專利名稱：豆甾烷－3,5,6－三醇及其衍生物用于制備抗病毒藥物的用途以及新的豆甾烷－3,5,6 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及豆甾醇衍生物用于制備抗逆轉錄病毒藥物的用途，更具體地，本發(fā)明涉及豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗艾滋病毒(HIV)和抗乙型肝類病毒(HBV)的藥物的用途。本發(fā)明還涉及含有豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物的藥物組合物以及使用豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物治療艾滋病和乙型肝炎的方法。
背景技術：
HIV感染已對我國人們的健康構成嚴重威脅。HIV感染者在1989年后急劇上升，到目前為止，為84萬，其中艾滋病患者8萬，艾滋病死亡人數已達22萬。其疫情特點是持續(xù)增長，流行呈聚集性分布，擴散跡象形成。專家推測到2010年將達到1000萬人。
目前，抗HIV藥物研究的重點為融合抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑及整合酶抑制。雖然已有10余種藥物可以有效地緩解癥狀，延長病程，但仍存在很多問題，如不能徹底清除體內病毒、停藥反彈、易產生耐藥性、副作用大及每年的昂貴費用，使得這些藥物的應用受到很大限制。特別是占全球感染者90％以上的廣大發(fā)展中國家的感染者根本無法接受治療。因此，進一步研制和開發(fā)低毒有效甚至能夠清除病毒的抗病毒藥物仍是一項迫切而艱巨的任務。
式I豆甾烷-3，5，6-三醇為已知化合物，
但到目前為止，關于其本身及其衍生物在抗逆轉錄病毒，尤其是抗HIV病毒和抗HBV病毒方面的用途尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明人在研究中出人意料地發(fā)現具有下式II的豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物在抑制HIV病毒和HBV病毒方面顯示出良好的活性。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗HIV病毒的藥物的用途 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨立地為H、C1-C6烷基、C1-C6烷?；7-C11芳?；?、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、果糖，
R4為具有以下結構的基團 本發(fā)明的第二個方面涉及上述式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗乙型肝炎病毒的藥物的用途。
本發(fā)明的第三個方面涉及新的式II豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨立地為H，C1-C6烷基，C1-C6烷酰基，C7-C11芳?；?，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，果糖，R4為具有以下結構的基團 條件是，當R1，R2和R3同時為H時，R4不為 本發(fā)明的第四個方面涉及含有式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物以及一種或多種藥學上可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明的第五個方面涉及治療艾滋病和乙型肝炎的方法，該方法包括給予需要治療的對象治療有效量的式I或式II化合物。
根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，在式III豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物中，R1，R2和R3相同或不同，為乙?；?、丙?；?、丁?；虮郊柞；?。
活性成分的提取根據本發(fā)明，式I豆甾烷-3，5，6-三醇是已知化合物，其可通過本領域已知方法得到，例如可以通過以下方法獲得用95％的乙醇加熱回流提取杜仲，減壓濃縮后的浸膏采用不同極性的溶劑依次進行提取，對其中的乙酸乙酯部分進行純化，以石油醚氯仿系統(tǒng)進行梯度洗脫，收集有關餾分，即可得到豆甾烷-3，5，6-三醇。
抗病毒活性研究采用HIV病毒感染的MT4細胞為實驗模型，以病毒引起的合胞體的產生為評價指標，觀察藥物的作用。研究發(fā)現，式I豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物可以有效地保護病毒感染的細胞，使其不產生病變，并且效果顯著，IC50值為9.38μg.ml-1，從而首次發(fā)現豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物具有抗HIV作用。另外，采用HepG 2.2215細胞系對豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物的抗HBV活性進行了測定。


圖1和圖2顯示了正常的MT4細胞。
圖3和圖4顯示了被HIV感染的MT4細胞。
圖5顯示了豆甾烷-3，5，6-三醇對于被HIV感染的MT4細胞的抗細胞病理作用。
具體實施例方式
儀器與材料MSZabspec高分辨質譜儀(Micromass公司)。
NMRJNM-ECA-400超導核磁共振儀(日本電子株式會社)，TMS為內標。
VarianUNITYINOVA600超導核磁共振儀。
熔點儀RY-1熔點儀(天津市分析儀器廠)。
硅膠薄層層析用硅膠H、HF254(青島海洋化工廠)。
纖維素板Merk公司。
薄層顯色紫外燈254，366nm，碘蒸汽、1％FeCl3醇溶液。
藥材來源中藥杜仲皮，購自廣州南方醫(yī)院中藥房。
實施例1 豆甾烷-3，5，6-三醇的提取、分離和結構鑒定將藥材(10Kg)用95％乙醇加熱回流提取三次，合并提取液，減壓濃縮至干，得浸膏736g。將浸膏溶于水中，必要時加熱使其完全溶解。采用不同極性的溶液依次進行萃取，分為石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水四個部分，對乙酸乙酯部分進行純化分離。用石油醚-氯仿系統(tǒng)(50∶1-5∶1)作洗脫劑進行硅膠柱層析，收集第14-24餾分，合并后在甲醇中析出白色片狀結晶，mp249-252℃，稱為式I化合物。
上述白色片狀結晶的Libermann-Burchard反應呈陽性，EI-MS給出分子離子峰M/Z 448(M+)，結合13C-DEPT和1HNMR確定分子組成C29H52O3，不飽和度為4，13C-DEPT顯示29個碳信號，其中在δ60-80區(qū)域有2個連氧叔碳(CH)δ65.63和74.22，一個連氧季碳δ75.85。EI-MS譜上可見連續(xù)脫水的碎片峰M/Z 430.2(M-H2O，100)，412.2(M-2H2O，74)，上述數據表明為甾醇類化合物。進一步根據EI-MS譜所示有失去C17側鏈的離子峰M/Z290(M-H2O-C10H20，26)，271(M-2H2O-C10H21，22)，說明該化合物為具有10個飽和碳的側鏈，這與豆甾烷類化合物的質譜裂解規(guī)律基本吻合，故將化合物13C-DEPT和1H-NMR與類似母核的豆甾烷醇類化合物進行比較歸屬，化合物的EI-MS，1HNMR，13CNMR與文獻報道的豆甾烷-3，5，6-三醇基本吻合(蔡雄，譚小秋，潘德濟，等.玉柏石松的甾體成分研究.中草藥，1989，744；Deshmane.S.S，Sukh Dev.High Isoprenoids-II Triterpenoidsand Steroids of Saccharum Officinarum.Tetrahedron，1971，271109-1118；Zhao M，Duan J.A，Huang WZ，et al.Steroids andAnthraquinones from Astragalus hoantchy.Journal of ChinaPharmaceutical University，2003，34(3)216；以及于德泉，楊峻山，分析化學手冊(7)化學工業(yè)出版社，2002，891)，故確定式I化合物為具有以下結構的豆甾烷-3，5，6-三醇。
式I化合物的波譜數據EI-MS(M/Z，％)456(M+，2)，438(2)，300(4)，248(100)，235(4)，207(40)，203(50)，189(17)，133(51)。
1H-NMR(DMSO-d6，600Hz)δppm 0.65(3H，s，18-H)，1.02(3H，s，19-H)，3.61(1H，s，3-H)，3.80(1H，m，3-H)，4.37，4.13(1H，1H，d，d，J＝4.2H z，6.0Hz，5-OH，6-OH)，3.61(1H，s，5-OH)13C-NMR(DMSO-d6)δppm 39.03(C-1)，30.98(C-2)，65.63(C-3)，31.89(C-4)，74.22(C-5)，75.85(C-6)，42.17(C-7)，29.90(C-8)，45.02(C-9)，35.47(C-10)，20.62(C-11)，40.82(C-12)，39.02(C-13)，55.57(C-14)，23.78(C-15)，27.78(C-16)，55.77(C-17)，11.68(C-18)，16.19(C-19)，37.69(C-20)，18.50(C-21)，33.25(C-22)，25.47(C-23)，44.46(C-24)，28.62(C-25)，19.62(C-26)，18.85(C-27)，22.52(C-28)，11.82(C-29)。
實施例2 式I化合物抗HIV作用研究材料與方法藥物將實施例1中所得的式I化合物樣品用DMSO溶解，以DMSO二倍稀釋成六個濃度。對照藥物AZT購自Sigma公司。
試劑DMSO軍事醫(yī)學科學院進口分裝；RPMI-1640培養(yǎng)基Invitrogen公司；小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司。
細胞和病毒MT4細胞株引自日本；HIV-1 IIIB引自美國。
病毒毒力測定10倍稀釋8個濃度HIV在RPMI-1640培養(yǎng)液中觀察細胞病變，計算TCID50為10-6。
式I化合物對細胞的毒性測定按照文獻(Rudi Pauwels，Jan Balzarini，Masanori Baba，etal.Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay forthe detection of anti-HIV compounds.J Virol Meth，1988，20309)描述的方法，將MT4細胞2×105個/ml接種于96孔板中，0.1ml/孔，加入驗證化合物，驗證化合物二倍稀釋為1000μg/ml-7.8μg/ml，陽性對照藥AZT三倍稀釋為500μg/ml-6.3μg/ml，每個濃度接種3孔，同時設正常細胞對照，DMSO溶劑對照及空白MT4細胞對照(不加病毒)，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)6天。MTT法測定細胞活性，確定CC50值。
式I化合物對HIV誘導的MT4細胞病變的抑制作用按照文獻(陳春英，黃學華，周井炎等，硫酸酯化箬葉多糖的結構修飾及其抗艾滋病病毒作用，藥學學報，1998，33264)所述方法，將MT4細胞2×105個/ml接種于96孔板中，0.1ml/孔，分別加入1000TCID50的HIV病毒100μl，同時設正常細胞對照和病毒對照，然后分別加入成倍稀釋五個濃度的樣品及AZT 100μl，每個樣品濃度設三個平行孔，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，72小時后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)。CPE判定標準無合胞體形成“-”，無合胞體形成但細胞不規(guī)則“±”，有合胞體形成“+”。
IC50的判定(1)只一復孔為“+”，另兩復孔為“-”或“-”與“±”，此藥物濃度可視為IC50。
(2)三復孔分別為“+”，“-”與“±”，此藥物濃度可視為IC50。
(3)三復孔均為“±”，此藥物濃度可視為IC50。
(4)三復孔均為“+”，下一個濃度作用下的三復孔均為“-”，兩個濃度的中間值可視為IC50。
選擇指數(SI)CC50/IC50。
結果HIV誘導MT4細胞病變模型的建立正常MT4細胞為懸浮細胞，呈聚集狀生長，邊界清晰，折光性好(圖1和2)。HIV感染細胞3天，有合胞體產生，但細胞活性基本正常(圖3)。HIV感染細胞第7天，細胞出現死亡，合胞體產生，有大的空泡出現(圖4)，說明細胞病變明顯。
式I化合物抑制細胞病變作用及細胞毒性結果顯示，式I化合物的抗HIV作用顯著，抑制細胞病變的IC50值為9.38μg/ml(表1)。細胞毒性實驗顯示，該化合物的CC50值大于1000μg/ml。并且，式I化合物的SI值大于50，說明其抗HIV作用強。
表1.在HIV-1/MT4培養(yǎng)體系中的式I化合物對于HIV-1誘導的CPE的抑制作用

由抑制細胞病變結果可見，式I化合物對細胞病變具有顯著的抑制作用。加藥后第三天，未見有病變產生，細胞狀態(tài)好，與正常對照組無差別。加藥第7天觀察，未見有細胞病變產生，細胞呈簇狀生長，邊界光滑，且細胞活性好于正常對照組細胞(圖5)。
實施例3 式I化合物的抗HBV作用研究材料和方法藥物將實施例1所得的式I化合物樣品用DMSO溶解，以DMSO二倍稀釋成六個濃度。對照藥物GS101(阿昔洛韋)由軍事醫(yī)學科學院二所提供。
細胞培養(yǎng)HepG2.2215細胞系為HBV DNA克隆轉染的人肝癌細胞(HepG2)，由美國Mount Sinai醫(yī)學中心構建，軍事醫(yī)學科學院引進，用含10％胎牛血清、谷胺酰胺、100μg.ml-1青霉素、100μg.ml-1鏈霉素、100μg.ml-1卡那霉素的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。定期用含380μg.ml-1G418的培養(yǎng)液篩選。選取生長良好的HepG2.2215細胞，用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，濃度為1×105個.L-1。懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，正常培養(yǎng)48小時后加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)4d后更換含相同藥物濃度的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4d。收集8d細胞上清檢測HBsAg、HBeAg及細胞存活率。
試劑HBsAg、HBeAg ELISA檢測試劑盒，HBV DNA PCR檢測試劑盒(北京華美生物工程有限公司)；噻唑藍(MTT)；胰蛋白酶；EaglesMEM細胞培養(yǎng)干粉，G-418(Geneticin)，美國GIBCO公司；胎牛血清，美國Hyclone Lab公司。
藥物對細胞的毒性實驗藥物用DMSO配制成2mg.ml-1，2倍稀釋成6個濃度加入96孔板，每濃度4孔，另設空白對照組，每4天換同濃度藥液，再培養(yǎng)4天，設無藥物細胞對照組。實驗第8天，傾去培養(yǎng)液，每孔加入含MTT的培養(yǎng)液(400μg.ml-1)，每孔100μl，37℃，5％CO2孵育4小時，棄上清，加DMSO 100μl溶解，待甲瓚顆粒完全溶解后，酶標儀540nm波長測定OD值。結果顯示，豆甾烷-3，5，6-三醇的半數無毒濃度(CC50)大于1000μg/ml。
細胞存活實驗實驗采用MTT法檢測，方法與上述細胞毒性實驗相同。藥物濃度為100μg.ml-1-3.125μg.ml-1。細胞用藥后，檢測得各個濃度孔中培養(yǎng)上清的光密度值，取均值后按下式計算細胞存活率，其中給藥組為給予不同濃度的實驗組；空白組為不加酶結合底物而平行操作的空白對照組；對照組為不加藥物處理的細胞對照組。細胞存活率＝[(D給藥組-D空白組)/(D對照組-D空白組)]×100％。鏡檢未見給藥組與對照組細胞存在形態(tài)學差異。
HBsAg、HBeAg含量的檢測收集用藥后培養(yǎng)上清，按HBsAg、HBeAg ELISA檢測試劑盒說明書測得各個濃度孔中培養(yǎng)上清的OD值，取均值后按下式計算抗原抑制率，抗原抑制率＝[(D對照組-D給藥組)/(D對照組-D空白組)]×100％。實驗重復進行3次。藥物對抗原的半數有效濃度(IC50)，按Logistic法計算，Logistic法擬和作圖，曲線形狀若為典型的S型濃度-效應曲線，可以說明藥物具有良好的量效關系，可以得到在不同濃度藥物處理時抗原生成量，測定最大值和最小值，最大抑制率、最低抑制率、抑制50％所需濃度(IC50)。IC50為抑制曲線中最重要的參數，濃度越低表示藥物的抑制活性越高。檢測半數無毒濃度CC50。治療指數(SI)＝CC50/IC50。結果見表2，經計算得到的抗原抑制率在30-40％之間。
表2.式I化合物對HBV抗原表達和細胞增殖的作用(n＝3，x±s)

*P＜0.05 **P＜0.01。
權利要求
1.式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗HIV病毒藥物的用途 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨立地為H、C1-C6烷基、C1-C6烷?；?、C7-C11芳酰基、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、果糖，R4為具有以下結構的基團
2.式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用于制備抗乙型肝炎病毒的藥物的用途 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨立地為H、C1-C6烷基、C1-C6烷?；?、C7-C11芳?；?、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、果糖，R4為具有以下結構的基團
3.式II的豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物 其中，R1，R2和R3相同或不同，各自獨立地為H，C1-6烷基，C1-C6烷酰基，C7-C11芳?；?，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，木糖，核糖，果糖，R4為具有以下結構的基團 條件是，當R1，R2和R3同時為H時，R4不為
4.權利要求3的式II豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物，其中，R1，R2和R3相同或不同，為乙?；?、丙酰基、丁?；虮郊柞；?。
5.含有權利要求3或4所述的式II豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物及一種或多種藥學上可接受的載體的藥物組合物。
6.治療HIV病毒感染的方法，包括給予需要治療的對象治療有效量的權利要求1，3或4所定義的豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物。
7.治療乙型肝炎病毒感染的方法，包括給予需要治療的對象治療有效量的權利要求1，3或4所定義的豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物用于制備抗艾滋病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)的藥物的用途。本發(fā)明還涉及新的豆甾烷－3，5，6－三醇衍生物、含有豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物的藥物組合物以及使用豆甾烷－3，5，6－三醇及其衍生物治療艾滋病和乙型肝炎的方法。
文檔編號A61P31/14GK1726922SQ20051007439
公開日2006年2月1日 申請日期2005年5月26日 優(yōu)先權日2004年7月28日
發(fā)明者孫燕榮, 張嘉杰, 徐偉, 吳曙光 申請人:南方醫(yī)科大學