專利名稱：一種固醇類物質(zhì)的衍生方法及其分析檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種化學(xué)分析過(guò)程中固醇類物質(zhì)的衍生方法及其定性定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
人體血清中除含有膽固醇外，還含有微量的角鯊烯和非膽固醇類固醇，非膽固醇類固醇包括膽固醇合成的前體物質(zhì)，如24-脫氫膽甾烷醇(Desmosterol)，7-烯膽甾燒醇(Lathosterol),和源自膳食的植物固醇，如菜油固醇(Campesterol),豆固醇(Stigmasterol), ￠-谷固醇(P-sitosterol)和膽留燒醇(Cholestanol)。部分固醇類物
質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)如下24-脫氫膽甾醇7-烯膽甾烷醇豆固醇膽甾烷醇新近研究發(fā)現(xiàn)，血清中的角鯊烯和膽固醇前體固醇可作為膽固醇合成標(biāo)志物反映機(jī)體的內(nèi)源性膽固醇合成效率，植物固醇可作為膽固醇吸收標(biāo)志物反映機(jī)體的外源性膽固醇吸收效率。固醇類物質(zhì)的常用測(cè)定方法為氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法，由于固醇類物質(zhì)的本身的高沸點(diǎn)和血清中含量極少的特性，檢測(cè)前需要對(duì)目標(biāo)物衍生處理轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的硅醚。通常采用六甲基二硅胺(HMDS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)等硅烷化試劑和吡啶的混合作為衍生試劑進(jìn)行樣品衍生。此類衍生試劑在衍生過(guò)程中容易產(chǎn)生副反應(yīng)，易產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的沉淀，在檢測(cè)中引入雜質(zhì)，靈敏度也會(huì)受到影響。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有衍生方法副反應(yīng)多、檢測(cè)靈敏度差的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種固醇類物質(zhì)的衍生方法。所述衍生方法采用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)為衍生試劑，于30-80°C衍生 20-60min。
所述固醇類物質(zhì)為非膽固醇的固醇類物質(zhì)；優(yōu)選人體血清中非膽固醇的固醇類物質(zhì)。所述非膽固醇的固醇類物質(zhì)為以膽固醇為前體的固醇類物質(zhì)和/或植物固醇；優(yōu)選24-脫氫膽留醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇或膽留烷醇中的一種或多種。上述衍生方法優(yōu)選采用MSTFA為衍生試劑，于50-70°C衍生30_50min ;進(jìn)一步優(yōu)選采用MSTFA為衍生試劑，于60°C衍生40min。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述衍生方法在固醇類物質(zhì)分析檢測(cè)中的用途。所述固醇類物質(zhì)為人體血清中非膽固醇的固醇類物質(zhì)；優(yōu)選人體血清中24-脫氫膽甾醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇或膽留烷醇中的一種或多種；所述分析檢測(cè)為氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法定性定量分析檢測(cè)。本發(fā)明還提供了一種固醇類物質(zhì)的定量分析測(cè)定方法，包括以下步驟(I)分別配制待測(cè)樣品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，混合并吹干；(2)采用上述衍生方法任一項(xiàng)技術(shù)方案所述的方法進(jìn)行衍生化處理；(3)衍生后的待測(cè)樣品采用氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定性定量檢測(cè)。所述的檢測(cè)方法優(yōu)選包括以下步驟(I)分別配制待測(cè)樣品溶液及5 a -膽甾烷內(nèi)標(biāo)溶液，混合并于40 60°C氮?dú)獯蹈?(2)加入100-300 ii L的N-甲基_N_三甲基硅基三氟乙酰胺，優(yōu)選200 y L，于60°C衍生40min ；(3)衍生后的待測(cè)樣品采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定性定量檢測(cè)，所述質(zhì)譜選擇離子模式，選用5 a -膽甾燒m/z 217, 24-脫氫膽甾醇m/z 129,膽甾燒醇m/z 306,7-烯膽留燒醇m/z 255,豆固醇m/z 83為定性定量離子；所述待測(cè)樣品為含有24-脫氫膽留醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇和膽留烷醇的樣品。上述步驟⑴優(yōu)選為分別配置待測(cè)樣品的正己烷溶液及5 a -膽甾烷正己烷內(nèi)標(biāo)溶液，再加入2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合并于40 60°C氮?dú)獯蹈?。上述待測(cè)樣品優(yōu)選為含有24-脫氫膽留醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇和膽留烷醇的人體血清樣品，所述步驟(I)為分別配置待測(cè)樣品的正己烷溶液及5a-膽留烷正己烷內(nèi)標(biāo)溶液，再加入2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合后加入堿性醇溶液皂化，正已烷提取，提取液于40 60°C氮?dú)獯蹈伞１景l(fā)明的技術(shù)方案采用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)為衍生試劑，衍生后的固醇類物質(zhì)在GC或GC-MS檢測(cè)中，表現(xiàn)出了較好的可重復(fù)性，衍生后的樣品連續(xù)檢測(cè)的變異系數(shù)較小(見(jiàn)圖2)，具有較高的靈敏度。此外，采用MSTFA作為衍生試劑，不產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的沉淀，而且使用單一衍生試劑，操作方便。本發(fā)明提供的分析檢測(cè)方法，對(duì)待測(cè)固醇類物質(zhì)的衍生效果好，有利于測(cè)定低含量的樣品，如人體血清中微量的非膽固醇固醇類物質(zhì)；用5 a-膽甾烷m/z 217，24-脫氫膽甾醇m/z 129，膽甾烷醇m/z 306，7-烯膽甾烷醇m/z 255，豆固醇m/z 83為定量離子，能有效避開(kāi)膽固醇峰的干擾，檢測(cè)效果好，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)均在0. 99以上。


圖I是本發(fā)明所述衍生方法的工藝流程圖；圖2是不同衍生試劑相同條件下檢測(cè)的定量離子的響應(yīng)因子(RRF);其中，A-D分別為膽留烷醇、24-脫氫膽留醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇衍生后的硅醚檢測(cè)得到的RRF，1-3分別為衍生試劑 HMDS+TMCS+pyridine (3+1+9)、BSTFA+TMCS (99+1)、MSTFA 衍生后檢測(cè)的RRF ；圖3是本發(fā)明所述衍生方法在不同衍生時(shí)間下檢測(cè)得到的RRF ；圖4是本發(fā)明所述衍生方法在不同衍生溫度下檢測(cè)得到的RRF ；圖5是本發(fā)明所述衍生方法在不同濃度下檢測(cè)得到的RRF的線性關(guān)系圖； 圖3-5中1、24_脫氫膽甾醇；2、豆固醇；3、7_烯膽甾烷醇；4、膽甾烷醇；圖6-1至圖6-5分別為5 a -膽甾烷及膽甾烷醇、24-脫氫膽甾醇、7-烯膽甾烷醇、豆固醇衍生后硅醚的定性定量離子在質(zhì)譜中的響應(yīng)值。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I衍生方法的確定(I)試劑的配制2,6- 二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)甲醇溶液稱取BHT粉末，以甲醇溶解，配制100ng/mL BHT甲醇溶液，檢測(cè)過(guò)程中起抗氧化作用。固醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液分別稱取I. 5 2. Omg 24-脫氫膽甾醇、7_烯膽甾烷醇、豆固醇、膽留烷醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以少量正已烷溶解，所得的溶解液混勻，繼續(xù)加入正已烷，配制一系列濃度(0. 001-1. 400mg/dL之間)的固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，人體血清中的非膽固醇類固醇物質(zhì)通常含量在0. 02-1. 00mg/dL之間，本發(fā)明技術(shù)方案選取濃度涵蓋了此濃度范圍。5a-膽甾烷正已烷內(nèi)標(biāo)溶液稱取5a-膽甾烷粉末，以正已烷溶解，配制
0.005mg/mL 5 a -膽甾烷正已烷溶液。取固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液IOOuL,置于一 IOmL的離心管中，加入5 a -膽甾烷正已烷溶液80 ii L，并加入ImLBHT甲醇溶液，置于50°C沙浴中氮?dú)獯抵两?，加入MSTFA 200yL，置于烘箱中衍生，所得溶液以氮?dú)獯蹈?，再?00 y L正已烷定容，轉(zhuǎn)移至400 y L內(nèi)插管中，進(jìn)樣分析，工藝流程見(jiàn)圖I。當(dāng)分析檢測(cè)樣品為人體血清樣品時(shí)，試劑的配制為以下步驟取人體血清IOOii L于5mL具塞刻度試管中，80iiL 5 a -膽甾烷正已烷內(nèi)標(biāo)溶液，ImL I. Omol/L的KOH甲醇溶液，I. OmL 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合，渦旋15s。置67°C水浴中皂化lh，冷卻，加入ImL水，2mL正已烷萃取,重復(fù)2次，取合并的正已烷層，加水洗滌至中性,分離出正已燒層，并于40 60°C氮?dú)獯蹈伞?2)氣相色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣量Iii L進(jìn)樣口溫度300°C進(jìn)樣模式不分流
柱流量恒線速度45cm/s色譜柱(5%苯基)甲基聚硅氧烷鍵合硅膠色譜柱(30mX0. 25mmX0. 25iim)，或同等類型的毛細(xì)管色譜柱柱溫40°C，保持 I. 5min，后以 50°C /min 升溫至 280°C，保持 12min，再以 30°C /min升溫至300 °C,保持5min。接口溫度290°C離子源EI源，70ev，23(TC。(3)定量離子的選擇內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與四種固醇物質(zhì)的定性定量離子分別為5a-膽甾烷(217，95，81)、24-脫氫膽甾醇(129，253，73)、膽甾烷醇(306，215，216)、7_烯膽甾烷醇(255，75，458)、豆固醇(83，55，129)。為了避開(kāi)膽固醇峰的干擾，選用質(zhì)荷比(m/z) 306為定量離子，m/z 306不受膽固醇峰的干擾(見(jiàn)圖6)。從表I和圖5可以看出，選用5 a -膽甾烷m/z217，24-脫氫膽留醇m/z 129，膽留烷醇m/z 306，7-烯膽留烷醇m/z255，豆固醇m/z 83為定量離子，四種固醇類物質(zhì)可以得出較好的濃度線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均在0. 99以上。表I四種固醇類物質(zhì)的線性參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種固醇類物質(zhì)的衍生方法，其特征在于，該方法采用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺為衍生試劑，于30-80°C衍生20-60min ;所述衍生方法優(yōu)選于50_70°C衍生30-50min ;進(jìn)一步優(yōu)選于60°C衍生40min。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的衍生方法，其特征在于，所述固醇類物質(zhì)為非膽固醇的固醇類物質(zhì)，優(yōu)選人體血清中非膽固醇的固醇類物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的衍生方法，其特征在于，所述非膽固醇的固醇類物質(zhì)為以膽固醇為前體的固醇類物質(zhì)和/或植物固醇；優(yōu)選24-脫氫膽留醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇或膽甾烷醇中的一種或多種。
4.權(quán)利要求1-3所述的衍生方法在固醇類物質(zhì)分析檢測(cè)中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述固醇類物質(zhì)為人體血清中非膽固醇 的固醇類物質(zhì)；優(yōu)選人體血清中24-脫氫膽留醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇或膽留烷醇中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述分析檢測(cè)為氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法定性定量分析檢測(cè)。
7.一種固醇類物質(zhì)的分析檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)分別配制待測(cè)樣品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，混合并吹干； (2)采用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行衍生化處理； (3)衍生后的待測(cè)樣品采用氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定性定量檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)分別配制待測(cè)樣品溶液及5a -膽甾烷內(nèi)標(biāo)溶液，混合并于40 60°C氮?dú)獯蹈桑? (2)加入100-300ii L的N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，優(yōu)選200 y L，于60°C衍生40min ； (3)衍生后的待測(cè)樣品采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定性定量檢測(cè)，所述質(zhì)譜采用離子模式，選用5 a-膽甾烷m/z 217，24-脫氫膽甾醇m/z 129，膽甾烷醇m/z 306，7-烯膽甾燒醇m/z 255,豆固醇m/z 83為定性定量離子； 所述待測(cè)樣品為含有24-脫氫膽留醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇和膽留烷醇的樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(I)為分別配置待測(cè)樣品的正己烷溶液及5 a-膽留烷正己烷內(nèi)標(biāo)溶液，再加入2，6_ 二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合并于40 60°C氮?dú)獯蹈伞?br> 10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品為含有24-脫氫膽留醇、7-烯膽留烷醇、豆固醇和膽留烷醇的人體血清樣品；所述步驟(I)為分別配置待測(cè)樣品的正己烷溶液及5a-膽留烷正己烷內(nèi)標(biāo)溶液，再加入2，6_ 二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液，混合后加入堿性醇溶液皂化，正己烷提取，提取液于40 60°C氮?dú)獯蹈伞?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種固醇類物質(zhì)的衍生方法，所述衍生方法采用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)為衍生試劑，于30-80℃衍生20-60min。本發(fā)明還涉及了所述衍生方法在固醇類物質(zhì)定性定量分析中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種固醇類物質(zhì)的分析檢測(cè)方法，采用前述方法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行衍生化處理。本發(fā)明采用MSTFA為衍生試劑，衍生后的固醇類物質(zhì)在GC或GC-MS檢測(cè)中，表現(xiàn)出了較好的可重復(fù)性，具有較高的靈敏度。此外，采用MSTFA作為衍生試劑，不產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)沉淀，而且使用單一衍生試劑，操作方便。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102731557SQ20111008323
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者劉奕忍, 劉洋, 勾新磊, 周曉萍, 張經(jīng)華, 徐康, 王啟輝, 鄭春巍, 陳瞾 申請(qǐng)人:北京市理化分析測(cè)試中心