專利名稱：MPG蛋白在抑制p53基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MPG蛋白在抑制P53基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
p53蛋白作為序列特異性轉(zhuǎn)錄因子，能通過調(diào)節(jié)大量靶基因的表達(dá)介導(dǎo)不同的下游功能，參與細(xì)胞周期阻滯、凋亡、老化和DNA損傷修復(fù)等諸多細(xì)胞事件。p53蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，具有經(jīng)典的序列特異性轉(zhuǎn)錄因子特征，它的結(jié)構(gòu)包含有N端轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，中部的DNA結(jié)合區(qū)(DBD, DNA binding domain)和C端的四聚化區(qū)。P53能特異的與被稱為p53保守結(jié)合模序的序列結(jié)合。這個(gè)模序又被稱為p53反應(yīng)元件(p53REs, p53 response elements),通常存在于許多p53祀基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)
(TSS, transcriptional start site)的上游和下游，包含有兩段重復(fù)的保守序列-
RRRCffffGYYY (R=A, G; W=A，T; Y=C, T)，中間間隔有0_13個(gè)堿基。然而，并不是所有含有p53REs的靶基因與P53的結(jié)合力都是一致的，提示了 p53作為轉(zhuǎn)錄因子功能的復(fù)雜性。p53REs的DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可能從功能上也產(chǎn)生了不同啟動子區(qū)的區(qū)別。目前的研究發(fā)現(xiàn)，一部分基因的p53REs臨近區(qū)域保持持續(xù)的松散、非核小體結(jié)合狀態(tài)，如GADD45和MDM2，而另一部分基因則與此相反，提示了 P53對不同靶基因活化差別的可能機(jī)制。另一方面，DNA自身的構(gòu)象也很重要,例如MDM2和p21的啟動子區(qū)更傾向于形成非B型DNA構(gòu)象。總體來說，p53的下游靶基因雖然都含有相似的p53REs，但是p53對各個(gè)基因中的p53REs親和力是有很大差別的，相較而言，P53對周期相關(guān)靶基因的親和力大于與凋亡相關(guān)的靶基因。這種p53的不同親和力進(jìn)一步提示了 P53對于細(xì)胞命運(yùn)決定的傾向性。少量的p53傾向于引起細(xì)胞周期阻滯，而大量P53累積則更容易引起細(xì)胞凋亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供MPG蛋白在抑制p53基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了 MPG蛋白在制備與p53蛋白有關(guān)的代謝通路的抑制劑中的應(yīng)用。所述與P53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為細(xì)胞周期。所述與p53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中與p53蛋白有關(guān)的代謝通路。本發(fā)明還提供了 MPG蛋白在制備廣品中的應(yīng)用；所述廣品具有如下功能中的至少一種(I)抑制p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性；(2)抑制與p53蛋白有關(guān)的代謝通路；(3)抑制p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄；(4)抑制p53蛋白的編碼基因的表達(dá)。所述靶蛋白可為周期相關(guān)蛋白，如p21蛋白、14-3-3 O蛋白或Gadd45蛋白。所述(I)中，所述p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。所述(2)中，所述與p53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中與p53蛋白有關(guān)的代謝通路。所述(3)中，所述p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中P53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄。所述(4)中，所述p53蛋白的編碼基因的表達(dá)具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白的編碼基因的表達(dá)。
MPG蛋白可用于抑制p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。所述p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。MPG蛋白可用于抑制與p53蛋白有關(guān)的代謝通路。所述與p53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為細(xì)胞周期。所述與P53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中與P53蛋白有關(guān)的代謝通路。MPG蛋白可用于抑制p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄。所述靶蛋白可為周期相關(guān)蛋白，如p21蛋白、14-3-3 O蛋白或Gadd45蛋白。所述p53蛋白下游革巴蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄。
MPG蛋白可用于抑制p53蛋白的編碼基因的表達(dá)。所述p53蛋白的編碼基因的表達(dá)具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白的編碼基因的表達(dá)。本發(fā)明還提供了抑制MPG蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在制備與p53蛋白有關(guān)的代謝通路的促進(jìn)劑中的應(yīng)用。所述與P53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為細(xì)胞周期。所述與p53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中與p53蛋白有關(guān)的代謝通路。本發(fā)明還提供了抑制MPG蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品具有如下功能中的至少一種(1)促進(jìn)P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性；(2)促進(jìn)與p53蛋白有關(guān)的代謝通路；(3)促進(jìn)p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄；(4)促進(jìn)p53蛋白的編碼基因的表達(dá)。所述革巴蛋白可為周期相關(guān)蛋白，如p21蛋白、14-3-3 O蛋白或Gadd45蛋白。所述(I)中，所述P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。所述(2)中，所述與p53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中與P53蛋白有關(guān)的代謝通路。所述(3)中，所述p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄。所述(4)中，所述P53蛋白的編碼基因的表達(dá)具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白的編碼基因的表達(dá)。抑制MPG蛋白編碼基因表達(dá)的產(chǎn)品可用于促進(jìn)p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。所述p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。抑制MPG蛋白編碼基因表達(dá)的產(chǎn)品可用于促進(jìn)與p53蛋白有關(guān)的代謝通路。所述與P53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為細(xì)胞周期。所述與p53蛋白有關(guān)的代謝通路具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中與p53蛋白有關(guān)的代謝通路。抑制MPG蛋白編碼基因表達(dá)的產(chǎn)品可用于促進(jìn)p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄。所述革巴蛋白可為周期相關(guān)蛋白，如p21蛋白、14-3-3 O蛋白或Gadd45蛋白。所述p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄。抑制MPG蛋白編碼基因表達(dá)的產(chǎn)品可用于促進(jìn)p53蛋白的編碼基因的表達(dá)。所述P53蛋白的編碼基因的表達(dá)具體可為MCF7細(xì)胞或HEK293細(xì)胞中p53蛋白的編碼基因的表達(dá)。以上任一所述的MPG蛋白為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
以上任一所述的p53蛋白為如下(C)或(d):(c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。以上任一所述的MPG蛋白編碼基因?yàn)槿缦?I)或(2)或(3)所述的DNA分子(I)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(3)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA 分子。所述嚴(yán)格條件為在0. I X SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。以上任一所述的p53蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?4)或(5)或(6)所述的DNA分子(4)序列表中序列4所示的DNA分子；(5)在嚴(yán)格條件下與(4)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；(6)與(4)或(5)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在0. I X SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述抑制MPG蛋白編碼基因表達(dá)的廣品可為如下(e)或(f )(e)序列表的序列5自5’末端第I至21位核苷酸所示的雙鏈RNA分子(siRNA)；Cf)序列表的序列5所示的單鏈核酸分子和序列表的序列6所示的單鏈核酸分子組成的雙鏈核酸分子。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)MPG蛋白具有抑制p53蛋白編碼基因表達(dá)的作用，導(dǎo)入MPG蛋白的編碼基因后，細(xì)胞中的P53蛋白含量降低。而p53蛋白是一種已知的重要的轉(zhuǎn)錄因子，其含量降低后，轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)降低，其下游的靶蛋白的含量也隨之變化。本發(fā)明對于進(jìn)一步研究P53蛋白的代謝通路，人為促進(jìn)或抑制p53蛋白的代謝通路具有重大意義。


圖I為實(shí)施例I的實(shí)驗(yàn)I的結(jié)果。圖2為實(shí)施例I的實(shí)驗(yàn)2的結(jié)果。圖3為實(shí)施例I的實(shí)驗(yàn)3的結(jié)果。圖4為實(shí)施例2的步驟一中實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果。圖5為實(shí)施例2的步驟一中Western Blot的結(jié)果。圖6為實(shí)施例2的步驟二中實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果。圖7為實(shí)施例2的步驟二中Western Blot的結(jié)果。圖8為實(shí)施例2的步驟三中實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。MPG蛋白如序列表的序列I所不，其編碼基因(MPG基因)如序列表的序列2所不。p53蛋白如序列表的序列3所不，其編碼基因(p53基因)如序列表的序列4所不。報(bào)告基因質(zhì)粒(又稱pG13_Luc質(zhì)?；騪G13L質(zhì)粒，包含有13個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的P53反應(yīng)原件)公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn)Chunyan Tian, Guichun Xing, Ping Xie, Kefeng Lu, Jing Nie, Jian Wang, LiLi, Mei Gao, Lingqiang Zhang, and Fuchu He, KRAB-type zinc-finger protein Apakspecifically regulates p53_dependent apoptosis, nature cell biology volumelI,number5, MAY2009, 580-591 ;p53蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，它能與其下游靶基因的保守序列結(jié)合，啟動下游靶基因的表達(dá)，這段保守序列就是P53的結(jié)合原件。PG13L質(zhì)粒是一個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒，在其啟動子區(qū)上游，構(gòu)建了 13個(gè)串聯(lián)的p53結(jié)合原件，如果p53蛋白存在會與結(jié)合 原件結(jié)合從而引發(fā)該質(zhì)粒的表達(dá)，發(fā)出熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度來判斷P53的轉(zhuǎn)錄活性。pCMV-Myc質(zhì)粒(真核表達(dá)載體)購自Clontech公司。pCMV-Flag 質(zhì)粒Sigma,目錄號E3762。Myc-MPG質(zhì)粒Myc_MPG質(zhì)粒是在pCMV_Myc質(zhì)粒的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列2所示的MPG基因得到的重組質(zhì)粒。p53質(zhì)粒是在pCMV-Flag質(zhì)粒的EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列4所示的p53基因得到的重組質(zhì)粒。pRL-TK 質(zhì)粒Promega 公司，產(chǎn)品號 E2241。Actin抗體、MPG抗體、p21抗體購自Santa Cruz公司。Myc抗體購自Clontech公司。Gadd45抗體購自Abnova公司。14-3-3 o抗體購自NeoMarkers公司。MCF7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞):美國模式培養(yǎng)物集存庫(簡稱ATCC ；http://www. atcc.0找/)，編號為肌8-22。HEK293細(xì)胞美國模式培養(yǎng)物集存庫(簡稱ATCC ；http://www. atcc. org/)，編號為 CRL-1573。
p53缺失型的H1299細(xì)胞美國模式培養(yǎng)物集存庫(簡稱ATCC ；http://www. atcc.org/)，編號為 CRL-5803p53 缺失型的 HCT116 細(xì)胞(又稱 p53-/-HCT116 cells 或 HCT116 p53_/_ 細(xì)胞):公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所獲得；參考文獻(xiàn)=ChunyanTian, Guichun Xing, Ping Xie, Kefeng Lu, Jing Nie, Jian Wang, Li Li, Mei Gao, LingqiangZhang, and Fuchu He, KRAB-type zinc-finger protein Apak specifically regulatesp53_dependent apoptosis, nature cell biology volume 11, number 5, MAY 2009,580-591。實(shí)施例I、MPG以劑量依賴的方式抑制內(nèi)源p53轉(zhuǎn)錄活性一、試驗(yàn) I將MCF7細(xì)胞加入24孔板中(每孔8X IO4個(gè)細(xì)胞/mL)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到70_90%融合率后分組進(jìn)行如下平行處理(每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔；借助購自Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑Iipofectamine2000并按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染)第一組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染IOOng pG13L質(zhì)粒和Ing pRL_TK質(zhì)粒；第二組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染0. I微克Myc-MPG質(zhì)粒、IOOng pG13L質(zhì)粒和Ing pRL-TK質(zhì)粒;第三組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染0. 2微克Myc-MPG質(zhì)粒、IOOng pG13L質(zhì)粒和Ing pRL_TK質(zhì)粒;第四組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染0. 3微克Myc-MPG質(zhì)粒、IOOng pG13L質(zhì)粒和Ing pRL-TK質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染48小時(shí)后采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(Promega，產(chǎn)品目錄號為E1980)檢測熒光強(qiáng)度。以第四組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，計(jì)算各組細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度，即相對P53 活性。結(jié)果見圖I (I至4依次代表第一組至第四組；進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值；*，P < 0. 05)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞的蛋白，采用Myc抗體作為一抗進(jìn)行Western Blot,結(jié)果見圖I。結(jié)果表明，MPG蛋白以劑量依賴的方式明顯抑制內(nèi)源p53基因的轉(zhuǎn)錄活性。二、試驗(yàn) 2根據(jù)對MPG基因進(jìn)行分析和篩選，設(shè)計(jì)用于抑制MPG基因表達(dá)的siRNA( siRNA甲)如下5’-AAGAAGCAGCGACCAGCUAGAIT-3’(序列表的序列 5)；3， -TTUUCUUCGUCGCUGGUCGAUCU-5，。設(shè)計(jì)作為陰性對照的siRNA (siRNA乙)如下5， -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，；3， -TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5，。將MCF7細(xì)胞和HEK293細(xì)胞分別進(jìn)行如下RNA干擾試驗(yàn)將細(xì)胞加入24孔板中(每孔8 X IO4個(gè)細(xì)胞/mL)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到70_90%融合率后分組進(jìn)行如下平行處理(每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔；借助購自Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000并按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染)第一組(Con):每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染20pmol siRNA 甲、IOOng pG13L 質(zhì)粒和 Ing pRL-TK質(zhì)粒;第二組(MPG):每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染20pmol siRNA 乙、IOOng pG13L 質(zhì)粒和 Ing pRL-TK質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測熒光強(qiáng)度。以第二組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，計(jì)算各組細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度，即相對P53活性。結(jié)果見圖2 (進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值；*，P < 0. 05)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞的蛋白，采用MPG抗體作為一抗進(jìn)行Western Blot,結(jié)果見圖2 (采用Actin蛋白為內(nèi)參)。結(jié)果表明，在MCF7細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中，利用RNA干擾抑制內(nèi)源MPG基因表達(dá)后，極大的增強(qiáng)了內(nèi)源P53基因的轉(zhuǎn)錄活性。三、試驗(yàn)3將p53缺失型的H1299細(xì)胞和p53缺失型的HCTl 16細(xì)胞分別進(jìn)行如下試驗(yàn)
將細(xì)胞加入24孔板中(每孔8 X IO4個(gè)細(xì)胞/mL)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到70_90%融合率后分組進(jìn)行如下平行處理(每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔；借助購自Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000并按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染)第一組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染IOOng pG13L質(zhì)粒和Ing pRL_TK質(zhì)粒；第二組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染50ng p53質(zhì)粒、IOOng pG13L質(zhì)粒和Ing pRL-TK質(zhì)粒；第三組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染0. I微克Myc-MPG質(zhì)粒、50ng p53質(zhì)粒、IOOng pG13L質(zhì)粒和 Ing pRL-TK 質(zhì)粒；第四組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染0. 3微克Myc-MPG質(zhì)粒、50ng p53質(zhì)粒、IOOng pG13L質(zhì)粒和 Ing pRL-TK 質(zhì)粒；第五組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染0. 5微克Myc-MPG質(zhì)粒、50ng p53質(zhì)粒、IOOng pG13L質(zhì)粒和 Ing pRL-TK 質(zhì)粒。 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測熒光強(qiáng)度。以第二組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，計(jì)算各組細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度，即相對P53活性。結(jié)果見圖3(1至5依次代表第一組至第五組；進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值；*，P < 0. 05)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞的蛋白，采用Myc抗體作為一抗進(jìn)行Western Blot,結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，當(dāng)缺乏外源p53基因時(shí)，PG13L不能被激活；轉(zhuǎn)入外源p53基因后，PG13L能被有效活化，共轉(zhuǎn)的MPG基因能以劑量依賴的方式抑制p53基因的活性。實(shí)施例2、MPG特異性調(diào)控p53下游周期相關(guān)靶基因mRNA水平一、MCF7細(xì)胞中MPG對p53下游靶基因mRNA水平的調(diào)節(jié)將MCF7細(xì)胞加入6孔板中(每孔3X IO5個(gè)細(xì)胞/mL)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到70_90%融合率后分組進(jìn)行如下平行處理(每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔；借助購自Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000并按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染)第一組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染2微克pCMV-Myc質(zhì)粒；第二組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染2微克Myc-MPG質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR鑒定細(xì)胞中MPG基因和周期相關(guān)靶基因(p21、14-3-3o、Gadd45)的表達(dá)量(GAPDH基因作為內(nèi)參基因)。用于鑒定MPG基因的引物對如下F，5，-CTTCTGCATGAACATCTCCAGC-3，；R, 5，-AGGGTGCTGCGAAGCTGACGC-3，。用于鑒定p21基因的引物對如下F，5，-CACCGAGACACCACTGGAGG-3，；R, 5，-GAGAAGATCAGCCGGCGTTT-3，。用于鑒定14-3-3 0基因的引物對如下F，5，-GGCCATGGACATCAGCAAGAA-3，；R, 5，-CGAAAGTGGTCTTGGCCAGAG-3，。用于鑒定Gadd45基因的引物對如下F，5，-TGCGAGAACGACATCAACAT-3，；
R, 5，-TCCCGGCAAAAACAAATAAG-3，。用于鑒定GAPDH基因的引物對如下F，5，-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3，；R, 5，-TTGAGGTCAATGAAGGGGTCA-3。以第二組的基因表達(dá)量為1，計(jì)算各組細(xì)胞中各個(gè)基因的相對表達(dá)量，結(jié)果見圖4(進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值；*，P < 0. 05)。結(jié)果表明，MPG基因過表達(dá)選擇性下調(diào)P53下游與周期相關(guān)靶基因mRNA水平。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后提取細(xì)胞的蛋白，采用針對各個(gè)蛋白的抗體作為一抗進(jìn)行WesternBlot，用灰度掃描軟件進(jìn)行定量分析，結(jié)果見圖5 (采用Actin蛋白為內(nèi)參)。在MCF7細(xì)胞中，過表達(dá)MPG基因，p21，Gadd45和14_3_3 o蛋白水平下調(diào)。 二、MCF7細(xì)胞中敲低MPG能選擇性上調(diào)p53下游的周期相關(guān)靶基因和靶蛋白將MCF7細(xì)胞加入6孔板中(每孔3X IO5個(gè)細(xì)胞/mL)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到70-90%融合率后分組進(jìn)行如下平行處理(每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔；借助購自Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000并按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染)第一組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染IOOpmol siRNA甲；第二組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染IOOpmol siRNA乙；轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR鑒定細(xì)胞中MPG基因和周期相關(guān)靶基因(p21、14-3-3o、Gadd45)的表達(dá)量(GAPDH基因作為內(nèi)參基因)。方法同步驟一。以第二組的基因表達(dá)量為1，計(jì)算各組細(xì)胞中各個(gè)基因的相對表達(dá)量，結(jié)果見圖6(進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值；*，P<0. 05)。結(jié)果表明，抑制MPG基因表達(dá)能上調(diào)p53下游周期相關(guān)靶基因。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞的蛋白，采用針對各個(gè)蛋白的抗體作為一抗進(jìn)行WesternBlot，結(jié)果見圖7 (采用Actin蛋白為內(nèi)參)。在MCF7細(xì)胞中抑制MPG基因表達(dá)，MPG蛋白水平的降低導(dǎo)致p21，Gadd45和14-3-3 o蛋白水平上調(diào)。三、HEK293細(xì)胞中MPG對p53下游靶基因mRNA水平的調(diào)節(jié)將HEK293細(xì)胞加入6孔板中(每孔3 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到70-90%融合率后分組進(jìn)行如下平行處理(每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔；借助購自Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000并按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染)第一組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染IOOpmol siRNA甲；第二組每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染IOOpmol siRNA乙；轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR鑒定細(xì)胞中MPG基因和周期相關(guān)靶基因(p21、14-3-3 O、Gadd45)的表達(dá)量(GAPDH基因作為內(nèi)參基因)。方法同步驟一。以第二組的基因表達(dá)量為1，計(jì)算各組細(xì)胞中各個(gè)基因的相對表達(dá)量，結(jié)果見圖8(進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值；*，P<0. 05)。結(jié)果表明，抑制MPG基因表達(dá)能上調(diào)p53下游周期相關(guān)靶基因。
權(quán)利要求
1.MPG蛋白在制備與p53蛋白有關(guān)的代謝通路的抑制劑中的應(yīng)用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
2.MPG蛋白在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述產(chǎn)品具有如下功能中的至少一種(I)抑制P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性；(2)抑制與p53蛋白有關(guān)的代謝通路；(3)抑制p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄；(4)抑制p53蛋白的編碼基因的表達(dá)； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述⑴和/或(2)和/或(3)和/或(4)中，所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
3.MPG蛋白在抑制p53蛋白轉(zhuǎn)錄活性中的應(yīng)用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
4.MPG蛋白在抑制與p53蛋白有關(guān)的代謝通路中的應(yīng)用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
5.MPG蛋白在抑制p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
6.抑制MPG蛋白的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在制備與p53蛋白有關(guān)的代謝通路的促進(jìn)劑中的應(yīng)用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
7.抑制MPG蛋白的編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述產(chǎn)品具有如下功能中的至少一種(I)促進(jìn)P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性；(2)促進(jìn)與p53蛋白有關(guān)的代謝通路；(3)促進(jìn)p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄；(4)促進(jìn)p53蛋白的編碼基因的表達(dá)； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述⑴和/或(2)和/或(3)和/或(4)中，所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
8.抑制MPG蛋白的編碼基因表達(dá)的產(chǎn)品在促進(jìn)p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性中的應(yīng)用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
9.抑制MPG蛋白的編碼基因表達(dá)的產(chǎn)品在促進(jìn)與p53蛋白有關(guān)的代謝通路中的應(yīng)用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)； 所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
10.抑制MPG蛋白的編碼基因表達(dá)的產(chǎn)品在促進(jìn)p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用； 所述MPG蛋白為如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與P53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)；所述p53蛋白為如下(c)或(d) (c)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且具有轉(zhuǎn)錄活性的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種MPG蛋白在抑制p53基因轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)MPG蛋白可用于抑制p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性、抑制與p53蛋白有關(guān)的代謝通路、抑制p53蛋白下游靶蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)入MPG蛋白的編碼基因后，細(xì)胞中的p53蛋白含量降低，而p53蛋白是一種已知的重要的轉(zhuǎn)錄因子，其含量降低后，轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)降低，其下游的靶蛋白的含量也隨之變化。本發(fā)明對于進(jìn)一步研究p53蛋白的代謝通路，人為促進(jìn)或抑制p53蛋白的代謝通路具有重大意義。
文檔編號C12N15/113GK102747101SQ20121022942
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者宋珊珊, 張令強(qiáng), 賀福初, 邢桂春 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所