專利名稱：采用磁性顆粒的具有內(nèi)部自校正系統(tǒng)的流式測定的制作方法
背景技術(shù)：
在測定試樣中存在和/或不存在分析物的試驗(yàn)中，通常使用多種分析方法和裝置。例如，免疫測定法是利用免疫系統(tǒng)機(jī)制，即為了響應(yīng)致病的或?qū)ι矬w異質(zhì)的抗原的存在而產(chǎn)生抗體。這些抗體和抗原，即免疫反應(yīng)物，能夠互相結(jié)合，從而引起高度特異性反應(yīng)機(jī)制，可用于檢測生物樣品中特定抗原的存在或者濃度。
一些已知的免疫測定方法利用被可檢測成分標(biāo)記的免疫反應(yīng)物以便在分析上可檢測到分析物。例如，典型地是，“夾層式”測定法涉及混合試樣與所述分析物的抗體。這些抗體是可移動(dòng)的并聯(lián)接著標(biāo)記物或者探針，如染色乳膠珠，膠體金溶膠，或放射性同位素。再將該混合物與含有固定的分析物抗體帶或區(qū)域的層析分離介質(zhì)接觸。層析分離介質(zhì)通常呈類似于量尺的條帶形式。當(dāng)分析物和標(biāo)記抗體的復(fù)合物到達(dá)層析分離介質(zhì)上固定了抗體的區(qū)域時(shí)，就發(fā)生結(jié)合并且該結(jié)合的標(biāo)記抗體滯留在該區(qū)域。這就指示了分析物的存在。該技術(shù)可用于獲得定量或半定量的結(jié)果。Grubb等人的4168146號(hào)和Tom等人的4366241號(hào)美國專利中描述了這種夾層式測定法的例子。
另一種技術(shù)為“競爭式”測定法。在“競爭式”測定法中，典型地，標(biāo)記物為標(biāo)記的分析物或分析物類似物，其與樣品中存在的任何非標(biāo)記的分析物競爭性結(jié)合抗體。競爭性測定法被典型地用于檢測諸如半抗原的分析物，每個(gè)半抗原為單價(jià)的并且只能夠結(jié)合一個(gè)抗體分子。Deutsch等人的4235601號(hào)，Liotta的4442204號(hào)，以及Buechler等人的5208535號(hào)美國專利中描述了這種競爭性免疫測定裝置的例子。
磁性結(jié)合測定法被廣泛地用于從復(fù)雜樣品中分離生物物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì)、細(xì)胞、微生物)，因?yàn)槠湟子谕ㄟ^磁場來操縱并且不需要專門的和昂貴的儀器。這樣，磁性免疫測定法可提供快速而簡單的技術(shù)來測定所述物質(zhì)的存在與否。在這種測定方法中，使用了多種信號(hào)發(fā)生機(jī)制，包括顏色(吸收和反射)，熒光，化學(xué)發(fā)光，放射性以及酶。
然而，常規(guī)的磁性免疫測定法每次用于獲得分析物的定量信息時(shí)，通常需要對(duì)照樣品以制成校正曲線。特別是在分析試樣中生物物質(zhì)的存在與否時(shí)，要同時(shí)測定多個(gè)對(duì)照樣品，用于所述已知量的物質(zhì)，從而在近似相同的條件下校正所述測定。遺憾地是，所述校正方法通常不是很方便、成本較高，對(duì)測試者來說比較麻煩。
因此，目前需要一種易于控制并且較為廉價(jià)的用于測定的準(zhǔn)確校正系統(tǒng)。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，揭示了一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的基于膜的裝置(例如，基于測流膜的測定裝置)。該裝置包括與可產(chǎn)生檢測信號(hào)的檢測探針以及可產(chǎn)生校正信號(hào)的磁性校正探針流體連通的多孔膜。一般來說，檢測探針和校正探針可以由能夠產(chǎn)生可檢測信號(hào)的任何物質(zhì)構(gòu)成。例如，一些實(shí)施方式中，這些探針選自于包括以下物質(zhì)的組生色基團(tuán)、催化劑、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接可見標(biāo)記物、脂質(zhì)體及其組合。例如，檢測探針和校正探針可以為熒光化合物，如熒光顆粒。在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，檢測探針為熒光非磁性化合物，而校正探針為熒光磁性顆粒。如果需要的話，熒光磁性顆粒可以和特異性結(jié)合成分結(jié)合或者被阻斷。
在一些實(shí)施方式中，該裝置還包括一個(gè)或多個(gè)與該多孔膜流體連通的結(jié)合墊。如果需要，檢測探針與校正探針被加在一個(gè)或多個(gè)所述結(jié)合墊上。該裝置還可包括與所述多孔膜流體連通的加樣墊。如果需要的話，將試樣加在該加樣墊上。另外，該裝置還可包括與所述多孔膜流體連通的吸收墊以幫助試樣的流動(dòng)通過。
磁性裝置設(shè)置在由該多孔膜界定的檢測區(qū)附近。該磁性裝置能夠?qū)z測探針和校正探針從施加到多孔膜上的溶液中分離出來。例如，在夾層測定形式的一個(gè)實(shí)施方式中，檢測探針和校正探針與分析物形成復(fù)合物。當(dāng)放置在檢測區(qū)與磁性裝置相作用時(shí)，這些分析物的復(fù)合物以及任何非復(fù)合形式的校正探針可從剩余試樣中分離。
分離的檢測和校正探針(復(fù)合形式的和/或非復(fù)合形式的)因此就能夠指示試樣中分析物的存在或者量。特別是，試樣中分析物的量與檢測區(qū)被分離出的檢測探針(復(fù)合形式的和/或非復(fù)合形式的)所產(chǎn)生的檢測信號(hào)強(qiáng)度成比例，所述檢測信號(hào)經(jīng)過檢測區(qū)中分離的校正探針(復(fù)合形式的和/或非復(fù)合形式的)產(chǎn)生的校正信號(hào)強(qiáng)度值校正。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，試樣中分析物的量與檢測信號(hào)強(qiáng)度和校正信號(hào)強(qiáng)度的商成比例。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，揭示了一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的方法。該方法包括i)提供基于膜的裝置，所述裝置包括a)與能夠產(chǎn)生檢測信號(hào)的檢測探針以及能夠產(chǎn)生校正信號(hào)的磁性校正探針流體連通的多孔膜，所述多孔膜界定了檢測區(qū)域；以及b)設(shè)置在鄰近檢測區(qū)處的磁性裝置；ii)將檢測探針與校正探針與試樣接觸形成溶液；iii)利用所述磁性裝置在檢測區(qū)從所述溶液中分離檢測探針和校正探針；iv)激發(fā)所述分離的檢測探針(復(fù)合形式的和/或非復(fù)合形式的)以及所述分離的校正探針(復(fù)合形式的和/或非復(fù)合形式的)，其中所述激發(fā)引起所述分離的檢測探針發(fā)出檢測信號(hào)，以及所述分離的校正探針發(fā)出校正信號(hào)；v)在第一發(fā)射波長處測量所述檢測信號(hào)的強(qiáng)度以及在第二發(fā)射波長處測量所述校正信號(hào)的強(qiáng)度，第二發(fā)射波長可以與第一發(fā)射波長相同或不同；以及vi)比較所述檢測信號(hào)和所述校正信號(hào)的強(qiáng)度，其中試樣中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度值校正的檢測信號(hào)的強(qiáng)度值成比例。
分離的檢測探針和校正探針可以被同時(shí)地或者分別地激發(fā)。同樣，檢測信號(hào)和校正信號(hào)的強(qiáng)度可以被同時(shí)地或者分別地測量。另外，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括為多個(gè)預(yù)定的分析物濃度對(duì)經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行作圖，從而得到校正曲線。
下面更詳細(xì)地討論了本發(fā)明的其它特征和方面。
附圖簡述針對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，說明書的以下部分參考以下附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行全面而且有效的公開，其中包括最佳實(shí)施方式，所述附圖包括


圖1是本發(fā)明的基于膜技術(shù)的裝置的一個(gè)實(shí)施方式透視圖；圖2是用于本發(fā)明的一種夾層測定形式實(shí)施方式的機(jī)制圖解說明；圖3是用于本發(fā)明的另一種夾層測定形式實(shí)施方式的機(jī)制圖解說明；圖4是用于本發(fā)明的一種競爭性測定形式實(shí)施方式的機(jī)制圖解說明；圖5是用于本發(fā)明的另一種競爭性測定形式實(shí)施方式的機(jī)制圖解說明；圖6是抗體與羧酸鹽納米顆粒共價(jià)結(jié)合的一個(gè)實(shí)施方式圖解說明；圖7表示根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中的校正探針(C)和檢測探針(FP)的激發(fā)(EX)和發(fā)射(EM)光譜；圖8表示如實(shí)施方式1中所討論的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度與促黃體生成激素(LH)量的關(guān)系曲線；圖9表示如實(shí)施方式2中所討論的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度與促黃體生成激素(LH)量的關(guān)系曲線；以及圖10表示如實(shí)施方式4中所討論的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度與C反應(yīng)蛋白(CRP)量的關(guān)系曲線。
說明書和附圖中重復(fù)使用的附圖標(biāo)記表示本發(fā)明的相同或類似特征或元件。
代表性實(shí)施方式詳述定義這里使用的術(shù)語“分析物”通常涉及待檢測的物質(zhì)。例如，分析物可包括抗原物質(zhì)、半抗原、抗體及其組合。分析物包括但不限于毒素、有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、類固醇、維生素、藥物(包括出于治療目的以及出于違禁目的而服用的)、細(xì)菌、病毒顆粒以及任何上述物質(zhì)的代謝物或抗體。一些分析物的具體實(shí)施方式
包括鐵蛋白，肌酐激酶MIB(CK-MB)，地高辛，苯妥英，苯巴比妥，卡馬西平，萬古霉素，慶大霉素，茶堿，丙戊酸，奎尼丁，促黃體生成激素(LH)，促卵泡激素(FSH)，雌二醇，孕酮，IgE抗體，維生素B2微球蛋白，糖化血紅蛋白(Gly.Hb)，皮質(zhì)醇，毛地黃毒苷，N-普魯卡因乙酰胺(NAPA)，普魯卡因胺，風(fēng)疹抗體如風(fēng)疹I(lǐng)gG和風(fēng)疹I(lǐng)gM，弓形體抗體如弓形蟲IgG(Toxo-IgG)和弓形蟲IgM(Toxo-IgM)，睪丸激素，水楊酸鹽，醋氨酚，B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，B型肝炎核心抗原的抗體，如B型肝炎核心抗原IgG和IgM抗體(抗HBC)，人類免疫缺陷病毒1和2(HIV1和HIV2)，人類T細(xì)胞白血病病毒1和2(HTLV)，B型肝炎e抗原(HBeAg)，B型肝炎e抗原抗體(抗HBe)，促甲狀腺激素(TSH)，甲狀腺素(T4)，總?cè)饧谞钕僭彼?總T3)，游離三碘甲狀腺原氨酸(游離T3)，癌胚抗原(CEA)以及甲胎蛋白(AFP)。濫用藥物以及受控制的物質(zhì)包括但不限于，安非他明，脫氧麻黃堿，巴比妥酸鹽，如阿米妥、司可巴比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、以及巴比妥，苯化重氮，如利眠寧和安定，大麻的化學(xué)成分，如印度大麻制劑和大麻葉和花制劑，可卡因，芬太尼，LSD，安眠酮，鴉片劑，如海洛因、嗎啡、可待因、二氫嗎啡酮、二氫可待因酮、美沙酮、羥可酮、氧嗎啡酮和鴉片，苯環(huán)己哌啶，以及丙氧吩。Tom等人的第4366241號(hào)美國專利中記載了其它可能的分析物。
這里使用的術(shù)語“試樣”通常涉及被懷疑含有所述分析物的材料。試樣可以從提供源中一獲得就直接使用或者經(jīng)由預(yù)處理步驟以改善樣品的性質(zhì)。試樣可以獲得自任何生物來源，例如生理性液體，包括血液、唾液、接目鏡液體、腦脊髓液、汗液、尿液、乳汁、腹水、raucous、滑液、腹膜液、羊水或其類似物。試樣在使用前可經(jīng)過預(yù)處理，例如從血液中制備血漿，稀釋粘液，或類似處理。處理方法包括過濾、蒸餾、濃縮、滅活干擾組分，以及加入試劑。除了生理性體液之外，也可使用其它液體樣品，例如用于環(huán)境和食品生產(chǎn)測定的水、食物產(chǎn)品及其類似物。此外，被懷疑含有所述分析物的固體材料也可用作試樣。在一些例子中，最好對(duì)固體試樣進(jìn)行修飾以便形成液體介質(zhì)或者釋放出分析物。
發(fā)明詳述現(xiàn)在將詳細(xì)參考說明本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式，它們的一個(gè)或多個(gè)實(shí)例列在了下面。每個(gè)提供的實(shí)例用于解釋發(fā)明，而不是對(duì)發(fā)明的限定。實(shí)際上，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不偏離本發(fā)明范圍和實(shí)質(zhì)的情況下很明顯可以做出各種修改和變化。例如，圖示或者描述說明的作為一個(gè)實(shí)施方式部分的特征，可以被用于另一個(gè)實(shí)施方式中從而得到另外一個(gè)實(shí)施方式。因此，如本發(fā)明所附的權(quán)利要求及其等價(jià)物的范圍中包括這類修改和變化。
本發(fā)明主要致力于一種用于檢測試樣中分析物的存在或量的基于膜的測定。裝置利用自校正的磁性結(jié)合測定法(例如夾層測定，競爭性測定等等)，包括能產(chǎn)生檢測信號(hào)的檢測探針(例如熒光非磁性顆粒)以及能產(chǎn)生校正信號(hào)的校正探針(例如熒光磁性顆粒)。試樣中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度值校正的檢測信號(hào)的強(qiáng)度值成比例(例如正比或者反比)。已發(fā)現(xiàn)該自校正系統(tǒng)能提供用于測定試樣中分析物存在的精確、廉價(jià)、并且易于控制的方法。
例如，參見圖1-2，現(xiàn)在將更為詳細(xì)地說明根據(jù)本發(fā)明制成的基于測流膜的裝置20的一個(gè)實(shí)施方式。如圖所示，裝置20包括可選擇性地由剛性材料21支持的多孔膜23。一般來說，多孔膜23可以由試樣能夠通過的多種材料中的任何一種構(gòu)成。例如，構(gòu)成多孔膜23的材料可包括但不限于，天然的、合成的或者經(jīng)合成修飾的自然產(chǎn)生的材料，例如多糖(如纖維素材料如紙，以及纖維素衍生物如醋酸纖維素和硝酸纖維素)；硅石；無機(jī)材料如惰性氧化鋁、硅藻土、MgSO4、或其它均勻分散在多孔聚合物基質(zhì)中的無機(jī)細(xì)小物質(zhì)，其中聚合物如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物、和氯乙烯-醋酸乙烯共聚物；織物，天然形成的(如棉花)與合成的(如尼龍或人造絲)；多孔膠，如硅膠、瓊脂糖、葡聚糖和凝膠；聚合膜，如聚丙烯酰胺，等等。在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，多孔膜23由硝酸纖維素和/或聚砜膜材料構(gòu)成。應(yīng)當(dāng)明白，術(shù)語“硝酸纖維素”涉及纖維素的硝酸酯，其可以是單獨(dú)的硝酸纖維素，或者與硝酸和其它酸如1至7個(gè)碳原子的脂肪族羧酸的混合酯。
裝置20還可以包含吸收墊28。該吸收墊28通常接收移動(dòng)通過整個(gè)多孔膜23的液體。如本領(lǐng)域所知，該吸收墊28可有助于促進(jìn)毛細(xì)作用以及流體流過該膜23。
開始檢測試樣中的分析物時(shí)，使用者可直接將試樣加到多孔膜23的一部分，然后通過該部分移動(dòng)到一個(gè)或多個(gè)檢測和校正區(qū)域(描述見下)。或者，試樣可先加到與該多孔膜23流體連通的加樣墊上(未示出)?？捎糜跇?gòu)成加樣墊的合適物質(zhì)包括但不限于，硝酸纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊、以及玻璃纖維濾紙。如果需要，該加樣墊還可以含有一個(gè)或多個(gè)檢測預(yù)處理試劑，所述試劑擴(kuò)散性或非擴(kuò)散性地附著在加樣墊上。
在所示的實(shí)施方式中，試樣從加樣墊(未示出)移動(dòng)到與該加樣墊一端流體連通的結(jié)合墊22。結(jié)合墊22是由試樣能夠通過的材料構(gòu)成的。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合墊22由玻璃纖維構(gòu)成。盡管只給出了一個(gè)結(jié)合墊22，應(yīng)當(dāng)明白其它的結(jié)合墊也可以用于本發(fā)明。
可將多種檢測探針41加到該結(jié)合墊22上，用以幫助檢測試樣中分析物的存在與否。這些探針41被包含在結(jié)合墊22上時(shí)，當(dāng)分析物從加樣墊流經(jīng)結(jié)合墊22時(shí)，所述探針可與分析物結(jié)合。一旦與分析物結(jié)合，探針41將隨后用于鑒別分析物的存在或者不存在。檢測探針41既可用于裝置20的檢測又可用于其校正。然而在可替代的實(shí)施方式中，也可在結(jié)合墊22上施加單獨(dú)的校正探針43，用來與檢測探針41結(jié)合以有助于同時(shí)進(jìn)行校正和檢測，從而消除常規(guī)測定校正體系通常造成的不準(zhǔn)確性。然而應(yīng)當(dāng)明白的是，檢測探針41和/或校正探針43可以同時(shí)地或者分別地施加在裝置20的任何部位上，而不需要加在結(jié)合墊22上。而且，還應(yīng)當(dāng)明白的是，檢測探針41和/或校正探針43可以加到相同或不同的結(jié)合墊上。
通常能夠產(chǎn)生可見的或者利用儀器可檢測到的信號(hào)的任何物質(zhì)可被用作檢測探針41和/或校正探針43。有多種適合的物質(zhì)包括生色基團(tuán)，催化劑，熒光化合物，化學(xué)發(fā)光化合物，磷光化合物，放射性化合物，直接可見標(biāo)記物，包括膠體金屬(如金)和非金屬顆粒、染色顆粒、酶或底物、或者有機(jī)聚合物乳膠顆粒，脂質(zhì)體或其它含有信號(hào)發(fā)生物質(zhì)的囊泡，等等。例如，Litman等人的第4275149號(hào)美國專利中披露了一些適合作為探針的酶，在此出于各種目的對(duì)其進(jìn)行全文引用作為參考。酶/底物體系的一個(gè)例子為堿性磷酸酶和底物硝基藍(lán)四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，或者其衍生物或類似物，或者底物4-甲基傘形酮(methylumbelliferyl)-磷酸鹽。Jou等人的第5670381號(hào)和Tarcha等人的第5252459號(hào)美國專利中還披露了其它合適的探針，在此出于各種目的對(duì)其進(jìn)行全文引用作為參考。
在一些實(shí)施方式中，檢測探針41和/或校正探針43包括產(chǎn)生可檢測信號(hào)的熒光化合物。所述熒光化合物可為分子、聚合物、樹枝狀大分子、顆粒及類似物。例如，一些適合的熒光分子的例子包括但不限于，熒光素、銪螯合物、藻膽蛋白、羅丹明以及其衍生物和類似物。另外，還有一些商業(yè)上用的適合的熒光顆粒的例子，包括Molecular Probes公司出售的商品名為“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere2”(543/620)以及“Texas Red”的熒光羧基微球和同為Molecular Probes公司出售的5-和6-羧基四甲基羅丹明。
不論所采用的使探針具有信號(hào)生成能力的技術(shù)，人們通常希望探針41和/或校正探針43為磁感應(yīng)探針。一般來說，如果一種材料受施加的磁場影響，例如，被吸引或排斥或者具有可檢測的磁化率或感應(yīng)度，就被認(rèn)為是具有“磁感應(yīng)性”或者“磁性”。例如，一些可用于向探針提供磁性能的合適的磁感應(yīng)性材料的例子包括但不限于，順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、亞鐵磁性材料以及變磁性材料。特別的例子有，金屬如鐵、鎳、鈷、鉻、錳等，鑭系元素如釹、鉺等，合金如鋁、鎳、鈷、銅等的磁性合金，氧化物如氧化鐵(Fe3O4)、氧化亞鐵(Fe2O3)、氧化鉻(CrO2)、氧化鈷(CoO)、氧化鎳(NiO2)、氧化錳(Mn2O3)等，復(fù)合材料如鐵素體等，以及固溶體如氧化鐵磁鐵礦等。
在一些實(shí)施方式中，檢測探針41和/或校正探針43是熒光的并且具有磁性。熒光磁性探針在本領(lǐng)域中一般來說是已知的并且通常包括磁感應(yīng)成分和熒光成分。例如在一些實(shí)施方式中，將一個(gè)或多個(gè)熒光染料應(yīng)用于磁性顆粒上以形成探針，而在其它的實(shí)施方式中，將熒光染料應(yīng)用于與磁性顆粒偶聯(lián)的非磁性顆粒上。一些適合的熒光染料的例子包括但不限于，單甲川染料、三甲川染料、五甲川染料、喹啉染料、方酸基染料等等。嘧啶類的單甲川染料典型地能發(fā)出藍(lán)色或綠色的熒光，而喹啉類典型地能發(fā)出綠色或黃綠色熒光。三甲川染料基本上漂移至紅光波長，而五甲川染料漂移的更多，常呈現(xiàn)紅外熒光輻射。這種熒光染料的特例包括單不限于酞菁、2，3-萘肽菁、方酸菁(squaraine)以及克酮酸衍生物。其它合適的熒光磁性顆粒記載在Luotola等人的第4731337號(hào)、Chandler等人的第6268222號(hào)美國專利中。在此出于各種目的對(duì)其進(jìn)行全文引用作為參考。
當(dāng)檢測探針41和/或校正探針43是如上所述的顆粒時(shí)，一般來說根據(jù)諸如所選顆粒的類型、膜上孔大小以及膜組分之類的因素，顆粒的平均直徑可隨需要而變化。例如在一些實(shí)施方式中，顆粒探針的平均直徑范圍可以從大約0.01微米到大約1000微米，一些實(shí)施方式中從大約0.01微米到大約100微米，而在一些實(shí)施方式中從大約0.01微米到大約10微米。在一個(gè)特別的實(shí)施方式中，顆粒探針具有的平均直徑從大約1至大約2微米。一般來說，顆?；旧蠟榍蛐?，但是在本發(fā)明中也適合使用其它的形狀，包括但不限于，盤狀、桿狀、棒狀、不規(guī)則形狀等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員來應(yīng)明白，顆粒的組成、形狀、尺寸和/或密度可以有很大范圍的變化。
檢測探針41和/或校正探針43能夠與分析物結(jié)合(共價(jià)或非共價(jià)地)或者物理吸附。然而通常需要以一些方式對(duì)探針進(jìn)行修飾，以便其更易于與分析物結(jié)合。在這種情況下，檢測探針41和/或校正探針43可用某些特異性結(jié)合組分90a和/或90b(參見圖2)進(jìn)行修飾，所述特異性結(jié)合組分連接其上形成探針配合物。
特異性結(jié)合組分一般來說涉及特異性的結(jié)合對(duì)組分，即兩個(gè)不同的分子，其中一個(gè)分子與第二個(gè)分子化學(xué)和/或物理結(jié)合。例如，免疫反應(yīng)性特異性結(jié)合組分包括抗原、半抗原、寡核苷酸配基、抗體及其復(fù)合物，包括通過重組DNA方法或者肽合成法而制成的?？贵w可以是單克隆或者多克隆抗體，重組蛋白或其混合物或片段，以及抗體和其它特異性結(jié)合組分的混合物。這類抗體的制備方法以及其作為特異性結(jié)合組分的適用性的詳細(xì)內(nèi)容對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。
其它常規(guī)的特異性結(jié)合對(duì)包括但不限于，生物素與抗生物素蛋白，碳水化合物與凝集素，互補(bǔ)核苷酸序列(包括DNA雜交試驗(yàn)中用來檢測目標(biāo)核酸序列的探針和捕獲核酸序列)，互補(bǔ)肽序列包括那些通過重組方法獲得的序列，效應(yīng)物與受體分子，激素與激素結(jié)合蛋白，輔酶與酶，酶抑制劑與酶等等。此外，特異性結(jié)合對(duì)還可包括原特異性結(jié)合組分的類似物組分。例如，分析物的衍生物或者片段，即分析物類似物，只要其具有至少一個(gè)與分析物相同的抗原表位。
通常利用各種已知技術(shù)中的任何一種就能使特異性結(jié)合組分90a和/或90b聯(lián)接至探針41和/或43上。例如，利用羧基、氨基、醛基、溴化乙酰基、碘化乙酰基、硫醇基、環(huán)氧基以及其它反應(yīng)性或聯(lián)接官能團(tuán)，以及自由基殘基和自由基正離子可以實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合組分90a和/或90b與探針41和/或43的共價(jià)聯(lián)接，通過其能夠完成蛋白質(zhì)的偶聯(lián)反應(yīng)。也可以引入表面官能團(tuán)作為功能化的共聚單體，這是因?yàn)槲⒘５谋砻婵梢院休^高濃度的極性基團(tuán)。而且，盡管微粒探針通常在合成后進(jìn)行功能化，但在諸如聚(苯硫酚)這類的情況下，微粒能夠與蛋白質(zhì)直接共價(jià)聯(lián)接而不需要進(jìn)一步修飾。例如圖6，其表示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中共價(jià)結(jié)合探針的過程。如圖所示，結(jié)合過程的第一步為利用碳化二亞胺在探針表面上活化羧基。第二步，活化的羧酸基團(tuán)與抗體的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。所述活化作用和/或抗體偶聯(lián)可在緩沖液中進(jìn)行，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)(如pH值7.2)或2-(N-嗎啉)乙基磺酸(MES)(如pH值5.3)。如圖所示，得到的探針可以被乙醇胺所阻斷，從而形成探針復(fù)合物。除了共價(jià)聯(lián)接，其它聯(lián)接技術(shù)如吸附作用也可用于本發(fā)明。
參見圖1-2，首先將含有分析物的試樣加到加樣墊上。接著該試樣從加樣墊移動(dòng)到結(jié)合墊22上，在此分析物與檢測探針41和/或校正探針43混合。根據(jù)所選的探針類型，分析物可與檢測探針41和/或校正探針43結(jié)合形成復(fù)合物49(參見圖2)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，含有分析物的試樣與(1)和第一結(jié)合組分90a結(jié)合的熒光非磁性顆粒41以及(2)和第二結(jié)合組分90b結(jié)合的熒光磁性顆粒43混合。在該實(shí)施方式中，分析物與熒光非磁性顆粒41和熒光磁性顆粒43形成夾層復(fù)合物49。另外，由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體連通，該復(fù)合物49可從結(jié)合墊22移動(dòng)到多孔膜23上的檢測區(qū)31中。
在檢測區(qū)31，接著將復(fù)合物49與任何未結(jié)合的復(fù)合熒光磁性顆粒43通過磁性裝置60捕獲，并采用常規(guī)技術(shù)從剩余樣品中分離。例如，可用磁場發(fā)生器產(chǎn)生磁場引起磁感應(yīng)性探針的感應(yīng)。合適的磁場發(fā)生器包括但不限于，永磁體和電磁體。典型的磁分離過程包括在液體介質(zhì)中將樣品與磁性顆?；旌贤ㄟ^親和反應(yīng)結(jié)合分析物，再通過施加磁場將未結(jié)合的磁性顆粒與分析物復(fù)合物從樣品介質(zhì)中分離。如果不是全部的磁性顆粒，則大多數(shù)磁性顆粒會(huì)及時(shí)沉淀下來，除了那些膠體顆粒。因而，可以攪拌該液體介質(zhì)從而使顆粒懸浮足夠長的時(shí)間以便發(fā)生生物親和性結(jié)合反應(yīng)。已知的攪拌方法例子包括晃動(dòng)、渦流、搖動(dòng)、旋轉(zhuǎn)或類似操作于部分填充的容器。一些商業(yè)上使用的合適的磁性分離裝置包括紐約成功湖的Dynal公司生產(chǎn)的Dynal MPC系列分離器，其中在容器的外部設(shè)置永磁體，所述容器用于容納測試介質(zhì)，該裝置僅僅用于分離。單獨(dú)對(duì)測試介質(zhì)中的磁性顆粒進(jìn)行混合從而進(jìn)行親和結(jié)合反應(yīng)。此外，其它用于捕獲磁性顆粒的方法在Liberti等人的5200084號(hào)，Tuunanen等人的5647994號(hào)，Wang等人的5795470號(hào)，以及Siddiqi的6033574號(hào)美國專利中有所記載，在此出于各種目的對(duì)其全文引用作為參考。
一旦被捕獲，復(fù)合的和未復(fù)合的熒光磁性顆粒43以及復(fù)合物49的熒光信號(hào)可以用常規(guī)的技術(shù)測得。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，顆粒43和復(fù)合物49可被相同的外部源所激發(fā)。在該實(shí)施方式中，該外部源提供激發(fā)波長的輻射，從而引起顆粒43發(fā)光，其波長與復(fù)合物49發(fā)出的波長不同。這就可以分別測得復(fù)合物49與顆粒41的存在。或者，也可以使用分別的外部源來分別測量顆粒43與復(fù)合物49。
一般來說，熒光是特定熒光組分的三步過程形成的結(jié)果。第一步中，外部源諸如白熾燈或激光提供能量并被熒光化合物所吸收，形成激發(fā)電子單重態(tài)。第二步中，激發(fā)態(tài)存在有限的時(shí)間，在此期間熒光化合物經(jīng)歷了構(gòu)象變化并與其分子環(huán)境發(fā)生多種可能的交互作用。在此期間，激發(fā)態(tài)能量部分消耗，形成松弛態(tài)，產(chǎn)生熒光發(fā)射。第三步是熒光發(fā)射階段，其中能量被釋放，熒光化合物回到其基態(tài)。發(fā)射的能量低于其激發(fā)能量(光或者激光)因而波長較長。這種能量或者波長的改變或者區(qū)別使得發(fā)射能量可被檢測得到并且可與激發(fā)能量相區(qū)別。
一般來說，熒光檢測利用波長過濾從激發(fā)光子中分離發(fā)射光子，以及利用檢測器記錄發(fā)射光子并產(chǎn)生可記錄的輸出，所述輸出通常是電信號(hào)或者攝影圖像。通常有四種類型的公知檢測器熒光分光光度計(jì)與微板讀數(shù)器，熒光顯微鏡，熒光掃描儀以及流式細(xì)胞儀。本發(fā)明使用的一種適合的熒光檢測器為新澤西Edison的SPEX工業(yè)公司銷售的FluoroLog III熒光分光光度計(jì)。
盡管不需要，但特別理想的檢測和校正探針對(duì)的選擇標(biāo)準(zhǔn)包括(1)吸收光譜或者或熒光光譜沒有或者很少有光譜重疊，這樣才能分別地測量發(fā)射強(qiáng)度；(2)當(dāng)相互接近時(shí)檢測和校正探針之間沒有顯著的熒光能量傳遞，這樣它們能夠獨(dú)立地發(fā)光；以及(3)相對(duì)較長的發(fā)射波長(例如大于約600nm)，這樣生物液體的自身熒光對(duì)該熒光測量中的影響很小。例如圖7表示了激發(fā)光譜具有很少重疊的校正探針和檢測探針的例子，這樣它們能夠分別地被激發(fā)。
另外如果需要，已知的“時(shí)間分辨熒光檢測”技術(shù)也可用于本發(fā)明。時(shí)間分辨熒光檢測的設(shè)計(jì)是利用一定熒光材料，如銪((III))和鋱((III))的鑭系螯合物的熒光特性，減少來自于發(fā)射源或者散射過程(激發(fā)輻射的散射引起)的背景信號(hào)。當(dāng)在較短波長處激發(fā)螯合物后，這些螯合物顯示出強(qiáng)烈的紅色飄移、窄帶、長壽命的發(fā)射。典型地是，由于生色基團(tuán)在分子中離鑭系元素位置很近，該螯合物具有強(qiáng)烈的紫外吸收帶。在生色基團(tuán)吸收了光之后，激發(fā)能量可從該激發(fā)的生色基團(tuán)傳遞到鑭系元素。接著該鑭系元素具有了熒光發(fā)射特性。采用脈沖式激發(fā)和按時(shí)選通的檢測，以及窄帶發(fā)射濾波器，可以僅僅對(duì)來自鑭系元素螯合物的熒光進(jìn)行特定檢測，而排除樣品中存在的其它物質(zhì)的發(fā)射光，這些發(fā)射光通常壽命較短或者是具有較小波長的發(fā)射。測量熒光的其它時(shí)間分辨技術(shù)在Davidson的5585276號(hào)和Hemmila等人的5637509號(hào)美國專利中有所記載，在此出于各種目的對(duì)其進(jìn)行全文引用作為參考。
不考慮測量熒光的技術(shù)，通過比較捕獲的熒光非磁性顆粒41與捕獲的熒光磁性顆粒43的熒光信號(hào)可以確定分析物的絕對(duì)量?？蓪?duì)捕獲的熒光非磁性顆粒41的熒光強(qiáng)度Is與捕獲的熒光磁性顆粒43的熒光強(qiáng)度Ic進(jìn)行比較。捕獲的熒光磁性顆粒43的總量為預(yù)定和已知的，因而可以作校正目的使用。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，分析物的量與Is和Ic的比率成正比。根據(jù)檢測區(qū)31的強(qiáng)度范圍，可以確定分析物大致的濃度范圍。結(jié)果，校正和樣品測試可在大致相同的條件下同時(shí)操作，這樣就提供了可靠的定量或半定量的結(jié)果，靈敏度也有所提高。
如果需要，可以在已知的分析物濃度范圍內(nèi)對(duì)Is與Ic的比率和分析物濃度進(jìn)行作圖從而得到校正曲線。為了測得未知試樣中分析物的量，根據(jù)該校正曲線可將該信號(hào)比轉(zhuǎn)換成分析物濃度。值得注意的是，對(duì)于任意給定樣品，復(fù)合的和未復(fù)合的熒光磁性顆粒的捕獲效率通常是相同的。因此，并不認(rèn)為捕獲效率的改變會(huì)顯著干擾樣品與樣品之間的結(jié)果，這是因?yàn)橛脽晒鈴?qiáng)度比率(即Is/Ic)代替了絕對(duì)的熒光。還應(yīng)注意的是，也可以就Is與Ic之間的其它數(shù)學(xué)關(guān)系對(duì)分析物濃度進(jìn)行作圖從而得到校正曲線。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，可以就Is/(Is與Ic)的值對(duì)分析物濃度進(jìn)行作圖從而得到校正曲線。
根據(jù)本發(fā)明也可設(shè)計(jì)其它各種實(shí)施方式。例如，參見圖3，上述的和圖1所示的裝置20也可變?yōu)閵A層測定的另一種形式。例如在一個(gè)實(shí)施方式中，先將含有分析物的試樣與(1)結(jié)合了第一結(jié)合組分190a的熒光非磁性顆粒141a，(2)熒光磁性顆粒143，以及(3)結(jié)合了第二結(jié)合組分190b的熒光磁性顆粒141b混合。在該特別實(shí)施方式中，熒光磁性顆粒143可被諸如β-酪蛋白的阻斷劑阻斷，以防止與分析物的非特異性結(jié)合，從而使這些顆粒143僅僅用作校正探針。此外，第一特異性結(jié)合組分190a和第二特異性結(jié)合組分190b可以為分析物類似物。
術(shù)語“阻斷劑”意思是連接到探針表面使之“阻斷”或防止非分析物質(zhì)與該表面結(jié)合的試劑。阻斷劑可包括但不限于，β-酪蛋白，白蛋白如牛血清白蛋白，pluronic或其他表面活性劑、聚乙二醇、聚乙烯醇，或者上述化合物的硫衍生物，以及其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的阻斷材料。
參見圖3，分析物與復(fù)合的熒光非磁性顆粒141a和復(fù)合的非熒光磁性顆粒141b形成夾層復(fù)合物149。由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體連通，因此復(fù)合物149可以從結(jié)合墊22移動(dòng)到多孔膜23上的檢測區(qū)31。在檢測區(qū)31，接著復(fù)合物149以及任何未結(jié)合的顆粒143和/或141b被磁性裝置60所捕獲并從剩余樣品中分離。如上所述，通過比較捕獲的熒光非磁性顆粒141a的熒光強(qiáng)度Is與捕獲的熒光磁性顆粒143的熒光強(qiáng)度Ic，可以確定分析物的絕對(duì)量。特別是捕獲的熒光磁性顆粒143的總量是預(yù)定和已知的，因而可以作校正目的使用。因此，在該實(shí)施方式中分析物的量與Is和Ic的比例成正比。
另外，參見圖4，上述的和圖1所示的裝置20也可變?yōu)楦偁幮詼y定形式。例如在一個(gè)實(shí)施方式中，先將含有分析物的試樣與(1)結(jié)合了第一結(jié)合組分290a的熒光非磁性顆粒241，以及(2)結(jié)合了第二結(jié)合組分290b的熒光磁性顆粒243混合。在該特別實(shí)施方式中，第一結(jié)合組分290a可與分析物相同，而第二結(jié)合組分290b可以為分析物類似物。
混合之后，分析物與復(fù)合的熒光非磁性顆粒241競爭復(fù)合的熒光磁性顆粒243，這樣形成了分析物與熒光磁性顆粒243的復(fù)合物249a以及熒光磁性顆粒243與熒光非磁性顆粒241的復(fù)合物249b。由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體連通，復(fù)合物249a和249b可從結(jié)合墊22移動(dòng)到多孔膜23上的檢測區(qū)31。在檢測區(qū)31，接著復(fù)合物249a和249b以及任何未結(jié)合的顆粒243被磁性裝置60所捕獲并從剩余樣品中分離。如上所述，通過比較捕獲的熒光非磁性顆粒241的熒光強(qiáng)度Is與捕獲的、復(fù)合或未復(fù)合的熒光磁性顆粒243的熒光強(qiáng)度Ic，可以確定分析物的絕對(duì)量。特別是捕獲的熒光磁性顆粒243的總量是預(yù)定和已知的，因而可以作校正目的使用。因此，在該實(shí)施方式中分析物的量與Is和Ic的比例成反比。
參見圖5，上述的和圖1所示的裝置20也可變?yōu)榱硪环N競爭性測定形式。例如在一個(gè)實(shí)施方式中，先將含有分析物的試樣與(1)結(jié)合了第一結(jié)合組分390a的熒光非磁性顆粒341a，(2)熒光磁性顆粒343，以及(3)結(jié)合了第二結(jié)合組分390b的非熒光磁性顆粒341b混合。在該特別實(shí)施方式中，第一結(jié)合組分390a可與分析物相同，而第二結(jié)合組分390b可以為分析物類似物。此外，熒光磁性顆粒343可被諸如β-酪蛋白的阻斷劑阻斷，以防止與分析物的非特異性結(jié)合，從而這些顆粒只用作校正探針。
混合之后，分析物與復(fù)合的熒光非磁性顆粒341a競爭復(fù)合的非熒光磁性顆粒341b，這樣形成了分析物與非熒光磁性顆粒341b的復(fù)合物349a以及非熒光磁性顆粒341b與熒光非磁性顆粒341a的復(fù)合物349b。由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體連通，復(fù)合物349a和349b可從結(jié)合墊22移動(dòng)到多孔膜23上的檢測區(qū)31。在檢測區(qū)31，接著復(fù)合物349a和349b以及任何未復(fù)合的顆粒343和/或341b被磁性裝置60所捕獲并從剩余樣品中分離。如上所述，通過比較捕獲的熒光非磁性顆粒341a的熒光強(qiáng)度Is與捕獲的熒光磁性顆粒343的熒光強(qiáng)度Ic，可以確定分析物的絕對(duì)量。特別是捕獲的熒光磁性顆粒343的總量是預(yù)定和已知的，因而可以作校正目的使用。因此，在該實(shí)施方式中分析物的量與Is和Ic的比率成反比。
盡管上面描述了該裝置構(gòu)造的多種實(shí)施方式，但應(yīng)當(dāng)明白的是，一般來說本發(fā)明的裝置可以具有任何想要的構(gòu)造，而不需要包括所有的上述元件。此外，裝置20還可使用不同的測定形式。例如，可以形成如圖4所示和上面所描述的競爭性測定，除了顆粒241是熒光磁性顆粒而顆粒243是熒光非磁性顆粒。同樣，可以形成如圖5所示和上面所描述的競爭性測定，除了顆粒341a是非熒光磁性顆粒而顆粒341b是熒光非磁性顆粒。其它多種裝置構(gòu)造和/或測定形式在Lambotte等人的5395754號(hào)，Jou等人的5670381號(hào)以及Malick等人的6194220號(hào)美國專利中有所記載，在此出于各種目的對(duì)其全文引用作為參考。
另外，盡管上面描述了多種實(shí)施方式，特別地涉及將熒光用作校正和檢測機(jī)制，但其它已知的檢測機(jī)制也同樣可應(yīng)用于本發(fā)明。例如，在一些實(shí)施方式中，檢測和/或校正探針可為化學(xué)發(fā)光或者磷光化合物。例如化學(xué)發(fā)光探針可以通過使用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)物激發(fā)。根據(jù)本發(fā)明還可以設(shè)計(jì)出其它的實(shí)施方式和構(gòu)造。
發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基于膜的測定裝置可用于控制磁性探針并建立分析物的分離和檢測。特別是將磁性分離和檢測技術(shù)(例如熒光)結(jié)合在一完整系統(tǒng)中。而且，該系統(tǒng)是自校正形式的從而消除了使用常規(guī)的外部校正技術(shù)時(shí)對(duì)對(duì)照校正樣品的需要。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過使用熒光磁性探針實(shí)現(xiàn)自校正。熒光磁性探針以及熒光非磁性探針發(fā)出的熒光可以在同一樣品中分別被檢測到。因?yàn)榇判灶w粒的數(shù)量是預(yù)定的，當(dāng)確定被捕獲的熒光非磁性探針的量并隨后確定分析物的量時(shí)，系統(tǒng)進(jìn)行自校正。另外，由于校正和檢測探針的熒光是在同樣條件下同時(shí)測量的，可以避免諸如溫度和儀器不穩(wěn)定性等許多變化可能造成的干擾，從而提高檢測可靠性和穩(wěn)定性。
參考以下實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。
實(shí)施例1證明了利用如圖3所示的夾層測定法可檢測分析物存在的能力。首先將下列組分加入6個(gè)Eppendorf管中(1)25微升共價(jià)結(jié)合的非熒光磁性顆粒(PBS緩沖液中3毫克每毫升)；(2)15微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(3)10微升用β-酪蛋白(PBS緩沖液中3毫克每毫升)阻斷的熒光磁性顆粒；以及
(4)促黃體生成激素(LH)分析物，范圍從0，10微升(1微克每毫升)，20微升(1微克每毫升)，40微升(1微克每毫升)，40微升(2微克每毫升)，到80微升(2微克每毫升)。
向每個(gè)Eppendorf管加入適量的PBS緩沖液至最終體積為150微升。在室溫下孵化并輕輕搖動(dòng)該試樣10分鐘。再通過Dynal公司的磁性分離器將磁性顆粒分離。棄去每個(gè)管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液。用N.J.Edison SPEX工業(yè)公司的“Fluorolog III熒光分光光度計(jì)”采用直角模式測量樣品的熒光。對(duì)于熒光磁性顆粒，采用470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，對(duì)于熒光非磁性顆粒，采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。積分時(shí)間為0.2秒。
圖8顯示了作為每個(gè)樣品中LH量的函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和校正后的熒光強(qiáng)度。將測量的樣品的熒光強(qiáng)度除以對(duì)照樣品的熒光強(qiáng)度得到標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)度。對(duì)照樣品為不含分析物的樣品。
實(shí)施例1中所用的顆粒形成如下非熒光磁性顆粒通過磁分離器將125微升10％的經(jīng)羧基修飾的順磁性顆粒(0.35微米，Estapor超順磁性微球，來自Bang’s Laboratories公司)用1.5毫升碳酸鹽緩沖液洗滌一次，PBS洗滌兩次。再將洗滌后的顆粒重新懸浮于0.6毫升的PBS和15毫克的碳化二亞胺(來自Polysciences公司)中。在振蕩器上使該混合物在室溫下(RT)反應(yīng)30分鐘。再將活化的顆粒用硼酸鹽緩沖液洗滌兩次。將該活化的顆粒再次重懸浮于1.2毫升的硼酸鹽緩沖液中。之后，將30微升LHβ-單克隆抗體(9.8mg/ml，購自Fitzgerald國際工業(yè)公司)加入該活化的顆粒中。室溫下讓反應(yīng)混合物在振蕩器上反應(yīng)過夜。然后收集該活化的顆粒并在1毫升0.1摩的乙醇胺中孵化并輕搖15分鐘。再將該顆粒用PBS洗滌兩次并在4℃下儲(chǔ)存于含有0.1摩PBS，0.15摩NaCl，1％β-酪蛋白，5％甘油以及0.1％NaN3的緩沖液中。
熒光非磁性顆粒根據(jù)上述步驟將“熒光非磁性”顆粒共價(jià)結(jié)合，但是所述結(jié)合組分是LHα-單克隆抗體(9.8毫克每毫升，購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司)，而不是LHβ-單克隆抗體。所用的該顆粒是購自于Molecular Probes公司的FluoSpheres羧基修飾微球。該顆粒尺寸為0.5微米，在580納米波長激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，并且其發(fā)射波長為605納米。
熒光磁性顆粒在Eppendorf管中加入100微升2.76％熒光超順磁性顆粒的固體(購自于賓西法尼亞沃靈頓的Polysciences公司)懸浮液和1毫升硼酸鹽緩沖液(0.1摩，pH＝8.5)。這些顆粒平均直徑在1至2微米之間，并且確信為含鐵微球，其具有可以被動(dòng)吸附的聚乙烯表面以及與蛋白質(zhì)反應(yīng)的官能團(tuán)。通過購自于Dynal公司的磁性分離器分離該顆粒，并重懸于200微升的0.1摩硼酸鹽緩沖液中，該緩沖液中含有10毫克每毫升的β-酪蛋白。懸浮液孵化30分鐘并輕輕混勻。上述步驟重復(fù)兩次。所述分離的顆粒重懸于200微升PBS中并且4℃儲(chǔ)存。
促黃體生成激素(LH)“促黃體生成激素(LH)”購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司。
實(shí)施例2證明了利用如圖2所示的夾層測定法可檢測分析物存在的能力。首先將下列組分加入6個(gè)Eppendorf管中(1)5微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(2)15微升物理吸附的結(jié)合熒光磁性顆粒(PBS緩沖液中3毫克每毫升)；以及(3)促黃體生成激素(LH)分析物范圍從0，5，10微升到20，40，100微升(2微克每毫升)。
向每個(gè)Eppendorf管加入適量的PBS緩沖液至最終體積為150微升。室溫下孵化并輕輕搖動(dòng)該試樣25分鐘。再通過Dynal公司的磁性分離器將磁性顆粒分離。棄去每個(gè)管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液。用N.J.Edison SPEX工業(yè)公司的“Fluorolog III熒光分光光度計(jì)”采用直角模式測量樣品的熒光。對(duì)于熒光磁性顆粒，采用470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，對(duì)于熒光非磁性顆粒，采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。積分時(shí)間為0.2至1秒。
圖9顯示了作為每個(gè)樣品中LH量的函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和經(jīng)校正的熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例2中所用的顆粒形成如下熒光非磁性顆?！盁晒夥谴判浴鳖w粒的形成如實(shí)施例1中所述。
熒光磁性顆粒將2.76毫克熒光超順磁性顆粒(2.5％固體水懸浮液)購自于賓西法尼亞沃靈頓的Polysciences公司。將該顆粒用硼酸鹽緩沖液洗滌三次，并通過購自于Dynal公司的磁分離器分離該顆粒。將洗滌后的顆粒重懸于200微升硼酸鹽緩沖液，并加入82微克β-促黃體生成激素(β-LH)單克隆抗體(1毫克每毫升，購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司)。將該混合物在室溫下輕輕混勻過夜。再通過磁分離器收集該顆粒，并在200微升β-酪蛋白(硼酸鹽緩沖液中10毫克每毫升)中孵化30分鐘并輕輕混勻以阻斷非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。被阻斷的顆粒用PBS洗滌兩次并儲(chǔ)存在0.1摩的PBS中。
促黃體生成激素(LH)“促黃體生成激素(LH)”購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司。
實(shí)施例3自校正的磁性結(jié)合測定法與非校正性的磁性結(jié)合測定法比較。
沒有自校正首先將下列組分加入5個(gè)Eppendorf管中(表I中第2-6號(hào)管)(1)15微升共價(jià)結(jié)合的非熒光磁性顆粒(0.1摩PBS緩沖液中3毫克每毫升)；(2)15微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(3)20微升促黃體生成激素(LH)分析物(1微克每毫升)；以及(4)20微升PBS。
對(duì)照Eppendorf管中僅含有20微升PBS(表I中第1號(hào)管)。
室溫下孵化并輕輕搖動(dòng)該樣品20分鐘。再通過Dynal公司的磁分離器將磁性顆粒分離。棄去每個(gè)管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液。用N.J.Edison SPEX工業(yè)公司的“Fluorolog III熒光分光光度計(jì)”采用直角模式測量樣品的熒光。在不同天，采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長，測量熒光。
表I列出了每天測得的相對(duì)熒光數(shù)據(jù)。
表I熒光檢測
具有自校正首先將下列組分加入5個(gè)Eppendorf管中(表II中第9-13號(hào)管)(1)15微升共價(jià)結(jié)合的非熒光磁性顆粒(0.1摩PBS緩沖液中3毫克每毫升)；(2)15微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(3)20微升被β-酪蛋白(PBS緩沖液中3毫克每毫升)阻斷的熒光磁性顆粒；以及(4)20微升促黃體生成激素(LH)分析物(1微克每毫升)；以及(5)20微升PBS。
對(duì)照Eppendorf管中僅含有20微升PBS(表II中第8號(hào)管)。
室溫下孵化并輕輕搖動(dòng)該樣品20分鐘。再通過Dynal公司的磁性分離器將磁性顆粒分離。棄去每個(gè)管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液用“Fluorolog III熒光分光光度計(jì)”采用直角模式測量樣品的熒光。在不同天，對(duì)于熒光磁性顆粒采用470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，對(duì)于熒光非磁性顆粒采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。
表II列出了每天測得的相對(duì)熒光數(shù)據(jù)。
表II熒光檢測
從兩種體系的每組樣品比較可以看出，甚至在小心控制的條件下，自校正系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(Std.Dev％)比沒用自校正時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)偏差小得多。由于自校正系統(tǒng)很少受測量條件影響，所以可預(yù)計(jì)，當(dāng)沒有對(duì)條件進(jìn)行小心控制時(shí)，自校正系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差仍將比沒有自校正的標(biāo)準(zhǔn)偏差更小。
實(shí)施例3中使用的顆粒形成如下非熒光磁性顆?！胺菬晒獯判浴鳖w粒的形成如上面實(shí)施例1中所述。
熒光非磁性顆?！盁晒夥谴判浴鳖w粒的形成如上面實(shí)施例1中所述。
熒光磁性顆?！盁晒獯判灶w?！钡男纬扇缟厦鎸?shí)施例2中所述。
促黃體生成激素(LH)“促黃體生成激素(LH)”購自于Fitzgerald國際工業(yè)公司。
實(shí)施例4證明了利用如圖3所示的夾層測定法可檢測分析物存在的能力。首先將下列組分加入6個(gè)Eppendorf管中
(1)30微升共價(jià)結(jié)合的非熒光磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(2)20微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(PBS緩沖液中2毫克每毫升)；(3)15微升用β-酪蛋白(PBS緩沖液中1毫克每毫升)阻斷的熒光磁性顆粒；以及(4)C反應(yīng)蛋白(CRP)分析物范圍從0，5，10，20，50到100微升(PBS中0.2微克每毫升)。
室溫下孵化并輕輕搖動(dòng)該試樣20分鐘。再通過Dynal公司的磁性分離器將磁性顆粒分離。棄去每個(gè)管的上清液再將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升的PBS中。每次熒光測量使用300微升該熒光磁性顆粒懸浮液。用N.J.Edison SPEX工業(yè)公司的“Fluorolog III熒光分光光度計(jì)”采用直角模式測量樣品的熒光。對(duì)于熒光磁性顆粒，采用將470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，對(duì)于熒光非磁性顆粒采用570納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。積分時(shí)間為0.2至1秒。圖10顯示了作為每個(gè)樣品中CRP劑量的函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例4中所用的顆粒形成如下非熒光磁性顆粒通過磁分離器將125微升10％的經(jīng)羧基修飾的順磁性顆粒(0.35微米，Estapor超順磁性微球，來自Bang’s Laboratories公司)用1.5ml碳酸鹽緩沖液洗滌一次，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次。再將洗滌后的顆粒重新懸浮于0.6毫升的PBS和15毫克的碳化二亞胺(來自Polysciences公司)中。在振蕩器上使該混合物在室溫下(RT)反應(yīng)30分鐘。再將活化的顆粒用硼酸鹽緩沖液洗滌兩次。將該活化的顆粒再次重懸浮于1.2ml的硼酸鹽緩沖液中。之后，將30微升抗C反應(yīng)蛋白(anti-CRP1)單克隆抗體(Mab A5804，2mg/ml，購自Biospacific公司)加入該活化的顆粒中。室溫下讓反應(yīng)混合物在振蕩器上反應(yīng)過夜。然后收集該活化的顆粒并在1毫升0.1摩的乙醇胺中孵化輕搖15分鐘。再將該顆粒用PBS洗滌兩次并在4℃下儲(chǔ)存于含有0.1摩PBS，0.15摩NaCl，1％β-酪蛋白，5％甘油以及0.1％NaN3的緩沖液中。
熒光非磁性顆粒根據(jù)上述步驟將“熒光非磁性”顆粒共價(jià)結(jié)合，除了該結(jié)合組分是用抗C反應(yīng)蛋白(抗-CRP2)單克隆抗體(2mg/ml，購自Biospacific公司)代替抗-CRP1。所用的該顆粒是購自于Molecular Probes公司的FluoSpheres羧基修飾微球。該顆粒尺寸為0.5微米，在580納米波長激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，并且其發(fā)射波長為605納米。
熒光磁性顆粒100微升2.76％熒光超順磁性顆粒固體(購自于賓西法尼亞沃靈頓的Polysciences公司)的懸浮液。這些顆粒平均直徑在1至2微米之間并且確信為含鐵微球，其具有可以被動(dòng)吸附的聚乙烯表面以及與蛋白質(zhì)反應(yīng)的官能團(tuán)。再向Eppendorf管中的顆粒加入1毫升硼酸鹽緩沖液(0.1摩，pH＝8.5)。通過購自于Dynal公司的磁分離器分離該顆粒，并將顆粒重懸于0.1M硼酸鹽緩沖液中的200微升10mg/mlβ-酪蛋白溶液中。懸浮液保溫30分鐘并輕輕混勻。上述步驟重復(fù)兩次。所述分離的顆粒重懸于200微升PBS中并且4℃儲(chǔ)存。
C反應(yīng)蛋白(CRP)所述“C反應(yīng)蛋白(CRP)購自于BioPacific公司。
實(shí)施例5證明了構(gòu)成基于膜技術(shù)的測定的能力。首先，將由硝酸纖維素制成的Millipore SX多孔膜樣品壓覆于長約30厘米的相應(yīng)的支持片上。膜的一端連接纖維素吸收墊(Millipore公司)。膜的另一端壓覆兩個(gè)玻璃纖維墊(樣品墊和結(jié)合墊)。該結(jié)合墊和吸收墊與膜直接接觸，而樣品墊與結(jié)合墊直接接觸。
再用2％的聚乙二醇山梨醇單月桂酸酯(Sigma-Aldirich的名為“Tween20”的非離子表面活性劑)處理每個(gè)樣品的樣品墊，并在37℃下干燥1小時(shí)。用非熒光磁性顆粒、熒光非磁性顆粒、熒光磁性顆粒、Tween20以及蔗糖浸泡該結(jié)合墊，再在37℃下干燥1小時(shí)?！胺菬晒獯判灶w粒”、“熒光非磁性顆?！币约啊盁晒獯判灶w粒”的形成如上面實(shí)施例1中所述。
每個(gè)樣品的中間部分下面放一個(gè)磁條形成檢測區(qū)。此后，將40微升PBS緩沖液加到第一樣品的加樣墊上，40微升促黃體生成激素(LH)(0.5微克/毫升)加到第二樣品的加樣墊上，以及40微升LH(5微克/毫升)加到第三樣品的加樣墊上。30分鐘后，用“Fluorolog III熒光分光光度計(jì)”采用正面模式并相對(duì)樣品成30°角測量在檢測區(qū)捕獲的熒光磁性顆粒和熒光非磁性顆粒。對(duì)于熒光磁性顆粒，采用470納米的激發(fā)波長和560納米的發(fā)射波長，對(duì)于熒光非磁性顆粒，采用560納米的激發(fā)波長和605納米的發(fā)射波長。
上述三種樣品的熒光檢測信號(hào)分別計(jì)為187000，217000和271000。上述三種樣品的熒光校正信號(hào)分別計(jì)為99000，103000，81000。
盡管已經(jīng)根據(jù)特定實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述實(shí)施方式，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)對(duì)前文的理解，可以容易地設(shè)計(jì)出這些實(shí)施方式的替換物、變形物以及等價(jià)物。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)為以下權(quán)利要求及其等同物的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的基于膜的測定裝置，所述裝置包括與可產(chǎn)生檢測信號(hào)的檢測探針和可產(chǎn)生校正信號(hào)的磁性校正探針流體連通的多孔膜，所述多孔膜界定了檢測區(qū)；以及設(shè)置在鄰近所述檢測區(qū)處的磁性裝置，其中所述磁性裝置能夠?qū)⑺鰴z測探針和所述校正探針從施加到所述多孔膜上的試樣中分離出來，其中所述試樣中分析物的量與在所述檢測區(qū)由所述分離的檢測探針產(chǎn)生的檢測信號(hào)強(qiáng)度成比例，所述檢測信號(hào)經(jīng)所述檢測區(qū)中由所述分離的校正探針產(chǎn)生的校正信號(hào)強(qiáng)度校正。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，還包括一個(gè)或多個(gè)與所述多孔膜流體連通的結(jié)合墊，所述檢測探針和所述校正探針施加于所述一個(gè)或多個(gè)結(jié)合墊。
3.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述多孔膜與施加樣品的加樣墊流體連通。
4.如權(quán)利要求1所述的裝置，還包括與所述多孔膜流體連通的吸收墊，以有助于試樣流過。
5.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述檢測探針和所述校正探針為熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物或其組合。
6.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述檢測探針為熒光非磁性化合物。
7.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述校正探針為熒光磁性顆粒。
8.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述檢測探針能夠與分析物結(jié)合。
9.如權(quán)利要求1所述的裝置，還包括非熒光磁性顆粒。
10.如權(quán)利要求9所述的裝置，其中所述非熒光磁性顆粒能夠與分析物結(jié)合。
11.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述分離的檢測探針包括由所述檢測探針形成的復(fù)合物。
12.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述分離的校正探針包括由所述校正探針形成的復(fù)合物。
13.如權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述試樣中分析物的量與在所述檢測區(qū)由所述分離的檢測探針產(chǎn)生的檢測信號(hào)強(qiáng)度和在所述檢測區(qū)由所述分離的校正探針產(chǎn)生的校正信號(hào)強(qiáng)度的商成比例。
14.一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的基于測流膜的測定裝置，所述裝置包括與可產(chǎn)生檢測信號(hào)的檢測探針、可產(chǎn)生校正信號(hào)的熒光磁性校正探針、以及可選擇性的非熒光磁性顆粒流體連通的多孔膜，所述多孔膜界定了檢測區(qū)；以及設(shè)置在鄰近所述檢測區(qū)處的磁性裝置，其中所述磁性裝置能夠?qū)⑺鰴z測探針和所述校正探針從施加到所述多孔膜上的試樣中分離出來，其中所述試樣中分析物的量與在所述檢測區(qū)由所述分離的檢測探針產(chǎn)生的檢測信號(hào)強(qiáng)度成比例，所述檢測信號(hào)經(jīng)所述檢測區(qū)中由所述分離的校正探針產(chǎn)生的校正信號(hào)強(qiáng)度校正。
15.如權(quán)利要求14所述的裝置，還包括一個(gè)或多個(gè)與所述多孔膜流體連通的結(jié)合墊，所述檢測探針和所述校正探針施加于所述一個(gè)或多個(gè)結(jié)合墊。
16.如權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述多孔膜與施加樣品的加樣墊流體連通。
17.如權(quán)利要求14所述的裝置，還包括與所述多孔膜流體連通的吸收墊，以有助于試樣流過。
18.如權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述檢測探針為熒光非磁性復(fù)合物。
19.如權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述分離的檢測探針包括由所述檢測探針形成的復(fù)合物。
20.如權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述分離的校正探針包括由所述校正探針形成的復(fù)合物。
21.如權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述試樣中分析物的量與在所述檢測區(qū)由所述分離檢測探針產(chǎn)生的檢測信號(hào)強(qiáng)度和在所述檢測區(qū)由所述分離校正探針產(chǎn)生的校正信號(hào)強(qiáng)度的商成比例。
22.一種用于檢測試樣中分析物的存在或者量的方法，所述方法包括i)提供基于膜的裝置，所述裝置包括a)與能夠產(chǎn)生檢測信號(hào)的檢測探針以及能夠產(chǎn)生校正信號(hào)的磁性校正探針流體連通的多孔膜，所述多孔膜界定了檢測區(qū)域；以及b)設(shè)置在鄰近所述檢測區(qū)處的磁性裝置；ii)將所述檢測探針和所述校正探針與所述試樣接觸形成溶液；iii)利用所述磁性裝置在所述檢測區(qū)從所述溶液中分離所述檢測探針和所述校正探針；iv)激發(fā)所述分離的檢測探針以及所述分離的校正探針，其中所述激發(fā)引起所述分離的檢測探針發(fā)出所述檢測信號(hào)，以及所述分離的校正探針發(fā)出所述校正信號(hào)；v)在第一發(fā)射波長處測量所述檢測信號(hào)的強(qiáng)度以及在第二發(fā)射波長處測量所述校正信號(hào)的強(qiáng)度，所述第二發(fā)射波長可以與第一發(fā)射波長相同或不同；以及vi)比較所述檢測信號(hào)和所述校正信號(hào)的強(qiáng)度，其中所述試樣中分析物的量與經(jīng)所述校正信號(hào)強(qiáng)度值校正的所述檢測信號(hào)的強(qiáng)度值成比例。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述基于膜的裝置還包括一個(gè)或多個(gè)與所述多孔膜流體連通的結(jié)合墊，所述檢測探針和所述校正探針應(yīng)用于所述一個(gè)或多個(gè)結(jié)合墊。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述多孔膜與施加樣品的加樣墊流體連通。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，還包括與所述多孔膜流體連通的吸收墊，以有助于試樣流過。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述檢測探針是非磁性的。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，所述分離的檢測探針包括由所述檢測探針形成的復(fù)合物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述復(fù)合物是與分析物形成的。
29.如權(quán)利要求22所述的方法，所述分離的校正探針包括由所述校正探針形成的復(fù)合物。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述復(fù)合物是與分析物形成的。
31.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述第一發(fā)射波長與所述第二發(fā)射波長不同。
32.如權(quán)利要求22所述的方法，所述方法還包括為多個(gè)預(yù)定分析物濃度就經(jīng)所述校正信號(hào)強(qiáng)度值校正的所述檢測信號(hào)強(qiáng)度值進(jìn)行作圖，從而得到校正曲線。
33.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述分離的檢測探針與所述分離的校正探針同時(shí)被激發(fā)。
34.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述分離的檢測探針與所述分離的校正探針分別被激發(fā)。
35.如權(quán)利要求22所述的方法，其中同時(shí)測量所述檢測信號(hào)和所述校正信號(hào)的強(qiáng)度。
36.如權(quán)利要求22所述的方法，其中分別測量所述檢測信號(hào)和所述校正信號(hào)的強(qiáng)度。
37.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述檢測和校正探針是化學(xué)發(fā)光的。
38.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述檢測和校正探針是磷光的。
39.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述檢測和校正探針是熒光的。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中使用熒光讀數(shù)器測量所述檢測信號(hào)和所述校正信號(hào)強(qiáng)度。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述熒光讀數(shù)器利用時(shí)間分辨熒光分光光度計(jì)測量所述檢測和所述校正信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測試樣中分析物的存在或量的基于膜的測定裝置。該裝置利用自校正的磁性結(jié)合測定形式(例如夾層測定，競爭性測定等等)，包括能產(chǎn)生檢測信號(hào)的檢測探針(例如熒光非磁性顆粒)以及能產(chǎn)生校正信號(hào)的校正探針(例如熒光磁性顆粒)。試樣中分析物的量與由校正信號(hào)強(qiáng)度值校正后的檢測信號(hào)的強(qiáng)度值成比例(如正比或者反比)。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基于流控技術(shù)的裝置能提供用于測定試樣中分析物存在的精確、廉價(jià)、并且易于控制的方法。
文檔編號(hào)G01N33/58GK1675547SQ03819393
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月27日
發(fā)明者宋旭東, R·凱洛 申請(qǐng)人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司