專利名稱：成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子－2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，屬于骨組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于腫瘤切除、外傷、骨疾病及骨異常生長所造成的骨缺損，單純依靠自行修復(fù)很難愈合，因此植骨術(shù)是治療大段骨缺損的最有效措施。在美國植骨術(shù)已成為僅次于輸血的組織移植技術(shù)。據(jù)美國疾病預(yù)防與控制中心不完全統(tǒng)計，在美國每年因骨缺損需要進行骨移植手術(shù)的患者超過100萬例，醫(yī)療費用超過50億美元，在英國的費用也超過了9億英鎊。傳統(tǒng)的移植方式主要有自體骨移植和異體骨移植，但自體骨移植面臨著骨源受限、增加創(chuàng)傷和感染率等缺陷，而異體骨移植存在生物活性差、免疫排斥反應(yīng)和傳播疾病的危險。近年來組織工程技術(shù)的發(fā)展為骨缺損的治療提供了新思路。
骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)因具有明確的成骨分化潛能，易于獲得及擴增，其獨特的細胞增殖分裂模式使外源基因易于導(dǎo)入和表達，因此成為目前研究最廣泛的的組織工程骨種子細胞。MSCs具有成骨潛能，一方面其中的定向性骨祖細胞能自動分化為成骨細胞，另一方面其中的誘導(dǎo)性骨祖細胞在誘導(dǎo)物的作用下也能轉(zhuǎn)化為成骨細胞系。盡管已經(jīng)有大量的實驗證實了MSCs的成骨分化，然而如何通過合適的基因修飾使MSCs進行定向誘導(dǎo)成骨分化，從而更好的應(yīng)用于骨組織工程是亟待解決的問題。成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2(Osf2)，又稱核心結(jié)合因子α1(Cbfa1)，屬于runt結(jié)構(gòu)域基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，已被證實對成骨細胞分化和骨形成具有重要作用，但國內(nèi)外未見將Osf2應(yīng)用于組織工程化骨構(gòu)建的報道。
另外，在骨組織工程中，良好的支架材料利于細胞和/或生物活性因子的定位及遞送，既而影響新組織的三維空間構(gòu)型的形成，以及最終與受體很好地適應(yīng)并結(jié)合在一起，形成具有適宜結(jié)構(gòu)和功能的新組織。理想的骨組織工程材料應(yīng)滿足以下要求①良好的生物相容性；②良好的生物降解性；③易加工成形，并具有一定的強度；④材料表面易于細胞粘附且不影響其增殖分化。已有大量的實驗應(yīng)用人工合成材料進行骨缺損的修復(fù)嘗試，并取得一定的效果，但生物相容性、降解產(chǎn)物代謝、力學(xué)特性等諸多問題限制了其應(yīng)用。因此，尋求一種綜合考慮生物相容性、生物降解性、骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，以及力學(xué)性質(zhì)的材料制備方法十分必要。天然生物衍生材料抗原性較弱，并有良好的組織親和性和結(jié)合力，其天然的孔隙結(jié)構(gòu)，為種子細胞的粘附、增殖、分化和成骨提供了天然的三維空間結(jié)構(gòu)。但目前的生物衍生材料也有其弊端脫蛋白處理較好地保留了材料的孔隙結(jié)構(gòu)和機械強度，降低了抗原性，但同時降低了材料的骨誘導(dǎo)性；脫鈣處理雖較好的保留了誘導(dǎo)性，但大大降低了機械強度。
細胞在生物支架材料的體外培養(yǎng)是目前骨組織工程研究中的一個難點，主要原因是簡單的三維培養(yǎng)會導(dǎo)致細胞分布不均勻，深部細胞的營養(yǎng)交換障礙等問題，因此應(yīng)用合理而實用的體外種植和培養(yǎng)體系是構(gòu)筑組織工程化骨的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對目前的骨組織工程研究中種子細胞、支架材料和體外培養(yǎng)三個方面進行改進，目的是提供一種具有明確成骨效應(yīng)的組織工程化骨的構(gòu)建方法，用于臨床上修復(fù)骨缺損。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下本方法以成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞為種子細胞，與脫細胞骨基質(zhì)天然生物衍生材料復(fù)合構(gòu)建骨組織，經(jīng)體外動態(tài)培養(yǎng)后，進行大段長骨缺損的修復(fù)，包括以下三個步驟(1)種子細胞的獲取所述種子細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞融合度約為90％后利用成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2(Osf2)腺病毒感染，感染24小時后收集細胞用于與支架材料的復(fù)合；(2)天然生物衍生材料的制備由異種或同種骨組織去除抗原性和細胞成分，保留骨基質(zhì)的天然孔架結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性；(3)種子細胞的種植與組織工程化骨的動態(tài)培養(yǎng)完成支架材料的制備后，在支架材料上接種種子細胞。繼而在反應(yīng)器內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)5-7天，即獲得組織工程化骨。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明針對目前的骨組織工程研究中種子細胞、支架材料和體外培養(yǎng)三個方面進行改進。通過Osf2基因修飾骨髓MSCs，增強了種子細胞的成骨定向分化能力，并在修復(fù)過程中促進骨形成；脫細胞骨基質(zhì)生物衍生材料的應(yīng)用，只脫去細胞成分，而保留組織的無機和有機成分，極利于細胞的附著及新骨的形成，使支架材料在生物相容性、生物降解性、骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性及力學(xué)性質(zhì)方面較為理想；動態(tài)培養(yǎng)促進了種子細胞在支架材料的黏附、生長增殖，并進一步促進Osf2基因修飾的MSCs的成骨分化能力，解決了細胞在生物支架材料的體外培養(yǎng)是目前骨組織工程研究中難題。本發(fā)明適用于骨科、整形、頜面外科等多種常見修復(fù)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1是實施例1中組織工程化骨裸鼠背部皮下種植。4周后可見大量新骨生成。熒光示蹤觀察和組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，組織工程化骨內(nèi)大量經(jīng)基因修飾的種子細胞發(fā)揮成骨效應(yīng)(200×)。
圖2.是實施例2中兔橈骨1.2cm缺損的修復(fù)。X線檢查術(shù)后12周A組支架材料完全降解并被新生骨組織所取代，新骨塑形完成，骨髓腔通暢。A組在新骨形成、骨改建和髓腔再通等方面明顯優(yōu)于其它組。
具體實施例方式
以下結(jié)合實施例詳細說明本發(fā)明的構(gòu)建過程實施例11.種子細胞的制備抽取小鼠骨髓懸液約2m1，通過密度梯度離心，收集界面的單核細胞層，調(diào)整至2×105/cm2的密度接種。24小時后首次換液，棄取未貼壁細胞，此后每周半量換液2次。14d后單層細胞基本融合。0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2傳代。使用第1-6代細胞，細胞融合度約為90％后利用攜帶人Osf2基因腺病毒感染，感染1天后收集細胞用于與支架材料的復(fù)合。
1.1骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取自小鼠股骨抽取骨髓懸液約2ml，緩慢加至預(yù)先加入Percoll分離液5mL(比重1.073g/mL)的離心管中，以2000r/min×20min離心，收集界面的單核細胞層，PBS洗2次，去除多余脂肪及組織液，加入DMEM培養(yǎng)液，吹打，稀釋成細胞懸液，調(diào)整至2×105/cm2的密度接種于25ml培養(yǎng)瓶。加入足量培養(yǎng)液，培養(yǎng)基為DMEM+10％FCS，5％CO2，37℃孵育，24h后換液，棄取未貼壁細胞，此后每周半量換液2次，逐日觀察。14d后單層細胞基本融合。0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2傳代。收集1-6代細胞用于下面的構(gòu)建。
1.2攜帶人Osf2腺病毒載體構(gòu)建如下設(shè)計引物，上游5’-GAAGATCTTCATGGCATCAAACAGCCTCTT-3’(加入BgllI酶切位點)；下游5’-GCCTCGAGCGTCAATATGGTCGCCAAACAGATTCA-3’(加入XhoI酶切位點)，抽提成骨細胞總RNA，用RT-PCR方法克隆人Osf2基因cDNA，定向克隆于穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV(美國Stratagene公司編號#240007)的BglII(第947bp)和XbaI(第972bp)位點，繼而利用細菌內(nèi)重組原理與骨架質(zhì)粒pAdeasy-1(美國Stratagene公司編號#240005)重組得到pAdEasy-1/Osf2質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細胞，重組腺病毒在293細胞大量擴增繁殖，氯化銫密度梯度超離心法純化，得到Osf2重組腺病毒。
以上述所構(gòu)建的重組腺病毒基因組DNA為模板，可以擴增出Osf2基因片斷，而未能擴增出腺病毒E1蛋白的特異條帶，表明獲得的腺病毒攜帶Osf2基因，且無具備復(fù)制能力的腺病毒污染，可以應(yīng)用于種子細胞的基因修飾。
1.3 Osf2腺病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞的具體操作如下將MSCs以2×104/cm2的密度傳代于6孔板，約3d后細胞融合約90％時，用PBS洗2次，加入感染復(fù)數(shù)(MOI)＝50的Osf2重組腺病毒，感染1小時后PBS洗2次，加入條件培養(yǎng)液(DMEM+10％胎牛血清+地塞米松10nmol/l+維生素C50mg/l+β-甘油磷酸鈉10mmol/L)。
2.天然生物衍生材料的制備方法采用以下方式將異種或同種松質(zhì)骨塊置入1∶2甲醇氯仿溶液中脫脂12h→0.05M Tris-HCl(PH7.4)緩沖液中，緩沖液中加入蛋白酶抑制劑(4U/mlDispase，lμM Acetyl-Pepstain，0.5μM AEBSF，2μg/ml Aprotinins，100μM Leupeptin)，4℃恒溫震蕩3d→骨塊置入含3％TritonX-100的Tris-HCl(PH7.4)緩沖液中，內(nèi)加蛋白酶抑制劑，4℃恒溫震蕩3d→去離子水連續(xù)沖洗12h后，加入DNAase和RNAase混合液室溫下消化12h→重復(fù)第3步。最后骨塊經(jīng)蒸餾水充分沖洗后，真空制干，經(jīng)10kGy鈷60-γ射線照射消毒滅菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 將上述方法制備的脫細胞骨基質(zhì)材料行形態(tài)學(xué)檢測HE染色可見脫細胞骨基質(zhì)膠原纖維排列整齊，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，無明顯斷裂，骨陷窩內(nèi)空虛，未見細胞和其它細胞成分。哈佛氏系統(tǒng)中央管及周圍陷窩中均未見細胞，整個基質(zhì)呈伊紅色。邊緣部與中心部脫細胞效果相同。掃描電鏡顯示脫細胞骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)較完整，骨陷窩空虛，陷窩內(nèi)壁光滑規(guī)則，未見任何細胞殘留成分。脫細胞骨基質(zhì)的網(wǎng)孔測量脫細胞骨基質(zhì)呈現(xiàn)不規(guī)則的網(wǎng)架-空隙結(jié)構(gòu)，經(jīng)測量50個視野的500個孔隙，經(jīng)統(tǒng)計脫細胞骨基質(zhì)的孔隙直徑為253±106μm，孔隙率約75.8％。
該支架材料的力學(xué)指標骨的壓縮破壞載荷、最大抗壓強度、彈性模量等幾項指標稍有減小和降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其縱向壓縮的力學(xué)性質(zhì)沒有明顯的改變。異種抗原α-gal無表達。
3.種子細胞的種植與組織工程化骨的動態(tài)培養(yǎng)實際例為①將脫細胞骨基質(zhì)(1.0cm×1.0cm×0.5cm)在DMEM培養(yǎng)基中預(yù)濕2h。②然后將2.0×106個經(jīng)Osf2腺病毒感染的MSCs制成400μl細胞懸液，利用1ml注射器加入基質(zhì)材料，盡量使細胞灌入孔隙中。24孔板靜置培養(yǎng)，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)4小時。③最后加入含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基覆蓋基質(zhì)材料，培養(yǎng)過夜(12-16小時)。每周換液2次。④在自行設(shè)計制備的細胞灌流系統(tǒng)，或者旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)等進行組織工程化骨的動態(tài)培養(yǎng)。將細胞-材料復(fù)合物置于流動腔，調(diào)整位置，使培養(yǎng)基可以充分流經(jīng)支架材料，培養(yǎng)5-7天，每周換液2次。
經(jīng)上述步驟進行種子細胞的種植靜置培養(yǎng)4小時，加入可覆蓋材料的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，倒置顯微鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)材料孔隙和周邊有細胞粘附，隨著細胞培養(yǎng)的時間延長，附著于材料上的細胞逐漸增多。電鏡顯示經(jīng)反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)5天后，細胞在材料中粘附良好，細胞形態(tài)呈纖維狀梭形或扁平，伸出細胞突起“鉚伏”在材料的孔隙或者表面。相鄰細胞之間有突起相連接，細胞表面有鈣顆粒沉積。細胞的堿性磷酸酶活性和骨鈣素產(chǎn)物均高于靜態(tài)培養(yǎng)組和未經(jīng)Osf2基因修飾MSCs組，表明在流體促進細胞分化的基礎(chǔ)上，通過Osf2的基因修飾，可以進一步增強MSCs向成骨細胞的分化，從而更好的發(fā)揮組織工程化骨的修復(fù)功能。
按照步驟3進行體外的動態(tài)培養(yǎng)5天后，裸鼠背部皮下種植。4周后可見大量新骨生成。見圖1，熒光示蹤觀察和組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，組織工程化骨內(nèi)大量經(jīng)基因修飾的種子細胞發(fā)揮成骨效應(yīng)(200×)。
實施例2按實施例1中的步驟1方法獲得兔骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)Osf2基因修飾后，種植在按步驟2所制備的支架材料，繼而按照步驟3進行體外的動態(tài)培養(yǎng)5天。選擇3月齡日本大白兔40只，建立單側(cè)橈骨1.2cm缺損，根據(jù)不同的修復(fù)方式分成4組，每組10只A組.Osf2基因修飾MSCs與脫細胞骨基質(zhì)材料復(fù)合后修復(fù)；B組.未基因修飾MSCs與脫細胞骨基質(zhì)材料復(fù)合后修復(fù)；C組.單純支架材料修復(fù)；D組.空白對照，不加任何植骨處理。結(jié)果參見圖2，X線檢查和組織學(xué)觀察顯示A組在新骨形成、骨改建和髓腔再通等方面明顯優(yōu)于其它組，術(shù)后12周A組支架材料完全降解并被新生骨組織所取代，新骨塑形完成，骨髓腔通暢；修復(fù)后修復(fù)側(cè)橈骨與健側(cè)相比破壞壓縮載荷差異不顯著(P＞0.05)。
上述方法若是對于人，種子細胞為取自髂前上棘的骨髓間充質(zhì)干細胞，其余實施步驟相同。
權(quán)利要求
1.成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是采用如下的方法制備(1)種子細胞的獲取所述種子細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞融合度約為90％后利用成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2(Osf2)腺病毒感染，感染24小時后收集細胞用于與支架材料的復(fù)合；(2)天然生物衍生材料的制備由異種或同種骨組織去除抗原性和細胞成分，保留骨基質(zhì)的天然孔架結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性；(3)種子細胞的種植與組織工程化骨的動態(tài)培養(yǎng)完成支架材料的制備后，在支架材料上接種種子細胞，繼而在反應(yīng)器內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)5-7天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是，在其制備方法(1)中骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取如下抽取骨髓懸液約2ml，緩慢加至預(yù)先加入Percoll分離液5mL的離心管中，以2000r/min×20min離心，收集界面的單核細胞層，以2×105/cm2的密度接種于25ml培養(yǎng)瓶；24h后換液，棄取未貼壁細胞，此后每周半量換液2次，逐日觀察；14d后單層細胞基本融合；0.25％胰蛋白酶消化，按1∶2傳代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是，在其制備方法(1)中攜帶人Osf2基因腺病毒載體構(gòu)建如下設(shè)計引物上游5’-GAAGATCTTCATGGCATCAAACAGCCTCTT-3’；下游5’-GCCTCGAGCGTCAATATGGTCGCCAAACAGATTCA-3’，抽提成骨細胞總RNA，用RT-PCR方法克隆人Osf2基因cDNA，定向克隆于穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV的BglII和XbaI位點，既而利用細菌內(nèi)重組原理與骨架質(zhì)粒pAdeasy-1重組得到pAdEasy-1/Cbfal質(zhì)粒，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細胞，重組腺病毒在293細胞大量擴增繁殖，純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是，在其制備方法(1)中Osf2腺病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞的具體操作如下將MSCs以2×104/cm2的密度傳代于6孔板，約3d后細胞融合約90％時，加入感染復(fù)數(shù)(MOI)＝50的Osf2重組腺病毒，感染1小時后PBS洗2次，加入條件培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是，制備方法(1)中加入的條件培養(yǎng)液為DMEM+10％胎牛血清+地塞米松10nmol/L+維生素C50mg/L+β-甘油磷酸鈉10mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是，在其制備方法(2)中天然生物衍生材料的制備方法如下將異種或同種松質(zhì)骨塊置入1∶2甲醇氯仿溶液中脫脂12h→0.05M Tris-HCl緩沖液中，PH7.4，緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，4℃恒溫震蕩3d→將骨塊置入含3％TritonX-100的Tris-HCl緩沖液中，PH7.4，內(nèi)加蛋白酶抑制劑，4℃恒溫震蕩3d→去離子水連續(xù)沖洗12h后，加入DNAase和RNAase混合液室溫下消化12h→重復(fù)第3步；最后骨塊經(jīng)蒸餾水充分沖洗后，真空制干，經(jīng)10kGy鈷60-γ射線照射消毒滅菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是，制備方法(2)中加入的蛋白酶抑制劑為4U/mlDispase，1μMAcetyl-Pepstain，0.5μM AEBSF，2μg/ml Aprotinins和100μM Leupeptin。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是在其制備方法(3)中種子細胞的種植操作如下首先將脫細胞骨基質(zhì)在DMEM培養(yǎng)基中預(yù)濕2小時；然后將2.0×106個經(jīng)Osf2腺病毒感染的MSCs制成400μl細胞懸液，利用1ml注射器加入基質(zhì)材料，盡量使細胞灌入孔隙中；24孔板靜置培養(yǎng)，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)4h；最后加入含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基覆蓋基質(zhì)材料，培養(yǎng)12-16h，每周換液2次。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子-2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，其特征是，在其制備方法(3)中組織工程化骨的動態(tài)培養(yǎng)組織工程化骨在反應(yīng)器內(nèi)動態(tài)培養(yǎng)，利用細胞灌流系統(tǒng)或旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)RCCS，將細胞-材料復(fù)合物置于流動腔，調(diào)整位置，使培養(yǎng)基可以充分流經(jīng)支架材料，培養(yǎng)5-7天，每周換液2次。
全文摘要
本發(fā)明涉及成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子－2基因修飾的組織工程化骨的構(gòu)建方法，屬于骨組織工程領(lǐng)域。本方法采用一種天然生物衍生材料(脫細胞骨基質(zhì))與種子細胞(成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子－2基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞)復(fù)合構(gòu)建骨組織，經(jīng)體外動態(tài)培養(yǎng)后，進行大段長骨缺損的修復(fù)，可實現(xiàn)骨缺損的臨床愈合。本發(fā)明適用于骨科、整形、頜面外科等多種常見修復(fù)。
文檔編號A61L27/38GK1733318SQ200510057220
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者董世武, 應(yīng)大君, 謝肇 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)