自羥基或甲氧基的含氧取代基。
2.式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽類 式I其中，環(huán)己酮的六元環(huán)取4C1椅式構(gòu)型；R1、R2、R3、R4、R5、R6為氫、羥基、氨基、甲氧基或任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-20烴基，并且，R1-R6中至少一個(gè)為所述的任選被羥基、氨基等取代基取代的飽和或不飽和直鏈或支鏈C15-C20烴基，其余至少三個(gè)為選自羥基或甲氧基的含氧取代基。
3.權(quán)利要求2所述的式I化合物，其中，R1和R2為羥基或(Z)-14-烯十九烷基；R3、R4、R5、R6為羥基或氫。
4.權(quán)利要求2或3所述式I化合物，其中，R1為(Z)-14-烯十九烷基，R2、R4、R6為羥基，R3、R5為氫。
5.權(quán)利要求2或3所述式I化合物，其中，R2為(Z)-14-烯十九烷基，R1、R3、R6為羥基，R4、R5為氫。
6.含有作為活性成分的權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述化合物以及一種或多種藥用載體或賦形劑的藥物組合物。
7.權(quán)利要求1所述提取物的制備方法，該方法包括用醇或含水醇浸提有關(guān)植物原料例如南酸棗，獲得提取物。
8.權(quán)利要求2所述的式I化合物的制備方法，該方法包括用醇或含水醇浸提有關(guān)植物原料例如南酸棗獲得粗浸膏后，分離純化得到式I化合物。
9.權(quán)利要求1所述的提取物和/或權(quán)利要求2所述的式I化合物用于制備細(xì)胞周期抑制劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、腫瘤細(xì)胞的增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑的用途。
10.權(quán)利要求1所述的提取物和/或權(quán)利要求2所述的式I化合物用于制備抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及式I含一個(gè)長(zhǎng)鏈烴取代基的單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物、含有該類化合物的提取物及所述化合物和提取物的制備方法和用途。本發(fā)明的單環(huán)多取代飽和環(huán)己酮類化合物可作為細(xì)胞周期抑制劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、細(xì)胞增殖抑制劑和抗腫瘤劑用于抗腫瘤治療。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1872838SQ20051007480
公開日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者崔承彬, 李長(zhǎng)偉, 蔡兵, 韓冰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所