專利名稱：炎癥基因活性及膽固醇生物合成的抑制劑的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及鑒定能夠有效抑制炎癥疾病活性和/或膽固醇生物合成的試劑的方法，以及制備和利用含有該試劑的組合物來預(yù)防和/或治療與炎癥疾病活性和/或膽固醇生物合成相關(guān)病癥的方法，例如動脈粥樣硬化、炎癥性腸病、腎病等。本發(fā)明涉及可作為炎癥基因活性和/或膽固醇生物合成的有效抑制劑的試劑。例如，本發(fā)明涉及核受體，例如短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)和類法尼醇X受體(FXR)的抑制劑。本發(fā)明涉及含有這種抑制劑的組合物，包括能有效預(yù)防和/或治療與炎癥基因表達和/或膽固醇生物合成相關(guān)的疾病或病癥的組合物。本發(fā)明還涉及受感染的細胞系和載體，用于制備和鑒定可以抑制炎癥基因表達和/或膽固醇生物合成的試劑。
背景技術(shù)：
越來越多的醫(yī)學(xué)病癥和疾病與炎癥基因的表達相關(guān)。例如，科學(xué)文獻中已經(jīng)指出動脈粥樣硬化，腎病和炎癥性腸病與炎癥基因的表達有關(guān)。假定可能存在共同的遺傳變體，該變體可引發(fā)對炎癥疾病的敏感度，或促進這些疾病的亞型所共有的異常炎性過程。這些病癥的結(jié)合影響代表重要的公共衛(wèi)生問題，特別是這些病癥中的每一個都單獨代表這一顯著的醫(yī)學(xué)問題。
膽固醇的生物合成途徑也與重要的人類醫(yī)學(xué)病癥有關(guān)。例如，動脈粥樣硬化或動脈硬化引發(fā)的死亡率占發(fā)達國家中總死亡率的一半以上，也是在美國導(dǎo)致人口死亡的主要原因。當(dāng)其影響冠狀動脈時(例如，冠心病或CHD)，是大多數(shù)心臟病發(fā)作的根本原因，也通常是充血性心力衰竭和心律不齊的誘因。
病理過程最早是由動脈內(nèi)膜中儲存的脂質(zhì)所組成的多脂條斑開始。被稱為泡沫細胞的修飾巨噬細胞在動脈粥樣斑區(qū)域累積。這些泡沫細胞會累積脂肪，特別是氧化的低密度脂蛋白(LDL)。這些脂蛋白和膽固醇酯通過內(nèi)膜下的成纖維細胞誘導(dǎo)膠原合成。當(dāng)病變逐漸滲透到纖維材料時，它就突出到動脈的腔管中。病變本身很少封閉動脈，而是在動脈粥樣斑頂端形成的血塊會封堵血管。
慢性病變會逐漸鈣化，而血管的彈性會降低。這種動脈硬化可增大血流的阻力，并因此升高血壓。體內(nèi)的任何血管在理論上都可能受動脈粥樣硬化的影響，但是多數(shù)常常影響到主動脈、冠狀動脈、頸動脈和回腸動脈。局部缺血或特定區(qū)域的梗塞可引起特定的癥狀和臨床結(jié)果。
高血壓、升高的膽固醇、低HDL(高密度脂蛋白)、抽煙、糖尿病、年齡、性別、體力的鈍化，以及心臟病家族史是形成動脈粥樣硬化的風(fēng)險系數(shù)。
動脈粥樣硬化疾病是動力學(xué)過程，如果減少血漿脂蛋白可以減緩動脈粥樣化生成的進展。依據(jù)高脂血癥的根本原因，一些藥理學(xué)方法可以奏效。首先要完成膳食測量，但是必須持續(xù)作為藥物治療的一部分。
大多數(shù)高血脂患者對嚴(yán)格限制膽固醇和飽和脂肪的飲食反應(yīng)良好?？偟闹究防飸?yīng)該是20-25％，其中飽和脂肪低于總卡路里的8％，膽固醇低于200mg/d。推薦增加纖維和復(fù)合碳水化合物。這種飲食制可以將血清膽固醇減低20到30％。
煙酸(煙堿酸)極其可能通過抑制LDL產(chǎn)量來降低血漿LDL水平。肝的膽固醇合成也被抑制。由于HDL的分解降低使高密度脂蛋白水平升高。降低了凝結(jié)的蛋白質(zhì)纖維蛋白原，并且升高了“凝結(jié)大塊″組織纖溶酶原激活物，這兩者對于限制動脈粥樣斑凝塊的生成都很重要。
副作用包括皮膚的血管舒張以及熱感、惡心、腹部不適、皮疹或皮膚干燥。即使它是維生素，以降低膽固醇為目的所采用的低劑量維生素也具有一些嚴(yán)重的副作用，所以接受煙酸的患者應(yīng)該由內(nèi)科醫(yī)師監(jiān)護。
安妥明可以增強清除甘油三酯豐富的脂蛋白并且可以間接地抑制肝臟中的膽固醇生物合成。其通過刺激分解脂蛋白的酶來發(fā)揮作用。最常見的副作用是腹部不適以及惡心。罕見的毒性作用包括皮炎、肝臟機能障礙、骨髓機能降低，往往還包括男性性欲降低。
膽汁酸結(jié)合樹脂，如降脂2號(colestipol)樹脂，是可口服的極大的陽離子交換樹脂。在消化道中，它們會結(jié)合膽汁酸，預(yù)防其再吸收。結(jié)果是增加了膽汁酸的排泄，并且降低了血漿中的LDL水平。最常見的副作用是便秘、膨脹、胃灼熱以及腹瀉。
新霉素是可以抑制膽固醇和膽汁酸的腸再吸收從而使血漿LDL降低的抗生素。低劑量的新霉素甚至也會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。可能發(fā)生惡心、腹部絞痛、腹瀉和吸收障礙。同時，抗性微生物可能會繁殖并導(dǎo)致小腸結(jié)腸炎(腸和結(jié)腸的炎癥)。
抑制素類(statins)是目前可獲得的最有效的降膽固醇藥。它們包括阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛弗斯特丁、帕伐他汀、和辛伐他汀。它們可以降低血液中的LDL膽固醇(被認(rèn)為是有害的膽固醇)和甘油三酯，同時升高HDL膽固醇。HDL膽固醇被認(rèn)為是“有益的膽固醇”，因為它可將膽固醇運輸?shù)礁闻K，膽固醇在那里可被降解。這些藥物主要在其效力、降低甘油三酯的能力和價格上有差異。但是，目前抑制素類的有效率通常為50％或更少。
雖然公知膽固醇的副作用顯著，包括參與形成在動脈粥樣硬化中觀察到的、血管中的破壞性動脈粥樣斑，但膽固醇還是被用于合成甾體激素和膽汁酸，是重要的細胞膜組分。除膳食攝取的膽固醇之外，人體也制備膽固醇。普遍認(rèn)為細胞內(nèi)膽固醇合成的限速步驟涉及一種所謂HMG-CoA還原酶的作用。被稱為HMG-CoA還原酶抑制劑的抑制素類，可以抑制這種酶而降低細胞合成膽固醇的能力。
動脈粥樣硬化引起的破壞不僅是由于動脈粥樣硬化的動脈粥樣斑會限制血流通過狹窄的動脈，而且還是由于脆弱的動脈粥樣斑的破裂。事實上，大部分問題歸因于破裂的動脈粥樣斑會釋放促使血塊生成的物質(zhì)。動脈粥樣斑內(nèi)部充滿膽固醇的清除型細胞會分泌使動脈粥樣斑易于破裂的物質(zhì)。抑制素類似乎可以穩(wěn)定動脈粥樣斑。最近的研究也說明抑制素類可以改善內(nèi)皮的排列。內(nèi)皮涉及到血塊的生成以及溶解，似乎在患有冠狀動脈心臟病的人群中機能障礙。
抑制素類與各種副作用相關(guān)，因此許多患者難以接受。例如，抑制素類會引發(fā)肝臟毒性風(fēng)險，因此應(yīng)常規(guī)性地監(jiān)測血液。另外，有許多藥物和一些食物會與這些藥物相互作用。在有些人群中，抑制素類會引起肌肉炎癥(肌病)。事實上，這常常發(fā)生在接受其它降膽固醇藥或紅霉素的人群中。肌肉疼痛的現(xiàn)象可能會非常嚴(yán)重。多數(shù)情況下，肌肉痙攣可發(fā)展成被稱為橫紋肌瘤的嚴(yán)重肌肉炎癥形式，并可能引起腎衰竭。這些藥物對絕經(jīng)后婦女的額外好處是它們可能刺激骨生長，從而減少骨質(zhì)疏松癥以及該癥引起的骨折風(fēng)險，
各種可降低膽固醇的非處方(OTC)補充物由米糠油制成。它們含有活性類似于維生素E的生育三醇。它們可以象抑制素類一樣起作用，降低由身體合成的膽固醇。然而還沒有證實其有效性和安全性。
考慮到上述療法的缺陷，已經(jīng)作出很大努力以揭示與動脈粥樣硬化有關(guān)的途徑。特別進行了許多努力來揭示膽固醇體內(nèi)穩(wěn)態(tài)途徑，例如用于鑒定改進的降膽固醇藥劑。例如，已揭示出膽固醇體內(nèi)穩(wěn)態(tài)途徑中的SHP。具體而言，有報道說肝膽汁酸體內(nèi)穩(wěn)態(tài)是由涉及吸收和合成膽汁酸的基因的負反饋抑制而進行調(diào)節(jié)的，而且膽汁酸通過SHP的膽汁酸受體(fxr)活化作用可下調(diào)膽汁酸合成的限速基因——膽固醇7α-羥化酶(cyp7a)，其中所述受體充當(dāng)核受體抑制劑。參見Denson等，胃腸病學(xué)Gastroenterology，121(1)218-20(2001)。由SHP基因編碼的蛋白質(zhì)是孤兒受體，其含有假定的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但是缺乏常規(guī)的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該蛋白質(zhì)是核激素受體家族的成員，該家族是由少量的疏水性激素調(diào)節(jié)的一組轉(zhuǎn)錄因子，其中的子集不具有已知的配體，被稱為孤兒核受體。該人類孤兒核激素受體SHP蛋白質(zhì)起初是由seol，W等，Science，2721336-39(1996)表征的。但是，到目前為止沒有人鑒定到能夠抑制SHP的化合物。
動脈粥樣硬化的實例為例說明，類似的多種其它病癥和疾病，例如腎病和炎性腸疾病。對每種病情來說，就其效力和患者耐受力而言早先的預(yù)防和/或治療方法均不夠理想。因此，顯然需要能有效針對炎癥基因表達和/或膽固醇生物合成病癥，而且患者對其有良好的耐藥力的試劑。
另外，早先沒有方法可有效、安全且價格低廉地鑒定可在炎癥基因途徑和/或膽固醇生物合成途徑中有效抑制SHP或FXR活性的試劑，或在此基礎(chǔ)上研制產(chǎn)品，使其可有效針對患者中與炎癥疾病表達和/或膽固醇生物合成有關(guān)的病癥。
因此，仍有必要鑒定可有效減少炎癥基因表達和/或膽固醇生物合成的試劑，以及用于鑒定該試劑的感染細胞系載體和啟動子。另外，仍需要有效的核受體例如SHP和FXR的抑制劑，以及含有所述抑制劑的治療性組合物。同樣需要能有效減低升高的膽固醇水平的組合物，用于預(yù)防和治療動脈粥樣硬化及其他與升高的膽固醇水平升高有關(guān)的病癥，還需要能有效針對炎癥疾病，例如炎性腸疾病和腎病的組合物。此外，還需要能普遍有效地對抗大量相關(guān)病癥的組合物和療法，例如與炎癥基因活性和膽固醇生物合成相關(guān)的病癥。還需要制備和施用所述組合物的經(jīng)濟而有效的方法。
發(fā)明概述為滿足這些及其他需求，考慮到其目的，本發(fā)明提供用于鑒定、制備和施用炎癥疾病活性和/或膽固醇生物合成的有效抑制劑的方法，以及該方法所用的感染細胞系、載體和啟動子。本發(fā)明的試劑鑒定方法精確，高效且價格低廉。
本發(fā)明的一個實施例提供一種能有效抑制短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)的試劑的鑒定方法，該方法包括對細胞培養(yǎng)物施用一種試劑；以及挑選出能在所述細胞培養(yǎng)物中引起可檢測物質(zhì)增加的試劑的步驟，所述細胞培養(yǎng)物表達(i)短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或(ii)類法尼醇X受體(FXR)，并含有NF-κB啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子。
本發(fā)明的另一實施例提供一種預(yù)防或改善與炎癥基因活性和/或膽固醇生物合成相關(guān)的疾病的方法，該方法包括施用由本發(fā)明的任何方法挑選出的試劑。
本發(fā)明的另一實施例提供一種含有由在此所述的本發(fā)明的任何方法挑選的試劑的組合物。
本發(fā)明的另一實施例提供含有一種試劑的組合物，該試劑的特征在于當(dāng)將其施用被其中含有核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB啟動子/熒光素酶(luc)基因報道分子的載體于感染的、轉(zhuǎn)染的或改變的細胞培養(yǎng)物時，可導(dǎo)致熒光素酶增加，所述的細胞培養(yǎng)物表達短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)。
本發(fā)明另一實施例提供一種啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其包括NF-κB啟動子和可檢測物質(zhì)的基因，所述的NF-κB啟動子位于可檢測物質(zhì)基因的前面。
本發(fā)明的另一實施例提供一種分離的CYP7A1、CYP8B1或SHP啟動子，其包括一個包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8或其組合的多核苷酸。
本發(fā)明的另一實施例提供一種組合物，其包括非天然變性失活的短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)復(fù)合體。
本發(fā)明的另一實施例提供一種組合物，其包括能結(jié)合SEQ ID NOS1-4之任一項的試劑。
應(yīng)該理解本發(fā)明的上述概述及下列的詳細說明都是示范性的，絕非限制本發(fā)明。
附圖簡述

圖1是說明乙炔雌二醇對IL-1β基因表達的抑制作用的線性圖。
圖2是說明在HepG2中IL-1β對SHP表達的抑制作用線性圖。
圖3a、3b和3c是說明乙炔雌二醇對Fnk、JAB和LIX的抑制作用為IL-1β特異性的柱形圖。
圖4a、4b、4c、4d和4e是說明乙炔雌二醇通過雌激素受體(ER)依賴機理阻斷IL-1β誘導(dǎo)的基因表達的柱形圖。
圖5a，5b，5c，5d和5e的柱形圖說明肝臟中乙炔雌二醇的調(diào)控需要ERα。
圖6a和6b的柱形圖說明ERα對IL-1β基因誘導(dǎo)的抑制作用不需要乙炔雌二醇誘導(dǎo)基因表達。
圖7a，7b，7c，7d和7e的柱形圖說明乙炔雌二醇對IL-1β的抑制作用在肺中不存在。
圖8的柱形圖表明在HepG2細胞中ERα和Erβ抑制IL-1β誘導(dǎo)NF-κB活性。
圖9的柱形圖表明在小鼠肝臟中ERα對SHP表達的調(diào)控。
圖10的柱形圖說明在大鼠肝臟中雌激素對SHP的調(diào)控。
圖11a和11b的柱形圖說明在人類細胞中ERα調(diào)節(jié)hSHP啟動子的活性。
圖12a和12b的柱形圖說明在293細胞中ERα調(diào)節(jié)hSHP啟動子的活性。
圖12c的線性圖說明在293細胞中ERα調(diào)節(jié)hSHP啟動子的活性。
圖13的圖譜說明E2反應(yīng)元件在293細胞中的位置。
圖14a，14b，和14c的柱形圖說明ER對SHP的誘導(dǎo)沒有抑制CYP7A1和CYP8B1。
圖15的線性圖說明膽酸鹽對CYP7A1和CYP8B1的抑制不需要SHP誘導(dǎo)。
圖16表明HepG2中滴定針對由HNF4/pSI驅(qū)動的CYP8B1啟動子的SHP/pSI產(chǎn)生的熒光素酶活性。
圖17是說明TNF-α、VCAM-1和RANTES mRNA的肝臟水平的劑量依賴性誘導(dǎo)的圖表。
圖18a和18b是說明UDCA和CA的相對SHP表達的圖表。
圖19是說明CDCA在HepG2細胞中的相對表達的圖表。
圖20a是說明GW 4064在HepG2細胞中的相對表達的圖表。
圖20b是說明以劑量依賴性方式，通過CDCA或GW 4064處理誘導(dǎo)的M-CSF表達的圖表。
圖21a-d的柱形圖說明炎癥基因表達對膽酸鹽的依賴性。
圖22a-b的線性圖說明急性膽酸鹽和理可以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)炎癥基因表達。
圖23a-b的柱形圖說明UDCA不誘導(dǎo)炎癥基因的表達。
圖24a-b的線性圖說明FXR拮抗劑可在HepG2細胞中誘導(dǎo)ICAM-1表達。
圖25的線性圖說明GW 4064誘導(dǎo)ICAM-1體內(nèi)表達。
圖26的柱形圖說明GW 4064誘導(dǎo)ICAM-1啟動子表達。
發(fā)明詳述膽汁酸是從腸道消化和吸收脂溶性營養(yǎng)所必需的雙親性類固醇去污劑，其已被證明是可以調(diào)節(jié)膽汁酸和膽固醇的新陳代謝的核受體類法尼醇X受體(FXR)的配體。膽汁酸在肝臟內(nèi)合成，分泌到膽汁中，在回腸再吸收，并通過門靜脈循環(huán)運輸回到肝臟，通過抑制限速酶編碼基因——膽固醇7α-羥化酶(cyp7a)抑制膽汁酸合成。FXR介導(dǎo)的孤兒核受體SHP(短異二聚體伴侶)誘導(dǎo)會通過SHP對LRH-1(肝臟受體同系物-1)活性的拮抗作用而導(dǎo)致對cyp7a的抑制，所述LRH-1是一種控制cyp7a表達的轉(zhuǎn)錄因子(Goodwin‘00 Cell & Lu‘00Cell)。因此，已經(jīng)提出了FXR和SHP拮抗劑在控制高脂血癥和膽汁郁積性肝病方面有治療性潛能。
出乎意料地發(fā)現(xiàn)FXR信號途徑的新功能與誘導(dǎo)炎癥基因在肝臟表達的潛能有關(guān)。以前已證明膽汁酸可以通過一種未表征的機理在肝臟巨噬細胞中誘導(dǎo)炎癥細胞因子(Miyake等，‘00 JBC 27521805)。
除FXR的信號外，已經(jīng)顯示膽汁酸可以直接激活蛋白激酶C信號途徑(Stravitz，‘95 JLR)，該途徑也可以引起炎癥基因表達。在此我們證明了激活的FXR能在肝細胞系HepG2中直接激活炎癥基因表達。用膽汁酸、鵝膽酸(CDCA)或合成的FXR配體GW 4064處理HepG2細胞會導(dǎo)致對炎癥基因胞內(nèi)附著分子(ICAM-1)和巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF)的誘導(dǎo)作用。以下證據(jù)進一步表明FXR信號可通過誘導(dǎo)SHP表達來誘導(dǎo)NF-κB介導(dǎo)的炎癥基因表達。這些結(jié)果表明活化的FXR對于促進炎癥基因表有新的功用。由于FXR主要在肝臟、腸、腎上腺和腎臟表達，因此FXR或SHP拮抗劑可以在諸如動脈粥樣硬化、炎性腸病和腎病的疾病中表現(xiàn)出抗炎活性。
基于上述意外的發(fā)現(xiàn)，本文提供用于鑒定可以在膽固醇生物合成途徑和/或炎癥基因表達途徑中抑制FXR和/或SHP的試劑的方法。
術(shù)語“組合物”或“治療性組合物”和“各組合物”或“各治療性組合物”在此可分別互換使用。因此，各種術(shù)語的復(fù)數(shù)形式均包括單數(shù)，單數(shù)形式也均包括復(fù)數(shù)形式。
當(dāng)描繪該組合物“包括”某些成分時，同樣也包括由該成分組成的組合物或基本上由該成分組成的組合物。
本文所用術(shù)語“治療性組合物”是指可通過內(nèi)用或外用來治療細胞、組織、器官或系統(tǒng)的組合物。
本文所用術(shù)語“治療有效量”是指能夠有效治療目的醫(yī)學(xué)疾病的劑量。
本文所用術(shù)語“藥物學(xué)上可接受的”是指被如此描述的組合物或組份具有足夠高的純度，并適用于與皮膚、組織，或膜接觸，而沒有過分的毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、過敏反應(yīng)等。
術(shù)語“升高的膽固醇水平”指低密度脂蛋白(LDL)膽固醇的血清水平，這種膽固醇被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為是對健康有害的，應(yīng)對其進行一些適當(dāng)?shù)闹委?。目前，認(rèn)為高于每dL 220mg(5.7mmol/L)的血清LDL膽固醇水平是對健康有害的，應(yīng)對其進行治療。
本發(fā)明涉及制備和鑒定試劑和組合物的方法，所述試劑和組合物能有效抑制炎癥疾病活性和/或膽固醇生物合成，以及利用所述組合物預(yù)防和/或治療患者炎癥疾病或與膽固醇生物合成有關(guān)的病癥的方法。本發(fā)明還涉及被感染的細胞系和載體，其用于制備及鑒定能夠抑制炎癥基因表達和/或膽固醇生物合成的試劑。
本發(fā)明還提供通過本發(fā)明方法鑒定的試劑，其可有效地作為炎癥基因活性和/或膽固醇生物合成的抑制劑。例如，本發(fā)明涉及核受體，例如短的異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)及類法尼醇X受體(FXR)的抑制劑，特別涉及炎癥基因途徑和/或膽固醇生物合成途徑中的SHP和FXR的抑制劑。本發(fā)明涉及含有這種抑制劑的組合物，包括能夠有效防止和/或治療與炎癥基因表達和/或膽固醇生物合成有關(guān)的疾病或病癥，例如動脈粥樣硬化、炎癥性腸病和腎病的組合物。
此外，本發(fā)明提供可以改善和防止膽固醇水平升高及相關(guān)疾病，例如動脈粥樣硬化的組合物和方法。為鑒定可用于改進和防止膽固醇水平升高及相關(guān)病癥的組合物，本文提供了一種方法可以高效率且有效地篩選能夠在膽固醇體內(nèi)平衡途徑中抑制SHP活性的試劑。
可單獨使用本發(fā)明的治療性組合物，或與任何其他的醫(yī)藥和/或治療方法一起使用。尚未發(fā)現(xiàn)與使用本發(fā)明的治療性組合物有關(guān)的不良副作用或問題。
本發(fā)明的組合物和方法可適用于未出現(xiàn)癥狀的個體，但是該個體可能被視為對某一病癥或病癥組合具有高于正常水平的患病風(fēng)險。
例如，本發(fā)明的組合物和方法有時還可用于未出現(xiàn)膽固醇水平升高的個體，但是該個體被斷定具有易患有膽固醇水平升高或其相關(guān)疾病的風(fēng)險。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的各種風(fēng)險系數(shù)也可加以考慮，例如高血壓、升高的膽固醇、低HDL(高密度脂蛋白)、吸煙、糖尿病、年齡、性別(35到44歲的白種男性死亡率是白種女性的6倍)、體力的鈍化、心臟病家族史等等。例如，不加限制地，本發(fā)明組合物可以施用于被發(fā)現(xiàn)遺傳性地傾向于患有膽固醇水平升高或通常與其相關(guān)的疾病，例如動脈粥樣硬化的個體、具有低水平低密度脂蛋白(LDL)的個體、患有高血壓的個體、處于某一生命階段的個體等等。例如就低LDL來說，認(rèn)為較高的血清高密度脂蛋白(HDL)膽固醇水平是心臟保護性的，而較低的水平則是早期CHD(冠心病)的有力預(yù)示征兆。分離的低HDL水平定義為35mg HDL膽固醇含量/dL(0.90mmol/L)或更少，低于160mg/dL的LDL膽固醇含量(4.15mmol/L)以及低于250mg/dL的三酸甘油酯水平(2.83mmol/L)。當(dāng)然，隨著不斷獲得新的研究成果，任何風(fēng)險系數(shù)都可隨時間變化。本發(fā)明的意圖是預(yù)期任何這種變化。另外，根據(jù)本文提供的指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地鑒定這種狀況并且適當(dāng)?shù)厥┯帽景l(fā)明的組合物。
核激素受體是包括在各種生理學(xué)、發(fā)育學(xué)以及毒理學(xué)過程中的配體-活化轉(zhuǎn)錄因子(Mangelsdorf等，1995；Blumberg和Evans，1998；Kliewer等，1999)。這些受體具有高度保守的DNA和配體結(jié)合域，根據(jù)其二聚特性被亞分為兩組。第一組包括雌激素、黃體酮和糖皮質(zhì)激素受體，該組所有成員均以同源二聚體與其同源的DNA反應(yīng)元件結(jié)合。第二組包括過氧化物酶體增殖子-活化受體(PPAR)、視黃酸受體(RAR)、維生素D受體和甲狀腺激素受體，其所有成員均與稱為類視黃醇X受體(RXR)的共同伴侶形成異二聚體。
類法尼醇X受體(FXR)屬于第二組，該受體是利用來自高度保守的核受體超家族DNA結(jié)合域(Forman等，1995)的簡并性寡核苷酸探針從大鼠肝臟cDNA文庫分離得到。發(fā)現(xiàn)高濃度的法尼醇——甲戊二羥酸途徑的異戊二烯代謝產(chǎn)物——可以活化FXR(Forman等，1995)。利用人RXR配體結(jié)合域作為餌在酵母雙-雜交試驗中克隆小鼠直向同源RIP14，發(fā)現(xiàn)僅能通過類法尼醇(farnesoids)稍活化(Seol等，1995)。相反，視黃酸和合成類視黃酸TTNPB{(E)-4-[2-(5，6，7，8-四氫化-5，5，8，8-四甲基-2-亞萘基)-1丙烯基]安息香酸}卻顯示可作為有效的FXR活化劑，雖然是在高于生理學(xué)的濃度下(Zaviacki等，1997)。而類法尼醇和類視黃醇提供FXR的重要初始表征，活化所需的高濃度表明這些化合物是內(nèi)源配體的前體，或是其它相關(guān)生理學(xué)配體的模擬作用。
SHP是核激素受體超家族的成員，尚沒有已知的配體。SHP蛋白質(zhì)的同源性分子模型表明它可實現(xiàn)經(jīng)典的配體結(jié)合受體構(gòu)象，如下圖所示，其中SHP(白線)位于與視黃酸-視黃酸(gaie-retinoic acid)(紅線)復(fù)合的RXR配體結(jié)合域上。SHP含有典型的螺旋12，其中包括形成電荷夾所必需的必要疏水性氨基酸和負電氨基酸，該電荷夾與共活化劑或共抑制劑相互作用。
下列是短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)編碼基因的核酸序列，本文命名為SEQ ID NO1。
SHP基因的核酸序列(SEQ ID NO1)
1 gagctggaag tgagagcaga tccctaacca tgagcaccag ccaaccaggg gcctgcccat61 gccagggagc tgcaagccgc cccgccattc tctacgcact tctgagctcc agcctcaagg121 ctgtcccccg accccgtagc cgctgcctat gtaggcagca ccggcccgtc cagctatgtg181 cacctcatcg cacctgccgg gaggccttgg atgttctggc caagacagtg gccttcctca241 ggaacctgcc atccttctgg cagctgcctc cccaggacca gcggcggctg ctgcagggtt301 gctggggccc cctcttcctg cttgggttgg cccaagatgc tgtgaccttt gaggtggctg361 aggccccggt gcccagcata ctcaagaaga ttctgctgga ggagcccagc agcagtggag421 gcagtggcca actgccagac agaccccagc cctccctggc tgcggtgcag tggcttcaat481 gctgtctgga gtccttctgg agcctggagc ttagccccaa ggaatatgcc tgcctgaaag541 ggaccatcct cttcaacccc gatgtgccag gcctccaagc cgcctcccac attgggcacc601 tgcagcagga ggctcactgg gtgctgtgtg aagtcctgga accctggtgc ccagcagccc661 aaggccgcct gacccgtgtc ctcctcacgg cctccaccct caagtccatt ccgaccagcc721 tgcttgggga cctcttcttt cgccctatca ttggagatgt tgacatcgct ggccttcttg781 gggacatgct tttgctcagg tgacctgttc cagcccaggc agagatcagg tgggcagagg841 ctggcagtgc tgattcagcc tggccatccc cagaggtgac ccaatgctcc tggaggggca901 agcctgtata gacagcactt ggctccttag gaacagctct tcactcagcc acaccccaca961 ttggacttcc ttggtttgga cacagtgctc cagctgcctg ggaggctttt ggtggtcccc1021 acagcctctg ggccaagact cctgtccctt cttgggatga gaatgaaagc ttaggctgct1081 tattggacca gaagtcctat cgactttata cagaactgaa ttaagttatt gatttttgta1141 ataaaaggta tgaaacacta aaaaaaaa下列是短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)多肽的氨基酸序列，本文命名為SEQ ID NO2。
SHP多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)1 MSTSQPGACP CQGAASRPAI LYALLSSSLK AVPRPRSRCL CRQHRPVQLCAPHRTCREAL61 DVLAKTVAFL RNLPSFWQLP PQDQRRLLQG CWGPLFLLGL AQDAVTFEVAEAPVPSILKK121 ILLEEPSSSG GSGQLPDRPQ PSLAAVQWLQ CCLESFWSLE LSPKEYACLKGTILFNPDVP181 GLQAASHIGH LQQEAHWVLC EVLEPWCPAA QGRLTRVLLT ASTLKSIPTSLLGDLFFRPI241 IGDVDIAGLL GDMLLLR下列是FXR編碼基因的核酸序列
FXR基因的核酸序列(SEQ ID NO3)1 acgagactct ctcctcctcc tcacctcatt gtctccccga cttatcctaa tgcgaaattg61 gattctgagc atttgtagca aaatcgctgg gatctggaga ggaagactca gtccagaatc121 ctcccagggc cttgaaagtc catctctgac ccaaaacaat ccaaggaggt agaagacatc181 gtagaaggag tgaaagaaga aaagaagact tagaaacata gctcaaagtg aacactgctt241 ctcttagttt cctggatttc ttctggacat ttcctcaaga tgaaacttca gacactttgg301 agtttttttt gaagaccacc ataaagaaag tgcatttcaa ttgaaaaatt tggatgggat361 caaaaatgaa tctcattgaa cattcccatt tacctaccac agatgaattt tctttttctg421 aaaatttatt tggtgtttta acagaacaag tggcaggtcc tctgggacag aacctggaag481 tggaaccata ctcgcaatac agcaatgttc agtttcccca agttcaacca cagatttcct541 cgtcatccta ttattccaac ctgggtttct acccccagca gcctgaagag tggtactctc601 ctggaatata tgaactcagg cgtatgccag ctgagactct ctaccaggga gaaactgagg661 tagcagagat gcctgtaaca aagaagcccc gcatgggcgc gtcagcaggg aggatcaaag721 gggatgagct gtgtgttgtt tgtggagaca gagcctctgg ataccactat aatgcactga781 cctgtgaggg gtgtaaaggt ttcttcagga gaagcattac caaaaacgct gtgtacaagt841 gtaaaaacgg gggcaactgt gtgatggata tgtacatgcg aagaaagtgt caagagtgtc901 gactaaggaa atgcaaagag atgggaatgt tggctgaatg cttgttaact gaaattcagt961 gtaaatctaa gcgactgaga aaaaatgtga agcagcatgc agatcagacc gtgaatgaag1021 acagtgaagg tcgtgacttg cgacaagtga cctcgacaac aaagtcatgc agggagaaaa1081 ctgaactcac cccagatcaa cagactcttc tacattttat tatggattca tataacaaac1141 agaggatgcc tcaggaaata acaaataaaa ttttaaaaga agaattcagt gcagaagaaa1201 attttctcat tttgacggaa atggcaacca atcatgtaca ggttcttgta gaattcacaa1261 aaaagctacc aggatttcag actttggacc atgaagacca gattgctttg ctgaaagggt1321 ctgcggttga agctatgttc cttcgttcag ctgagatttt caataagaaa cttccgtctg1381 ggcattctga cctattggaa gaaagaattc gaaatagtgg tatctctgat gaatatataa1441 cacctatgtt tagtttttat aaaagtattg gggaactgaa aatgactcaa gaggagtatg1501 ctctgcttac agcaattgtt atcctgtctc cagatagaca atacataaag gatagagagg1561 cagtagagaa gcttcaggag ccacttcttg atgtgctaca aaagttgtgt aagattcacc1621 agcctgaaaa tcctcaacac tttgcctgtc tcctgggtcg cctgactgaa ttacggacat1681 tcaatcatca ccacgctgag atgctgatgt catggagagt aaacgaccac aagtttaccc1741 cacttctctg tgtaatctgg gacgtgcagt gatggggatt acaggggagg ggtctagctc1801 ctttttctct ctcatattaa tctgatgtat aactttcctt tatttcactt gtacccagtt1861 tcactcaaga aatcttgatg aatatttatg ttgtaattac atgtgtaact tccacaactg1921 taaatattgg gctagataga acaactttct ctacattgtg ttttaaaagg ctccagggaa1981 tcctgcattc taattggcaa gccctgtttg cctaattaaa ttgattgtta cttcaattct2041 atctgttgaa ctagggaaaa tctcattttg ctcatcttac catattgcat atattttatt2101 aaagagttgt attcaatctt ggcaataaag caaacataat ggcaacagaa aaaaaaaaaa2161 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaFXR多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO4)
1 MGSKMNLIEH SHLPTTDEFS FSENLFGVLT EQVAGPLGQN LEVEPYSQYSNVQFPQVQPQ61 ISSSSYYSNL GFYPQQPEEW YSPGIYELRR MPAETLYQGE TEVAEMPVTKKPRMGASAGR121 IKGDELCVVC GDRASGYHYN ALTCEGCKGF FRRSITKNAV YKCKNGGNCVMDMYMRRKCQ181 ECRLRKCKEM GMLAECLLTE IQCKSKRLRK NVKQHADQTV NEDSEGRDLRQVTSTTKSCR241 EKTELTPDQQ TLLHFIMDSY NKQRMPQEIT NKILKEEFSA EENFLILTEMATNHVQVLVE301 FTKKLPGFQT LDHEDQIALL KGSAVEAMFL RSAEIFNKKL PSGHSDLLEERIRNSGISDE361 YITPMFSFYK SIGELKMTQE EYALLTAIVI LSPDRQYIKD REAVEKLQEPLLDVLQKLCK421 IHQPENPQHF ACLLGRLTEL RTFNHHHAEM LMSWRVNDHK FTPLLCEIWD VQ本發(fā)明涉及試劑的鑒定和/或開發(fā)(如小分子、反義寡核苷酸、重組受體、抗體等等)，該試劑能夠例如通過與SHP或FXR結(jié)合或競爭來抑制SHP和/或FXR在炎癥基因途徑和/或膽固醇生物合成途徑中的活性。這些試劑能夠抑制SHP或FXR在膽固醇體內(nèi)穩(wěn)態(tài)途徑中對膽汁酸合成的負效應(yīng)，從而有效地降低血清LDL膽固醇水平，和/或抑制SHP或FXR在炎癥基因表達途徑中的負效應(yīng)。
鑒定SHP或FXR抑制劑的方法因為沒有已知的SHP或FXR配體，所以不可能進行結(jié)合試驗來鑒定對其活性有影響的分子。本發(fā)明提供一種新的方法用于鑒定能夠在炎癥基因表達和/或膽固醇生物合成途徑抑制SHP和/或FXR中活性的試劑。
作為本文示范的實例，我們已確定雌激素可通過ERα依賴性機制誘導(dǎo)SHP的表達?？梢詳喽⊿HP的這種誘導(dǎo)會降低膽汁酸合成和肝細胞中膽汁酸的水平。這會導(dǎo)致FXR的活性減少并降低apoCII的產(chǎn)量，同時提高血漿甘油三酯。此外，由于膽汁中膽汁酸與膽固醇的比例降低，膽汁酸合成的減少可導(dǎo)致膽囊結(jié)石形成傾向性的增強。有趣的是，進行激素替代療法的女性顯示出這兩種作用她們具有增加的甘油三酯水平，膽囊結(jié)石的發(fā)生率也有所增加。這表明SHP活性的藥理學(xué)處理導(dǎo)致了可觀察到的生理變化。因此SHP活性的抑制作用提高了膽固醇到膽汁酸的轉(zhuǎn)化率，并且降低了甘油三酯水平。這些作用對患有動脈粥樣硬化的病人十分有利。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，鑒定在炎癥基因表達途徑和/或膽固醇生物合成途徑中的SHP或FXR抑制劑的方法包括篩選試驗。該篩選試驗包括獲得測試試劑，然后將測試試劑施用于可表達(i)SHP或(ii)FXR且含有NF-κB啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子的細胞培養(yǎng)物?？梢种芐HP和/或FXR的測試試劑能夠引起可檢測物質(zhì)的增加。這樣，在施用各種測試試劑之后，通過在感染細胞培養(yǎng)物中對可檢測物質(zhì)的增加進行監(jiān)測，可以從大量可能的測試試劑中挑選出有效的抑制劑。
根據(jù)實施例，NF-κB啟動子含有胸苷激酶(TK)啟動子，并且該TK啟動子的上游存在兩個拷貝的NF-κB反應(yīng)元件。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，另一個鑒定SHP抑制劑的方法通常包括構(gòu)建全長LRH-1和SHP克隆，構(gòu)建LRH-1標(biāo)記，設(shè)計腺病毒構(gòu)建體，挑選細胞系及建立篩選范例。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括克隆CYP7A1或CYP8B1啟動子；將所克隆的CYP7A1或CYP8B1啟動子插入載體中可檢測物質(zhì)基因(例如，熒光素酶(luc)基因)的前面，形成CYP7A1或CYP8B1啟動子/可檢測物質(zhì)基因(如熒光素酶(luc)基因)報道分子；感染、轉(zhuǎn)染或改變(如，染色體變化等等)可表達SHP以及任選的表達HNF4α且?guī)в蠧YP7A1或CYP8B1啟動子/可檢測物質(zhì)基因(如熒光素酶(luc)基因)報道分子的細胞培養(yǎng)物，以形成感染的細胞培養(yǎng)物；對該感染的細胞培養(yǎng)物施用所述的試劑；檢測感染細胞培養(yǎng)物中可檢測物質(zhì)(如熒光素酶)的增加。
本文提供了用于鑒定可在膽固醇生物合成途徑和/或炎癥基因表達途徑中作為有效抑制劑的試劑的方法。根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，該方法包括克隆CYP7A1或CYP8B1啟動子；將該克隆的CYP7A1或CYP8B1啟動子插入載體中可檢測物質(zhì)基因(例如，熒光素酶(luc)基因)的前面，形成CYP7A1或CYP8B1啟動子/可檢測物質(zhì)基因(如熒光素酶(luc)基因)報道分子；感染可表達SHP以及任選的表達HNF4α且?guī)в蠧YP8B1啟動子/可檢測物質(zhì)基因(如熒光素酶(luc)基因)報道分子的細胞培養(yǎng)物，以形成感染的細胞培養(yǎng)物；對該感染的細胞培養(yǎng)物施用所述的試劑；檢測感染細胞培養(yǎng)物中可檢測物質(zhì)(如熒光素酶)的增加；克隆CYP7A1或CYP8B1啟動子；將該克隆的CYP7A1或CYP8B1啟動子插入載體中可檢測物質(zhì)基因(例如，熒光素酶(luc)基因)的前面，形成CYP7A1或CYP8B1啟動子/可檢測物質(zhì)基因(如熒光素酶(luc)基因)報道分子；感染可表達SHP以及任選的表達HNF4α且?guī)в蠧YP8A1或CYP8B1啟動子/可檢測物質(zhì)基因(如熒光素酶(luc)基因)報道分子的細胞培養(yǎng)物，以形成感染的細胞培養(yǎng)物；對該感染的細胞培養(yǎng)物施用所述的試劑；檢測感染細胞培養(yǎng)物中可檢測物質(zhì)(如熒光素酶)的增加。
根據(jù)實施例，監(jiān)測SHP和/或FXR的蛋白水平以確定該試劑是在蛋白質(zhì)或還是在核苷酸水平起作用。例如，可以標(biāo)記表達SHP的細胞(如通過表位標(biāo)記或利用六或七個氨基酸的標(biāo)志標(biāo)記)，然后利用Western印跡，ELISA或一些合適的技術(shù)監(jiān)測各水平，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
以下描述了用于實踐上述方法的各種實施例。而且，下面提供了特定的實施例(參見實施例3和4)，其表明了用于鑒定作為SHP抑制劑的任何測試化合物的特定試驗的全部操作。實施例3提供了利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)物，用于實施本發(fā)明實施例所述試驗的特定方法。實施例4提供了用腺病毒感染細胞培養(yǎng)物的優(yōu)選特定方法。利用本發(fā)明的方法可以鑒定SHP和FXR的抑制劑。根據(jù)本文，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的各種實施例可以容易地實踐所述方法。所以，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本文所提供的信息可以很容易地建立試驗來鑒定SHP或FXR的抑制劑。
表達體系和載體對宿主細胞(和包括該細胞的細胞培養(yǎng)物)進行遺傳工程操作以導(dǎo)入本發(fā)明的表達體系、其部分或多核苷酸。
將多核苷酸導(dǎo)入宿主細胞可通過眾多標(biāo)準(zhǔn)實驗手冊所述的方法進行，例如Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nded，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)位，顯微注射，超聲波，陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，摩擦裝載(scrapeloading)，生物彈道導(dǎo)入或感染。
適宜宿主的代表性實例包括哺乳動物細胞，例如大鼠細胞(如培養(yǎng)的大鼠肝癌細胞)、小鼠細胞(如小鼠肝細胞)、兔細胞、人細胞等等。例如，適宜的細胞包括HELA、人肝胚細胞瘤細胞系(HepG2)、人胚腎293細胞系(HEK293)、大鼠FTO-2B細胞、大鼠McA-RH7777或其組合。
通過眾所周知的方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化重組生產(chǎn)的多肽，包括高效液相色譜法，硫酸銨或乙醇沉淀，酸萃取，陰離子或陽離子交換色層分離法，磷酸纖維素色譜法，疏水作用色譜法，親和色譜法，羥磷灰石色譜法和凝集素色譜法。
可利用各種表達體系。這種體系包括，來自染色體、游離基因和病毒衍生的體系，如來自下述的載體細菌質(zhì)粒、減毒細菌，例如沙門氏菌(US 4,837,151)、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母游離基因、插入元件、酵母染色體元件、病毒例如牛痘及其他痘病毒、新培斯病毒、腺病毒、桿狀病毒、乳多泡病毒，例如SV40、雞痘病毒、假狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒、甲病毒屬，例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(US專利號5,643,576)、非節(jié)段的負-鏈RNA病毒，例如水泡性口膜炎病毒(US專利號6,168,943)，以及來自其組合的載體，例如來自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件，如粘粒和噬菌粒。該表達系統(tǒng)可包括調(diào)節(jié)并引起表達的調(diào)控區(qū)域，如啟動子及其他調(diào)控元件(如多腺苷化信號)。通常，可以利用適合于維持、增殖或表達多核苷酸以在宿主中產(chǎn)生多肽的任何體系或載體。可通過任何眾所周知的和常規(guī)的方法將適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄胁迦氡磉_體系中，如在Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(同上)；還可參見Zhang等，Journal of Biological Chemistry，276(45)41690-41699(2001)；Goodwin等，Molecular Cell，6517-526(2000)；以及Sinal等，Cell，102731-744(2000)，各文獻在此均全文并入本文。
本發(fā)明還提供包括本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的載體(如表達載體、測序載體、克隆載體)，用本發(fā)明載體進行遺傳工程操作的宿主細胞，以及通過重組方法生產(chǎn)的本發(fā)明多肽。還可以使用非細胞翻譯系統(tǒng)，利用來自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNAs來產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的載體是病毒載體，如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、牛痘病毒、桿狀病毒，及其他具有所需要的細胞趨性的重組病毒。因而，利用病毒載體或通過直接導(dǎo)入DNA，可體外導(dǎo)入編碼功能性或突變蛋白質(zhì)或多肽或其片段的基因。可通過將轉(zhuǎn)基因載體靶向特定細胞來影響在靶組織中的表達，如利用病毒載體或受體配體，或利用組織特異性的啟動子或兩者共同使用來完成。靶向基因的遞送在PCT公開號WO 95/28494中有描述。
通常用于體外方法的病毒載體是以DNA為基礎(chǔ)的載體以及逆轉(zhuǎn)錄載體。用于構(gòu)建和利用病毒載體的方法是本領(lǐng)域公知的(如，Miller和Rosman，BioTechniques，1992，7980-990)。優(yōu)選該病毒載體是復(fù)制缺陷型，也就是說它們不能在靶細胞中自主復(fù)制。優(yōu)選該復(fù)制缺陷型病毒是最小的病毒，即它僅保留包裝該基因組以生產(chǎn)病毒粒子所必需的基因組序列。
DNA病毒載體包括減毒或缺陷型DNA病毒，例如，但不限于，單純皰疹病毒(HSV)、乳頭狀瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒(AAV)等等。
優(yōu)選缺乏全部或幾乎全部病毒基因的缺陷型病毒。缺陷病毒在導(dǎo)入細胞之后沒有傳染性。利用缺陷型病毒載體可以在特異的限定區(qū)域施用于細胞，而不必擔(dān)心載體可能會感染其他的細胞。這樣，可明確地靶向特定組織。特定的載體實例包括但不限于，缺陷型皰疹病毒1(HSV1)載體(Kaplitt等，Molec.Cell，Neurosci.，1991，2320-330)，缺乏糖蛋白L基因的缺陷型皰疹病毒載體，或其他缺陷型皰疹病毒載體(PCT公開號WO 94/21807和WO 92/05263)；減毒的腺病毒載體，例如Stratford-Perricaudet等描述的載體(J.Clin.Invest.，1992，90626-630；也參見La Salle等，Science，1993，259988-990)；和缺陷型腺病毒相關(guān)病毒載體(Samulski等，J.Virol.，1987，613096-3101；Samulski等，J.Virol.，1989，633822-3828；Lebkowski等，Mol.Cell，Biol.，1988，83988-3996)。
各種公司生產(chǎn)商業(yè)病毒載體，包括但不限于，Avigen，Inc.(Alameda，加利福尼亞；AAV載體)、Cell Genesys(Foster City，加利福尼亞；逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV載體和慢病毒載體)、Clontech(逆轉(zhuǎn)錄病毒和桿狀病毒載體)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，賓夕法尼亞；腺病毒和AAV載體)、Genvec(腺病毒載體)、IntroGene(Leiden，荷蘭；腺病毒載體)、Molecular Medicine(逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV和皰疹病毒載體)、Norgen(腺病毒載體)、OxfordBioMedica(牛津，英國，慢病毒載體)，和Transgene(Strasbourg，法國；腺病毒、牛痘、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體)。
腺病毒是可被修飾以便將本發(fā)明的核苷酸有效遞送到各種細胞類型的真核DNA病毒。存在各式各樣的腺病毒血清型。這些血清型中，在本發(fā)明范疇內(nèi)優(yōu)選利用2型或5型人腺病毒(Ad 2或Ad 5)或動物來源的腺病毒(參見，PCT公開號WO 94/26914)。可用于本發(fā)明的動物來源的腺病毒包括犬、牛、鼠(如，Mavl，Beard等，Virology，1990，75-81)、綿羊、豬、鳥類和猿(如SAV)來源的腺病毒。優(yōu)選動物來源的腺病毒是犬腺病毒，更優(yōu)選CAV2腺病毒(如，Manhattan或A26/61毒株，ATCC VR-800)。已經(jīng)描述了各種復(fù)制缺陷型腺病毒和最小化的腺病毒載體(如，PCT公開號WO 94/26914、WO 95/02697、WO 94/28938、WO 94/28152、WO 94/12649、WO 95/02697、WO 96/22378)。本發(fā)明的復(fù)制缺陷型重組腺病毒可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法制備(如，Levrero等，Gene，1991，101195；歐洲公開號EP 185 573；Graham，EMBO J.，1984，32917；Graham等，J.Gen.Virol.，1977，3659)。利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)回收和純化重組腺病毒。
腺病毒相關(guān)病毒(AAV)是相對較小尺寸的DNA病毒，其可以穩(wěn)定且定點的方式整合到被其感染的細胞基因組中。它們能夠感染廣譜細胞而不對細胞的生長、形態(tài)學(xué)或分化有任何誘導(dǎo)作用，并且看起來它們并未涉及人的病理學(xué)。AAV基因組已被克隆、測序且表征。已經(jīng)描述了通過來自AAVs的載體體外轉(zhuǎn)移基因的應(yīng)用(參見，PCT公開號WO 91/18088和WO 93/09239；US專利號4,797,368和5,139,941；歐洲公開號EP 488 528)。本發(fā)明的復(fù)制缺陷型重組AAVs可通過下述制備將含有目的核酸序列的質(zhì)粒和攜帶AAV殼體化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到用人輔助病毒(例如腺病毒)感染的細胞系中，其中所述目的序列的兩側(cè)是兩個AAV轉(zhuǎn)化的末端重復(fù)(ITR)區(qū)域。然后利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化產(chǎn)生的AAV重組體。
在另一實施例中，可將該基因?qū)肽孓D(zhuǎn)錄病毒載體中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體如以下文獻所述US專利號5,399,346；Mann等，Cell，1983，33153；US專利號4,650,764和4,980,289；Markowitz等，JVirol.，1988，621120；US專利號5,124,263；歐洲公開號EP 453242和EP178 220；Bernstein等，Genet.Eng.，1985，7235；McCormick，BioTechnology，1985，3689；PCT公開號WO 95/07358；和Kuo等，Blood，1993，82845。該逆轉(zhuǎn)錄病毒是感染分裂細胞的整合病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括兩個LTR，一個殼體化序列和三個編碼區(qū)域(gag、pol和env)。在重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，gag、pol和env基因通常是全部或部分缺失的，并替換為異源的目的核酸序列。可根據(jù)不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒來構(gòu)建這些載體，例如HIV、MoMuLV(″鼠源莫洛尼白血病病毒″)、MSV(“鼠源莫洛尼肉瘤病毒”)、HaSV(″Harvey肉瘤病毒”)、SNV(″脾壞死病毒″)、RSV(″勞氏肉瘤病毒”)，和Friend病毒。已經(jīng)描述了適當(dāng)?shù)陌b細胞系，特別是細胞系PA317(US4,861,719)、PsiCRIP細胞系(PCT公開號WO 90/02806)和GP+envAm-12細胞系(PCT公開號WO 89/07150)。另外，該重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以在LTRs內(nèi)部含有修飾，用于抑制轉(zhuǎn)錄活性，還可含有大量的殼體化序列，其中可以包括部分gag基因(Bender等，JVirol.，1987，611639)。利用該領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
可以構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使其作為傳染性粒子發(fā)揮作用，或進行單輪的轉(zhuǎn)染。在前一種情況下，該病毒被修飾以保留病毒中除負責(zé)致癌轉(zhuǎn)化特性基因之外的全部基因，并表達異源基因。處理非傳染性的病毒載體以破壞該病毒的包裝信號，但保留包裝該共導(dǎo)入病毒所需的結(jié)構(gòu)基因，其中所述的共導(dǎo)入病毒被設(shè)計為含有異源基因和包裝信號。這樣，產(chǎn)生的病毒粒子就不能制造另外的病毒。
還可以利用DNA病毒導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該病毒容許逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制一個周期并可增強轉(zhuǎn)染效率(參見PCT公開號WO 95/22617、WO 95/26411、WO96/39036和WO97/19182)。
另一實施例中，可使用慢性病毒載體作為直接運送的媒介，維持轉(zhuǎn)基因在若干組織類型中的表達，包括腦、視網(wǎng)膜、肌肉、肝和血液。該載體能在這些組織中有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和未分裂細胞，并維持目的基因的長期表達。相關(guān)綜述，可參見Naldini，Curr.Opin.Biotechnol.，1998，9457-63；還可參見，Zufferey等，J.Virol.，1998，729873-80。慢病毒包裝細胞系通常是本領(lǐng)域通用并公知的。它們可以促進高滴度慢病毒載體的生產(chǎn)以用于基因治療。一個實例是四環(huán)素-誘導(dǎo)型VSV-G假型慢病毒包裝細胞系，其能在至少3到4天內(nèi)產(chǎn)生滴度大于106IU/ml的病毒粒子(Kafri等，J.Virol.，1999，73576-584)?？梢詽饪s該誘導(dǎo)型細胞系所產(chǎn)生的載體，用于滿足體外高效轉(zhuǎn)導(dǎo)未分裂細胞的需要。
還可使用其他的分子來促進核酸體外轉(zhuǎn)染，例如陽離子低聚肽(如，PCT專利公開號WO95/21931)、來自DNA結(jié)合蛋白的肽(如，PCT專利公開號WO96/25508)，或陽離子聚合物(如，PCT專利公開號WO 95/21931)，或丁哌卡因(US5,593,972)。
可使用活載體將本發(fā)明的分離多肽運送給哺乳動物，特別是利用活的重組細菌、病毒或其它活的媒介，只要其含有該多肽或作為外源多肽的免疫原片段表達所必需的遺傳物質(zhì)。特別地，繁殖于胃腸道的細菌，例如沙門菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、弧菌屬(Vibrio)、大腸桿菌屬(Escherichia)和BCG已被開發(fā)成為疫苗載體，這些細菌及其他實例由Holmgren等(1992)和McGhee等(1992)加以論述。
以下可用作載體列表的一部分，但并不限于此單分子負鏈RNA病毒目(單分子負鏈RNA病毒)未節(jié)段化的、反義、單鏈RNA病毒的分類副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)副粘病毒屬(Paramyxovirus Genus)仙臺病毒(小鼠副流感病毒1型)人副流感病毒(PIV)1和3型牛副流感病毒(BPV)3型腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)猿猴病毒5(SV)(犬副流感病毒2型)腮腺炎病毒新城疫病毒(NDV)(鳥副粘病毒1)人副流感病毒(PIV-2，4a和4b型)麻疹病毒屬(Morbillivirus)麻疹病毒(MV)海豚麻疹病毒犬瘟熱病毒(CDV)Peste-des-petits-反芻動物病毒Phocine瘟熱病毒牛瘟病毒未分類的Hendra病毒Nipah病毒肺病毒亞科(Pneumovirinae)肺病毒(Pneumovirus)屬人呼吸道合胞病毒(RSV)牛呼吸道合胞病毒小鼠肺炎病毒Metapneumovirus屬人metapneumovirus鳥pneumovirus(曾命名火雞鼻氣管炎病毒)彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒(Lyssavirus)屬狂犬病病毒水泡性病毒屬(Vesiculovirus)水泡性口膜炎病毒(VSV)短暫熱病毒屬(Ephemerovirus)牛短暫熱病毒纖絲病毒科(Filovirdae)纖絲病毒(Filovirus)屬馬伯格氏病毒RNA病毒載體是基本上分離的核酸分子，其含有的序列編碼單分子負鏈RNA病毒目未節(jié)段化的、反義、單鏈RNA病毒的至少一個基因組或反基因組。該分離的核酸分子可含有編碼基因組、反基因組或其改良形式的多核苷酸序列。在一個實施例中，該多核苷酸編碼可操作連接的啟動子，所需要的基因組或反基因組，以及翻譯終止子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，該多核苷酸編碼已在野生型RNA病毒基礎(chǔ)上，利用核苷酸的插入、重排、缺失或取代而修飾基因組或反基因組。該基因組或反基因組序列可源自于人或非人病毒。該多核苷酸序列還可編碼嵌合的基因組，該基因組可由重組連接來自兩個或更多來源的基因組或反基因組而形成。例如，將來自RSV A組的一個或多個基因插入RSVB組基因的相應(yīng)位點；或?qū)⒁粋€或多個來自牛PIV(BPIV)、PIV-1或PIV-2的基因插入PIV-3基因的相應(yīng)位點；或者RSV也可以被PIV基因取代等等。在另外的實施例中，該多核苷酸編碼單分子負鏈RNA病毒目的RNA病毒的基因組或反基因組，該病毒可為人、?；蛘呤笤床《?。因為將本發(fā)明方法制備的重組病毒被用于治療或預(yù)防的目的，所以該多核苷酸也可以編碼所選RNA病毒的減毒或傳染性形式。在多數(shù)實施例中，該多核苷酸編碼RNA病毒的減毒的、傳染性形式。在特定優(yōu)選實施例中，該多核苷酸編碼單分子負鏈RNA病毒目的未分段的、反義、單鏈RNA病毒基因組或反基因組，在3′基因組啟動子區(qū)域具有至少一個減毒性突變并且在RNA聚合酶基因中具有至少一個減毒性突變，如同公開的國際專利申請WO 98/13501所述，該申請在此并入本文作為參考。
作為載體，編碼上述所需要基因組和反基因組改良形式的多核苷酸序列還可編碼一個或多個本發(fā)明免疫原性蛋白質(zhì)的基因或核苷酸序列。另外，根據(jù)需要還可加入一個或多個異源基因以形成所需要的免疫原性組合物/載體。根據(jù)所需要的重組病毒的應(yīng)用，該異源基因可以編碼輔助因子、細胞因子(如白細胞介素)、T-輔助表位、限制性標(biāo)記、佐劑或不同微生物病原體(如，病毒、細菌或真菌)的蛋白質(zhì)，尤其是能夠引起保護性免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)。該異源基因還可用于提供進行基因治療的試劑。在優(yōu)選實施例中，該異源基因編碼細胞因子，如白細胞介素-12，所述細胞因子被選擇用于改善重組病毒的預(yù)防或治療性特征。
優(yōu)選該載體為腺病毒。更優(yōu)選該腺病毒為復(fù)制缺陷型腺病毒。更優(yōu)選該復(fù)制缺陷型腺病毒含有SV40啟動子、CMV啟動子、MLP啟動子或其組合。更優(yōu)選，該復(fù)制缺陷型腺病毒含有SV40啟動子。
高通量篩選本發(fā)明用于檢測和鑒定生物樣本中SHP抑制劑的方法預(yù)期應(yīng)用高通量篩選。來自高通量篩選的信息流程中存在三個不同的階段生化試驗的實驗設(shè)計，數(shù)據(jù)完整性問題和數(shù)據(jù)分析。當(dāng)建立篩選時最主要的是實驗設(shè)計，其用于迅速地鑒定最佳的試驗條件并且確保所獲數(shù)據(jù)的精確性。數(shù)據(jù)完整性問題包括計算各組化合物的試驗應(yīng)變性，鑒定及盡可能校正系統(tǒng)的影響，并驗證該數(shù)據(jù)是否適用于其預(yù)定的應(yīng)用。最后，數(shù)據(jù)分析包括用數(shù)據(jù)進行操作，或者簡化數(shù)據(jù)以通過類似Ki的結(jié)果來概括原始數(shù)據(jù)，或從數(shù)據(jù)中提取圖象和信息，如SAR，QSAR或神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析。總之，這些方法是從大量數(shù)據(jù)中提取信息。
試驗設(shè)計是典型的統(tǒng)計方法，該方法已在許多需要找到最優(yōu)條件和建模反應(yīng)表面的學(xué)科中得到應(yīng)用，但經(jīng)常在生物學(xué)中未被充分使用。試驗設(shè)計的理論基礎(chǔ)在許多的統(tǒng)計文本中有詳細描寫，如，Cochran，W.G，和Cox GM，Experimental Designs，John Wiley和SonsNew York，1957；Hicks，CR，F(xiàn)undamental Concepts ofDesign of Experiments，Holt，Rhinehart和Winston，1974；Box，GE，Hunter，WG，和Hunter，S，Statistics for ExperimentersAn Introduction to Design，Data Analysis and Model Building，John Wiley和SonsNew York，1978；Montgomery，DC，Designand Analysis of Experiments，John Wiley和SonsNew York，1984，各文獻在此均全文引入作為參考。可在與指定領(lǐng)域有關(guān)的文獻中找到應(yīng)用情形的研究。實例包括工業(yè)生產(chǎn)方法的優(yōu)化，如以下所述，Daniel，C，Applications of Statistics to IndustrialExperimentation，John Wiley和SonsNew York，1976；Murphy，T.D.，design and analysis of industrial experiments，ChemicalEngineering，June 6，1977，168-182；以及如下所述的化學(xué)過程，Deming SN和Morgan，SL，Experimental Designachemometricapproach；Elsevier，1987；Austel，V.，Design of Test Seriesby Combined Apllication of 2n Factorial Schemes and PatternRecognition Techniques.Quantitative Approaches to DrugDiscovery；Dearden，JC，Ed；Elsevier，1983。與生物學(xué)和化學(xué)應(yīng)用的試驗設(shè)計相關(guān)的問題和方法由Haaland，ExperimentalDesign in Biotechnology，Marcel Dekker，1989公開。
應(yīng)考慮到以系統(tǒng)性的方式進行最優(yōu)化的手段，以便以最少量的操作提取出最大量的信息。多數(shù)情況下，最優(yōu)條件的鑒定是充分的。在其它情況下，用數(shù)學(xué)方法模擬各因素與反應(yīng)之間的關(guān)系。相互作用格外重要，因為在生物學(xué)中它們是普遍存在而不是偶爾發(fā)生的，會大大地提高問題的復(fù)雜性，甚至在最壞的情況下，使得那些數(shù)據(jù)無法解釋。試驗設(shè)計的一個特別子集是方差縮減試驗設(shè)計。在這種設(shè)計中，被最優(yōu)化的是反應(yīng)的方差，而不是反應(yīng)本身。這些設(shè)計在生物學(xué)中很重要，因為將方差最小化可以使試驗更加穩(wěn)妥。在其他的應(yīng)用中，成本是一個重要因素，希望將其最優(yōu)化，以盡量降低像蛋白質(zhì)那樣的稀缺資源的用量。多數(shù)情況下考慮多種應(yīng)對例如非限制性地舉例而言，最小化方差的同時保持低受體濃度以便保留蛋白質(zhì)。最后，建模的優(yōu)點是可以進行預(yù)測，即使是簡單的模型，例如形成經(jīng)典試驗設(shè)計基礎(chǔ)的線性模型。
在經(jīng)典的試驗設(shè)計中，研究者選擇大量認(rèn)為可能對反應(yīng)有影響的因素。根據(jù)因素的數(shù)目及其可能范圍，可以選擇不同類型的設(shè)計，用于確定這些因素定義的空間。所有這些因素都以系統(tǒng)性的方式同時改變，這種方式可隨后允許測量特定因素的顯著性或者因素之間的相互作用。一般地，在作用范圍的極限值試驗這些因素，使用線性或多項式插值函數(shù)來建模各設(shè)定點之間的區(qū)域。
可根據(jù)特定的目的來選擇不同的試驗設(shè)計。當(dāng)首先建立了一個自動試驗時，往往存在許多因素可能影響該試驗的穩(wěn)妥性。
為找到重要因素，可以進行一個低分辨率分級的因素設(shè)計。確定了重要因素之后，可以建立一個完整的因素設(shè)計以便找到各因素的最佳設(shè)定值?？梢赃M行反應(yīng)曲面建模用于確定最佳背景周圍的區(qū)域，來評定該因素的靈敏度以及檢驗更高級別的相互作用。
近來的科技進展已經(jīng)引入了新的范例來研究發(fā)現(xiàn)藥物?；瘜W(xué)文庫以及用于生物鑒定的自動系統(tǒng)的可獲得性能夠容許在一天內(nèi)合成并檢驗數(shù)百乃至數(shù)千的化合物。這為自動化試驗和數(shù)據(jù)分析作好了準(zhǔn)備。組合文庫為檢驗提供了大量化合物。當(dāng)利用靶分子芯片檢驗文庫時所得到的大量數(shù)據(jù)可以為結(jié)構(gòu)活性關(guān)系分析創(chuàng)造新的機會，也加強了有效統(tǒng)計法的必要性，以便確保數(shù)據(jù)的完整性并且鑒定數(shù)據(jù)中的趨勢和關(guān)系。
本發(fā)明提供一種大規(guī)模篩選能夠抑制熒光素酶報告基因表達的試劑的方法，所述基因在特定組織或細胞類型中表達。該方法將試劑文庫和高通量原位方法以及隨后的分析結(jié)合在一起。通過利用自動技術(shù)可以合而為一地檢驗大量化合物。例如，可以在一天內(nèi)檢驗1,000到40,000個化合物。優(yōu)選在一天內(nèi)檢驗約40,000個化合物。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該篩選方法利用冷凍小瓶的細胞，將細胞自動等分到孔板中。然后培養(yǎng)該孔板，取出該板，鑒定報道分子。優(yōu)選每批使用4千萬細胞，并且將1000個細胞等分到100個384孔板(一個孔板具有384個孔)的各孔中。優(yōu)選所述培養(yǎng)是在約37℃進行約24到約48小時。
試劑本發(fā)明的上述方法能夠鑒定在炎癥基因表達和/或膽固醇生物合成途徑中有效抑制SHP和/或FXR的試劑。通過本發(fā)明方法鑒定的試劑非限制性地包括小分子、反義寡核苷酸、重組受體(如重組SHP、重組FXR、可溶性重組SHP、可溶性重組FXR)抗體等等。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提供可在炎癥基因表達途徑和/或膽固醇生物合成途徑中有效抑制SHP或FXR活性的小分子，例如，該小分子的特征在于當(dāng)其被施用于用含有NF-κB啟動子/熒光素酶(luc)基因報道分子的載體所感染的細胞培養(yǎng)物時，會導(dǎo)致熒光素酶增加，其中所述細胞培養(yǎng)物表達SHP或FXR。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該小分子的特征在于當(dāng)其被施用于用含有CYP7A1或CYP8B1啟動子/熒光素酶(luc)基因報道分子的載體所感染的細胞培養(yǎng)物時，會導(dǎo)致熒光素酶增加，其中所述細胞培養(yǎng)物表達短的異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)以及任選的肝細胞核因子4α(HNF4α)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易理解術(shù)語“小分子”用于表示其通常含義，并用于本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通應(yīng)用。優(yōu)選該小分子的分子量約為50到約1500。更優(yōu)選該試劑的分子量為約50到約750。更優(yōu)選該小分子的分子量為約50到約500。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何可接受的測量小分子分子量的方法來測定分子量。
該小分子可以是各種種類的化合物。例如非限制性地，該小分子可以是天然的或合成的脂類。此外，該小分子可以從脂溶性延伸到水溶性的試劑。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該小分子是脂溶性的。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該小分子是天然或合成的類固醇。類固醇是一大組天然存在和合成的脂類或脂溶性化合物，其顯示出極大的生理活性多樣性。類固醇當(dāng)中包括某些醇類(固醇)、膽汁酸、許多重要的激素、一些天然藥物以及在一些蟾蜍皮膚中發(fā)現(xiàn)的毒素。當(dāng)暴露于太陽的紫外線下時，人類皮膚中發(fā)現(xiàn)的各種固醇就被轉(zhuǎn)變成維生素D。事實上，膽固醇本身就是一種固醇。
甾體激素類似于固醇但并不等同于固醇，其包括腎上腺皮層的皮質(zhì)醇、皮質(zhì)素、醛甾酮和黃體酮；以及雌性和雄性激素、雌激素和睪丸激素。大部分的口服避孕藥是由抑制排卵的雌激素組成的合成類固醇。皮質(zhì)素和各種合成衍生物被廣泛用于藥品。例如，這種類固醇被用于各種皮膚疾病、變形性關(guān)節(jié)炎、哮喘和過敏，以及各種眼疾病和腎上腺機能不全或腎上腺皮質(zhì)機能障礙的病癥。并不是本發(fā)明的每個小分子都是類固醇，也并不是每種類固醇都是本發(fā)明的小分子。根據(jù)本文提供的指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地知道如何鑒定本發(fā)明的特定小分子。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，該小分子是非類固醇化合物。根據(jù)本文提供的指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的實施例可以容易地知道如何鑒定本發(fā)明的特定小分子。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選該小分子是非類固醇化合物。更優(yōu)選該小分子是分子量約為50到約1500的非類固醇化合物。更優(yōu)選該小分子是分子量約為50到約750的非類固醇化合物。更優(yōu)選該小分子是分子量約為50到約500的非類固醇化合物。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，優(yōu)選該小分子是非雌激素類固醇激素。更優(yōu)選該小分子是分子量約為50到約1500的非雌激素類固醇激素。更優(yōu)選該小分子是分子量約為50到約750的非雌激素類固醇激素。更優(yōu)選該試劑是分子量約為50到約500的非雌激素類固醇激素。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，該小分子與成熟或未成熟形式的SHP或FXR或編碼這兩種試劑的基因結(jié)合。另外，本發(fā)明的實施例包括能與SHP或FXR的成熟或未成熟形式競爭受體或配體的小分子，其中所述小分子以有效對抗動脈粥樣硬化的數(shù)量存在于組合物中。另外，本發(fā)明包括的小分子是SHP或FXR拮抗劑。拮抗劑是一種結(jié)構(gòu)類似物，其與受體結(jié)合，但不觸發(fā)該天然配體的正常效應(yīng)，從而阻斷該天然配體的作用。因此，SHP或FXR拮抗劑能夠競爭配體和/或受體的結(jié)合位點，防止SHP或FXR結(jié)合，因而抑制SHP或FXR的活性。根據(jù)本文提供的指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的實施例能夠容易地鑒定并且制備SHP或FXR拮抗劑。
治療性組合物還提供治療性組合物。如上所述本發(fā)明的組合物可用于治療多種病癥。例如，本發(fā)明的治療性組合物可用于治療哺乳動物——例如人(優(yōu)選)和非人動物——中血清低密度脂蛋白(LDL)膽固醇水平的升高。例如，該動物可以是牛、犬、馬、貓和豬。特定的應(yīng)用包括但不限于，治療動脈粥樣硬化及其他與LDL膽固醇水平升高相關(guān)的病癥。
本發(fā)明的治療性組合物可以是預(yù)防性的(即，為防止感染或減少感染的發(fā)生)或治療性的(即，為治療由感染后感染所引起的疾病或者副作用)。
該組合物可包括本發(fā)明的試劑。為此，將一種或多種試劑調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)臐舛?，并用任何適當(dāng)?shù)南♂寗?、載體或其任何組合配制。生理學(xué)可接受的媒介可以用作載體和/或稀釋劑。這些包括但不限于，水、適當(dāng)?shù)牡葷B媒介、甘油、乙醇及其他常規(guī)溶劑、磷酸鹽緩沖鹽水等等。
一旦配制后，本發(fā)明的組合物可被直接施用于患者，自體內(nèi)或體外遞送到來源于患者的細胞。如果直接運送給患者，可以通過任何常規(guī)形式給藥，例如鼻內(nèi)、腸道外、口服、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或局部應(yīng)用于任何粘膜表面，例如鼻內(nèi)、口、眼睛、肺、陰道或直腸表面，例如通過氣溶膠噴射。
任何生物學(xué)可接受的劑型及其組合都包括在本發(fā)明主題內(nèi)。這種劑型的實例非限制性地包括，嚼片、速溶劑片、泡騰片、可復(fù)水粉末、甘香制劑、液體、溶液、懸浮液、乳劑、片劑、多層片劑、雙層片劑、膠囊劑、軟膠膠囊、硬膠囊、囊片、錠劑、可嚼錠劑、珠粒、粉末、顆粒、粉粒、微粒、可分散的顆粒、扁囊劑、灌洗劑、栓劑、乳膏劑、局部劑、吸入劑、氣霧吸入劑、碎片、顆粒吸入劑、植入物、貯存植入物、可攝取劑、可注射劑、輸液劑、健康棒、糖膏、動物飼料、谷類、谷類包衣、食物、營養(yǎng)食物、機能性食品或其組合。上述劑型的制備是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。本發(fā)明的組合物優(yōu)選口服劑型。這些劑型全部是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。
本文所用術(shù)語“藥物學(xué)上可接受的”是指該劑型必須具有足夠高的純度并適用于與細胞、組織或膜接觸，無不當(dāng)毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、過敏反應(yīng)等等。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的治療性組合物是口服施用于生物學(xué)個體的。本發(fā)明的治療性組合物也可以湯劑的形式給藥。相信任何調(diào)味品或食物可以加入湯劑中以依照要求改變口味。
可以將各種添加劑結(jié)合到該組合物中。任選的組合物添加劑非限制性地包括淀粉、糖、脂肪、抗氧化劑、氨基酸、蛋白質(zhì)、其衍生物或其組合。
本發(fā)明主題的藥物組合物劑型也可能結(jié)合各種釋放形式，其中非限制性地包括立即釋放、連續(xù)釋放、脈沖釋放、可變釋放、控制釋放、延時釋放、維持釋放、延遲釋放、長效作用及其組合。可使用普通技術(shù)人員公知的過程和方法來獲得立即釋放、連續(xù)釋放、脈沖釋放、可變釋放、控制釋放、延時釋放、維持釋放、延遲釋放、長效作用特性的能力。這些為獲得所述釋放特征的特定技術(shù)或方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。本文所用的“控制的釋放形式”是指具有至少一個為控制釋放而配制的組分的任何形式。本文所用的“立即釋放形式”是指具有至少一些為立即釋放而配制的藥物學(xué)活性組分的任何形式。
下列方法非限制性地代表可接受的方法，用于制備本發(fā)明的主題范圍內(nèi)未包括的劑型。
例如，非限制性地，可以這樣制備速溶片劑將制劑與糖和纖維素衍生物之類的試劑混合，口服之后，這些試劑能促進所獲片劑通常在30秒之內(nèi)溶解或解體。
例如，非限制性地，谷類食品包衣可以這樣制備在谷類食品制劑已形成片、薄片或其它的幾何形狀以后，使其經(jīng)過精確噴涂裝置，用于沉積活性成分膜層，在形成元件的表面上加上賦形劑。然后干燥如此處理的元件以形成谷類食品包衣。
非限制性地，健康棒可以這樣制備將制劑加上賦形劑(如，粘合劑、填充劑、調(diào)味劑、色素等等)混合成可塑性稠密度。然后將試劑拉長或塑模以形成“糖塊”形狀，然后干燥或者使其固化以形成最終產(chǎn)品。
例如，非限制性地，軟凝膠或軟膠膠囊可以這樣制備將制劑分散在適當(dāng)?shù)娜軇?通常使用植物油)中以形成高粘度混合物。然后使用軟凝膠行業(yè)中公知的技術(shù)和機器將該混合物用明膠膜封裝。然后將如此形成的工業(yè)單元干燥到恒重。
例如，非限制性地，嚼片可以這樣制備將制劑與賦形劑混合，所述賦形劑設(shè)計成能形成相對軟的、加香的片劑型，該劑型用于咀嚼而非吞服?？梢岳贸Ｒ?guī)的劑片機器和方法，所述機器既直接受壓并成粒，或在壓縮前重擊。涉及藥物固體劑型生產(chǎn)的人員通曉這種方法，且用于可嚼劑型的機器在制藥工業(yè)中也很常見。
例如，非限制性地，膜包衣片可以這樣制備使用例如旋轉(zhuǎn)盤涂膜法或空氣懸浮方法的技術(shù)包覆藥片，以便在藥片上沉淀連續(xù)的膜層。該方法經(jīng)常是用于改進藥片的外觀美感，但也可用于改進藥片的吞服，或屏蔽不良氣味或味道，或用于改進難看的無覆蓋層藥片的特性。
例如，非限制性地，壓片可以這樣制備將制劑與用于給崩解性質(zhì)增加結(jié)合性能的賦形劑混合。該混合物可以直接壓縮或?；?，然后使用工業(yè)中公知的方法和機器壓縮。然后根據(jù)市場需要，包裝所獲的壓片劑量，即，單位劑量、筒裝、批量瓶、鼓泡包裝等等。
例如，可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法制造動物飼料?？梢酝ㄟ^將制劑與結(jié)合成分混合以形成膠質(zhì)試劑來制備動物飼料。然后在高壓下擠出該試劑，形成管狀的(或“空心粉條-樣”)的結(jié)構(gòu)，分割為球團粒度并干燥。
本發(fā)明的主題包括通過任何途徑施用配制的藥物組合物，非限制性地包括口服的、口腔的、舌下的、直腸的、腸胃外的、局部的、吸入的、可注射的以及透過皮膚起作用的，優(yōu)選口服的。營養(yǎng)組合物的物理化學(xué)特性，其劑型以及給藥途徑對于吸收很重要。吸收應(yīng)參照營養(yǎng)組合物從給藥位點到體循環(huán)的運動過程?？诜o藥的營養(yǎng)組合物可以是片劑或膠囊劑的形式，主要為了方便、經(jīng)濟、穩(wěn)定性以及病人接受性起見。它們必須在吸收發(fā)生之前分解并溶解。利用任何上述給藥途徑或劑型，可利用普通技術(shù)人員可獲得的公知方法和技術(shù)實現(xiàn)本發(fā)明的應(yīng)用。
本發(fā)明的主題包括生物學(xué)可接受載體的應(yīng)用，該載體可以從大量原料中制備。非限制性地，這種原料可包括稀釋劑、溶劑、粘合劑和粘附劑、潤滑劑、增塑劑、分解劑、色素、批量試劑、調(diào)味劑、甜味劑和其他原料，如緩沖劑和吸附劑，以便制備特定的藥物組合物。
可以從廣泛原料中選擇粘合劑，例如羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素或其它合適的纖維素衍生物、聚烯吡酮、丙烯酸甲基丙烯酸共聚物、藥物糖衣、膠、奶衍生物如乳清、淀粉和衍生物及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)粘合劑。無毒溶劑的非限制性示例可以是水、乙醇、異丙醇、二氯甲烷或混合物及其組合。批量試劑的非限制性示范可以包括糖、乳糖、明膠、淀粉及二氧化硅。
用于溶解改進體系的增塑劑優(yōu)選預(yù)先溶于有機溶劑并以溶液形式添加。優(yōu)選的增塑劑可以非限制性地選自鄰苯二甲酸二乙酯、癸二酸二乙酯、檸檬酸三乙酯、cronoticacid、丙二醇、酞酸丁酯、癸二酸二丁酯、蓖麻油及其混合物。很明顯，增塑劑本質(zhì)上可以是疏水性的或親水性的?？墒褂貌蝗苡谒氖杷镔|(zhì)來延遲水溶性原料的釋放，例如鄰苯二甲酸二乙酯、癸二酸二乙酯和蓖麻油。與此相反，當(dāng)使用不溶于水的原料時可以利用親水性的增塑劑，其可幫助溶解封裝的膜，在表面上產(chǎn)生溝槽，而幫助組合物釋放。
本發(fā)明的組合物可以部分地給藥，即分開劑量，在24小時期間內(nèi)一次或多次給藥，在24小時期間單一劑量給藥，在24小時期間加倍劑量給藥，或在24小時期間超過加倍劑量給藥?？梢酝瑫r或在24小時內(nèi)的不同時期進行部分的、加倍的或其它多元劑量。
本發(fā)明組合物計劃應(yīng)用于人及其他動物。根據(jù)體重調(diào)整劑量，因此本文在單位體重的基礎(chǔ)上闡明。例如，如果處方為55kg的個體指定約10-1000mg的范圍，對于35kg的個體而言該范圍可能調(diào)整為約6.3-630mg(如，范圍的下限(35kg/55kg)*10mg＝6.3mg)。小數(shù)點后的數(shù)量可以化為最接近的整數(shù)。這樣該組合物的上述方式可適合于任何個體，包括任何動物，無論其大小。
多肽本發(fā)明的方法能夠篩選抑制SHP或FXR活性的試劑。除SHP和FXR外，本發(fā)明包括利用任何具有SHP或FXR活性的化合物。例如，SHP或FXR的拮抗劑或在序列上有輕微改變但具有與SHP或FXR相同作用的化合物。這種化合物可用于篩選SHP或FXR活性的抑制劑。
例如，靶化合物可能具有和SEQ ID NOS2或4的參考序列相同的多肽序列，也就是說100％相同，或者同參考序列相比它可包括某一整數(shù)的氨基酸改變，因此相同性％小于100％。這種改變包括至少一個氨基酸的缺失、取代，包括保守和非保守替換或插入。所述改變可能在參考多肽序列的氨基或羧基末端發(fā)生，或者在末端位點之間的任何地方，可以個別地散布在參考的氨基酸序列當(dāng)中，或以一個或多個鄰接組的方式散布在參考氨基酸序列之內(nèi)。
因此，本發(fā)明還包括利用與序列表所含的氨基酸序列(即，SEQ IDNOS2或4)具有序列相同性的分離多肽。依據(jù)特定的序列，序列的相同性程度優(yōu)選大于50％(如，60％、70％、80％、90％、95％、97％，99％或更多)。這些同源蛋白質(zhì)包括突變體和等位變異體。
如同本領(lǐng)域公知的，“相同性”是指在兩個或更多個多肽序列或兩個或更多個多核苷酸序列之間的關(guān)系，是通過比較所述序列而確定的。在本領(lǐng)域中，“相同性”也是指在多肽或多核苷酸序列之間序列相關(guān)性的程度，視情況而定，通過這些序列字符串之間的匹配性而確定?！跋嗤浴焙汀跋嗨菩浴笨梢酝ㄟ^已知的方法容易計算，包括但不限于以下所述的那些方法計算的分子生物學(xué)，Lesk，AM，編輯，牛津大學(xué)出版社，紐約；生物計算機信息學(xué)和基因組計劃，Smith，DW，編輯，Academic Press，New York，1993；序列數(shù)據(jù)的計算機分析，Part I，Griffin，AM和Griffin，HG，編輯，Humana Press，New Jersey，1994；分子生物學(xué)中的序列分析，von Heinje，G，Academic Press，1987；和序列分析引物，Gribskov，M和Devereux，J，編輯，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H和Lipman，D，SIAM J Applied Math.，481073(1988)。確定相同性的優(yōu)選方法應(yīng)設(shè)計成能給出被檢序列之間最大的匹配性。確定相同性和相似性的方法已編碼在公眾可得到的計算機程序中。確定兩個序列之間相同性和相似性的優(yōu)選計算機程序包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，1990。BLASTX程序可以從NCBI及其他來源公開獲得(BLASTManual，Altschul，S等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul S等，1990)。還可以使用公知的Smith Waterman算法確定相同性。
例如，對于指定相同性百分比的氨基酸改變的數(shù)目可以這樣確定用多元序列中一個序列的氨基酸總數(shù)乘以各自的相同性百分比數(shù)值(除以100)，然后從所述多元序列的氨基酸總數(shù)中減去該結(jié)果，或者na≤xa-(xa·y)，其中na是改變的氨基酸數(shù)目，xa是多元序列中氨基酸的總數(shù)，y是例如對于70％而言為0.70，80％為0.80，85％為0.85等等，其中xa和y的任何非整數(shù)結(jié)果在從xa減去它之前，向下舍入最接近的整數(shù)。
修飾和改變可以發(fā)生在SHP或FXR的結(jié)構(gòu)中，但該化合物可以保留SHP或者FXR的活性。例如，序列中的某些氨基酸可以被其它氨基酸取代，而不帶來活性和/或抗原性的極大損失。因為是多肽的相互作用能力和特性限定了多肽的生物學(xué)功能活性，所以可以在多肽序列(或其所依據(jù)的DNA編碼序列)中進行某些氨基酸序列取代，而仍然獲得具有類似特性的多肽。
本發(fā)明因而包括任何可以是生物學(xué)等同物的分離多肽，其提供實質(zhì)上相同的活性，如同本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的那樣。反應(yīng)性如同本文描述。
本發(fā)明應(yīng)用包括SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的多肽的變異體多肽。本文所用術(shù)語“變異體”，包括不同于參考多肽、但保留基本特性的多肽。通常，差異是有所限制的，這樣參考的多肽序列和變異體整體上十分類似，并在許多區(qū)域中相同(即，生物學(xué)等同物)。變異體和參考多肽可以在氨基酸序列上不同，可以有任何組合的一個或多個取代、加入或缺失。取代或插入的氨基酸殘基可能由該遺傳密碼編碼，也可能不由該遺傳密碼編碼。多肽的變異體可以是天然存在的，例如等位變異體，或者它也可能是非天然的變異體。非天然存在的多肽變異體可以直接合成制備或通過誘變技術(shù)制備。
在這種改變的制備過程中，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。在賦予多肽的交互生物學(xué)功能中氨基酸親水指數(shù)的重要性通常為本領(lǐng)域所理解(Kyte & Doolittle，1982)。眾所周知某些氨基酸可以被其它的具有類似的親水指數(shù)或分?jǐn)?shù)的氨基酸取代，而仍然產(chǎn)生具有類似生物活性的多肽。各氨基酸已經(jīng)根據(jù)其疏水性和電荷特性而被指定了親水指數(shù)。那些指數(shù)如下被列在各氨基酸之后的括號內(nèi)異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸殘基的相對親水特性決定著所獲多肽的二級和三級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)反過來限定著多肽與其他分子的相互作用，例如酶、底物、受體、抗體、抗原等等。本領(lǐng)域眾所周知一個氨基酸可以被具有類似親水指數(shù)的另一氨基酸取代，并仍然獲得功能等同的多肽。這種改變中，優(yōu)選取代親水指數(shù)在+/-2范圍之內(nèi)的氨基酸，特別優(yōu)選+/-1，更特別優(yōu)選+/-0.5范圍之內(nèi)的氨基酸。
類似氨基酸的取代還可以在親水性的基礎(chǔ)上進行，特別是當(dāng)所述生物學(xué)功能等同的多肽或由此產(chǎn)生的肽被計劃用于免疫學(xué)應(yīng)用時。并入本文作為參考的US4,554,101說明了多肽的最大局部平均親水性，其取決于它的相鄰氨基酸的親水性，與其免疫原性和抗原性有關(guān)，即與多肽的生物學(xué)性質(zhì)有關(guān)。
如同在US4,554,101中所述，氨基酸殘基已被指定了下列親水性數(shù)值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.01)；谷氨酸(+3.01)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.51)；蘇氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。很清楚一種氨基酸可以被具有類似親水性數(shù)值的另一氨基酸取代并仍然獲得一種生物學(xué)同等物，特別是免疫學(xué)等同物多肽。在這種改變中，優(yōu)選取代親水性數(shù)值為±2，特別優(yōu)選±1，更特別優(yōu)選±0.5之內(nèi)的氨基酸。
如上所列，因此氨基酸通常根據(jù)氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性而被取代，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等等?？紤]到上述各種特征而進行的示范性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。如下面表XIII所示，合適的氨基酸取代包括如下
表I原始殘基 示范性殘基取代
多肽的生物學(xué)或功能等同物還可以如同本發(fā)明實施例所應(yīng)用的利用定點突變來制備。定點突變是適用于通過特異性突變其編碼DNA來制備源自該序列的第二代多肽或生物學(xué)、功能等同多肽的技術(shù)。如上所述，這種改變可以滿足要進行氨基酸取代的位點的需要。該技術(shù)還提供一種簡便的能力用于制備并檢驗變異體序列，例如考慮到上述一種或多種情況，在DNA中引入一個或多個核苷酸序列改變。通過使用編碼期望突變DNA序列的特異性寡核苷酸序列以及足夠的臨近核苷酸，提供足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，以在缺失連接的兩個鏈上都橫貫形成穩(wěn)定的雙鏈，定點突變就可以產(chǎn)生突變體。一般地，優(yōu)選約17到25個核苷酸長度的引物，其中在序列連接的兩條鏈上約5到10個殘基被改變。
通常，定點突變技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。可以理解，該技術(shù)一般使用可以以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。一般地，定點突變這樣獲得首先取得單鏈載體，該載體的序列中包含編碼全部或部分被選SHP多肽序列的DNA序列。例如通過公知的技術(shù)(如合成)制備含有期望突變序列的寡核苷酸引物。然后該引物與單鏈載體退火，利用酶進行延伸，例如E.coli聚合酶I Klenow片段，以便完成含突變鏈的合成。這樣，形成了異源雙鏈，其中一條鏈編碼原始的非突變序列，而第二條鏈含有期望的突變。然后將該異源雙鏈載體用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募毎?，例如E.coli細胞，并篩選包括含有突變的重組載體的克隆。市場上可買到的試劑盒提供了必要的試劑。
該多肽可以方便地切割為片段，用于進一步的結(jié)構(gòu)或功能分析，或用于產(chǎn)生藥劑。這可通過用肽酶，處理純化的或未純化的多肽而實現(xiàn)。用CNBr處理是另一方法，通過該方法可以從天然SHP或FXR多肽產(chǎn)生肽片段。重組技術(shù)還可用于產(chǎn)生SHP或FXR多肽的特異性片段。
該多肽可以是“成熟”或“不成熟”蛋白質(zhì)的形式或者可以是更大蛋白質(zhì)的一部分，例如融合蛋白質(zhì)或中間體。該多肽可以包含附加的氨基酸序列，該序列含有例如分泌或前導(dǎo)序列、前序列、幫助純化的序列，例如多組氨酸殘基，或者在重組形成期間維持穩(wěn)定性的附加序列。
該發(fā)明還包括該多肽的片段。片段是具有與氨基酸序列的一部分(而不是全部)完全相同的氨基酸序列的多肽。該片段可以含有，例如氨基酸序列中至少7個或更多個(如8、10、12、14、16、18、20或更多)的連續(xù)氨基酸。片段可以是“獨立的”或包含在更大的多肽內(nèi)，在該多肽中它們構(gòu)成了一部分或區(qū)域，最優(yōu)選是單個連續(xù)的區(qū)域。在一個實施例中，該片段包含成熟多肽序列的至少一個表位。
該方法所用的鑒定SHP活性抑制劑的多肽可以通過任何合適的方式制備。這種多肽包括天然存在的多肽、重組產(chǎn)生的多肽、合成制備的多肽以及這些方法組合而產(chǎn)生的多肽。用于制備這種多肽的方法是本領(lǐng)域公知的。
多核苷酸本發(fā)明還提供含有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸，以及與其緊密相關(guān)的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明實施例，該多核苷酸可以用于例如在細胞系中表達SHP或報告基因。
例如，非限制性地，本發(fā)明的多核苷酸可含有分離的CYP7A1或CYP8B1啟動子。下列是兩個用于本發(fā)明實施例的啟動子。
人CYP7A1啟動子序列(SEQ ID NO5)tctagaggatgcacttatgtagaatactctcttgaggatgttaggtgagtaacatgttactatatgtagtaaaatatctatgattttataaaagcactgaaacatgaagcagcagaaatgtttttcccagttctctttcctctgaacttgatcaccgtctctctggcaaagcacctaaattaattcttctttaaaagttaacaagaccaaattataagcttgatgaataactcattcttatctttctttaaatgattatagtttatgtatttattagctatgcccatcttaaacaggtttatttgttctttttacacataccaaactcttaatattagctgttgtccccaggtccgaatgttaagtcaacatatatttgagagaacttcaacttatcaagtattgcaggtctctgattgctttggaaccacttctgatacctgtggacttagttcaaggccagttactaccacttttttttttctaatagaatgaacaaatggctaattgtttgctttgtcaaccaagctcaagttaatggatctggatactatgtatataaaaagcctagcttgagtctcttttcagtggcatccttccctttctaatcagagattttcttcctcagagattttggcctagatttgcaaaatgatgaccacatctttgatttgggggattgctatagcagcatgctgttgtctatggcttattcttggaattaggagaaggtaagta人CYP8B1啟動子序列(SEQ ID NO6)
ccaattcgcccttggaggtaggagcagacatgacttcaacaaggtcatgcccccttggcaagcatctttgagaccagagaggaagacagactagggaaagaatgaggagataagcacgggctgctgtgaggtccaggggagcaggcaaaggtaagagaaaaggctttaggatactaactaacatatatggagcactagcatgagccaggcactattctaagtgcttttcaggtgttatctctttttgcctcac ggacagcacctacaaggcactgtaattatccctacttcacagatgagggagtggagccacagtgaggttaacttacttgaccaagggggccaagtaggaatggaggcatttgttgagtcttctaaagatgaggaaagagtggaagtgagattttgtaagtgcttgattcatttctaccaactgaactggcaaataaataaaagcatgagtaaatgggggtataaatagtctgtcagctatgggggtgggagtgggctcaaggcaggcttagagagaaggtgcaagagctgtctgaaaaggtcagagcaaagcatgaagctggtgagcagctgtgaccatagctggaagcttctctctgagctttctcctggttacctcctcctcccctacgtgaccagtcagccaagtgttaagtccaggggaacattttgctgcttccaagtactgtctcactagtgttatttgccataacttgcggccacagggcaaggtccaggtgctcagacctttacatcctggactttccaaggcctcccaaagctctctggcacccagggaacagtgtgcgtgtcgagagagggccggg根據(jù)本發(fā)明的實施例，CYP8B1啟動子含有相對于人CYP8B1轉(zhuǎn)錄起始位點-514到+303核苷酸的序列。人CYP8B1-514到+303的核苷酸序列(SEQ ID NO7)如下1 ggaggtagga gcagacatga cttcaacaag gtcatgcccc cttggcaagc atctttgaga ccagagaggaagacagacta61 gggaaagaat gaggagataa gcacgggctg ctgtgaggtc caggggagca ggcaaaggta agagaaaaggctttaggata121 ctaactaaca tatatggagc actagcatga gccaggcact attctaagtg cttttcaggt gttatctctt tttgcctcac181 ggacagcacc tacaaggcac tgtaattatc cctacttcac agatgaggga gtggagccac agtgaggtta acttacttga241 ccaagggggc caagtaggaa tggaggcatt tgttgagtct tctaaagatg aggaaagagt ggaagtgaga ttttgtaagt301 gcttgattca tttctaccaa ctgaactggc aaataaataa aagcatgagt aaatgggggt ataaatagtc tgtcagctat361 gggggtggga gtgggctcaa ggcaggctta gagagaaggt gcaagagctg tctgaaaagg tcagagcaaagcatgaagct421 ggtgagcagc tgtgaccata gctggaagct tctctctgag ctttctcctg gttacctcct cctcccctac gtgaccagtc481 agccaagtgt taagtccagg ggaacatttt gctgcttcca agtactgtct cactagtgtt atttgccata acttgcggcc541 acagggcaag gtccaggtgc tcagaccttt acatcctgga ctttccaagg cctcccaaag ctctctggca cccagggaac601 agtgtgcgt gtcgag此外，該多核苷酸可以含有編碼可檢測物質(zhì)的基因(本文指可檢測物質(zhì)基因)。例如，非限制性地，該可檢測物質(zhì)基因可以包括螢光蟲熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、分泌的堿性磷酸酶基因、renilla熒光素酶基因或其組合。優(yōu)選該可檢測物質(zhì)基因是螢光蟲熒光素酶基因。根據(jù)本發(fā)明實施例，將含有CYP7A1或CYP8B1啟動子(例如，含有相對于人CYP8B1轉(zhuǎn)錄起始位點第-514到+303位核苷酸序列的CYP8B1啟動子核苷酸序列)和可檢測物質(zhì)基因的核苷酸序列克隆到例如質(zhì)粒或腺病毒的載體中，用于形成構(gòu)建體，例如，非限制性地，CYP8B1啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子。CYP8B1啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子可用來感染或轉(zhuǎn)染細胞系，這樣當(dāng)CYP8B1啟動子被活化時，細胞系會表達可檢測物質(zhì)。
本發(fā)明的核苷酸可以包括啟動子或SHP和/或FXR編碼基因。該啟動子或基因可以克隆到含有NF-κB啟動子和可檢測物質(zhì)基因的載體中。
根據(jù)本發(fā)明實施例，SHP啟動子被克隆到載體中。優(yōu)選，該SHP啟動子具有下列核酸序列人SHP啟動子序列(SEQ ID NO8)cacaagctctgagaatctcaggctctggctgtgcaattgggccagtgggtccagggaaacaaacaaggactttggagtcaggcaagatctgggctttgtcttcctggtgggatgaccttgggcaagtcactttagcttttttagtctcataaagtaagaatctagccttaggaagaggctgccaatattagagtgggaagtgcctgacacataataagtgcttagagaatggcaaccatatatatacatatatatatatatatatgtatgtatgtatgtgtatatatatatacacatatacatataaatatacatatacatatacatatacatatacatatatatttttttgagacaggatcttgctctgttgcccaggctggagagcagtggcatgatctcagctcactgtaacctctgcctcccagtttcgagtgattcttttgccttagcctctagagtagctgggactacaggcacatgccaccatgcccggctaatttttgtatttttagtagagacgggattttgccatgttggccaggctggtcttgaactcctgacctcaaatgatcccccttcctcagcctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccaccgtgcccggctggcaactatcttttattataattctgtgagttcttctcagcagacctggcctttcaggagtggtaggaatcaggctggggataaggattctgaaggaccttattcctgcagggggcccagaactggaatcagaggaggaggcctcctagattggacagtgggcaaagtcctcccagcccccagggtcctggctcccttccctgtagcctgcttctggctgacaacagaagcagggccccaaggttaggcaaacaagctagtgataaggcacttccaggttgggccttgcattcaaggcccacccagctctggggctggcttcctggcttagcaaaagccctagtcttttgtgcacacaagagcgggcaccaatggggacacctgctgattgtgcacctggggccttggtgccctggtacagcctgagttaatgaccttgtttatccacttgagtcatctgataaggggcagctgagtgagcggcaggtggccctgtgccctgcaccggccacttcattgactgaggtgatatcagtgccacgtggggttcccaatgccccctcccccaccacttccccaccattcctgccaggggcaatgtctgtgtgtttttttcaatgaacatgacttctggagtcaaggttgttgggccattccccccgttccactcactgggaatataaatagcacccacagcgcagaacacagagccagagagctggaagtgagagcagatccctaaccatgagcaccagccaaccagggg本發(fā)明的核苷酸可以包括編碼短異二聚體蛋白質(zhì)SHP的基因和/或編碼肝細胞核因子4α的基因(HNF4α)。編碼SHP和任選的HNF4α的基因可以克隆到含有CYP7A1或CYP8B1啟動子和可檢測物質(zhì)基因的載體中。非限制性地，該核苷酸可以克隆到單一載體或多元載體中。
本文所用術(shù)語“變異體”是不同于參考多核苷酸、但保留基本特性的多核苷酸。變異體核苷酸序列中的改變可以改變，或者不能改變由參考多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸的改變可能在參考序列編碼的多肽中導(dǎo)致氨基酸的取代、加入、缺失、融合和截短。多核苷酸的變異體可以是天然存在的，例如等位變異體，或者它也可能是非天然的變異體。非天然存在的多核苷酸變異體可以通過突變技術(shù)制備或通過直接合成制備。
本發(fā)明還包括能夠在減低的嚴(yán)格條件，更優(yōu)選嚴(yán)格條件，最優(yōu)選高度嚴(yán)格條件下與本文所述多核苷酸雜交的多核苷酸。嚴(yán)格條件的實例如下面嚴(yán)格條件的表格所示高度嚴(yán)格條件是例如至少與條件A-F同樣嚴(yán)格的條件；嚴(yán)格條件是例如至少與條件G-L同樣嚴(yán)格的條件；減低的嚴(yán)格條件是例如至少與條件M-R同樣嚴(yán)格的條件。
表II嚴(yán)格條件表格
bp1預(yù)期的雜交多核苷酸的雜交區(qū)域的雜交長度。當(dāng)多核苷酸雜交到一個未知序列的靶多核苷酸上時，雜交長度假定為雜交多核苷酸的長度。當(dāng)雜交上已知序列的多核苷酸時，雜交長度可以由多核苷酸序列的序列對比和鑒定到的區(qū)域或者區(qū)域的最佳序列的互補性來確定。
緩沖液H在雜交和洗滌緩沖液中SSPE(1xSSPE為0.15M NaCl，10mM NaH2PO4，和1.25mM EDTA，pH 7.4)可以被SSC取代(1xSSC為0.15M NaCl和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成15分鐘之后進行洗滌。
TB到TR預(yù)期長度小于50個堿基對的雜交的雜交溫度應(yīng)為5-10EC，小于雜交的解鏈溫度(Tm)，其中Tm根據(jù)下列公式確定。對于長度小于18個堿基對的雜交，Tm(EC)＝2(A的#+T堿基)+4(G的#+C堿基)。對于長度在18和49個堿基對之間的雜交，Tm(EC)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％ G+C)-(600/N)，其中N是雜交中堿基的數(shù)目，[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(1xSSC的[Na+]＝0.165M)。
多核苷酸雜交的嚴(yán)格條件的其它實例由Sambrook，J.，E.FFritsch和T Maniatis，提供1989，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，第9和11章，和Current Protocols in MolecularBiology，1995，F(xiàn).M.Ausubel等，編輯，Johnwiley & Sons，Inc，第2.10和6.3-6.4節(jié)，其并入本文作為參考。
本發(fā)明還提供與這些多核苷酸完全互補的多核苷酸，也提供反義序列。本發(fā)明的反義序列也稱為反義寡核苷酸，包括內(nèi)部產(chǎn)生以及外部施用的序列，其能阻斷編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達。本發(fā)明的反義序列含有例如約15-20個堿基對。該反義序列可以被設(shè)計為例如通過防止啟動子與未翻譯序列上游結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄，或者通過防止核糖體與編碼本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合從而防止其翻譯。
本發(fā)明的多核苷酸可通過許多途徑制備(如通過化學(xué)合成、來自DNA文庫、來自有機體本身)并可以采取各式各樣的形式(如單鏈、雙鏈、載體、探針、引物)。術(shù)語“多核苷酸”包括DNA和RNA，以及它們的類似物，例如含有改進的骨架的類似物。
當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸用于重組制備多肽時，該多核苷酸可以包含成熟多肽的編碼序列或其片段，就本身而言，成熟多肽或片段的編碼序列在閱讀框中帶有其它的編碼序列，例如導(dǎo)肽或分泌序列的編碼序列，前-、原-，或前原-蛋白質(zhì)序列，或其它的融合蛋白質(zhì)部分。例如，可將能促進融合多肽純化的標(biāo)記序列與該編碼序列相連接。該多核苷酸還可能含有不編碼的5′和3′序列，例如轉(zhuǎn)錄的未翻譯序列，拼接和多腺苷信號，核糖體結(jié)合位點和穩(wěn)定RNA的序列。
給藥的方法本發(fā)明包括給個體施用上述組合物的方法。患者可以是哺乳動物或鳥。優(yōu)選患者是人。以適當(dāng)?shù)膭┝繉⒔M合物的有效量施用于患者，以此引起期望的反應(yīng)。本文所用的“有效量”，意思指哺乳動物宿主(優(yōu)選人)以單一劑量方式，或以系列劑量部分的方式的給藥數(shù)量，該劑量足以至少引起接受治療的個體體系產(chǎn)生期望的反應(yīng)，例如，就動脈粥樣硬化來說，減低LDL膽固醇血清濃度水平的反應(yīng)。除在晚期階段用于維持保護的激發(fā)劑劑量外，可以通過單一劑量的免疫原性組合物給予保護，或可能需要施用若干劑量。
該用藥量可以隨個體的特定條件而定，例如年齡和重量。該數(shù)量可以通過本領(lǐng)域公知的常規(guī)試驗進行確定。
用于將本發(fā)明組合物施用于病人的各種劑型如上所述。本發(fā)明包括由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的任何適當(dāng)?shù)慕M合物施用劑型。
實施例下列實施例僅為說明性，并非是對本發(fā)明的限制。
實施例1-乙炔雌二醇抑制IL-1β誘導(dǎo)基因在小鼠肝中表達根據(jù)如下的觀察結(jié)果進行研究在女性絕經(jīng)期之前，心血管疾病的發(fā)生率極低，然而絕經(jīng)期之后急劇上升。大量的研究表明激素替代療法可以在絕經(jīng)后的女性中降低心血管疾病的發(fā)生率。雖然雌激素對脂類分布具有有益影響，但是脂類的變化只能部分地解釋發(fā)病率的降低。炎癥是動脈粥樣硬化過程的重要組成部分。為研究雌激素體內(nèi)抑制炎癥的能力，用賦形劑或乙炔雌二醇(EE)處理卵巢切除的雌性C57BL/6小鼠四天，然后用IL-1β處理1小時。肝RNA的基因芯片分析顯示IL-1β誘導(dǎo)了大約100個基因。EE的處理抑制了這些基因中大約三分之一基因的誘導(dǎo)作用。該作用是特異于基因活化的，因為EE并未改變基礎(chǔ)表達水平。在敲除ERα的小鼠中不存在EE對IL-1β基因誘導(dǎo)的抑制作用。EE處理還誘導(dǎo)了肝中許多基因的表達，包括前列腺素D合酶，已知其表達抑制NFκB的活性。然而，用染料木黃酮或雷洛昔芬處理可保持IL-1β基因誘導(dǎo)的抑制作用，但并不刺激前列腺素D合酶或其它基因的表達。這些結(jié)果表明ERα通過不需要經(jīng)典ER-介導(dǎo)的基因誘導(dǎo)的機制，可以體內(nèi)抑制IL-1β誘導(dǎo)的基因表達。
進行實驗用于評估IL-1β對小鼠肝中基因表達的調(diào)控。通過共5天內(nèi)皮下給藥玉米油/乙醇賦形劑或者100μg/kg/天的乙炔雌二醇(EE)，預(yù)處理去卵巢的C57BL/6小鼠。在第五天，給小鼠進行腹膜內(nèi)注射PBS或20μg/kg在PBS中的IL-1β。一個小時后，移出肝臟并制備polyA RNA。利用來自Affymetrix的小鼠11K基因芯片進行分析，確定總的基因表達。對于每個基因而言，將在接受了賦形劑預(yù)處理加上PBS的動物中的表達水平定義為1.0，從而相對于此定義在接受了賦形劑預(yù)處理±IL-1β或EE預(yù)處理±IL-1β的小鼠中的表達水平。顯示的結(jié)果是來自兩個獨立實驗的平均值。通過IL-1β處理，七十五個基因被可再生地誘導(dǎo)大于2倍。相反地，五個基因的表達受到IL-1β的抑制。
下面的表III提供了這些實驗的結(jié)果。
表III
參照圖1，提供了確定乙炔雌二醇是否阻斷IL-1β對基因表達調(diào)控的研究結(jié)果。針對每個基因的調(diào)控倍數(shù)，對接受載體預(yù)處理的動物(X軸)相對于接受EE預(yù)處理的動物(Y軸)進行繪圖。未受EE預(yù)處理影響的IL-1β誘導(dǎo)作用下的基因沿著用虛線表示的對角線分布。對大多數(shù)基因而言就是這種情況。但是，許多基因明顯位于低于該對角線的位置，表明EE抑制了對這些基因的誘導(dǎo)作用。例如，IL-1β對bcl-3，JAB，LIX和Fnk的誘導(dǎo)都由于EE預(yù)處理而減低(也參見表III)。一些基因(例如谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶)的表達在EE+IL-1β處理的小鼠中有所增強，這與已知的IL-1β和雌激素會增強谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶表達的能力相一致。相反地，EE預(yù)處理抑制IL-1β介導(dǎo)的對SHP和HES-1的抑制，其以明顯高于該對角線的這些點表示。
參照圖2，按下述檢驗在HepG2細胞中IL-1β對SHP表達的抑制作用。IL-1β通常與基因表達的抑制無關(guān)。為檢驗IL-1β介導(dǎo)的對SHP表達的直接抑制作用，用100U/ml的IL-1β處理HepG2細胞。在不同的時間制備總RNA，然后利用實時PCR分析SHP的表達。在IL-1β處理后3和6小時，SHP的表達顯著降低(*p＜0.05對時間0)。這不是由于細胞生存能力的全面下降，因為SHP mRNA水平在IL-1β處理后9小時就恢復(fù)到基線水平。
參照圖3a，3b和3c，研究了EE對Fnk、JAB和LIX的抑制作用是IL-1β誘導(dǎo)特異性的。兩種可能的機理可以引起EE對基因表達的明顯作用。首先，EE可能改變了基因表達的基礎(chǔ)水平，而不是影響IL-1β處理誘導(dǎo)的誘導(dǎo)倍數(shù)。備選地，EE可能沒有影響基礎(chǔ)的基因表達而可能特異地阻斷了IL-1β介導(dǎo)的基因誘導(dǎo)。
參照圖3a，為鑒別這兩種機理，在用載體(黑色柱)或100μg/kg/天的EE(灰色柱)預(yù)處理的動物中，定量IL-1β對Fnk、JAB、LIX和bcl-3的誘導(dǎo)倍數(shù)以及IL-1對SHP的抑制倍數(shù)。通過對來自每種動物個體的RNA進行實時PCR來測定各基因的肝臟RNA水平(平均數(shù)+/-SEM)。在EE預(yù)處理的動物中IL-1β對Fnk、JAB和LIX的誘導(dǎo)倍數(shù)(定義為接受IL-1β的動物中表達與接受PBS的動物中的表達的比率)，有所降低。與此相反，在載體和EE處理的動物中IL-1β對bcl-3和SHP的調(diào)控倍數(shù)相同。
參照圖3b，EE抑制了bcl-3的基礎(chǔ)表達并增強了SHP的基礎(chǔ)表達(比較EE的處理小鼠和載體處理的小鼠)。EE沒有影響IL-1β直接調(diào)控這些基因的能力IL-1對bcl-3的誘導(dǎo)在載體處理的小鼠中是6.2倍，在EE處理的小鼠中是5.2倍，而在載體處理的動物中IL-1將SHP的表達抑制了86％，在EE處理的動物中是85％。
參照圖4a、4b、4c、4d和4e，進行實驗測定EE是否會通過雌激素受體(ER)依賴性機理阻斷IL-1β對基因表達的誘導(dǎo)。雌激素能夠通過許多機理調(diào)控基因表達，包括ER獨立性途徑，如抗氧化劑機理。為檢驗ER介導(dǎo)了EE對IL-1β基因調(diào)控的調(diào)節(jié)，用載體+PBS(灰色柱)、載體+IL-1β(黑色柱)或100μg/kg/天的乙炔基雌二醇(EE)、1或10mg/kg/天的17β-雌二醇(分別為1E2和10E2)、30mg/kg/天的染料木黃酮、5mg/kd/天的雷洛昔芬，或10mg/kg/天的ICI182780處理小鼠。通過實時PCR測定Fnk、JAB、LIX、bcl-3和SHP的肝臟表達水平(平均數(shù)+/-SEM)。EE和E2對這些基因的調(diào)控具有最大影響(*p＜0.05對單獨的IL-1β)。染料木黃酮和SERM雷洛昔芬也顯示出類似的調(diào)控模式，雖然數(shù)值沒有EE和E2顯示的大。最后，純的ER拮抗劑ICI-182780沒有影響任何這些基因的表達。因此所有基因的調(diào)控似乎都是ER介導(dǎo)的。
參照圖5a、5b、5c、5d和5e，進行試驗以確定EE調(diào)控基因在肝臟表達的過程是否需要Erα。為了證實ERα或ERβ是否介導(dǎo)了EE對肝臟中IL-1β基因表達的作用，用載體(黑色柱)或10μg/kg/天的EE(灰色柱)預(yù)處理C57BL/6野生型小鼠、C57BL/6ERαKO小鼠，或129 ERβKO小鼠5天，然后用IL-1β處理1小時。通過實時PCR定量Fnk、JAB、LIX、bcl-3和SHP的肝臟表達水平(平均數(shù)+/-SEM)，其中將接受載體+PBS的動物中的表達定義為1.0。在野生型動物和缺乏ERβ的動物中，EE抑制IL-1β對所有這些基因的調(diào)控作用的圖形都很相似(*p＜0.05，對比載體和EE處理的動物之間基因表達的改變)。與此相反，在缺乏ERα的動物中EE沒有影響IL-1β對這些基因的調(diào)控。
參照表IV，研究了EE對小鼠肝中基因表達的誘導(dǎo)作用。EE調(diào)控IL-1β基因誘導(dǎo)作用的一個可能機理是通過對SHP，一種已知的轉(zhuǎn)錄抑制物的誘導(dǎo)。但是，雷洛昔芬能夠抑制IL-1β對Fnk、JAB、LIX和bcl-3的誘導(dǎo)，但是雷洛昔芬不能增加SHP的表達，因此從藥理學(xué)角度排除這種機理(圖4)。為測定EE對任何其它基因的誘導(dǎo)是否能夠解釋對IL-1β基因誘導(dǎo)的抑制作用，分析EE對基因表達誘導(dǎo)的基因芯片結(jié)果。已知由EE預(yù)處理誘導(dǎo)的許多基因是受EE調(diào)控的，包括環(huán)己六醇-1-磷酸鹽合酶(IPS)、腸三葉形因子，肌酸激酶和補體家族的成員。另外，前列腺素D2合酶受到EE處理的強烈誘導(dǎo)。體外前列腺素D合酶的過表達可通過阻斷IKK活性而抑制NFκB的活化，可能提供一種IL-1β基因誘導(dǎo)抑制作用的替代機理。
表IV
參照圖6a和6b，設(shè)計并完成實驗，確定基因表達的EE誘導(dǎo)并不是ERα對IL-1β基因誘導(dǎo)的抑制作用所需要的。為測定EE對前列腺素D合酶的誘導(dǎo)作用是否為ERα介導(dǎo)的IL-1β基因誘導(dǎo)的抑制作用所需要，測定用載體+PBS(灰色柱)，載體+IL-1β(黑色柱)或100μg/kg/天的EE、30mg/kg/天的染料木黃酮、5mg/kg/天的雷洛昔芬，或10mg/kg/天的ICI-182780+IL-1β處理的小鼠中前列腺素D合酶的肝臟表達水平。將載體+PBS處理小鼠中的表達水平定義為1.0。這些RNA樣品與在圖4中所用相同，其表明EE，染料木黃酮和雷洛昔芬的這些劑量都抑制了IL-1β的誘導(dǎo)作用。但是，這些化合物抑制IL-1β基因誘導(dǎo)作用的能力(EE＞染料木黃酮＞雷洛昔芬)和這些化合物刺激前列腺素D合酶表達的能力(EE＞雷洛昔芬＞染料木黃酮)之間不存在關(guān)聯(lián)。IPS的誘導(dǎo)作用中發(fā)現(xiàn)了類似的圖形，雷洛昔芬具有微弱的誘導(dǎo)作用而染料木黃酮沒有誘導(dǎo)作用。這表明通過ERα的基因誘導(dǎo)并不是其抑制IL-1β誘導(dǎo)基因表達的能力所必需的。
參照圖7a、7b、7c、7d和7e，檢驗在肺中是否存在EE對IL-1β基因誘導(dǎo)的抑制作用。肝臟中EE的活性需要ERα，這與肝臟中ERα幾乎專有性的存在相一致(如同實時PCR測定到的，A道)。與此相反，肺中表達相對低水平的ERα和高水平的ERβ。為測定ERβ是否還能夠調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)基因表達的能力，在肝、脾和肺中測定EE改變IL-1β誘導(dǎo)Fnk、JAB、LIX和bcl-3的能力。如前所述，在肝中IL-1β對這些基因的誘導(dǎo)被明顯阻斷。在脾中，IL-1β對Fnk和JAB的誘導(dǎo)也被EE預(yù)處理阻斷。脾表達ERα的水平明顯地低于肝臟，然而略高于肺中的表達。相比之下，EE預(yù)處理沒有影響肺中IL-1β對Fnk、JAB、LIX或bcl-3的誘導(dǎo)。雖然組織特異性因子能夠影響這些結(jié)果，但是肺中調(diào)控的缺乏與該假設(shè)相符ERβ不能介導(dǎo)這些作用，但可能實際上抑制ERα改變IL-1β誘導(dǎo)基因表達的能力。
參照圖8，評價ERa和ERα在HepG2細胞中對IL-1β誘導(dǎo)NF-κB活性的抑制作用。在肺中缺乏EE對IL-1β誘導(dǎo)Fnk、JAB、LIX和bcl-3表達的抑制作用可能是由于ERβ實質(zhì)上不能介導(dǎo)這種抑制作用，或者是由于肝臟，脾和肺之間的組織特異性差異。為測定ERβ直接抑制IL-1β信號的能力，用人ERα或ERβ表達質(zhì)粒以及NF-κB驅(qū)動的熒光素酶報告質(zhì)粒和β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)染調(diào)控質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞。轉(zhuǎn)染后用載體、10nM 17β-雌二醇或10nM 17β-雌二醇+1uM ICI182780處理該細胞。第二天用100Uml的IL-1β處理細胞6小時，測定熒光素酶的表達。ERα和ERβ都顯著地抑制IL-1β對熒光素酶活性的誘導(dǎo)作用(*p＜0.01)，雖然ERβ一致地比ERα的效力小。因此在肺中缺乏IL-1β基因誘導(dǎo)作用的EE調(diào)控似乎不是由于ERβ實質(zhì)上不能抑制IL-1β信號。而是在肺中缺乏調(diào)控可能反映了出ER抑制IL-1β信號所需的輔助蛋白質(zhì)中具有組織特異性表達的差異。
從這些實驗結(jié)果可以明顯地獲得以下結(jié)論(1)用IL-1β處理1小時可在小鼠肝臟中誘導(dǎo)75個基因的表達，并抑制5個基因的表達；(2)EE預(yù)處理能以ERα依賴性的方式抑制許多IL-1β的調(diào)控；(3)EE能夠通過改變基礎(chǔ)表達水平或者通過特異性地抑制基因誘導(dǎo)而調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)的基因表達；(4)ERα對基因表達的誘導(dǎo)并不是ERα阻斷IL-1β介導(dǎo)的基因調(diào)控的能力所必需的，以及(5)IL-1β對Fnk、JAB、LIX和bcl-3的誘導(dǎo)作用是在肝中而不是在具有高水平Erβ的肺中被抑制。這并非由于ERβ本質(zhì)上不能抑制IL-1β信號，而很可能反映了EE抑制IL-1β信號所必需的輔助因子中組織差異。
實施例2-調(diào)控SHP的表達按下述進行幾個實驗研究SHP表達的調(diào)控。參照圖9，研究了小鼠肝臟中ERα對SHP表達的調(diào)控。通過六星期皮下注射載體、10μg/kg/天的E2、10μg/kg/天的E2+5mg/kg/天的ICI182780、5mg/kg/天的他莫昔芬或者5mg/kg/天的PPT，處理卵巢切除的野生型ErαERβ雙敲除的ERαKO或ERβKO小鼠。通過實時PCR監(jiān)測SHP的肝臟表達，用GAPDH的表達進行校正。在WT動物中，E2、他莫昔芬和ERα的選擇性拮抗劑PPT都誘導(dǎo)了SHP的mRNA水平。ICI182780則抑制這種誘導(dǎo)。E2不能誘導(dǎo)SHP在ERαKO或ERβKO小鼠中表達。在ERβKO小鼠中，SHP的基礎(chǔ)表達增強，但E2仍然誘導(dǎo)了SHP的表達。同時，這些結(jié)果表明在小鼠肝臟中雌激素對SHP的誘導(dǎo)主要是由ERα介導(dǎo)的。
如圖10所示，進行研究測定在大鼠肝臟中雌激素是否調(diào)控SHP。用載體、10μg/kg/天的E2或者5mg/kg/天的PPT處理卵巢切除的Sprague-Dawley大鼠六星期。通過實時PCR監(jiān)測SHP的肝臟表達，用GAPDH表達進行校正。E2和PPT都顯著地誘導(dǎo)SHP表達，表明ERα還能在大鼠肝臟中誘導(dǎo)SHP。
參照圖11a和11b，檢驗了人類細胞中ERα對hSHP啟動子活性的調(diào)控。用對照SV40驅(qū)動的β-半乳糖苷酶質(zhì)粒、1.4kb的人SHP啟動子驅(qū)動的熒光素酶質(zhì)粒，和編碼人ERα或不編碼蛋白質(zhì)的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人HepG2或293細胞。轉(zhuǎn)染后第一天，用DMSO載體或10nM的E2處理細胞24小時。然后分析細胞提取物的熒光素酶活性，β-半乳糖苷酶活性進行校正。E2僅在表達ERα的細胞中誘導(dǎo)SHP啟動子活性。這些結(jié)果表明E2可能在人肝臟中調(diào)控SHP的表達。
參照圖12a、12b和12c，檢驗了在293細胞中ERα對hSHP啟動子活性的調(diào)控作用。參照圖12a和12b，用對照SV40驅(qū)動的β-半乳糖苷酶質(zhì)粒、1.4kb的人SHP啟動子或合成的2xERE/TK啟動子驅(qū)動的熒光素酶質(zhì)粒以及人Erα的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2或293細胞。第二天用1uM指定的化合物(ICI182780、4-羥基他莫昔芬或雷洛昔芬)加上DMSO載體(-)或10nM的E2(+)處理細胞24小時。然后分析細胞提取物的熒光素酶活性，用β-半乳糖苷酶活性進行校正。如在小鼠中所示，E2和他莫昔芬都可促進SHP啟動子的活性。ICI和雷洛昔芬單獨是無活性的，并可拮抗E2活性。SHP啟動子與ERE驅(qū)動啟動子有很大的差別，表明E2對SHP啟動子活性的調(diào)控可能不是通過經(jīng)典的雌激素反應(yīng)元件起作用。
參照圖12c，提供了E2誘導(dǎo)SHP和2xERE啟動子活性的劑量反應(yīng)曲線。誘導(dǎo)SHP啟動子活性所需的E2濃度比SHP啟動子活性大約高10倍。由于SHP是ER活性的負調(diào)節(jié)物，當(dāng)E2水平達到高數(shù)量時，SHP啟動子活化作用所需要的高EC50可能反映僅引起該負反饋環(huán)的方式。
參照圖13，研究繪制在293細胞中E2反應(yīng)元件的圖譜。用ERα表達質(zhì)粒和β-半乳糖苷酶對照質(zhì)粒將一系列SHP啟動子截短報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293細胞中。用載體或者10nM的E2處理2 4小時之后，測定校正的熒光素酶活性。將1460bp SHP啟動子在載體處理過的細胞中的表達定義為1.0。影響293細胞中基礎(chǔ)表達的元件被定位在-795和-549之間，而E2調(diào)控定位在-1460和-1260之間。
參照圖14a、14b和14c，進行研究測定ER對SHP的誘導(dǎo)是否未能抑制CYP7A1和CYP8B1。用對照餌料(-)或含有膽酸鹽的餌料(+)飼養(yǎng)卵巢切除的小鼠，并通過每日皮下注射載體(-)或10μg/kg/天的乙炔雌二醇(+)處理5星期或者5天。研究的最后通過實時PCR測定SHP、CYP7A1和CYP8B的肝臟rmRNA水平，用GAPDH的表達校正。處理5天或5星期時EE誘導(dǎo)的SHP表達略低于膽酸鹽進行的誘導(dǎo)。但是，在任一時間點上EE處理沒有顯著地改變CYP7A1或CYP8B1的表達，相比之下膽酸鹽對CYP7A1或CYP8B1的表達則抑制了95％以上。這些結(jié)果表明簡單的誘導(dǎo)SHP表達還不足以有力地抑制CYP7A1或CYP8B1。
參照圖15，進行實驗檢查膽酸鹽對CYP7A1和CYP8B1的抑制是否需要SHP誘導(dǎo)。用升高濃度的膽酸鹽飼養(yǎng)卵巢切除的小鼠5天。研究的最后通過實時PCR測定SHP、CYP7A1和CYP8B的肝臟mRNA水平，用GAPDH的表達校正。只有餌料中有0.03％的膽酸鹽才會發(fā)生對CYP7A1和CYP8B1的顯著抑制作用，而到向餌料中加入0.3％的膽酸鹽之前SHP的mRNA水平?jīng)]有發(fā)生顯著提升直。SHP誘導(dǎo)所需的膽酸鹽水平比CYP7A1和CYP8B1抑制所需的高出10倍，再一次表明SHP表達的誘導(dǎo)并非是膽酸鹽調(diào)控CYP7A1和CYP8B1表達的基礎(chǔ)機理。
實施例3-瞬時轉(zhuǎn)染用于鑒定在膽固醇生物合成途徑中抑制SHP的化合物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增從基因組DNA中分離CYP8B1啟動子(相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的-514到+303的核苷酸序列)。使用TOPO TA克隆試劑盒(InVitrogen)將所獲的PCR產(chǎn)物TOPO克隆到質(zhì)粒pCR2.1中(獲自InVitrogen，Carlsbad，California)。證實了正確的序列之后，通過EcoRI消化移出CYP8B1啟動子。利用T4 DNA聚合酶將所獲DNA片段的末端處理成平末端。然后將該片段連接到SmaI消化的pRL-null中(獲自Promega Madison，Wisconsin)，形成pCYP8B1-RL，其具有由人CYP8B1啟動子驅(qū)動的renilla熒光素酶報告基因。通過類似的標(biāo)準(zhǔn)分子方法將人HNF-4和SHP編碼區(qū)域克隆到SV40-啟動子表達載體pSI中(Promega)。
然后在HepG2細胞中共轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒。將HepG2庫存細胞維持在DMEM高葡萄糖，10％ FBS，酚紅培養(yǎng)基(Invitrogen，GIBCO Cat No11995-065)中。為進行轉(zhuǎn)染，細胞在由不含酚紅的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基(Invitrogen，GIBCO Cat.No.31053-028)、10％活性炭脫色的FBS(HyClone，Logan，Utah，Cat.No.SH30068.03)組成的試驗培養(yǎng)基中，以每孔1×105個細胞的濃度，接種劑12孔板上。第二天，以Tfx-20對DNA為2∶1的比率，將轉(zhuǎn)染試劑Tfx-20(Promega；E2391)與0.5μg pCYP8B-RL，0.4μg pSI-HNF4和在不含血清和酚紅的DMEM/F12(Invitrogen，GIBCO Cat No 11039-021)中的最多1μg的pSI-SHP混合，并在室溫下孵育10分鐘。用不含血清的DMEM/F12洗滌細胞一次并吸出培養(yǎng)基。加入Tfx-20/DNA混合物，在37℃孵育細胞1小時。孵育末期加入分析培養(yǎng)基，進一步孵育細胞23-48小時。去除分析培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞。去除清洗液，加入250μl的lx Renilla裂解緩沖液(Promega；E2810)。將平板在搖床上放置15分鐘。將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)入微離心管，離心30秒澄清。將20μl等分試樣轉(zhuǎn)入顯微熒光板(ThermoLab系統(tǒng))。每次向一個孔中注射100μlRenilla分析試劑，在Dynex MLX微量滴定板光度計中以超過30秒的間隔讀數(shù)。
參照圖16，在圖中表明了所獲的熒光素酶活性。加入的SHP表達質(zhì)粒以劑量依賴性方式抑制了由CYP8B1啟動子活性誘導(dǎo)的HNF-4表達。
為測定測試化合物是否能夠抑制SHP活性，轉(zhuǎn)染后將測試化合物加入分析培養(yǎng)基。熒光素酶活性會由于SHP拮抗劑的存在而增加。
上述方法的替代實施方案是利用標(biāo)準(zhǔn)的可選擇標(biāo)記，包括新霉素、潮霉素或嘌呤霉素，用pCYPBB 1-RL、pSI-HNF4和pSI-SHP質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染細胞。
實施例4-腺病毒感染用于鑒定在膽固醇生物合成途徑中抑制SHP的化合物利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如ADEASY系統(tǒng)(獲自QbioGene，Carlsbad，California)中所述，構(gòu)建含有驅(qū)動報告基因(例如螢光蟲熒光素酶，renilla熒光素酶或β-半乳糖苷酶)表達的人CYP8B1啟動子區(qū)域的報告腺病毒。首先將CYP8B1啟動子報告構(gòu)建體克隆到轉(zhuǎn)移載體pShuttle或pQBI-AdBN中。用Pme I線性化所獲質(zhì)粒并與病毒質(zhì)粒pAdEasy-1一起共同轉(zhuǎn)化到E coli菌株BJ5183中。用卡那霉素選擇重組體并通過PCR或限制酶分析篩選。
然后將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5a中，并用常規(guī)方法如Qiagen Maxi試劑盒純化轉(zhuǎn)染質(zhì)量的DNA。用Pac I消化重組的腺病毒構(gòu)建體，用于暴露其ITR(反轉(zhuǎn)的末端重復(fù))，并轉(zhuǎn)染到QBI-293A細胞中，產(chǎn)生病毒顆粒。用標(biāo)準(zhǔn)方法擴增所獲的噬菌斑。用諸如氯化銫梯度的方法純化最終擴增的腺病毒后，使用293細胞滴定最終的腺病毒原液。類似地制備表達HNF-4和/或SHP的腺病毒，除了替換轉(zhuǎn)移載體之外，例如可以使用pShuttle-CMV。
替代性實施方案是使用已知對HNF-4a起反應(yīng)的任何其它啟動子(參照Naiki等，JBC 27714011，2002，將這種基因的列表并入作為參考)來驅(qū)動報告基因的表達。
上述方法的另一替代實施例是使用單個腺病毒來表達HNF-4和SHP。在該情況下，使用轉(zhuǎn)移載體pQBI-AdCMV5-IRES-GFP。SHP cDNA被克隆到CMV5啟動子的下游。用HNF-4a基因替換GFP基因。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實現(xiàn)這些步驟，如限制性內(nèi)切酶酶切片段重組或更優(yōu)選地使用重疊PCR。所獲的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒含有CMV啟動子，其后為SHP cDNA，SHP cDNA之后是內(nèi)部核糖體進入片段(IRES)，該片段后任選的是HNF-4 cDNA。其它啟動子可用于替換CMV啟動子，例如pQBI-AdBM5-PAG轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的主要晚期啟動學(xué)(MLP)。該優(yōu)選方法確保了SHP可以在所有表達HNF-4的細胞中表達。
另一個替代實施例是結(jié)合使用表達CPF(LRH-1)的腺病毒和含有驅(qū)動該報告基因表達的人CYP7A1啟動子區(qū)域的報告腺病毒。
一旦完成了腺病毒載體，它們可用于感染人細胞，最優(yōu)選人肝癌HepG2細胞。37℃下在培養(yǎng)基中使細胞與腺病毒接觸，一般為5小時。然后洗滌細胞，用帶腺病毒的新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)。使用每種病毒的各種MOIs的共感染，通過矩陣分析確定報告質(zhì)粒和HNF-4表達質(zhì)粒的適合感染復(fù)數(shù)。類似地，測定表達SHP的腺病毒的最佳MOI。因此在最后的試驗中，用x MOI的CYP8B1-報告腺病毒，y MOI的HNF-4表達腺病毒和z MOI的SHP表達腺病毒感染細胞。感染后用載體或測試化合物處理細胞。測試化合物通常溶于DMSO，并加入培養(yǎng)基中，達到大約10μM的終濃度。24到48小時后，測量報告活性的表達。例如，可通過許多方法監(jiān)測熒光素酶活性，包括LUC-SCREEN螢火蟲螢光毒酶報告基因分析系統(tǒng)(獲自Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California)，或通過裂解細胞然后應(yīng)用螢光毒酶分析系統(tǒng)(Promega)監(jiān)測。能夠增強熒光素酶活性的化合物可以當(dāng)作SHP的抑制劑。
為證實測試化合物可作為SHP的抑制劑，用x MOI的CYP8B1-報告腺病毒，y MOI的HNF-4表達腺病毒感染HepG2細胞。然后用載體或測試化合物處理細胞。如上所述監(jiān)測熒光素酶活性。在沒有SHP的這些細胞中SHP抑制劑將不會改變熒光素酶活性。
實施例5-膽酸鹽介導(dǎo)對炎癥基因表達的誘導(dǎo)作用將卵巢切除的C57BL/6小鼠(16-20g)(Taconic)分成8組。恢復(fù)5-7天后，用以酪蛋白為基礎(chǔ)的餌料(#8117，Test Diet，Richmond，IN)飼養(yǎng)小鼠五天。將酪蛋白餌料磨成粉末并通過混合補充以提高濃度的膽酸(CA；C-1129，Sigma，St Louis，MO)或7-二羥膽烷酸(UDCA；U-5127，Sigma，St Louis，MO)。實驗?zāi)┢谑占闻K進行RNA分析。
RNA分析使用Trizol試劑(BRL)制備肝臟總RNA，并利用ABI PRISM 7700檢測系統(tǒng)，根據(jù)該廠家的方案(Applied Biosystem)通過實時RT-PCR定量。利用序列檢測v1.7軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)，并利用Applied Biosystems引物組，根據(jù)GAPDH進行校正。
細胞實驗在37℃下，5％ CO2保溫箱中將HepG2細胞維持在生長培養(yǎng)基中。在6孔板中(Falcon)以5×105個細胞每孔的濃度將細胞接種在缺陷生長培養(yǎng)基中(不含酚紅的DMEM(Gibco BRL)，其中補充有熱失活的10％ FBS、1％ Glutamax、1％ MEM非必需氨基酸、100U/mi青霉素和100μg/ml鏈霉素)。然后在加入化合物24小時之前，把細胞放入血清缺陷培養(yǎng)基內(nèi)額外24小時。然后收集細胞進行RNA分析。
結(jié)果以前已顯示含膽酸鹽的高脂飲食飼養(yǎng)C57BL/6小鼠3-5星期后可誘導(dǎo)小鼠肝炎癥基因中的表達(Liao等，‘93 JCI 912572，Evans等01 Circ Res 89823 & Miyake等‘00 JBC 27521805)。為測定在介導(dǎo)這些誘導(dǎo)過程中膽酸鹽的相對作用，用補充有增大濃度的CA(0.01-1.0％)的固體餌料飼養(yǎng)C57BL/6小鼠5天。如圖1A所示，觀察到對TNFα(4倍)、VCAM-1(3倍)和RANTES(1.75倍)的肝臟水平有劑量依賴性誘導(dǎo)作用。正如所料，還觀察到對7α-羥化酶(cyp7a)有劑量依賴性抑制作用。
這些結(jié)果表明膽汁酸的急性處理足以在缺乏氧化壓力的情況下促進炎癥基因表達，所述氧化壓力是由在更多慢性研究中的高脂飲食或與升高的膽汁酸作用水平有關(guān)的潛在毒性所引起的。在體內(nèi)，CA在腸中被轉(zhuǎn)化為脫氧膽酸，已表明其可選擇性地與FXR相互作用(Wang′99Mol Cell3543 & Makishima 99 Science 2841362)，而更為親水性的膽汁酸，例如UDCA則通過與孕烷X受體(PXR)而非FXR結(jié)合(Heuman‘89 JLR 301161)來發(fā)揮功能。為測定通過FXR的信號是否是引起炎癥基因表達所必需的主要機理，將1％ UDCA補充到固體餌料中，膽汁酸通過結(jié)合FXR的信號是膽汁酸的一個主要機理。如圖1B所示，沒有觀察到炎癥基因表達的誘導(dǎo)作用，而UDCA處理則抑制了cyp7a表達，誘導(dǎo)的cyp3a表達與其通過PXR結(jié)合發(fā)揮作用的能力相一致。
另外，SHP表達的誘導(dǎo)作用同樣僅在CA而非UDCA(圖1C)中觀察到，證實在CA信號中需要FXR。
實施例6-對SHP和RJP140的FXR特異性膽汁酸誘導(dǎo)作用為進一步地研究通過FXR的膽汁酸信號能夠促進炎癥基因表達的可能性，在肝細胞系HepG2中進行實驗。用增加濃度的鵝膽酸(CDCA)(1-100uM)或選擇性合成的FXR配體GW 4064(1-1000nM)處理HepG2細胞24小時。由于CDCA比CA能更加有效地抑制cyp7a在HepG2細胞中表達(Makishima等‘99 Science 2841362)，所以在實驗中使用CDCA。HepG2細胞能組成型地表達大量炎癥基因，包括ICAM-1和M-CSF(Stonans等‘99 Cytokine 11151)。CDCA或GW 4064處理能夠以劑量依賴性方式誘導(dǎo)ICAM-1和M-CSF表達。如同陽性對照，證實了SHP mRNA的誘導(dǎo)作用和cyp7a的抑制作用。這些結(jié)果表明選擇性地通過CDCA或GW 4064進行的FXR活化作用能夠引起炎癥基因的誘導(dǎo)作用。
參照圖19、20a和20b，說明了CDCA和GW 4064在HepG2細胞中的相對表達。
這些實驗表明FXR在促進炎癥基因表達中的新功能。以前已表明含膽汁酸的高脂飲食能夠在3-5星期后在小鼠肝臟中引起炎癥基因的誘導(dǎo)作用(Liao等93 JCI 912572 & Evans等‘01 Circ Res 89823)。但是，認(rèn)為這些誘導(dǎo)作用是通過氧化壓力發(fā)生的，該壓力由高脂飲食結(jié)合膽汁酸引起，這些誘導(dǎo)作用可以反映肝臟的毒性(Delzenne等92 Toxicity Letters 61291)。為避免這些可能的混淆問題，在固體飼養(yǎng)小鼠中用急性膽汁酸處理進行研究。結(jié)果表明補充0.3％的CA足以誘導(dǎo)炎癥基因表達。CA的這個濃度還明顯抑制cyp7a基因，證實預(yù)期的FXR生物活性介導(dǎo)基因調(diào)控。當(dāng)向固體飼料中補充更加親水性的膽汁酸，UDCA時，沒有觀察到炎癥基因表達的誘導(dǎo)作用，但是仍然觀察到了cyp7a的抑制作用。認(rèn)為這是由于UDCA具有與PXR結(jié)合的能力(Schuetz等，‘01 JBC 27639411)。與此一致的是cyp3a活性的誘導(dǎo)作用，其是一種良好表征的PXR調(diào)控基因。這些結(jié)果表明FXR而非PXR的配體能夠誘導(dǎo)炎癥基因在肝臟中表達。這些結(jié)論得到HepG2細胞實驗的支持，該實驗中在存在膽汁酸CDCA或合成的FXR配體GW 4064的情況下，還觀察到了ICAM-1和M-CSF的炎癥基因誘導(dǎo)作用。以前GW 4064被表征為FXR的特異性配體(Goodwin等‘00 Mol Cell 6517)，EC50為90nM，與ICAM-誘導(dǎo)觀察到的差不多。
由于SHP表達能夠被膽汁酸或與FXR結(jié)合的GW 4064所誘導(dǎo)(Goodwin‘00 Mol Cell 6517 & Sinal′00 Cell 102731)，因此還監(jiān)測了SHP的mRNA水平。我們證實只有FXR配體CDCA和GW4064能夠誘導(dǎo)SHP表達，PXR配體UDCA則不能。最近，已經(jīng)證明SHP為一種NIP-KB的體外共活化劑(Kim‘01 JBC)。NIP-KB是與炎癥基因表達有關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子，可以解釋FXR配體如何加強炎癥基因的表達。
實施例7-膽酸鹽在介導(dǎo)誘導(dǎo)表達中的相對作用為測定在介導(dǎo)這些誘導(dǎo)過程中膽酸鹽的相對作用，用補充有增加濃度膽酸(CA；0.01-10％)的固體餌料飼養(yǎng)C57BL/6小鼠5天。觀察到了TNFoc、VCAM-1和ICAM-1 mRNA肝臟水平的劑量依賴性誘導(dǎo)作用。還觀察到對7α-羥化酶(cyp7a)有劑量依賴性抑制作用。在體內(nèi)，CA在腸中被轉(zhuǎn)化為脫氧膽酸，其選擇性地與FXR相互作用，而更加親水性的膽汁酸，例如7-二羥膽烷酸(UDCA)則通過與PXR而非FXR結(jié)合來發(fā)揮作用。為測定通過FXR的信號是否是引起炎癥基因表達所必需的，將1％的UDCA補充到固體餌料中。
特別地，參照圖21a-d，如同標(biāo)明的，用固體，致動脈粥樣硬化的或者高脂飲食(沒有膽酸鈉的致動脈粥樣硬化的餌料)飼養(yǎng)C57BL/6小鼠。5星期后，通過實時PCR測定指定基因的肝臟mRNA水平。各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM的形式報道。*p＜0.01對固體餌料小鼠。參照圖22a-b，如同所標(biāo)明的，用補充有增高濃度膽酸的固體餌料飼養(yǎng)C57BL/6小鼠。5天后，通過實時PCR測定指定基因的肝臟mRNA水平。各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM的形式報道。參照圖23a-b用補充有1％二羥膽烷酸(UDCA)的固體餌料飼養(yǎng)C57B/L6小鼠。在5天以后通過實時PCR測定指定基因的肝臟mRNA水平。B.比較1％膽酸(CA)或UDCA飼養(yǎng)5天的小鼠中肝臟SHP mRNA的表達。各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM的形式報道。
沒有觀察到炎癥基因表達的誘導(dǎo)作用，而UDCA處理則抑制了cyp7a表達，誘導(dǎo)cyp3a的表達，與其通過PXR結(jié)合發(fā)揮作用的能力一致。另外，SHP表達的誘導(dǎo)作用同樣僅在CA而非UDCA中觀察到，證實在CA信號中需要FXR。
為進一步研究通過FXR的膽汁酸信號能夠促進炎癥基因表達的可能性，在肝細胞系HepG2中進行實驗。用增濃度的鵝膽酸(CDCA)或選擇性合成的FXR配體，GW 4064處理HepG2細胞24小時。CDCA或GW 4064處理能夠以劑量依賴性方式誘導(dǎo)ICAM-1表達。
參照圖24a-b，用增加濃度的鵝膽酸(CDCA)處理HepG2細胞24小時。通過實時PCR測定指定基因的內(nèi)源性mRNA水平。各B組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM的形式報道。如上進行類似的實驗設(shè)計，只是用增加濃度的FXR而不是GW 4064處理細胞。各C57BL/6小鼠組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM的形式報道。參照圖25，用口服單一劑量GW的4064(50mg/kg)處理C57BL/6小鼠。在定量以后的各時間點，通過實時PCR測定指定基因的肝臟mRNA水平。各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM的形式報道。
參照圖26，用人FXR和RXRα表達質(zhì)粒和含有人SHP的鄰近啟動子區(qū)域(-360到+40)或連續(xù)缺失的人ICAM-1啟動子(-1108或-810到+18)的熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞。轉(zhuǎn)染后，用GW 4064(1uM)處理細胞24或48小時。數(shù)據(jù)代表三種獨立轉(zhuǎn)染的平均數(shù)+S.D.。
如同陽性對照，證實了兩種化合物的SHP mRNA誘導(dǎo)作用和cyp7a的抑制作用。在HepG2細胞轉(zhuǎn)染中，這表明ICAM-1啟動子活性還可被GW 4064強化，并且其活性需要鄰近的NF-κB反應(yīng)元件。已經(jīng)表明SHP可以作為NF-κB p65亞基的一種共活化劑，NF-κB是與炎癥基因表達有關(guān)的主要轉(zhuǎn)錄因子。該證據(jù)表明FXR信號可通過誘導(dǎo)SHP表達來誘導(dǎo)NF-κB介導(dǎo)的炎癥基因表達。
實施例8-瞬時轉(zhuǎn)染用于鑒定在炎癥基因表達途徑中抑制FXR和/或SHP的化合物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增從基因組DNA中分離的NF-κB啟動子。使用TOPO TA克隆試劑盒(InVitrogen)將所獲的PCR產(chǎn)物TOPO克隆到質(zhì)粒pCR2.1中(獲自InVitrogen，Carlsbad，California)。證實了正確的序列之后，通過EcoRI消化移出NF-κB啟動子。利用T4DNA聚合酶將所獲DNA片段的末端處理成平末端。然后將該片段連接到Sma I消化的pRL-null中(獲自Promega Madison，Wisconsin)，形成pNF-κB-RL，其具有由NF-κB啟動子驅(qū)動的renilla熒光素酶報告基因。通過類似的標(biāo)準(zhǔn)分子方法將人SHP或FXR編碼區(qū)域克隆到SV40-啟動子表達載體pSI中(Promega)。
然后在HepG2細胞中共轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒。將HepG2庫存細胞維持在DMEM高葡萄糖，10％ FBS，酚紅培養(yǎng)基(Invitrogen，GIBCO Cat No11995-065)中。為進行轉(zhuǎn)染，細胞在由不含酚紅的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基(Invitrogen，GIBCO Cat.No.31053-028)、10％活性炭脫色的FBS(HyClone，Logan，Utah，Cat.No.SH30068.03)組成的分析培養(yǎng)基中，以每孔1×105個細胞的濃度，接種在12孔板上。第二天，以Tfx-20對DNA為2∶1的比率，將轉(zhuǎn)染試劑Tfx-20(Promega；E2391)與0.5μg的pNF-κB-RL和在不含血清和酚紅的DMEM/F12(Invitrogen，GIBCO Cat No.11039-021)中的最多1μg pSI-FXR或最多1μg pSI-SHP混合，并在室溫下孵育10分鐘。用不含血清的DMEM/F12洗滌細胞一次并吸出培養(yǎng)基。加入Tfx-20/DNA混合物，在37℃孵育細胞1小時。孵育末期加入分析培養(yǎng)基，進一步孵育細胞23-48小時。去除分析培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞。去除清洗液，加入250μl的1x Renilla裂解緩沖液(Promega；E2810)。將平板在搖床上放置15分鐘。將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)入微離心管，離心30秒澄清。將20μl的等分試樣轉(zhuǎn)入顯微熒光板(ThermoLab系統(tǒng))。每次向一個孔中注射100μl的Renilla候選試劑，在Dynex MLX微量滴定板光度計上以超過30秒的間隔讀數(shù)。
為測定測試化合物是否能夠抑制SHP活性，轉(zhuǎn)染后將測試化合物加入分析培養(yǎng)基。熒光素酶活性由于SHP拮抗劑的存在而增加。
上述方法的替代實施例是利用標(biāo)準(zhǔn)的可選擇標(biāo)記，包括新霉素、潮霉素或嘌呤霉素，用pNF-κB-RL和pSI-SHP質(zhì)粒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染細胞。
實施例9-腺病毒感染用于鑒定在炎癥基因表達途徑中抑制FXR和/或SHP的化合物利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如ADEASY系統(tǒng)(獲自QbioGene，Carlsbad，California)中所述，構(gòu)建含有驅(qū)動報告基因(例如螢火蟲熒光素酶、renilla熒光素酶或β-半乳糖苷酶)表達的人NF-κB啟動子區(qū)域的報告腺病毒。首先將NF-κB啟動子標(biāo)記構(gòu)建體克隆到轉(zhuǎn)移載體pShuttle或pQBI-AdBN中。用PmeI線性化所獲質(zhì)粒并與病毒質(zhì)粒pAdEasy-1一起共同轉(zhuǎn)化到E.coli菌株BJ5183中。用卡那霉素選擇重組體并通過PCR或限制酶分析進行篩選。
然后將正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5a中，并用常規(guī)方法，如Qiagen Maxi試劑盒純化轉(zhuǎn)染質(zhì)量的DNA。用Pac I消化重組腺病毒構(gòu)建體，用于暴露其ITR(反轉(zhuǎn)的末端重復(fù))，并轉(zhuǎn)染到QBI-293A細胞中以產(chǎn)生病毒顆粒。用標(biāo)準(zhǔn)方法擴增所獲的噬菌斑。用諸如氯化銫梯度的方法純化最終擴增的腺病毒后，使用293細胞滴定最終的腺病毒。類似地制備表達FXR或SHP的腺病毒，除了替換轉(zhuǎn)移載體之外，例如可以使用pShuttle-CMV。
替代性實施例是使用任何對HNF-4α起反應(yīng)的其它已知啟動子(參照Naiki等，JBC 27714011，2002，將這種基因的列表并入作為參考)來驅(qū)動報告基因的表達。
上述方法的另一替代實施例是使用單個腺病毒來表達HNF-4以及SHP或FXR。在該情況下，使用轉(zhuǎn)移載體pQBI-AdCMV5-IRES-GFP。將SHP cDNA克隆到CMV5啟動子的下游。用HNF-4a基因替換GFP基因。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)這些步驟實現(xiàn)，如限制性內(nèi)切酶酶切片段重組或更優(yōu)選地使用重疊PCR。所獲的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒含有CMV啟動子，其后為SHP cDNA，SHP cDNA之后是內(nèi)部核糖體進入片段(IRES)，該片段后任選的是HNF-4cDNA。其它啟動子可用于替換CMV啟動子，例如pQBI-AdBM5-PAG轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的主要晚期啟動學(xué)(MLP)。該方法確保了SHP可以在所有能任選地表達HNF-4的細胞中表達。
另一替代實施例是將表達CPF(LRH-1)的腺病毒與含有驅(qū)動報告基因表達的人NF-κB啟動子區(qū)域的報告腺病毒結(jié)合使用。
一旦完成了腺病毒載體，它們可用于感染人細胞，最優(yōu)選人肝癌HepG2細胞。通過在37℃下，在培養(yǎng)基中使細胞與腺病毒接觸，一般為5小時，來實現(xiàn)感染。然后洗滌細胞，用帶腺病毒的培養(yǎng)基再培養(yǎng)。使用每種病毒的各種MOIs共感染，通過矩陣分析確定報告質(zhì)粒和SHP表達質(zhì)粒的適合感染復(fù)數(shù)(MOI)。因此在最后的試驗中，用x MOI的NF-κB報告腺病毒，y MOI的SHP表達腺病毒感染細胞。感染后用載體或測試化合物處理細胞。測試化合物通常溶于DMSO，并被加到培養(yǎng)基中，達到大約10μM的終濃度。24到48小時后測量報告活性的表達。例如，可通過許多方法監(jiān)測熒光素酶活性，包括LUC-SCREEN螢火蟲熒火素酶報告基因分析系統(tǒng)(獲自Applied Biosystems，F(xiàn)osterCity，California)，或通過裂解細胞然后應(yīng)用熒光素酶分析系統(tǒng)(Promega)監(jiān)測。能夠增強熒光素酶活性的化合物可以當(dāng)作SHP的抑制劑。
為證實測試化合物可作為SHP或FXR的抑制劑，用x MOI的NF-κB報告腺病毒感染HepG2細胞。然后用載體或測試化合物處理細胞。如上所述監(jiān)測熒光素酶活性。在沒有SHP的這些細胞中SHP抑制劑沒有改變熒光素酶活性。
盡管參照特定實施例進行了上述說明和描述，但是本發(fā)明并不僅限于所顯示的這些細節(jié)。而是可以在等同于權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)對這些細節(jié)進行各種改進，而不背離本發(fā)明的精神。因此，本發(fā)明包括其它不背離其精神或本質(zhì)特征的特定形式。因此無論從哪一點來看，給出的實施例被認(rèn)為是說明性而非限制性的，本發(fā)明通過所附的權(quán)利要求而指定其范圍。
權(quán)利要求
1.一種鑒定能有效抑制短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)的試劑的方法，該方法包括對細胞培養(yǎng)物施用一種試劑，其中所述的細胞培養(yǎng)物會表達(i)短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或(ii)類法尼醇X受體(FXR)，并含有NF-κB啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子；以及挑選出能在所述細胞培養(yǎng)物中引起可檢測物質(zhì)增加的試劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是小分子、反義寡核苷酸、抗體、重組SHP、重組FXR或其組合。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述試劑是分子量為約50到約1500的小分子。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測物質(zhì)基因是螢火蟲熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、分泌型堿性磷酸酶基因、renilla熒光素酶基因或其組合。
5.權(quán)利要求1的方法，其中可檢測物質(zhì)基因是螢火蟲熒光素酶基因。
6.權(quán)利要求1的方法，其中細胞培養(yǎng)物是改變的細胞培養(yǎng)物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中細胞培養(yǎng)物是轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中細胞培養(yǎng)物是感染的細胞培養(yǎng)物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中SHP、FXR或啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子是通過選自腺病毒、質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其組合的任一載體而導(dǎo)入細胞培養(yǎng)物的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中載體是腺病毒。
11.權(quán)利要求10的方法，其中腺病毒是復(fù)制缺陷型腺病毒。
12.權(quán)利要求11的方法，其中復(fù)制缺陷型腺病毒含有SV40啟動子、CMV啟動子、MLP啟動子或其組合。
13.權(quán)利要求12的方法，其中復(fù)制缺陷型腺病毒含有SV40啟動子。
14.權(quán)利要求1的方法，其中細胞培養(yǎng)物是HELA、人肝胚細胞瘤細胞系(HepG2)、人胚腎293細胞系(HEK293)、大鼠FTO-2B、大鼠McA-RH7777中任意一種或其組合。
15.權(quán)利要求1的方法，進一步包括克隆NF-κB啟動子，用于制備NF-κB啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子。
16.權(quán)利要求1的方法，其中NF-κB啟動子包括炎癥基因胞內(nèi)附著分子(ICAM-I)或巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF)。
17.權(quán)利要求1的方法，另外包括將所述試劑施用于第二種細胞培養(yǎng)物，其中該細胞培養(yǎng)物表達短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)，并含有CYP7A1或CYP8B 1啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，用于在第二種細胞培養(yǎng)物中檢測可檢測物質(zhì)的增加。
18.權(quán)利要求1的方法，另外包括克隆NF-κB啟動子并將所克隆的NF-κB啟動子插入到載體中可檢測物質(zhì)基因的前面，以在感染細胞培養(yǎng)物之前形成NF-κB啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其中NF-κB啟動子含有炎癥基因胞內(nèi)附著分子(ICAM-I)或巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)。
19.權(quán)利要求1的方法，另外包括將候選試劑施用于第二種細胞培養(yǎng)物，其中該細胞培養(yǎng)物表達短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)以及任選的肝細胞核因子4α(HNF4α)，并含有CYP7A1或CYP8B 1啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，用于在第二種細胞培養(yǎng)物中檢測可檢測物質(zhì)的增加。
20.權(quán)利要求1的方法，另外包括(a)將該試劑施用于第二種細胞培養(yǎng)物，所述第二種細胞培養(yǎng)物含有NF-κB啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，但不表達SHP或FXR；以及(b)選擇出能夠在施用該試劑后，在第一種細胞培養(yǎng)物中引起可檢測物質(zhì)增加，而在第二種細胞培養(yǎng)物中不引起可檢測物質(zhì)增加的試劑。
21.一種在受試者中預(yù)防或改善與炎癥基因活性和/或膽固醇生物合成相關(guān)的狀況的方法，該方法包括將通過上述權(quán)利要求1-20的任一方法選擇出的試劑施用于所述患者。
22.包括通過上述權(quán)利要求1-20任一方法選出的試劑的組合物。
23.權(quán)利要求22的組合物，其還包含藥物學(xué)上可接受的載體。
24.權(quán)利要求22的組合物，其中所述試劑是小分子、反義寡核苷酸、抗體、重組SHP、重組FXR或其組合。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述試劑是分子量為約50到約1500的小分子。
26.含有一種試劑的組合物，所述試劑的特征在于當(dāng)將其施用于被含有核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB啟動子/熒光素酶(luc)基因報道分子的載體感染的、轉(zhuǎn)染的或改變的細胞培養(yǎng)物時，可導(dǎo)致熒光素酶增加，所述的細胞培養(yǎng)物表達短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述試劑是小分子、反義寡核苷酸、抗體、重組SHP、重組FXR或其組合。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述小分子的分子量是約50到約1500。
29.權(quán)利要求27的組合物，其中所述小分子的分子量是約50到約750。
30.權(quán)利要求27的組合物，其中所述小分子的分子量是約50到約500。
31.權(quán)利要求27的組合物，其中所述小分子是非類固醇化合物。
32.權(quán)利要求26的組合物，其中所述載體是腺病毒、質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒中任意一種或其組合。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中載體是腺病毒。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中腺病毒是復(fù)制缺陷型腺病毒。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中復(fù)制缺陷型腺病毒含有SV40啟動子、CMV啟動子、MLP啟動子或其組合。
36.權(quán)利要求34的組合物，其中復(fù)制缺陷型腺病毒含有SV40啟動子。
37.權(quán)利要求26的組合物，其中細胞培養(yǎng)物是HELA、人肝胚細胞瘤細胞系(HepG2)、人胚腎293細胞系(HEK293)、大鼠FTO-2B、大鼠McA-RH7777或其組合。
38.權(quán)利要求26的組合物，其中NF-κB啟動子包括炎癥基因胞內(nèi)附著分子(ICAM-I)或巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF)。
39.權(quán)利要求26的組合物，其中所述的試劑抑制短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)在炎癥基因表達途徑中的活性。
40.權(quán)利要求26的組合物，其中所述試劑與成熟或未成熟形式的短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)或其編碼上述試劑的基因結(jié)合；所述試劑以有效對抗動脈粥樣硬化的數(shù)量存在于該組合物中。
41.權(quán)利要求26的組合物，其中所述試劑與成熟或未成熟形式的短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)競爭受體或配體。
42.權(quán)利要求26的組合物，其中NF-κB啟動子包括炎癥基因胞內(nèi)附著分子(ICAM-I)或巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF)。
43.一種啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，包括NF-κB啟動子和可檢測物質(zhì)基因，所述的NF-κB啟動子位于可檢測物質(zhì)基因的前面。
44.權(quán)利要求43的啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其中將NF-κB啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子導(dǎo)入載體中。
45.權(quán)利要求44的啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其中所述載體是復(fù)制缺陷型腺病毒載體。
46.權(quán)利要求45的啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其中復(fù)制缺陷型腺病毒載體含有SV40啟動子、CMV啟動子、MLP啟動子或其組合。
47.權(quán)利要求45的啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其中所述復(fù)制缺陷型腺病毒載體含有SV40啟動子。
48.權(quán)利要求43的啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其中該組合物進一步包括含有多核苷酸的載體，所述多核苷酸表達短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)。
49.權(quán)利要求43的啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其中NF-κB啟動子包括炎癥基因胞內(nèi)附著分子(ICAM-I)或巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF)。
50.權(quán)利要求44的啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子，其中將所述載體導(dǎo)入宿主細胞中。
51.一種分離的CYP7A1、CYP8B或SHP啟動子，其包括包含SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8的核苷酸序列的多核苷酸或其組合。
52.權(quán)利要求51的啟動子，其中CYP8B1啟動子包括相對于人CYPBB 1轉(zhuǎn)錄起始位點-514到+303位核苷酸的CYP8B1片段。
53.權(quán)利要求51的啟動子，其中所述啟動子被導(dǎo)入可檢測物質(zhì)基因以形成啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子。
54.權(quán)利要求53的啟動子，其中所述可檢測物質(zhì)基因是螢火蟲熒光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因、分泌型堿性磷酸酶基因、renilla熒光素酶基因或其組合。
55.權(quán)利要求53的啟動子，其中可檢測物質(zhì)基因是螢火蟲熒光素酶基因。
56.權(quán)利要求53的啟動子，其中將所述啟動子/可檢測物質(zhì)基因報道分子導(dǎo)入載體中。
57.權(quán)利要求56的啟動子，其中載體是腺病毒SV40。
58.權(quán)利要求51的啟動子，其中將該啟動子導(dǎo)入宿主細胞中。
59.一種組合物，含有非天然變性的短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)或類法尼醇X受體(FXR)復(fù)合體。
60.權(quán)利要求59的組合物，其另外含有藥物學(xué)上可接受的載體。
61.權(quán)利要求60的組合物，其中藥物學(xué)上可接受的載體是嚼片速溶片、泡騰片、可復(fù)水粉末、甘香制劑、液體、溶液、懸浮液、乳劑、片劑、多層片劑、雙層片劑、膠囊劑、軟膠膠囊、硬膠囊、囊片、錠劑、可嚼錠劑、珠粒、粉末、顆粒、粉粒、微粒、可分散的顆粒、扁囊劑、灌洗劑、栓劑、乳膏劑、局部劑、吸入劑、氣霧吸入劑、碎片、顆粒吸入劑、植入物、貯存植入物、可攝取劑、可注射劑、輸液劑、健康棒、糖膏、動物飼料、谷類、谷類包衣、食物、營養(yǎng)食物、機能性食品或其組合。
62.權(quán)利要求60的組合物，其中所述組合物另外含有藥物學(xué)上可接受的緩沖液、稀釋劑、輔劑或其組合。
63.一種組合物，其包括能結(jié)合SEQ ID NOS1-4之任一項的試劑。
64.權(quán)利要求63的組合物，其中所述試劑是SEQ ID NO1或SEQID NO3之任一項的反義寡核苷酸。
65.權(quán)利要求63的組合物，其中所述試劑是SEQ ID NO2或SEQ ID NO4之任一項的抗體。
66.基本上如上所述的組合物。
67.基本上如上所述的應(yīng)用。
全文摘要
鑒定能夠有效抑制短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)和類法尼醇X受體(FXR)的試劑的方法，以及該方法中所使用的啟動子，細胞系和載體。能有效抑制短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)的試劑的制備以及使用方法，包括使用該試劑預(yù)防和/或治療患者中與炎癥基因活性和/或膽固醇生物合成相關(guān)疾病的方法。能夠有效抑制短異二聚體蛋白質(zhì)(SHP)和類法尼醇X受體(FXR)的試劑以及含有該試劑的組合物，包括能夠有效降低患者體內(nèi)炎癥基因活性和/或膽固醇生物合成的組合物。
文檔編號G01N33/92GK1675376SQ03819498
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月13日
發(fā)明者M·J·埃文斯, D·C·哈尼斯 申請人:惠氏控股公司