專利名稱：降低血液粘度的試劑的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及降低血粘度試劑，其降低全血的粘度。
長久以來，納豆已經(jīng)成為日本傳統(tǒng)發(fā)酵食物，從1600s到目前，并且作為允許日本人有效攝取大豆蛋白質(zhì)的食物是杰出的。例如，納豆具有比大豆更高的可消化性。這是因?yàn)樽鳛榇蠖沟闹饕煞值牡鞍踪|(zhì)、脂肪、淀粉等被納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)分解成氨基酸、脂肪酸和葡萄糖，并且增強(qiáng)了攝入時(shí)的可消化性。
包含在納豆中的大多數(shù)維生素B家族緩和身體功能并縮短疲勞恢復(fù)時(shí)間。納豆包含大量的維生素B2，并預(yù)期用于恢復(fù)視力疲勞。納豆中維生素K的含量在食品中是最高的。預(yù)期納豆提高血鈣代謝，如預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和改善血液凝結(jié)能力。
近年來，已闡明了納豆的多種功能，并且作為保健食品，極大關(guān)注納豆的作用。已經(jīng)增加了納豆的消費(fèi)。具體地，稱為納豆激酶的含納豆的酶作為纖維蛋白溶解試劑和血栓溶解試劑是有效的，如日本專利公開號(hào)61-162184(參考文獻(xiàn)1)，3-168082(參考文獻(xiàn)2)和6-153977(參考文獻(xiàn)3)中所公開的生產(chǎn)方法，理化性質(zhì)和生化性質(zhì)。
納豆激酶作為血栓溶解試劑或血栓形成抑制劑已受到極大關(guān)注，如在日本專利公開號(hào)1-180834(參考文獻(xiàn)4)和8-208512(參考文獻(xiàn)5)中所述。這些參考文獻(xiàn)公開了與含有納豆激酶作為活性成分、安全、容易進(jìn)入的試劑代替目前在臨床領(lǐng)域用于血栓的試劑即溶解纖維蛋白試劑、血小板聚集抑制劑例如尿激酶、鏈激酶和組織纖溶酶原激活物相關(guān)的技術(shù)。
日本專利公開號(hào)2001-352929(參考文獻(xiàn)6)公開了以下述方式生產(chǎn)的納豆加工食品。在缺乏發(fā)酵納豆獨(dú)特香味的情形中，從透析的培養(yǎng)基中提取納豆獨(dú)特的活性成分，在所述培養(yǎng)基中將純化自大豆的豆蛋白粉末與納豆枯草芽孢桿菌一起培養(yǎng)。根據(jù)參考文獻(xiàn)6的方案，使用這種加工的食品能延遲血液凝固時(shí)間，并抑制血栓形成，除了使用納豆激酶的溶解血栓作用以外。
如上所述，來源于納豆的產(chǎn)品具有各種作用，例如除了溶解血栓作用以外，延遲血液凝固時(shí)間和抑制血栓形成。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在參考文獻(xiàn)6中公開的納豆加工食品的除了上述作用以外的新功能。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種通過使用來源于納豆的產(chǎn)品具有新功能的試劑。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，提供了一種降低血液粘度的試劑，其基本上由來源于納豆枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)組成，其從氨基末端順序包括第一結(jié)構(gòu)氨基酸序列，第二結(jié)構(gòu)氨基酸序列，第三結(jié)構(gòu)氨基酸序列和第四結(jié)構(gòu)氨基酸序列，所述第一結(jié)構(gòu)氨基酸序列具有丙氨酸，蘇氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，纈氨酸，谷氨酸，色氨酸，天冬酰胺，纈氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，異亮氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，脯氨酸，賴氨酸，丙氨酸，色氨酸，丙氨酸，亮氨酸，甘氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，纈氨酸，丙氨酸，絲氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，纈氨酸，谷氨酸，色氨酸，天冬酰胺，組氨酸，脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸，賴氨酸，谷氨酸，賴氨酸，酪氨酸，精氨酸，甘氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，色氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸，丙氨酸，絲氨酸，脯氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，天冬氨酸，亮氨酸，丙氨酸，組氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，組氨酸，纈氨酸，和蘇氨酸，所述第二結(jié)構(gòu)氨基酸序列具有丙氨酸，苯丙氨酸，絲氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，谷氨酸，丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸，色氨酸，纈氨酸，和亮氨酸，所述第三結(jié)構(gòu)氨基酸序列具有天冬氨酸，丙氨酸，谷氨酸，甘氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，組氨酸，脯氨酸，谷氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬氨酸，和纈氨酸，所述第四結(jié)構(gòu)氨基酸序列具有纈氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，丙氨酸，酪氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，色氨酸，和天冬氨酸，從而降低全血的粘度。


圖1是顯示血液粘度測量結(jié)果的圖表；和圖2是顯示血液粘度測量結(jié)果的圖表。
具體實(shí)施例方式
優(yōu)選實(shí)施方式的描述參考附圖將描述本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明人已開發(fā)了作為加工食品的產(chǎn)品(下文表示為NKCP)，其通過有效純化來自納豆枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的大豆液體培養(yǎng)基的纖維蛋白溶解物質(zhì)而獲得。在該開發(fā)過程中，本發(fā)明人在研究納豆的溶解纖維蛋白活性過程中已獲得一種新的與溶解血液凝塊一樣的發(fā)現(xiàn)。
下面描述NKCP的生產(chǎn)。將納豆枯草芽孢桿菌(Takahashi菌株)加入到純水中，并攪拌以制備懸浮液。將少量懸浮液接種到通過使用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基制備的瓊脂板上。在37℃培養(yǎng)懸浮液24小時(shí)，以獲得在瓊脂板上納豆枯草芽孢桿菌的菌落。
在具有500ml內(nèi)部體積的錐形瓶中制備含有1g葡萄糖和4g大豆蛋白粉末作為原料的200ml液體培養(yǎng)基。在高壓滅菌器中于120℃滅菌錐形瓶30分鐘，以滅菌錐形瓶的內(nèi)部。大豆蛋白粉末純化自大豆。通過研磨大豆獲得的大豆粉末可用作原料。大豆蛋白包含在原料中就足夠了。
用2mm直徑的接種環(huán)從在瓊脂板上培養(yǎng)的納豆枯草芽孢桿菌的菌落取樣納豆枯草芽孢桿菌一次。將取樣的納豆枯草芽孢桿菌接種到錐形瓶的液體培養(yǎng)基中。將含有其中接種了納豆枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基的錐形瓶在40℃保持開放，并且旋轉(zhuǎn)和振動(dòng)兩天以在錐形瓶中孵育液體培養(yǎng)基。
在具有30L內(nèi)部體積的小型發(fā)酵罐中制備20L含有100g葡萄糖，400g大豆蛋白粉末和可溶性淀粉的液體培養(yǎng)基，從而滅菌液體培養(yǎng)基。另外，將在錐形瓶中孵育的200ml納豆枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基加入到小型發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基中。孵育得到的培養(yǎng)基，同時(shí)在42℃鼓泡和攪拌兩天。制備三種另外相同的培養(yǎng)基，以獲得約50L的大豆蛋白液體培養(yǎng)基。
從得到的大豆蛋白液體培養(yǎng)基中通過離心去除納豆枯草芽孢桿菌菌體和雜質(zhì)，向其加入1mol硫酸銨。加入的硫酸銨通過使得蛋白質(zhì)變成疏水性質(zhì)而促進(jìn)聚集，所述蛋白質(zhì)包括高分子化合物例如分散在發(fā)酵溶液中的各種酶。硫酸銨的加入產(chǎn)生新的不溶性物質(zhì)。這些物質(zhì)用玻璃纖維濾紙過濾。
將用1mol硫酸銨溶液平衡的疏水性層析樹脂浸漬在過濾得到的大豆蛋白液體培養(yǎng)基中。疏水性高分子化合物聚集(附著)在樹脂上。在樹脂上的化合物浸漬在0.1mol碳酸氫銨溶液中以洗脫附著在樹脂上的高分子化合物，從而獲得40L濃縮的液體培養(yǎng)基。
使用具有10,000分子量制備范圍的超濾膜超濾濃縮的液體培養(yǎng)基，以分離低分子量物質(zhì)。將濃縮的液體培養(yǎng)基從40L濃縮到10L。向通過超濾膜獲得濃縮物中加入10L純水以獲得20L溶液。將得到的溶液再次進(jìn)行超濾。通過分離低分子量物質(zhì)將溶液重復(fù)濃縮三次，直至體積變?yōu)?0L。通過這三次濃縮，可以制備發(fā)酵的大豆蛋白液體培養(yǎng)基，其中幾乎消除了所有的低分子量物質(zhì)。
發(fā)酵的納豆獨(dú)特的氣味的主要組分是低分子量化合物，例如二甲基吡嗪(分子量108.14)，三甲基吡嗪(分子量122.17)，四甲基吡嗪(分子量126.20)，2-甲基丁酸酯(分子量102.13)，異戊酸(分子量102.13)，和氨水(分子量17.03)。包含在納豆中的維生素K2是具有649分子量的烴化合物。另一方面，蛋白質(zhì)例如酶(如納豆激酶)是具有幾萬或更大分子量的聚合物化合物。
通過超濾去除低分子量物質(zhì)，可以從發(fā)酵的大豆蛋白液體培養(yǎng)基中去除幾乎所有低分子量物質(zhì)例如對(duì)發(fā)酵納豆獨(dú)特“氣味”組分和維生素K2。最后，將作為稀釋劑的2kg乳糖加入到發(fā)酵的大豆蛋白液體培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基通過超濾去除了低分子量物質(zhì)，冷凍干燥得到的溶液以制備約2.1kg大豆蛋白發(fā)酵粉末(NKCP)。
自從約1990年以來，來自納豆的用作纖維蛋白溶解物質(zhì)的納豆激酶已被報(bào)道為枯草桿菌蛋白酶(堿性蛋白酶)。純化如上制備的NKCP的主要活性物質(zhì)，并通過各種設(shè)備分析檢驗(yàn)。分析結(jié)果顯示主要活性物質(zhì)是34,000道爾頓桿菌肽酶F，其用作由納豆枯草芽孢桿菌分泌的酶之一，并且不同于以前的納豆激酶。
為了設(shè)置作為NKCP功能食品的標(biāo)準(zhǔn)，除了稱為基質(zhì)分解活性(stroma decomposition activity)的傳統(tǒng)替代指數(shù)外，通過制備下述測量試劑盒進(jìn)行定量分析。在制備34,000道爾頓桿菌肽酶F的抗體的基礎(chǔ)上，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)制備試劑盒。日本食品研究實(shí)驗(yàn)室公司已證實(shí)這些分析方法是合適的定量分析方法。
為了開發(fā)NKCP作為功能食品，在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人臨床測試中檢驗(yàn)安全性和功效。關(guān)于安全性，該發(fā)現(xiàn)滿足具有健康、勞動(dòng)和福利部接受的申明的具體健康應(yīng)用的食品標(biāo)準(zhǔn)，并且在臨床劑量內(nèi)未觀察到臨床問題。在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和各種人臨床測試中均證實(shí)預(yù)期的溶解纖維蛋白活性的功效。在這些實(shí)驗(yàn)和測試過程中，在NKCP中不僅發(fā)現(xiàn)先前已報(bào)道的枯草桿菌蛋白酶對(duì)于血栓的溶解纖維蛋白活性，而且發(fā)現(xiàn)抑制血栓形成和降低血液粘度的作用。
以下將描述證實(shí)了在含該實(shí)施方案的NKCP的抗凝劑中降低血液粘度作用。從不吸煙、預(yù)先同意的20-22歲的志愿者收集新鮮血液。收集后，立即將新鮮血液倒入測量容器，其中振蕩粘度計(jì)保持在37℃。在400-500mPa·S的剪切速率(share rate)下隨時(shí)間測量臨床測試數(shù)值和血液的血液粘度值。
將樣品溶解在生理鹽水中，并將1/100樣品加入倒入了新鮮血液的測量容器中。在測量粘度的過程中，快速攪拌樣品和新鮮血液。在不刺激凝結(jié)/溶解纖維系統(tǒng)的條件下，小心收集血液。處理血液使得可以在振蕩粘度計(jì)中觀察到凝結(jié)。
可以在無抗凝劑或稀釋劑的條件下，在生理溫度下同時(shí)保證如同血液在實(shí)際人體內(nèi)流動(dòng)的物理變化，觀察通過上述方法測量的人血的粘度。在將血液放置在測量系統(tǒng)中后，血液粘度立即顯示平衡狀態(tài)。在血液凝結(jié)反應(yīng)基礎(chǔ)上，在平衡狀態(tài)后粘度指數(shù)級(jí)地增加約300sec。另外的詳細(xì)信息參見參考文獻(xiàn)7，8和9。
在另一個(gè)血液粘度測量裝置例如MC-FAN(Micro Channel array FlowANalyzer)中，用抗凝劑進(jìn)行測量以防止血液在裝置中凝結(jié)。當(dāng)測量與血液中血細(xì)胞(大部分血液紅細(xì)胞)的粘附和變形相關(guān)的血液粘度時(shí)就足夠了。然而，在包括血液的凝結(jié)和纖維蛋白溶解的活體條件下，在測量中振蕩粘度計(jì)比上述裝置更好。
當(dāng)以0.05mg/mL或更大的量向血液中加入NKCP時(shí)，延遲了粘度的指數(shù)級(jí)增加時(shí)間。未證實(shí)以0.5mg/mL或更大的量增加粘度。以0.25mg/mL的量降低平衡的粘度約10％，以0.5mg/mL的量降低約20％。加入NKCP的血液的凝結(jié)癥狀程度和表現(xiàn)時(shí)間不同于加入作為溶解纖維蛋白試劑的組織纖溶酶原激活物或作為抗凝劑的肝素的血液。
測量攝入NKCP后在臨床條件下的血液粘度。有8名預(yù)先同意的成人受試者。選擇6名另外的受試者作為安慰劑處理的對(duì)照組。在選擇的受試者中，明顯患有急性疾病和慢性疾病的急性惡化的人排除在外。
每日劑量是10個(gè)片劑，其等同于1,250mg NKCP。在研究的第一天，在早晨將10個(gè)片劑與兩個(gè)米團(tuán)一起給藥。從第二天，在午餐后，每天給藥一次10個(gè)片劑，持續(xù)1周。在研究的第一天，在給藥前、給藥后105分鐘、180分鐘和240分鐘測量血液粘度。
在測量容器中，在400-500mPa·s的剪切速率下測量血液粘度，所述容器中以如上所述相同的方式將所有血液樣品保持在37℃振蕩粘度計(jì)中。利用在粘度指數(shù)級(jí)變化前設(shè)置的“平衡粘度”測定血液粘度的變化。如表1和圖1所示，在180分鐘和240分鐘觀察到血液粘度的降低，而在安慰劑處理組中未觀察到血液粘度的變化。
表1給藥NKCP后隨時(shí)間的變化參數(shù)

數(shù)值是8名志愿者的平均±SD。給藥前的差異，鄧肯氏多重檢驗(yàn)(Duncan’sMultiple Test)，*p＜0.05，**p＜001。
VIS在32℃的血液粘度(mPa·s)，Ht血細(xì)胞比容(39.8-51.8％)。
使用振蕩粘度計(jì)測量添加了NKCP的血液粘度，添加了另一種納豆激酶的血液粘度和無添加劑的血液粘度。確定了圖2中的變化。在圖2中，添加了NKCP的血液測量結(jié)果，添加了另一種納豆激酶的血液測量結(jié)果，和無添加劑的血液測量結(jié)果分別表示為圓點(diǎn)，黑方塊和黑三角。表示為圓點(diǎn)的添加了NKCP的血液測量結(jié)果顯示粘度增加少于具有另一種納豆激酶的血液。因此，在納豆中包含的酶和蛋白質(zhì)的情況下基本上未觀察到血液粘度的變化。
關(guān)于血液粘度測量，參見Masahito Hitosugi等.，“Rheologic Changes inVenous Blood During Prolonged Sitting”，Thrombosis Research 100，409-412頁，2000(參考文獻(xiàn)7)，Masahito Hitosugi等.，“Change in BloodViscosity by Heparin and Argatroban’，Thrombosis Research 104，371-374頁，2001(參考文獻(xiàn)8)，和Masahito Hitosugi，等.，“Change in BloodViscosity with Synthetic Protease Inhibitors”，Journal of PharmacologicalSciences，卷91，334-336頁，2003(參考文獻(xiàn)9)。
如上所述，依照含有該實(shí)施方案的NKCP的降低血液粘度試劑，血液粘度明顯降低。預(yù)期降低血液粘度作用有助于改善人類的衛(wèi)生保健和幸福，例如預(yù)防用于誘導(dǎo)血栓形成的止血，改善在外周組織例如肌肉中關(guān)于增加供給氧和營養(yǎng)物質(zhì)的活性能力，改善伴隨降低外周血管抗性的高血壓，預(yù)防動(dòng)脈硬化發(fā)展和改善由降低外周血管抗性導(dǎo)致的心力衰竭的病癥。
降低血液粘度試劑具有預(yù)防血液粘度增加和收集血液后的凝結(jié)、改善臨床測試精度和便利性的性能，所述凝結(jié)導(dǎo)致在利用取樣血液的臨床測試中的難題。還預(yù)期降低血液粘度試劑改善由于抑制在臨床檢查和處理中使用的工具的血液污染中粘度增加的清潔作用。降低血液粘度試劑可有助于經(jīng)歷治療和外科手術(shù)的組織、和從活體清除的組織及從其中收集的血液的維持和保留。
在下文描述依照該實(shí)施方案用作降低血液粘度試劑的NKCP的物化性質(zhì)的研究結(jié)果。通過“16S核糖體DNA的核苷酸序列方法”分析用作產(chǎn)生NKCP的菌株的納豆枯草芽孢桿菌(Takahashi菌株)的基因序列，其顯示與168枯草芽孢桿菌亞種，桿菌菌株99.9％或更高的同源性。
通過TOF-MS(飛行時(shí)間質(zhì)譜，Time Of Flight Mass Spectrometry)測量NKCP的分子量為34,134道爾頓。NKCP的分子量為約34,100道爾頓。為了進(jìn)行該測量，使用分子篩載體如SuperQ-Toyopeal 650M，Butyl-Toyopearl650M，或Toyopearl HW-40F，通過重力層析重復(fù)純化NKCP樣品。在隨后的測量中使用以如上所述相同方式純化的樣品。
利用Edman降解法通過自動(dòng)氨基酸序列分析儀分析NKCP結(jié)構(gòu)，從氨基末端分析85氨基酸序列。當(dāng)使用賴氨?；鶅?nèi)肽酶有限降解NKCP時(shí)獲得幾個(gè)肽片段。利用高壓液相色譜純化這些肽片段。對(duì)于純化的肽片段，利用TOF-MF進(jìn)行質(zhì)量分析和利用Edman降解法進(jìn)行自動(dòng)氨基酸殘基序列分析。獲得的NKCP結(jié)構(gòu)如下。
證實(shí)NKCP從氨基末端具有結(jié)構(gòu)氨基酸序列(肽片段)例如“ATDGVEWNVDQIDAPKAWALGYDGTGTVVASIDTGVEWNHPALKEKYRGYNPENPNEPENEMNWYDAVAGEASPYDDLAHGTHVT”，“AFSEDGGTDADILEAGEWVL”，“DAEGNPHPEMAPDV”和“VPGQAYEDGWD”。換言之，NKCP是源自納豆枯草芽孢桿菌從氨基末端具有上述氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在上述序列中，A表示丙氨酸；G-甘氨酸；M-甲硫氨酸；S-絲氨酸；C-半胱氨酸；H-組氨酸；N-天冬酰胺；T-蘇氨酸；D-天冬氨酸；I-異亮氨酸；P-脯氨酸；V-纈氨酸；E-谷氨酸；K-賴氨酸；Q-谷氨酰胺；W-色氨酸；F-苯丙氨酸；L-亮氨酸；R-精氨酸和Y-酪氨酸。
從質(zhì)量分析結(jié)果和分子結(jié)構(gòu)的分子量的計(jì)算值的綜合，Xu-Chu，Wu等“Cloning，Genetic Organization，and Characterization of a Structural GeneEncoding Bacillopeptidase F from Bacillus Subtilis*”，The Journal ofBiological Chemistry卷265，No.12，6845-6850頁，1990(參考文獻(xiàn)10)顯示的枯草芽孢桿菌的基因數(shù)據(jù)庫的綜合，和氨基酸序列的易生物切割能力的測定結(jié)果，NKCP具有結(jié)構(gòu)序列“ATDGVEWNVDQIDAPKAWALGYDGTGTVVASIDTGVEWNHPALKEKYRGYNPENPNEPENEMNWYDAVAGEASPYDDLAHGTHVTGTMVGSEPDGTNQIGVAPGAKWIAVKAFSEDGGTDADIIEAGEWVLAPKDAEGNPHPEMAPDVVNNSWGGGSGLDEWYRDMVNAWRAADIFPEFSAGNTDLFIPGGPGSIANPANYPESFATVATDINKKLADFSLQGPSPYDEIKPEISAPGVNIRSSVPGQAYEDGWDFTSMAGPHVSAVAALLKQANASLSVDEMEDILTSTAEPLTDSTFPDSPNNGYGHGLVNAFDAVSAVTDGLGK”。
證實(shí)NKCP具有絲氨酸蛋白酶活性中心作為同源序列，其包括天冬酰胺殘基，組氨酸殘基，和絲氨酸殘基。這些由用作枯草芽孢桿菌的胞外蛋白酶的桿菌肽酶F證實(shí)，如Alan Sloma，等.，“Cloning and Characterization ofthe Gene for an Additional Extracellular Serine Protease of Bacillus Subtilis”，Journal of Bacteriology，卷173，No.21，6889-6895頁，Vov.1991(參考文獻(xiàn)11)所述。這證實(shí)NKCP是一種絲氨酸蛋白酶。
將描述日本發(fā)酵傳統(tǒng)食品-納豆的常規(guī)生理活性。納豆比大豆具有更高的消化吸收性。這是因?yàn)樽鳛榇蠖沟闹饕M分的蛋白質(zhì)，脂肪和淀粉可被納豆枯草芽孢桿菌分解成氨基酸，脂肪酸和葡萄糖。納豆在攝入后具有更高的消化吸收效率。大多數(shù)包含在納豆中的維生素B家族平緩身體功能并且恢復(fù)疲勞。維生素B2大量包含在納豆中，并且對(duì)于視力疲勞是有效的。納豆中維生素K2的含量是在食品中最高的。這可預(yù)期血液中鈣代謝的改善例如改善骨質(zhì)疏松癥和血液凝結(jié)。
在納豆枯草芽孢桿菌降解大豆蛋白的過程中，分泌各種酶例如蛋白酶和淀粉酶，并用作活性酶試劑以改善消化和活化代謝。納豆激酶可溶解血栓。
將考慮納豆激酶和NKCP之間作為酶的差異。在納豆中發(fā)現(xiàn)的用作強(qiáng)溶解纖維蛋白酶的納豆激酶是一種分泌自納豆枯草芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶，具有20,000道爾頓的分子量。納豆激酶具有降解血栓和纖溶酶的合成的顯色底物的能力?？蓮募{豆檢測除了上述酶之外的具有27,000道爾頓或更高分子量的一些溶解纖維蛋白的酶。
使用生理鹽水可容易地從納豆中提取納豆激酶，所述納豆激酶用作具有在納豆中發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)溶解纖維蛋白活性的新的溶解纖維蛋白酶。納豆激酶具有20,000道爾頓的分子量，和8.6的等電點(diǎn)。納豆激酶不僅分解纖維蛋白，而且分解合成的顯色纖溶酶底物(S-2251)。納豆激酶在中性pH中相對(duì)穩(wěn)定，并且當(dāng)其被加熱到60℃時(shí)損失其活性。
在4℃向納豆中加入10倍生理鹽水，攪拌混合物并通過離心分離。得到的上清液中添加80％乙醇以凝膠過濾。濃縮得到的洗脫液，冷凍干燥以制備粗酶級(jí)分。制備的粗酶級(jí)分具有一些溶解纖維蛋白的酶，所述酶具有尿激酶原激活物活性。在27,000道爾頓或更高分子量發(fā)現(xiàn)三個(gè)或更多的活性峰。
如上所述，NKCP是獲自納豆枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的溶解纖維蛋白的蛋白的粗略純化產(chǎn)品。在獲自NKCP的Lysim-X條帶中具有水解特異性的來源于納豆枯草芽孢桿菌的蛋白包含預(yù)定量的活性蛋白，其分子量和最適pH分別是約34,100道爾頓和9.0。從粗純化產(chǎn)品中去除維生素K和納豆枯草芽孢桿菌菌體，所述納豆枯草芽孢桿菌導(dǎo)致發(fā)酵納豆的獨(dú)特氣味。這具有不同于納豆激酶的分子量。
以下將描述NKCP對(duì)血栓和溶解纖維蛋白系統(tǒng)的作用。證實(shí)NKCP具有體外和體內(nèi)溶解纖維蛋白作用。該作用比可商購的組織纖溶酶原激活物(t-Pa)更適度。NKCP溶解纖維蛋白活性增加的作用機(jī)制是由直接的纖維蛋白降解和纖溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)的降解導(dǎo)致的。通過使用振蕩粘度計(jì)測量還在降解血液粘度中發(fā)現(xiàn)NKCP作用機(jī)制。
顯示了NKCP對(duì)組織培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的凝結(jié)溶解血栓系統(tǒng)作用的檢測結(jié)果。使用HUVEC細(xì)胞和U87-MG細(xì)胞，在體外和原位比較了加入NKCP和不加入任何NKCP的纖溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)產(chǎn)物量。48小時(shí)時(shí)，由HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生的總PAI-1是700ng/ml，游離的PAI-1增加高達(dá)580ng/ml。在0小時(shí)和24小時(shí)未觀察到NKCP關(guān)于PAI-1量的影響。
在高NKCP濃度(10μg/ml)時(shí)在完全培養(yǎng)基中，對(duì)于所有孵育時(shí)間，U87-MG細(xì)胞的產(chǎn)量受到完全抑制。關(guān)于DMEM培養(yǎng)基，PAI-1生產(chǎn)受到完全抑制。將在加入了NKCP的完全培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基中PAI-1產(chǎn)物與那些不加入任何NKCP的相比較。在HUVEC細(xì)胞中未觀察到NKCP的影響，但在U87-MG細(xì)胞中觀察到低分子量蛋白增加。這表明NKCP的溶解纖維蛋白活性是通過PAI-1降解的纖溶酶原活化功能。
當(dāng)在收集后立即向血液中添加NKCP時(shí)，并使用振蕩粘度計(jì)測量血液粘度，發(fā)現(xiàn)血液粘度被降低。使用無添加的組織纖溶酶原激活物(t-PA)、添加NKCP、和添加肝素作為對(duì)照實(shí)施例，當(dāng)進(jìn)行血液的300sec臨床測試時(shí)，通過振蕩粘度計(jì)其顯示凝結(jié)，發(fā)現(xiàn)了通過添加NKCP導(dǎo)致的不是由抗血栓活性和纖溶酶活性引起的溶解纖維蛋白活性。當(dāng)健康成人攝入250mg-500mg的NKCP持續(xù)7天時(shí)，觀察到血液粘度的降低。
如上所述，依照本發(fā)明，由于上述氨基酸序列是獲自來源于納豆枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)，通過使用來源于納豆枯草芽孢桿菌作為源自納豆的產(chǎn)品提供了一種可以降低血液粘度的新試劑。
權(quán)利要求
1.一種降低血液粘度的試劑，其特征在于基本上由來源于納豆枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)組成，并且從氨基末端順序包括第一結(jié)構(gòu)氨基酸序列，第二結(jié)構(gòu)氨基酸序列，第三結(jié)構(gòu)氨基酸序列和第四結(jié)構(gòu)氨基酸序列，從而降低全血的粘度，所述第一結(jié)構(gòu)氨基酸序列具有丙氨酸，蘇氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，纈氨酸，谷氨酸，色氨酸，天冬酰胺，纈氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，異亮氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，脯氨酸，賴氨酸，丙氨酸，色氨酸，丙氨酸，亮氨酸，甘氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，纈氨酸，丙氨酸，絲氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，纈氨酸，谷氨酸，色氨酸，天冬酰胺，組氨酸，脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸，賴氨酸，谷氨酸，賴氨酸，酪氨酸，精氨酸，甘氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，脯氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，色氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸，丙氨酸，絲氨酸，脯氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，天冬氨酸，亮氨酸，丙氨酸，組氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，組氨酸，纈氨酸，和蘇氨酸，所述第二結(jié)構(gòu)氨基酸序列具有丙氨酸，苯丙氨酸，絲氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，谷氨酸，丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸，色氨酸，纈氨酸，和亮氨酸，所述第三結(jié)構(gòu)氨基酸序列具有天冬氨酸，丙氨酸，谷氨酸，甘氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，組氨酸，脯氨酸，谷氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬氨酸，和纈氨酸，所述第四結(jié)構(gòu)氨基酸序列具有纈氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，丙氨酸，酪氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，色氨酸，和天冬氨酸。
2.依照權(quán)利要求1的試劑，其中來源于納豆枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)基本上由大豆蛋白發(fā)酵物組成，所述大豆蛋白發(fā)酵物通過從含有獲自大豆的大豆蛋白的納豆枯草芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基中去除納豆枯草芽孢桿菌菌體和低分子量組分獲得，所述低分子量組分具有比由納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的酶低的分子量。
3.依照權(quán)利要求2的試劑，其中所述低分子量組分通過超濾去除。
全文摘要
一種降低血液粘度的試劑，其含有來源于納豆枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)，并且從氨基末端順序包括第一結(jié)構(gòu)氨基酸序列，第二結(jié)構(gòu)氨基酸序列，第三結(jié)構(gòu)氨基酸序列和第四結(jié)構(gòu)氨基酸序列，從而降低全血的粘度。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1775284SQ200510074080
公開日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者一杉正仁, 前田浩明, 大村和伸 申請(qǐng)人:大和藥品株式會(huì)社, 一杉正仁