專利名稱：一種肝素親和柱及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝素親和柱及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝素是一類糖胺聚糖，由糖醛酸和葡萄糖胺以1—4鍵連接起來的重復(fù)二糖單位組 成的多糖鏈的混合物；可以作為親和色譜與離子交換色譜的有效配體。其可以親和許多 生物分子，包括凝血因子和其它血漿蛋白如脂蛋白、蛋白合成因子、核酸酶以及固醇 類激素受體。2-0-硫酸-a-L艾杜糖酸酸及6-0-硫酸-N-硫酸-a-D葡萄糖胺是其中的主要 單糖，由它們組成的三硫酸二糖的重復(fù)單位構(gòu)成了肝素的所謂"規(guī)則區(qū)"，是肝素結(jié)構(gòu)的 主要部分，另外的單糖殘基以很低的頻率出現(xiàn)于"非規(guī)則區(qū)"。成品肝素中，只有三分之 一的肝素分子能與A T III結(jié)合，這些結(jié)合的部分具有抗凝活性，而其余部分則活性很 低。研究發(fā)現(xiàn)，肝素加速抗凝血酶-絲氨酸蛋白酶反應(yīng)依賴于一個(gè)獨(dú)特的五糖序列。
肝素親和柱目前主要由國外Pharmacia公司生產(chǎn)，技術(shù)一直沒有公布。國內(nèi)外也有 文獻(xiàn)報(bào)道過多種肝素親和柱的制備方法。最經(jīng)典的是用溴化氰活化瓊脂糖后連上肝素 (如Phamacia公司的heparin sepharose CL 6B產(chǎn)品)，但此方法因溴化氰有劇毒而不宜 在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，并且形成的化學(xué)鍵易斷裂，肝素的活性受偶聯(lián)的影響也比較大。國內(nèi) 有人將瓊脂糖環(huán)氧化后直接連接肝素，并用之成功分離純化了肝生長因子，但這種偶聯(lián) 方式的產(chǎn)品在醇類溶液中不穩(wěn)定。用還原胺化的方法將肝素偶聯(lián)上瓊脂糖類介質(zhì)是比較 理想的一種方法，原因是還原胺化法偶聯(lián)的是肝素的末端醛基與胺化瓊脂糖上的胺基， 不影響肝素的活性中心，從而可以保證所得產(chǎn)品具有較高的親和性能。國外早在1983 年就有人用3種方法將肝素聯(lián)上瓊脂糖進(jìn)行對(duì)比，3種方法中以還原胺化法消耗的肝素 量最少，但親和能力最高；然而當(dāng)時(shí)的方法也有一定的缺陷，就是還原劑氰基硼氫化鈉 的反應(yīng)產(chǎn)物有劇毒，對(duì)環(huán)境有污染以及反應(yīng)周期長達(dá)16天等。國內(nèi)近期也有人采用不 同的方法法制備了肝素瓊脂糖凝膠6FF親和柱(非間接還原胺化)，成功分離純化了抗凝 血酶III (AntithrombinIII,ATlII)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本低、效果好的肝素親和柱。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述肝素親和柱的制備方法。 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述肝素親和柱的應(yīng)用。
本發(fā)明采用瓊脂糖凝膠6FF介質(zhì)(國產(chǎn))作為固相載體，經(jīng)過環(huán)氧化與胺化后與肝 素相偶聯(lián)制備親和層析柱，降低親和柱的制備成本，簡化制備方法，用普通試劑代替?zhèn)?統(tǒng)制備過程使用的劇毒試劑，與此同時(shí)保證親和柱的穩(wěn)定性與親和能力。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種肝素親和柱，該肝素親和柱是通過下列方法制備得到的瓊脂糖凝膠6FF作為 固相載體，載體先進(jìn)行活化，偶聯(lián)上環(huán)氧基團(tuán)后，再進(jìn)行胺化偶聯(lián)上胺基，胺化瓊脂糖 凝膠6FF與肝素在甲醇中形成中間產(chǎn)物醛亞胺，再進(jìn)一步還原胺化形成穩(wěn)定化學(xué)鍵即得 肝素瓊脂糖凝膠6FF。
所述的肝素親和柱，該肝素親和柱是通過下列方法制備得到的
a. 瓊脂糖凝膠6FF首先用環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行活化，即在水中分別以終濃度為20-30 % (v/v)的瓊脂糖凝膠6FF、 5~10% (v/v)的環(huán)氧氯丙烷、0.3-0.5 mol/L的NaOH進(jìn) 行混合，37'C反應(yīng)l-2h，得到環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF;
b. 取20g環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF加1~2倍體積濃氨水(通常為25%-28%) 37'C反 應(yīng)l-2h，獲得胺化瓊脂糖凝膠6FF;
c. 胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素鈉混合物在甲醇中預(yù)處理:按lg胺化瓊脂糖凝膠6FF 中加入30 50mg肝素鈉與l-2ml甲醇混合，在氮?dú)猸h(huán)境下室溫振搖36-52h，形成醛亞 胺；
d. 按lg胺化瓊脂糖凝膠6FF加20-30mg硼氫化鈉比例，將硼氫化鈉加入醛亞胺， 對(duì)醛亞胺還原，得到肝素瓊脂糖凝膠6FF。
所述肝素親和柱的制備方法，該方法包括下列步驟瓊脂糖凝膠6FF作為固相載體， 載體先進(jìn)行活化，偶聯(lián)上環(huán)氧基團(tuán)后，再進(jìn)行胺化偶聯(lián)上胺基，胺化瓊脂糖凝膠6FF與 肝素在甲醇中形成中間產(chǎn)物醛亞胺，再進(jìn)一步還原胺化形成穩(wěn)定化學(xué)鍵即得肝素瓊脂糖 凝膠6FF。
所述的肝素親和柱的制備方法，該方法為
a. 瓊脂糖凝膠6FF首先用環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行活化，即在水中分別以終濃度為20-30 % (v/v)的瓊脂糖凝膠6FF、 5~10% (v/v)的環(huán)氧氯丙烷、0.3~0.5mol/L的NaOH進(jìn) 行混合，37'C反應(yīng)l-2h，得到環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF;
b. 取20g環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF加1~2倍體積濃氨水37'C反應(yīng)l-2h，獲得胺化瓊脂糖凝膠6FF;
c. 胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素鈉混合物在甲醇中預(yù)處理:按1 g胺化瓊脂糖凝膠6FF 中加入30~50 mg肝素鈉與1~2 ml甲醇混合，在氮?dú)猸h(huán)境下室溫振搖36-52h，形成醛亞 胺；
d. 按lg胺化瓊脂糖凝膠6FF加20 30mg硼氫化鈉比例，將硼氫化鈉加入醛亞胺， 對(duì)醛亞胺還原，得到肝素瓊脂糖凝膠6FF。
所述肝素親和柱在分離純化與肝素有特異結(jié)合能力的物質(zhì)中的應(yīng)用。
所述的應(yīng)用，其中與肝素有特異結(jié)合能力的物質(zhì)為載脂蛋白H (Apolipoprotein H， ApoH)、抗凝血酶III (Antithrombinin)、肝生長因子等，還用于重組產(chǎn)品的純化如人 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、蛇毒類凝血酶安克洛等。
對(duì)于未結(jié)合的胺基可進(jìn)行乙?；揎棸磍g粗制肝素親和柱加入lml 0.2mol/L醋 酸鈉、0.5ml醋酸酐的比例混合，冰浴30分鐘后，再加入0.5ml醋酸酐室溫放置另一 個(gè)30分鐘，然后交替用水、0.1 mol/LNaOH和水進(jìn)行清洗，最后用含20% (體積/體積) 乙醇的0.05 mol/L的醋酸鈉溶液乙醇的或含0.01% (質(zhì)量/體積)硫柳汞的0.15 mol/L NaCl溶液保存在4'C進(jìn)行保存。
肝素瓊脂糖凝膠6FF親和柱的使用方法
將制備好的親和柱從4'C中取出，室溫平衡后使用。
(1) .上樣放掉柱內(nèi)溶液，用上樣緩沖液(0.02mol/LTris-HCl)淋洗柱子進(jìn)行平衡， 將提取的樣品用上樣緩沖液溶解并充分透析，上樣；
(2) .針對(duì)不同的樣品分別用含有不同濃度NaCl的上樣緩沖液進(jìn)行洗脫；
(3) .用含有1.0-2.0 mol/L NaCl的上樣緩沖液淋洗進(jìn)行再生，也可以用0.1-0.5mol/L NaOH進(jìn)行清洗；
(4) .用含20%乙醇的0.05 mol/L的醋酸鈉溶液保存或含0.01%硫柳汞的0.15 mol/LNaCl溶液置換柱內(nèi)液體，4'C進(jìn)行保存，以待重復(fù)使用。
本發(fā)明有益效果
本發(fā)明采用瓊脂糖凝膠6FF作為固相載體，與肝素相偶聯(lián)制備可重復(fù)使用的肝素親 和柱，用于載脂蛋白質(zhì)H等的分離純化，解決了傳統(tǒng)溴化氰法制備的毒性產(chǎn)物問題。采 用肝素末端醛基與胺化瓊脂糖的胺基結(jié)合，可使肝素的活性不受影響，保證了親和柱有 較高的親和力；肝素偶聯(lián)穩(wěn)定，可多次反復(fù)使用；本發(fā)明所用試劑成本低、無環(huán)境污染， 方法便捷，時(shí)間短，效率高，為普通實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模分離純化與肝素有特異結(jié)合能力的物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，可促進(jìn)國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的研究。
親和柱性能的評(píng)價(jià)包括肝素結(jié)合量的測(cè)定、柱容量的測(cè)定、柱空白的測(cè)定、重復(fù) 性與穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。
1、 肝素結(jié)合量的測(cè)定采用電位滴定法進(jìn)行測(cè)定。首先制作肝素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分
別配制含有3.91、 5.33、 7.83、 9.65、 10.65、 14.43、 15.65、 21.30、 31.30、 42.60 mg肝 素鈉的0.1mol/LKCl溶液各10ml，用濃鹽酸(36-38%)將它們的pH調(diào)到2.50±0.01， 然后用0.5 mol/LKOH進(jìn)行滴定，記錄到終點(diǎn)時(shí)消耗的KOH量，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。肝 素瓊脂糖凝膠6FF(在真空度約為-30千帕?xí)r進(jìn)行抽干，下同)親和柱與瓊脂糖凝膠6FF 預(yù)先用0.1 mol/LKCl置換溶液。同法測(cè)定0.1 mol/LKCl溶液中加入1.10、 2.77、 3.64、 3.39、 5.21、 5.79、 5.98、 6.92、 10.45 g肝素瓊脂糖凝膠6FF抽干膠后滴定消耗的KOH 量；以0.1mol/LKCl溶液中加入3.5、 5.0、 7.0、 8.0、 11.0 g瓊脂糖凝膠6FF抽干膠時(shí) 消耗的KOH量作為空白對(duì)照。測(cè)定原理是A = Aheparin + As。luti。n+ASephar。se。 (A為達(dá)到
滴定終點(diǎn)時(shí)所要消耗的KOH量，Aheparin、 As。luti。n、 Asephar。se分別為肝素、KC1溶液、瓊
脂糖凝膠6FF達(dá)滴定終點(diǎn)時(shí)所要消耗的KOH量)
肝素結(jié)合量的計(jì)算見圖2。以肝素親和柱消耗掉的KOH量，利用回歸方程求出 對(duì)應(yīng)的肝素含量，平均值即為制備的肝素親和柱的肝素結(jié)合量，約為4mg/g抽干膠。
2、 柱容量的測(cè)定將不同劑量的載脂蛋白H溶液(0.5、 1、 1.5、 2、 2.5 ml，濃度 為lmg/ml)上0.2ml體積肝素親和柱親和，經(jīng)平衡、洗脫后分別收集平衡峰與洗脫峰。 將平衡峰上另一個(gè)肝素親和柱親和，檢査親和柱的飽和情況。
結(jié)果表明在1 mg/ml的載脂蛋白H溶液濃度下，1.5ml/ml介質(zhì)為肝素親和柱親和 柱的飽和點(diǎn)，超過此量，親和就不完全。
3、 重復(fù)性與穩(wěn)定性評(píng)價(jià)制備的親和柱在防菌和用含1.0-2.0 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl或0.1-0.5mol/L NaOH的再生處理情況下，在使用中發(fā)現(xiàn)半年、30次以 上柱容量未明顯下降。親和柱放于70%乙醇中1月以上，測(cè)定其肝素結(jié)合量未下降，說 明其在較高濃度的醇溶液中是比較穩(wěn)定的。


圖1:肝素瓊脂糖凝膠6FF的合成線路。
圖2:肝素瓊脂糖凝膠6FF中肝素結(jié)合量的電位滴定結(jié)果。
肝素標(biāo)準(zhǔn)(令)，瓊脂糖結(jié)合肝素(o)，空白瓊脂糖凝膠6FF—)，以及O.l mol/LKCl 溶液(A)分別用不同的符號(hào)表示。下橫座標(biāo)表示肝素標(biāo)準(zhǔn)的濃度，上橫座標(biāo)表示肝素親和柱或空白瓊脂糖凝膠6FF的加入量，縱座標(biāo)表示達(dá)到滴定終點(diǎn)時(shí)KOH的消耗量。所 有測(cè)量物均以0.1mol/LKCl作為溶劑，終體積為10ml，在室溫下測(cè)量。 圖3 :肝素瓊脂糖凝膠6FF對(duì)載脂蛋白H的親和層析圖譜。
圖4 : SDS-PAGE結(jié)果(實(shí)施例1)。泳道1為Marker,泳道2為粗制品，泳道3 為肝素瓊脂糖凝膠6FF提純之后的產(chǎn)品。
圖5 : Western-blotting結(jié)果。
圖6 : SDS-PAGE結(jié)果(實(shí)施例2)。
圖7: SDS-PAGE結(jié)果(實(shí)施例3)。 具體實(shí)施方案
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例1
所需試劑DEAE-纖維素-52，瓊脂糖凝膠6FF，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，SDS， 肝素鈉，蛋白Marker,考馬斯亮蘭R250，硼氫化鈉，兔抗人載脂蛋白H多克隆抗體， HC104(72%-74%)， (NH4)2S04， TPB (0.039 mol/LTris-0.005mol/L H3P04， pH8.6)， 0.02 mol/LTris-HCl等其它相關(guān)試劑。
親和柱的制備
取抽干瓊脂糖凝膠6FF 20g加環(huán)氧氯丙垸3 ml， 2 mol/LNaOH 13 ml,蒸餾水30 ml
混合，37。C搖床2h，得到環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF;
用蒸餾水清洗得到的環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF，抽干后稱重，得膠約18.5g。
取18 g環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF加入27 ml濃氨水37。C反應(yīng)2h，獲得胺化瓊脂糖凝
膠6FF;
用蒸餾水清洗胺化瓊脂糖凝膠6FF，抽干后稱重，得膠17.1 g。與肝素鈉混合先在 甲醇中預(yù)處理，按lg胺化瓊脂糖凝膠6FF中加入30mg肝素鈉與1.5ml甲醇混合，在 氮?dú)猸h(huán)境下室溫振搖48h，形成混合體系；
按lg胺化瓊脂糖凝膠6FF加25 mg硼氫化鈉比例，將硼氫化鈉直接加入上面的混 合體系中進(jìn)行還原，反應(yīng)4小時(shí)，得到粗制肝素瓊脂糖凝膠6FF。用清水進(jìn)行清洗，然 后對(duì)未結(jié)合的胺基進(jìn)行乙酰化修飾按lg膠加入lml 0.2mol/L醋酸鈉、0.5ml醋酸酐 的比例混合，冰浴30分鐘后，再加入0.5ml醋酸酐室溫放置另一個(gè)30分鐘，然后交替 用水、0.1mol/LNaOH和水進(jìn)行清洗，抽干后稱重，得成品肝素瓊脂糖凝膠6FF約16.3 g。最后用含20%乙醇的0.05 mol/L的醋酸鈉溶液在4'C進(jìn)行保存。肝素親和柱用于對(duì)載脂蛋白H的純化
載脂蛋白H粗提品的制備150 mL人混合血清加入3.75 mL 70 % HC104 (體積/體 積)，lOOOg離心15分鐘，棄去沉淀。收集上清并用4mol/LNaOH調(diào)pH至中性(pH 7.0-7.2)后，加入380 g/L(NH4)2S04,過夜，離心收集沉淀。將沉淀以最小體積TPB(0.039 mol/LTris-0.005 mol/LH3PO4， pH8.6)緩沖液溶解，并對(duì)TPB緩沖液透析后，上預(yù)先 用TPB平衡的DEAE-纖維素-52離子交換柱(1.7cmX32cm)，深凹面梯度洗脫，收集 第二峰OD〉0.1的各管合并，再用終濃度為0.2mol/LHClO4 4"處理2小時(shí)，然后離心 棄去沉淀，對(duì)TPB緩沖液透析以除去HC104。
用親和柱進(jìn)一步純化制備好的親和柱從冰箱中取出與室溫平衡后使用。粗提樣品 經(jīng)過0.02 mol/L Tris-HCl透析，上預(yù)先用0.02 mol/L Tris-HCl平衡的自制肝素親和柱， 先用平衡液洗柱，再用0.15 mol/L NaCl-0.02 mol/L Tris-HCl洗柱，最后用0.35 mol/L NaCl-0.02 mol/LTris-HCl洗脫并收集。
純化載脂蛋白H的鑒定用SDS-PAGE、 Westem-blotting、氨基酸組成分析分別對(duì) 純化樣品的性質(zhì)與純度進(jìn)行鑒定。具體方法如下
SDS-PAGE與Western-blotting法鑒定配制12%分離膠與3%濃縮膠，裝板，樣品 與Marker同時(shí)上樣，100V穩(wěn)壓。同時(shí)跑兩塊膠，其中一塊電泳完后行考馬斯亮蘭R250 染色，用來鑒定蛋白質(zhì)純度和測(cè)定分子量。另一塊轉(zhuǎn)膜，用0.45umNC膜，100mA恒 流150分鐘。固定液配方含5%磺基水楊酸、10%三氯醋酸、0.15mol/L的Tris以及 0.12mol/L的甘氨酸。封閉液配方2g脫脂奶粉用20ml馬來酸鈉溶液(0.1mol/L馬來酸 鈉-0.15mol/LNaCl， PH7.5)煮沸溶解，再加入180mlPBS (0.01mol/L)與200"lNP-40。
氨基酸組成分析 一定量載脂蛋白H置水解管中，用終濃度6 mol/L的HC1 ll(TC 水解24小時(shí)，經(jīng)異硫氰酸苯酯(PITC)衍生后，以高效液相色譜儀分析。流動(dòng)相A液 為三水醋酸鈉，B液為水、乙醇、甲醇。
鑒定結(jié)果Western-blotting結(jié)果說明提純物質(zhì)為載脂蛋白H， SDS-PAGE與氨基酸 組成分析結(jié)果說明用制備的肝素親和柱提純的載脂蛋白H具有很高的純度。最終獲得的 純化載脂蛋白H總蛋白量約4mg。
表l:提純的載脂蛋白H的氨基酸組成分析結(jié)果
氨基酸 aspgluserglyhisthralaarg pro tyr val met ile leuphe lys Mol/mol3 68.9 82.5 60.9 101.1 14.9 82.9 74.6 49.7 119.3 33.2 48.7 29 38.3 51.8 69.6 94.5實(shí)施例2
親和柱的制備方法同于實(shí)施例1，用30 g瓊脂糖凝膠6FF制備，最終得到肝素 瓊脂糖凝膠6FF 26.3 g在4'C保存于含0.01 %硫柳汞的0.15 mol/LNaCl溶液。 肝素親和柱用于對(duì)載脂蛋白H的純化
載脂蛋白H粗提品的制備:200mL人混合血清加入5.0mL70 % HC104(體積/體積)， 4'C攪拌I5分鐘，性狀由稀到稠再到稀，1000 g離心I5分鐘，棄去沉淀。收集上清并 用4mol/LNaOH調(diào)pH至中性(pH 7.0-7.2)后，加入380 g/L(NH4)2S04，過夜，離心收 集沉淀。將沉淀以最小體積TPB (0.039 mol/LTris-0.005 mol/LH3P04, pH8.6)緩沖液 溶解，并對(duì)TPB緩沖液透析后，上預(yù)先用TPB平衡的DEAE-纖維素-52離子交換柱 (1.7cmX32cm)，深凹面梯度洗脫，收集第二峰ODX).l的各管合并，再用終濃度為0.2 mol/LHC104 4t:處理10小時(shí)，然后離心棄去沉淀，對(duì)TPB緩沖液透析以除去HC104。
用親和柱進(jìn)一步純化制備好的親和柱從冰箱中取出在室溫平衡后使用。粗提樣品 經(jīng)過0.02 mol/L Tris-HCl透析，上預(yù)先用0.02 mol/L Tris-HCl平衡的肝素親和柱，先用 平衡液洗柱，再用0.15 mol/LNaCl-0.02 mol/LTris-HCl洗柱，最后用0.35 mol/L NaCl-0.02 mol/LTris-HCl洗脫并收集。
純化載脂蛋白H的鑒定用SDS-PAGE、 Western-blotting、氨基酸組成分析分別對(duì) 純化樣品的性質(zhì)與純度進(jìn)行鑒定。具體方法鑒定方法同于實(shí)施例1。
鑒定結(jié)果最終獲得的純化載脂蛋白H總蛋白量約5.1mg。
實(shí)施例3:
親和柱為實(shí)施例2所用親和柱活化再生后使用，再生方法為先用含有1.5 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl淋洗，再用0.1 mol/L NaOH進(jìn)行清洗；
肝素親和柱用于對(duì)載脂蛋白H的純化
載脂蛋白H粗提品的制備175mL人混合血清加入4.375 mL 70 % HC104(v/v)， 4°C 攪拌15分鐘，性狀由稀到稠再到稀，約1500 g離心15分鐘，棄去沉淀。收集上清并 用4mol/LNaOH調(diào)pH至中性(pH7.0-7.2)后，加入380 g/L(NH4)2S04，過夜，離心收 集沉淀。將沉淀以最小體積TPB (0.039 mol/LTris-0.005 mol/LH3P04， pH8.6)緩沖液 溶解，并對(duì)TPB緩沖液透析后，上預(yù)先用TPB平衡的DEAE-纖維素-52離子交換柱 (1.7cmX32cm)，深凹面梯度洗脫，收集第二峰OD>0.1的各管合并，再用終濃度為0.2 mol/L HC104 4'C處理10小時(shí)，然后離心棄去沉淀,對(duì)TPB緩沖液透析以除去HC104。用親和柱進(jìn)一步純化制備好的親和柱從冰箱中取出與室溫平衡后使用。粗提樣品 經(jīng)過0.02 mol/L Tris-HCl透析，上預(yù)先用0.02 mol/L Tris-HCl平衡的肝素親和柱，先用 平衡液洗柱，再用0.15 mol/L NaCl-0.02 mol/L Tris-HCl洗柱，最后用0.35 mol/L NaCl-0.02 mol/L Tris-HCl洗脫并收集。
純化載脂蛋白H的鑒定用SDS-PAGE、 Westem-blotting、氨基酸組成分析分別對(duì) 純化樣品的性質(zhì)與純度進(jìn)行鑒定。具體方法鑒定方法同于實(shí)施例1。
鑒定結(jié)果最終獲得的純化載脂蛋白H總蛋白量4.2mg。說明按實(shí)施例1中的方法 再生的親和柱可以重復(fù)使用)。
權(quán)利要求
1、一種肝素親和柱，其特征在于該肝素親和柱是通過下列方法制備得到的瓊脂糖凝膠6FF作為固相載體，載體先進(jìn)行活化，偶聯(lián)上環(huán)氧基團(tuán)后，再進(jìn)行胺化偶聯(lián)上胺基，胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素在甲醇中形成中間產(chǎn)物醛亞胺，再進(jìn)一步還原胺化形成穩(wěn)定化學(xué)鍵即得肝素瓊脂糖凝膠6FF。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素親和柱，其特征在于該肝素親和柱是通過下列方法 制備得到的a. 瓊脂糖凝膠6FF首先用環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行活化，即在水中分別以終濃度為20~30 % (v/v)的瓊脂糖凝膠6FF、 5 10% (v/v)的環(huán)氧氯丙烷、0.3-0.5 mol/L的NaOH進(jìn) 行混合，37'C反應(yīng)l-2h，得到環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF;b. 取20g環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF加1~2倍體積濃氨水37'C反應(yīng)l-2h，獲得胺化瓊 脂糖凝膠6FF;c. 胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素鈉混合物在甲醇中預(yù)處理:按1 g胺化瓊脂糖凝膠6FF 中加入30-50 mg肝素鈉與l-2ml甲醇混合，在氮?dú)猸h(huán)境下室溫振搖36-52h，形成醛亞 胺；d. 按lg胺化瓊脂糖凝膠6FF加20 30mg硼氫化鈉比例，將硼氫化鈉加入醛亞胺， 對(duì)醛亞胺還原，得到肝素瓊脂糖凝膠6FF。
3、 權(quán)利要求1所述肝素親和柱的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟瓊 脂糖凝膠6FF作為固相載體，載體先進(jìn)行活化，偶聯(lián)上環(huán)氧基團(tuán)后，再進(jìn)行胺化偶聯(lián)上 胺基，胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素在甲醇中形成中間產(chǎn)物醛亞胺，再進(jìn)一步還原胺化形 成穩(wěn)定化學(xué)鍵即得肝素瓊脂糖凝膠6FF。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的肝素親和柱的制備方法，其特征在于該方法為a. 瓊脂糖凝膠6FF首先用環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行活化，即在水中分別以終濃度為20~30 % (v/v)的瓊脂糖凝膠6FF、 5 10% (v/v)的環(huán)氧氯丙垸、0.3~0.5mol/L的NaOH進(jìn) 行混合，37'C反應(yīng)l-2h，得到環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF;b. 取20g環(huán)氧化瓊脂糖凝膠6FF加1~2倍體積濃氨水37'C反應(yīng)l-2h，獲得胺化瓊 脂糖凝膠6FF;c. 胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素鈉混合物在甲醇中預(yù)處理:按lg胺化瓊脂糖凝膠6FF 中加入30 50mg肝素鈉與l~2ml甲醇混合，在氮?dú)猸h(huán)境下室溫振搖36-52h，形成醛亞胺;d.按lg胺化瓊脂糖凝膠6FF加20 30mg硼氫化鈉比例，將硼氫化鈉加入醛亞胺， 對(duì)醛亞胺還原，得到肝素瓊脂糖凝膠6FF。
5、 權(quán)利要求1所述肝素親和柱在分離純化與肝素有特異結(jié)合能力的物質(zhì)中的應(yīng)用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于與肝素有特異結(jié)合能力的物質(zhì)為載脂 蛋白H (Apolip叩rotein H, Apo H)、抗凝血酶III (Antithrombin III)、肝生長因子、堿 性成纖維細(xì)胞生長因子或蛇毒類凝血酶安克洛。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肝素親和柱及其制備方法和應(yīng)用。該肝素親和柱是通過下列方法制備得到的瓊脂糖凝膠6FF作為固相載體，載體先進(jìn)行活化，偶聯(lián)上環(huán)氧基團(tuán)后，再進(jìn)行胺化偶聯(lián)上胺基，胺化瓊脂糖凝膠6FF與肝素在甲醇中形成中間產(chǎn)物醛亞胺，再進(jìn)一步還原胺化形成穩(wěn)定化學(xué)鍵即得肝素瓊脂糖凝膠6FF。該親和柱制備方法簡單，時(shí)間短，效率高。采用肝素末端醛基與胺化瓊脂糖的胺基結(jié)合，可使肝素的活性不受影響，保證了親和柱有較高的親和力；肝素偶聯(lián)穩(wěn)定，可多次反復(fù)使用；本方法所用試劑成本低、無環(huán)境污染，為普通實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模分離、純化與肝素有特異結(jié)合能力的物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，可促進(jìn)國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的研究。
文檔編號(hào)B01J20/286GK101306353SQ200810018999
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日
發(fā)明者張春妮, 克 李, 汪俊軍, 王相棟 申請(qǐng)人:中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院