專利名稱：重組人a20蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程重組蛋白重組人A20蛋白，及其用于臨床各種炎癥相關(guān)性疾病的治療，尤其是用于全身性失控性炎癥的治療。
背景技術(shù)：
炎癥可發(fā)生于機(jī)體的任何部位和任何組織，適度的炎癥反應(yīng)是機(jī)體的一種正常免疫防御機(jī)制；過度的炎癥反應(yīng)則會引起組織器官損傷，導(dǎo)致臨床炎性疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)過度的炎癥反應(yīng)與一種被稱為NF-κB的核轉(zhuǎn)錄因子過度活化有關(guān)。促炎細(xì)胞因子、病原微生物感染、組織缺血缺氧、化學(xué)毒物損傷、電離輻射損傷等刺激，都可以激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB，活化的NF-κB進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)與其相應(yīng)的DNA序列結(jié)合，使促炎細(xì)胞因子(TNFα、IL-1、IL-2、IL-6等)、產(chǎn)炎癥介質(zhì)酶類(如NO合成酶、環(huán)氧化酶等)、黏附分子(如E選擇素、ICAM-1、VCAM-1等)等的表達(dá)上調(diào)。促炎細(xì)胞因子中的TNF α、IL-1等反過來又進(jìn)一步刺激細(xì)胞，通過與他們各自相應(yīng)的膜受體的結(jié)合，引起NF-κB更進(jìn)一步活化，以至于生成更多的促炎細(xì)胞因子……形成炎癥的級聯(lián)放大環(huán)，最終引起炎癥反應(yīng)過度，甚至發(fā)生失控。此時，體內(nèi)促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子之間的平衡被破壞，同時伴有免疫機(jī)能紊亂發(fā)生。因此，抑制過高的NF-κB活性、恢復(fù)促炎細(xì)胞因子和抑炎細(xì)胞因子平衡對于臨床炎性疾病的治療十分重要。
回顧人們曾經(jīng)使用過的抗炎治療藥物，其中的糖皮質(zhì)激素雖然是NF-κB活性的有效抑制物，但是副作用大；抗氧化劑類，如乙酰半胱氨酸，對NF-κB活性的抑制作用較弱且效果不確定；阿司匹林和水楊酸鈉雖然也可以抑制NF-κB活化，但是發(fā)揮作用必須使用異常高的濃度；天然抑制物如曲霉來源的glyotoxin對人的毒性太大。人們曾經(jīng)用抗TNF α抗體、IL-1受體拮抗劑等生物工程產(chǎn)品進(jìn)行治療，都未能得到明顯的治療效果。美國禮來公司近期推出的重組人活化蛋白C雖然具有明顯的抗炎特性，但是同時也是一種強(qiáng)效抗凝物質(zhì)，可以引起嚴(yán)重的出血并發(fā)癥如顱內(nèi)出血等，因此其臨床應(yīng)用受到很大的局限。總之，開發(fā)新型抗炎藥物仍然是人們面對的挑戰(zhàn)之一。
1990年人們發(fā)現(xiàn)了A20蛋白，近年的研究結(jié)果證實(shí)A20是一種體內(nèi)組織細(xì)胞NF-κB活化后合成的一種C2/C2型鋅指蛋白。各種炎癥誘發(fā)因素刺激細(xì)胞，細(xì)胞都可以表達(dá)A20。A20表達(dá)后存在于細(xì)胞漿中，通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的方式抑制NF-κB活性，導(dǎo)致體內(nèi)促炎細(xì)胞因子TNF α、IL-1、IL-6等表達(dá)的下調(diào)、以及介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性膜受體TLR4表達(dá)的下調(diào)。由于A20表達(dá)后及時下調(diào)了TNFα水平，對過高TNFα引起的組織細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出保護(hù)性效果。目前已經(jīng)證實(shí)，A20的表達(dá)見于臨床膿毒血癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、慢性肝炎、糖尿病、動脈粥樣硬化等多種炎癥性疾病，在這些疾病中，A20的表達(dá)與炎癥抑制和炎癥時的組織細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)有關(guān)。因此，開發(fā)基于人A20蛋白氨基酸序列的炎癥治療性基因工程藥物，具有特異、高效的特點(diǎn)。
遺憾的是，A20蛋白為胞漿蛋白，無論是從動物組織中直接分離得到的A20蛋白，還是采用原核表達(dá)和/或真核表達(dá)獲得的人A20蛋白，都不能進(jìn)入細(xì)胞，也就無法實(shí)現(xiàn)其抗炎作用。為了克服天然人A20的上述缺點(diǎn)，我們設(shè)想通過對天然人A20蛋白的改造，賦予其能夠進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮抗炎作用的能力。
HIV-1Tat蛋白是HIV-1的轉(zhuǎn)錄活化因子，含86～102個氨基酸殘基，將Tat蛋白作為愛滋病預(yù)防和治療性接種疫苗的研究已有報道(用于預(yù)防和治療接種的HIV-1TAT或其衍生物，申請?zhí)?8812496.3)。研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1Tat蛋白有一個堿性區(qū)域，是介導(dǎo)HIV-1進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵，其中第49位～57位氨基酸是介導(dǎo)HIV-1進(jìn)入細(xì)胞的最小單元——稱HIV-1Tat的穿膜結(jié)構(gòu)域。因此，我們設(shè)想將HIV-1Tat蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域與人A20抗炎功能域，通過基因工程操作進(jìn)行融合，希望得到一個能夠主動進(jìn)入細(xì)胞同時兼有人A20蛋白抗炎功能的重組人A20蛋白，用于臨床炎癥性疾病的治療，尤其是用于全身性失控性炎癥的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠進(jìn)入細(xì)胞、抑制細(xì)胞NF-κB活性、下調(diào)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的重組人A20蛋白，單獨(dú)或作為一種組分用于治療臨床炎癥性疾病，尤其是全身性失控性炎癥的治療。
本發(fā)明的另一個目的是提供該重組蛋白的氨基酸序列。
本發(fā)明的再一個目的是提供了該重組蛋白單獨(dú)或作為一種組分在臨床炎癥性疾病治療，尤其是在全身性失控性炎癥治療中的用途。
本發(fā)明提供的重組人A20蛋白，HIV Tat蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域位于其氨末端，人A20抗炎功能域位于其羧末端，兩者之間由一個連接肽將它們連接起來，以確保兩者翻譯后的正確折疊。該重組蛋白具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，分子量為93kD。
SEQ ID NO11 YVRKKRRQRRRSGGS1516GSGGGGEFVLPQALY3031LSNMRKAVKIRERTP4546EDIFKPTNGIIHHFK6061TMHRYTLEMFRTCQF7576CPQFREIIHKALIDR9091NIQATLESQKKLNWC105106 REVRKLVALKTNGDG120121 NCLMHATSQYMWGVQ135136 DTDLVLRKALFSTLK150151 ETDTRNFKFRWQLES165166 LKSQEFVETGLCYDT180181 RNWNDEWDNLIKMAS195196 TDTPMARSGLQYNSL210211 EEIHIFVLCNILRRP225226 IIVISDKMLRSLESG240241 SNFAPLKVGGIYLPL255256 HWPAQECYRYPIVLG270271 YDSHHFVPLVTLKDS285286 GPEIRAVPLVNRDRG300301 RFEDLKVHFLTDPEN315316 EMKEKLLKEYLMVIE330331 IPVQGWDHGTTHLIN345346 AAKLDEANLPKEINL360361 VDDYFELVQHEYKKW375376 QENSEQGRREGHAQN390391 PMEPSVPQLSLMDVK405406 CETPNCPFFMSVNTQ420421 PLCHECSERRQKNQN435436 KLPKLNSKPGPEGLP450451 GMALGASRGEAYEPL465466 AWNPEESTGGPHSAP480481 PTAPSPFLFSETTAM495496 KCRSPGCPFTLNVQH510511 NGFCERCHNARQLHA525526 SHAPDHTRHLDPGKC540541 QACLQDVTRTFNGIC555556 STCFKRTTAEASSSL570571 STSLPPSCHQRSKSD585586 PSRLVRSPSPHSCHR600601 AGNDAPAGCLSQAAR615
616TPGDRTGTSKCRKAG630631CVYFGTPENKGFCTL645646CFIEYRENKHFAAAS660661GKVSPTASRFQNTIP675676CLGRECGTLGSTMFE690691GYCQKCFIEAQNQRF705706HEAKRTEEQLRSSQR720721RDVPRTTQSTSRPKC735736ARASCKNILACRSEE750751LCMECQHPNQRMGPG765766AHRGEPAPEDPPKQR780781CRAPACDHFGNAKCN795796GYCNECFQFKQMYG 809本發(fā)明提供的重組蛋白也可以是至少具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，其分子量可以小到只有28kD。
SEQ ID NO21 YVRKKRRQRRRSGGS1516 GSGGGGEFVRSPSPH3031 SCHRAGNDAPAGCLS4546 QAARTPGDRTGTSKC6061 RKAGCVYFGTPENKG7576 FCTLCFIEYRENKHF9091 AAASGKVSPTASRFQ105106NTIPCLGRECGTLGS120121TMFEGYCQKCFIEAQ135136NQRFHEAKRTEEQLR150151SSQRRDVPRTTQSTS165166RPKCARASCKNILAC180181RSEELCMECQHPNQR195196MGPGAHRGEPAPEDP210211PKQRCRAPACDHFGN225226AKCNGYCNECFQFKQ240241MYG243該重組蛋白加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，可以自動進(jìn)入到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，明顯抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，下調(diào)促炎細(xì)胞因子(如TNFα、IL-1β)的表達(dá)，關(guān)閉細(xì)胞的炎癥反應(yīng)應(yīng)答；該重組蛋白注射入炎癥動物模型體內(nèi)后，可以下調(diào)實(shí)驗(yàn)動物血液中的TNFα、IL-1β、IL-6水平，達(dá)到對實(shí)驗(yàn)動物過度炎癥反應(yīng)應(yīng)答的干預(yù)目的，可以單獨(dú)或作為一種組分用于各種炎癥性疾病的治療，尤其是全身性失控性炎癥反應(yīng)的治療。
發(fā)明的用途單獨(dú)或作為一種組分用于臨床各種炎癥性疾病的治療，尤其是全身性失控性炎癥的治療。
發(fā)明的特點(diǎn)本發(fā)明是將HIV-1Tat的穿膜結(jié)構(gòu)域與人A20蛋白的抗炎功能域進(jìn)行融合得到的一種重組人A20蛋白，為了確保HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域的穿膜功能和人A20抗炎功能域的抗炎功能，不因?yàn)榛虻拇?lián)造成翻譯后蛋白質(zhì)空間折疊上的改變而喪失它們各自天然空間折疊所賦予的生物學(xué)活性，我們在HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域和人A20抗炎功能域之間設(shè)計了一個連接肽，該連接肽使重組人A20蛋白的穿膜結(jié)構(gòu)域和A20抗炎功能域分別具有正確的空間折疊形式，從而同時兼有了進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞的功能和抑制NF-κB活性的功能，成為可單獨(dú)或做為一種組分用于臨床炎性疾病，尤其是全身性失控性炎癥反應(yīng)救治的治療性藥物。


本發(fā)明通過實(shí)施例進(jìn)一步說明，實(shí)施例包括如下附圖附圖1HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體陽性克隆的菌落PCR快速篩選電泳圖附圖2HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體插入序列測序結(jié)果附圖3TOPO-hA20質(zhì)粒EcoRI酶切物0.8％瓊脂糖凝膠電泳圖附圖4重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體陽性克隆的菌落PCR快速篩選電泳圖附圖5重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體hA20基因正向插入載體篩選的1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果附圖6重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體基因測序結(jié)果附圖7YPD-G418梯度平板篩選GS115重組人A20基因高整合菌株附圖8重組人A20基因在畢赤酵母GS115基因組中整合的PCR快速鑒定附圖9重組人A20蛋白畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)上清液SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果附圖10重組人A20蛋白畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)上清液Western Blot結(jié)果附圖11畢赤酵母GS115表達(dá)重組人A20蛋白的時間-產(chǎn)量關(guān)系附圖12超濾純化重組人A20蛋白的SDS-PAEG電泳凝膠之考馬斯亮蘭染色結(jié)果附圖13超濾純化重組人A20蛋白的Western Blot結(jié)果附圖14重組人A20蛋白穿膜活性鑒定結(jié)果附圖15重組人A20蛋白對細(xì)胞LPS應(yīng)答時NF-κB活性的調(diào)節(jié)附圖16重組人A20蛋白對細(xì)胞LPS應(yīng)答時TNFα和IL-1β表達(dá)的調(diào)節(jié)附圖17重組人A20蛋白對膿毒癥大鼠血液TNFα、IL-1β、IL-6水平的調(diào)節(jié)參見圖1，該圖反映HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體陽性克隆的菌落PCR快速篩選電泳結(jié)果。其中M是DNA Marker DL2000；1到5是LB平板上生出來的不同菌落。
參見圖2，該圖反映HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體插入序列測序結(jié)果。
參見圖3，該圖反映TOPO-hA20EcoR I酶切物0.8％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖中1為TOPO-hA20；2為TOPO-hA20之EcoR I酶切物；3為DNA Marker DL15000/2000。
參見圖4，該圖反映重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體陽性克隆的菌落PCR快速篩選結(jié)果(1.2％瓊脂糖凝膠電泳)。圖中M為DNAMarker DL 15000/DL 2000；1到12為LB平板上生出的不同菌落；其中1、7、8、9為陽性克隆。
參見附圖5，該圖反映重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體hA20基因正向插入載體篩選的1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖中M為λ-EcoT14I消化的DNAMarker；C1到C6為不同陽性克隆來源的質(zhì)粒。其中C3和C5為hA20基因正向插入的重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體。
參見附圖7，附圖反映是YPD-G418梯度平板篩選GS115重組人A20基因高整合菌株。圖中從1到7依次是含0、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0mg/ml G418的YPD平板。
參見附圖8，附圖反映重組人A20基因在畢赤酵母GS115基因組中整合的PCR快速鑒定。圖中1到13為不同的YPD-G418篩選菌株；14為陰性對照；M為DNA markerλ-EcoT14I片段。
附圖9反映重組人A20蛋白畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)上清液SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果。圖中M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1是GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；2是HIV-1Tat-連接肽基因整合GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；3～7是重組人A20基因整合GS115誘導(dǎo)第1天～誘導(dǎo)第7天的培養(yǎng)液。
附圖10反映重組人A20蛋白畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)上清液Western Blot結(jié)果。圖中M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1是GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；2是HIV-1Tat-連接肽基因整合GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；3～7是重組人A20基因整合GS115誘導(dǎo)第1天～誘導(dǎo)第7天的培養(yǎng)液。
圖11反映畢赤酵母GS115表達(dá)重組人A20蛋白的時間-產(chǎn)量關(guān)系。圖中1為GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；2是HIV-1Tat-連接肽基因整合GS 115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；3～7是重組人A20基因整合GS115誘導(dǎo)第1天～誘導(dǎo)第7天的培養(yǎng)液。
圖12反映超濾純化重組人A20蛋白的SDS-PAEG電泳凝膠之考馬斯亮蘭染色結(jié)果。圖中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1為GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；2是HIV-1Tat-連接肽基因整合GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；3是超濾純化的重組人A20。
圖13反映超濾純化重組人A20蛋白的Western Blot結(jié)果。圖中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1為GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；2是HIV-1Tat-連接肽基因整合GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)液；3是超濾純化的重組人A20。
圖14反映重組人A20蛋白穿膜活性鑒定結(jié)果。圖中A為加入對照液孵育的THP1細(xì)胞，B為加入FITC標(biāo)記rhA20液孵育的THP1細(xì)胞。
圖15反映重組人A20蛋白對細(xì)胞LPS應(yīng)答時NF-κB活性的調(diào)節(jié)。圖中1陰性對照組；2LPS處理對照組；31ng/ml重組人A20治療組；410ng/ml重組人A20治療組；5100ng/ml重組人A20治療組；61μg/m重組人A20治療組；710μg/ml.重組人A20治療組。
圖16反映重組人A20蛋白對細(xì)胞LPS應(yīng)答時TNF α和IL-1β表達(dá)的調(diào)節(jié)。圖中1陰性對照組；2LPS處理對照組；31ng/ml重組人A20治療組；410ng/ml重組人A20治療組；5100ng/ml重組人A20治療組；61μg/m重組人A20治療組；710μg/ml.重組人A20治療組。
圖17反映重組人A20蛋白對膿毒癥大鼠血液TNFα、IL-1β和IL-6水平的調(diào)節(jié)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建EcoRI/SnaBI消化HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽DNA片段的準(zhǔn)備人工合成HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽基因的正義鏈DNA(5′cgacgTACGTAAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAAGCGGAGGATCGGGTAGCGGAGGAGGAGGAGAATTCGTCCGGagc3′，83bp)和反義鏈DNA(5′gctCCGGACGAATTCTCCTCCTCCTCCGCTACCCGATCCTCCGCTTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTTACGTAcgtcg3′，83bp)，用滅菌純水將它們配制成200μmol/L，1∶1混合后，95℃變性10分鐘，立即插入冰浴冷卻10分鐘，取出投入55℃退火15分鐘。取經(jīng)過變性退火的反應(yīng)液170μl，加入15u/μl的EcoRI 10.0μl，加入10×H Buffer 20μl，混均勻，37℃水浴4小時，65℃20分鐘。用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收DNA，并將回收DNA溶于85μl滅菌純水中。繼續(xù)加入5u/μl的SnaBI 5.0μl，10×SEB Buffer B 10μl，混均勻，繼續(xù)37℃水浴4小時，65℃20分鐘，并用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收DNA于30μl滅菌純水中，為準(zhǔn)備好的試劑A。
EcoRI/SnaBI開環(huán)pPIC9K質(zhì)粒的準(zhǔn)備取pPIC9K質(zhì)粒(購于Invitrogen Co.)20μg，加入5u/μl的SnaBI 4.0μl，10×SEB Buffer B 10μl，以滅菌純水補(bǔ)足100μl體積，混均勻，37℃水浴4小時，65℃20分鐘，用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收DNA于86μl滅菌純水中。繼續(xù)加入15u/μl的EcoRI 4.0μl，加入10×H Buffer 10μl，混均勻，37℃水浴4小時，65℃20分鐘，用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收DNA于50μl滅菌純水中，為準(zhǔn)備好的試劑B。
EcoRI/SnaBI開環(huán)pPIC9K質(zhì)粒和EcoRI/SnaBI消化HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽DNA片段的連接反應(yīng)和陽性克隆的快速篩選取試劑A4.5μl，試劑B0.5μl，加入Solution I(購于TaKaRa Co.)5.0μl，混均勻，16℃4小時。加入50μl的大腸桿菌JM109(ATCC購置)的感受態(tài)細(xì)胞，混均勻，冰浴30分鐘，42℃90秒，立即加入37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基500μl，在37℃搖床上輕輕震蕩培養(yǎng)1小時，接種含氨芐青霉素mg/ml的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。次日，平板上生出一些菌落，挑菌落少許于10μl滅菌純水中，煮沸15分鐘，10000rpm離心5分鐘。取上清液1.0μl，加入合成的PCR引物P1(5′tat tat tgc cag cat tgc tgc3′，21bp)0.5μl，加入合成的PCR引物P2(5′gca aat ggc att ctg aca tcc3′，21bp)0.5μl，再按照試劑盒說明書加入通用的PCR試劑(購于TaKaRa Co.)。94℃5分鐘，進(jìn)入94℃45秒→55℃45秒→72℃45秒的熱循環(huán)，共循環(huán)30次，最后72℃4分鐘。吸取2μl進(jìn)行3.5％的瓊脂糖凝膠電泳，掃描結(jié)果見附圖1，提示Lane3是我們希望得到的253bp的擴(kuò)增片段。
挑取少許Lane3對應(yīng)的菌落于25ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床上震蕩培養(yǎng)過夜，取0.5ml菌液送上海申能博彩生物技術(shù)公司測序，其余菌液用Omega Co.質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA備用。測序結(jié)果見附圖2，證實(shí)插入序列與設(shè)計序列完全一致。
實(shí)施例2重組人A20蛋白畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建EcoRI開環(huán)HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體的準(zhǔn)備取HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體15μg，加入15u/μl的EcoRI 4.0μl，加入10×H Buffer 10μl，用滅菌純水補(bǔ)足100μl，混均勻，37℃水浴4小時，65℃20分鐘。用Omega PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收DNA，并將回收DNA溶于88μl滅菌純水中。繼續(xù)加入10×堿性磷酸酶緩沖液10μl，10～30u/μl的堿性磷酸酶(購于TaKaRa Co.)2μl，37℃水浴30分鐘，再補(bǔ)加堿性磷酸酶1μl，繼續(xù)37℃水浴30分鐘。加入滅菌純水200μl，加入Tris飽和酚150μl，24∶1的氯仿/異戊醇150μl，充分混均勻，室溫1000rpm離心2分鐘。轉(zhuǎn)移水相，再重復(fù)抽提一次。轉(zhuǎn)移水相，乙醇沉淀法將DNA濃縮到10μl滅菌純水中，為試劑C。
EcoRI修飾hA20抗炎功能域DNA片段的準(zhǔn)備取TOPO-hA20質(zhì)粒30μg(TOPO-hA20質(zhì)粒的構(gòu)建方法見文獻(xiàn)吳麗娟等。人鋅指蛋白A20ORF的克隆.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004；26(8)658-662)，加入15u/μl的EcoRI 9.0μl，加入10×H Buffer 20μl，用滅菌純水補(bǔ)足200μl，混均勻，37℃水浴4小時，65℃20分鐘。將全部反應(yīng)液做0.8％瓊脂糖凝膠電泳(電泳結(jié)果的見附圖3)，用TakaRa瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收2.4kb的目的片段，并將回收DNA溶于30μl滅菌純水中，為試劑D。
EcoRI開環(huán)HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體和EcoRI修飾hA20抗炎功能域DNA片段的連接與陽性克隆的快速篩選取試劑C 0.5μl，試劑D 4.5μl，加入Solution I(購于TaKaRa Co.)5.0μl，混均勻，16℃4小時。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞及陽性克隆的菌落PCR快速篩選方法同“HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域-連接肽畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建”的相應(yīng)部分。重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體陽性克隆的菌落PCR快速篩選結(jié)果見附圖4。其中的第1、第7、第8、第9泳道對應(yīng)的克隆為陽性目標(biāo)克隆。
重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體hA20基因正向插入載體的篩選取菌落PCR鑒定得到的陽性克隆少許，放大培養(yǎng)后，用TaKaRa質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。取質(zhì)粒各500ng，加入10u/μl SacI 0.5μl，10×SEBBuffre G1μl，以滅菌純水補(bǔ)足10μl。37℃2小時，做1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見附圖5。其中的C3和C5為hA20基因正向插入的目標(biāo)重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體。選擇C3進(jìn)行測序，結(jié)果見附圖6-1～附圖6-5，測序結(jié)果證實(shí)重組人A20基因序列與我們的設(shè)計完全一致。
實(shí)施例3重組人A20基因在畢赤酵母GS115菌株基因組中的整合線性化重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體基因的準(zhǔn)備取C3質(zhì)粒5μg，用SalI或BglII進(jìn)行消化，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提2次，轉(zhuǎn)移水相，乙醇沉淀法濃縮DNA于5μl滅菌純水中。
畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備采用山梨醇法，具體方法參見Invitrogen Co.試劑盒說明書進(jìn)行。
電轉(zhuǎn)化與陽性克隆的篩選取50μl GS115感受態(tài)細(xì)胞，加入線性化重組人A20畢赤酵母表達(dá)載體3μg，混均勻后轉(zhuǎn)入冰提前冷卻的電轉(zhuǎn)化杯中，使用Bio-Rad Gene Pulser(購于美國BioRad公司)，用1500V 25μF 200Ω條件進(jìn)行轉(zhuǎn)化，立即接種His-營養(yǎng)缺陷平板(制作方法參見Invitrogen Co.試劑盒說明書)，30℃培養(yǎng)5～6天。加入1ml的YPD液體培養(yǎng)基(配制方法參見Invitrogen Co.試劑盒說明書)，以推桿碾下菌細(xì)胞，將碾下的菌細(xì)胞吸入1.5ml離心管中，徹底震蕩，打散菌細(xì)胞，用分光光度計測OD600，將其調(diào)至約106個/ml的密度，按每個平板接種100μl菌液依次接種YPD-G418梯度平板(G418梯度包括0，1，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0mg/ml，制作方法參見Invitrogen Co.試劑盒說明書)，28～30℃孵箱培養(yǎng)3～5天，菌落生長情況見附圖7。如附圖7所示，在無G418的YPD平板和含1mg/mlG418的YPD平板上細(xì)菌生長旺盛，鋪滿了整個平板。在含2.0mg/ml及以上G418的YPD平板上長出單個高拷貝菌落。
實(shí)施例4重組人A20基因在畢赤酵母GS115基因組中整合的PCR鑒定模板DNA的制備
分別挑取適量的畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子單個菌落于5ml YPD中，28～30℃250rpm培養(yǎng)2～3天，將OD600調(diào)至0.5，取1.5ml菌液用酵母基因組提取試劑盒(購于上海申能博彩生物科技公司)提取全基因組DNA，具體方法見試劑盒說明書。
PCR按50μl總體積預(yù)混PCR反應(yīng)體系5u/l TaKaRa Taq 0.25μl，10×PCRBuffer(Mg2+Free)5.0μl，25mmol/L MgCl23.0μl，dNTPs Mixture(each2.5mmol/L)4.0μl，20μmol/L引物P1(同前)1.0μl，20μmol/L引物P2(同前)1.0μl，滅菌純水30.75μl?；靹?，9μl/支進(jìn)行分裝，插于冰浴中。在每支中分別加入相應(yīng)酵母基因組模板DNA各1.0μl。熱啟動94℃2min；進(jìn)入變性94℃1分鐘、退火55℃1分鐘，延伸72℃1分鐘的熱循環(huán)，共重復(fù)擴(kuò)增30次；最后72℃繼續(xù)延伸4min。取1μlPCR產(chǎn)物做0.8％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見附圖8，其中第1～第3、第6～第7、第11～第13號菌株證實(shí)整合了重組人A20基因。
實(shí)施例5重組人A20的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)將陽性菌株單克隆接種于盛有10ml BMGY培養(yǎng)基(成分為1％YeastExtract/2％Peptone/100mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液/1.34％YNB/4×10-5Biotin/1％Glycerol，配制方法參見Invitrogen Co.試劑盒說明書)的100ml三角燒瓶中，30℃，250～300rpm振搖培養(yǎng)16～18小時。將菌液轉(zhuǎn)入盛有10ml BMGY培養(yǎng)基(成分為1％ Yeast Extract/2％ Peptone/100mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液/1.34％ YNB/4×10-5Biotin/0.5％ Methanol，配制方法參見Invitrogen Co.試劑盒說明書)的100ml三角燒瓶中，繼續(xù)30℃250～300rpm振搖培養(yǎng)6～8小時，使菌體數(shù)呈指數(shù)上升，室溫2000×g離心5分鐘收集菌體，重懸菌細(xì)胞于盛有10ml BMMY培養(yǎng)基的100ml三角燒瓶中，繼續(xù)30℃振搖培養(yǎng)24小時。加入終濃度為0.5％的甲醇，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6天。每天補(bǔ)充甲醇1次，每次10μl。室溫2000×g離心10分鐘，收集酵母培養(yǎng)液。
實(shí)施例6畢赤酵母表達(dá)重組人A20的鑒定9％SDS-PAGE電泳具體方法及試劑配制參見金冬雁、黎孟楓譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)第888頁897頁，選擇5％的積層膠/9％的分離膠。將樣品(酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)液)與上樣緩沖液按照4∶1的比例進(jìn)行混合，沸水浴中加熱10分鐘，立即插入冰浴冷卻。點(diǎn)樣時，每孔加入的總體積20～30μl。電泳時積層膠電壓50v，時間約1h，待染料前沿進(jìn)入分離膠后，電壓改為80v，電泳約3h，直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部后關(guān)閉電源。電泳結(jié)束后，取下電泳玻璃板和凝膠，用三蒸水洗滌凝膠表面，將一塊凝膠用于考馬斯亮藍(lán)染色，另一塊用于Western Bot。
考馬斯亮藍(lán)染色用5倍體積的考馬斯亮藍(lán)R250染色染浸泡SDS-PAGE膠，放于搖床上RT緩慢旋轉(zhuǎn)染色1～2h。換掉染色液，用甲醇/醋酸脫色溶液浸泡凝膠，緩慢搖動24h進(jìn)行脫色，期間需換脫色液2～3次，直到條帶滿意為止。將脫色后的凝膠掃描，結(jié)果見附圖9，全長重組蛋白的百分含量從第1天～第7天分別達(dá)到0.1％、0.3％、0.5％、0.9％、1.1％、0.8％和0.6％。
蛋白質(zhì)的Westerb Blot具體方法及試劑配制參見金冬雁、黎孟楓譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)第888頁897頁。電壓15V，過夜轉(zhuǎn)膜。先用麗春紅S染色以標(biāo)出蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品的參照位置，再進(jìn)行封閉。一抗為小鼠抗人A20IgG1單克隆抗體(購于美國Active Motif公司)，稀釋比例1∶2000。二抗為生物素化山羊抗小鼠IgG(Genex產(chǎn)品，北京鼎國生物科技公司分裝)，稀釋比例1∶2000。三抗為鏈霉菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(Genex產(chǎn)品，北京鼎國生物科技公司分裝)，稀釋比例1∶1000。顯色反應(yīng)使用AP-NBT/BCIP顯色系統(tǒng)，用凝膠成像系統(tǒng)掃描NC膜，結(jié)果見附圖10，在93kD附近有目標(biāo)全長重組人A20蛋白條帶。
全長重組人A20蛋白表達(dá)量測算全長重組人A20蛋白表達(dá)量＝用全長重組人A20蛋白表達(dá)的百分含量×相應(yīng)上清液的總蛋白含量。上清液的總蛋白含量用BCA蛋白質(zhì)定量法進(jìn)行測定。(BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購于上海申能博彩生物科技公司，詳細(xì)方法參見試劑盒說明書。)結(jié)果誘導(dǎo)的第一天、第二天、第三天、第四天、第五天、第六天和第七天全長rhA20的分泌量分別達(dá)到1.74±0.06、5.40±0.19、9.08±0.30、16.95±0.36、22.84±0.17、15.79±0.65和13.22±1.13μg/ml，統(tǒng)計圖見附圖11。
實(shí)施例7重組人A20蛋白的超濾純化及鑒定超濾純化超濾時，先用300K規(guī)格的超濾杯(美國Pall-Gelman產(chǎn)品，購于北方同正公司重慶分公司)過濾離心以去除100kD及以上大小的蛋白質(zhì)，收集濾過液，重復(fù)過濾5次，每次使用新的過濾杯。換用30K規(guī)格的超濾杯繼續(xù)過濾離心，收集未濾過液體，加入滅菌的去離子水進(jìn)行一定稀釋，再換新超濾杯離心，共離心5次。之后，換用60K規(guī)格的超濾杯繼續(xù)過濾離心，仍然收集未濾過液體，加入滅菌的去離子水進(jìn)行一定稀釋，再同法離心1次。經(jīng)過上述30K和60K規(guī)格超濾杯離心過濾后，收集的未濾過液體中90kD以下大小的蛋白質(zhì)及鹽類被除去，樣品杯中的殘流液即為純化產(chǎn)物。上述處理的詳細(xì)操作步驟參見Pall-Gelman超濾杯使用說明書。
9％SDS-PAGE方法同前述，結(jié)果見附圖12。如附圖12所示，超率物電泳后僅剩下約93kD大小的單一目標(biāo)蛋白條帶。
Western Blot電轉(zhuǎn)方法同前述，抗原抗體反應(yīng)時二抗為辣根過氧(化)物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(Genex產(chǎn)品，北京鼎國生物科技公司分裝)，稀釋比例1∶20000，使用化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)(購于PIERCE)，凝膠成像系統(tǒng)采集發(fā)光信號，結(jié)果見附圖13。附圖13表明超率物電泳所示約93kD大小的蛋白條帶是重組人A20蛋白。
實(shí)施例8重組人A20穿膜活性鑒定重組人A20的FITC標(biāo)記用pH9.5的0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液對純化的重組人A20進(jìn)行透析，加入DMSO溶解的FITC(即異硫氰酸熒光素，為Sigma產(chǎn)品)，4℃反應(yīng)16小時，用Sephadex G50純化FITC偶聯(lián)物。詳細(xì)方法參見Masseyeff RF，etal.Methods of Immunological Analysis Volumes.GermarryVCHVerlagagesellschatt MBH Weinheim(Federal Republic)，1993；237-238。
黏附劑處理玻片的準(zhǔn)備玻片按常規(guī)洗凈，烘干。用丙酮將APES(Sigma產(chǎn)品)稀釋50倍，將玻浸入稀釋APES中并停留30秒。取出玻片，將之放入蒸餾水中洗去表面上沒有結(jié)合的游離APES，放通風(fēng)處涼干即可。
穿膜實(shí)驗(yàn)將人單核細(xì)胞株THP1懸浮于含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃5％CO2條件下培養(yǎng)，2～3天換液傳代一次。實(shí)驗(yàn)前一天，將穩(wěn)定培養(yǎng)的THP1細(xì)胞換液，37℃5％CO2培養(yǎng)過夜。800rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，用含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone產(chǎn)品)重懸細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度至1×108/ml。取2只洗凈滅菌的青霉素小瓶，各加入1ml的細(xì)胞懸浮液，向其中的1只中加入FITC標(biāo)記的重組人A20蛋白100μl(100ng)，另1只加入GS115誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天上清液經(jīng)過超濾純化和FITC標(biāo)記同法處理收集液(即對照)100μl，立即放回CO2培養(yǎng)箱，37℃5％CO2培養(yǎng)40分鐘。加入8ml生理鹽水，800rpmin離心5min洗滌細(xì)胞，重復(fù)洗滌2次，重懸細(xì)胞于1ml RPMI1640培養(yǎng)基中，取1滴細(xì)胞懸液滴加在APES處理玻片上，輕輕趕開，涼干后用在德國Leica激光共聚焦掃描儀上進(jìn)行檢查。結(jié)果見附圖14(其中A為陰性對照)，在附圖14A中無熒光信號，無法顯示出細(xì)胞的輪廓；而附圖14B中有明亮的黃綠色熒光信號，細(xì)胞形態(tài)清晰，在細(xì)胞核部分熒光信號有明顯的減弱。上述結(jié)果提示重組人A20能夠進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。
實(shí)施例9重組人A20對炎性細(xì)胞炎癥應(yīng)答的干預(yù)作用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前一天對穩(wěn)定培養(yǎng)的人單核細(xì)胞株THP1細(xì)胞進(jìn)行一次換液傳代，次日離心收集細(xì)胞并用生理鹽水洗滌2次，用RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并測定細(xì)胞濃度。實(shí)驗(yàn)分陰性對照組、LPS處理對照組和rhA20治療組進(jìn)行，rhA20治療組分1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml五個不同的濃度點(diǎn)。向各組各濃度點(diǎn)培養(yǎng)瓶中加入3ml的10％FCS-RPMI 1640培養(yǎng)基，4.5×106的THP1細(xì)胞。向LPS處理對照組和rhA20治療組各培養(yǎng)瓶中加入終濃度為10ng/ml的LPS。37℃5％CO2條件培養(yǎng)30分鐘后，向rhA20治療組各培養(yǎng)瓶加入規(guī)定終濃度的純化rhA20。繼續(xù)37℃5％CO2培養(yǎng)6小時，離心分別收集細(xì)胞和上清液。
核蛋白的提取采用核蛋白提取試劑盒(PIERCE公司產(chǎn)品)提取細(xì)胞樣品中的核蛋白，詳細(xì)方法參見試劑盒說明書。
NF-κB活性側(cè)定采用NF-κB活性檢測試劑盒(Active motif公司產(chǎn)品)測定核蛋白中的NF-κB活性，詳細(xì)方法參見試劑盒說明書，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖15。陰性對照組、LPS處理對照組、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml和10μg/ml重組人A20治療組，反映THP1細(xì)胞NF-κB活性水平的OD450/660值分別為0.09±0.02、0.48±0.05、0.44±0.02、0.41±0.05、0.30±0.06、0.10±0.01和0.09±0.03，可見加入不同濃度的重組人A20后，THP1細(xì)胞NF-κB活性在不同程度上都有所降低。將陰性對照組、各重組人A20治療組依次與LPS處理對照組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示在陰性對照組與LPS處理對照組之間NF-κB活性存在極顯著性差別，P＜0.01，說明細(xì)胞功能狀態(tài)滿意；加入1ng/ml、10ng/ml重組人A20后，THP1細(xì)胞NF-κB活性都有所下降，但下降程度與LPS處理對照組之間無顯著性差別，P值分別為0.3713和0.3276，即全部P＞0.05；加入100ng/ml重組人A20后，THP1細(xì)胞NF-κB活性下降程度與LPS處理對照組之間存在顯著性差別，P＝0.0116，即P＜0.05。加入1μg/ml和10μg/ml重組人A20后，THP1細(xì)胞NF-κB活性下降程度與LPS處理對照組之間存在極顯著性差別，P值分別為0.0066和0.0018，P＜0.01。上述結(jié)果表明1ng/ml～10μg/ml的重組人A20對LPS激活THP1細(xì)胞NF-κB有不同程度的抑制效果且存在劑量依賴性特點(diǎn)，其中以加入微克級重組人A20效果更明顯。
TNFα水平的ELISA分析采用TNFαELISA試劑盒(JINGMEI BIOTECH產(chǎn)品)測定上清液中的TNFα水平，具體方法按說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖16。陰性對照組、LPS處理對照組、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的重組人A20治療組，THP1細(xì)胞合成并分泌到培養(yǎng)液中的TNFα分別為28.15±10.77、541.37±75.50、508.20±81.03、418.72±49.39、212.13±38.86、103.05±33.53和99.78±30.22pg/ml，提示加入不同濃度的重組人A20后，THP1細(xì)胞合成和分泌的TNFα在不同程度上都有所降低。將陰性對照組、各重組人A20治療組依次與LPS處理對照組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示在陰性對照組與LPS處理對照組之間TNFα水平存在極顯著性差別，p＜0.01，說明細(xì)胞功能狀態(tài)滿意；1ng/ml、10ng/ml重組人A20治療組與LPS處理對照組之間TNFα水平?jīng)]有顯著性差別，P值分別為0.3419和0.2306，全部P＞0.05；100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml重組人A20干預(yù)組與LPS處理對照組之間TNFα水平存在極顯著性差別，P值分別為0.0062、0.0105和0.0043，即P＜0.01。上述結(jié)果表明重組人A20對THP1細(xì)胞合成并分泌TNFα有干預(yù)作用，且存在劑量依賴性特點(diǎn)，其中以加入100ng/ml以上的重組人A20效果最為顯著。
IL-1β水平的ELISA分析采用IL-1βELISA試劑盒(JINGMEI BIOTECH產(chǎn)品)測定上清液中的IL-1β水平，具體方法按說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖16。陰性對照組、LPS處理對照組、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的重組人A20治療組，THP1細(xì)胞合成并分泌到培養(yǎng)液中的IL-1β分別為27.49±5.67、807.56±85.57、721.21±75.26、699.03±59.97、431.79±40.49、153.66±32.20和121.37±20.75pg/ml，提示加入不同濃度的重組人A20后，THP1細(xì)胞合成和分泌的IL-1β在不同程度上都有所降低。將陰性對照組、各重組人A20治療組依次與LPS處理對照組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示在陰性對照組與LPS處理對照組之間IL-1β水平存在極顯著性差別，P＝0.0035，說明細(xì)胞功能狀態(tài)佳；1ng/ml、10ng/ml、重組人A20治療組與LPS處理對照組之間IL-1β水平?jīng)]有顯著性差別，P值分別為0.4441和0.3169，即全部P＞0.05；100ng/ml重組人A20治療組與LPS處理對照組之間IL-1β水平存在顯著性差別，P＝0.0282；1μg/ml、10μg/ml重組人A20治療組與LPS處理對照組之間IL-1β水平存在極顯著性差別，P值分別為0.0028和0.0033，即P＜0.01。上述結(jié)果表明重組人A20對THP1細(xì)胞合成并分泌IL-1β有干預(yù)作用，且存在劑量依賴性特點(diǎn)，其中以加入微克級重組人A20效果最顯著。
因此，可以認(rèn)為重組人A20具有抑制THPI細(xì)胞NF-κB活化、下調(diào)細(xì)胞生成TNFα、IL-1β的能力，對實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的炎癥應(yīng)答具有明顯的調(diào)節(jié)作用。
實(shí)施例10重組人A20對膿毒癥大鼠全身性失控性炎癥反應(yīng)的治療作用動物實(shí)驗(yàn)清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體重200～300克，適應(yīng)喂養(yǎng)1周。rhA20治療組大鼠6只，腹腔注射10mg/kg的LPS，分別于1小時后尾靜脈注射30μg/kg/d的rhA20。LPS處理組大鼠6只，腹腔注射10mg/kg的LPS，分別于1小時后尾靜脈注射與rhA20等體積的生理鹽水。對照組大鼠6只，腹腔注射與LPS等體積的生理鹽水，分別于1小時后尾靜脈注射與rhA20等體積的生理鹽水。上述各組動物于尾靜脈注射24小時后收集血液樣品，離心分離血清。
血清TNFα水平的測定試劑及方法同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)TNFα測定，結(jié)果見附圖17。對照組、LPS處理組、rhA20治療組血清中TNFα分別為45.55±13.67、268.76±65.34和112.00±31.05pg/ml，將LPS處理組、rhA20治療組與對照組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示LPS處理組、rhA20治療組與對照組血清中TNFα水平存在極顯著性差異，P值分別為0.0003和0.0103；將rhA20治療組與LPS處理組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示rhA20治療組與LPS處理血清中的TNFα水平存在極顯著性差異，P＝0.0060。上述結(jié)果表明，rhA20對LPS所致實(shí)驗(yàn)性膿毒癥大鼠血液中TNFα水平具有明顯的調(diào)節(jié)作用。
血清IL-1β水平的測定試劑及方法同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)IL-1β測定，結(jié)果見附圖17。對照組、LPS處理組、rhA20治療組血清中IL-1β分別為38.98±17.11、321.44±66.51和121.49±56.26pg/ml，將LPS處理組、rhA20治療組與對照組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示LPS處理組、rhA20治療組與對照組血清中IL-1β水平存在極顯著性差異，P值分別為0.0002和0.0140；將rhA20治療組與LPS處理組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示rhA20治療組與LPS處理血清中的IL-1β水平存在極顯著性差異，P＝0.0052。上述結(jié)果表明，rhA20對LPS所致實(shí)驗(yàn)性膿毒癥大鼠血液中IL-1β水平具有明顯的調(diào)節(jié)作用。
血清IL-6水平的測定采用IL-6ELISA試劑盒(JINGMEI BIOTECH產(chǎn)品)測定血清中的IL-6水平，具體方法按說明書進(jìn)行，結(jié)果見附圖17。對照組、LPS處理組、rhA20治療組血清中IL-6分別為19.32±4.22、113.51±32.23和56.50±25.31pg/ml，將LPS處理組、rhA20治療組與對照組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示LPS處理組與對照組血清中IL-6水平存在極顯著性差異，P＝0.0007。rhA20治療組與對照組血清中IL-6水平存在顯著性差異，P＝0.0151；將rhA20治療組與LPS處理組進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示rhA20治療組與LPS處理血清中的IL-6水平存在顯著性差異，P＝0.0182。上述結(jié)果表明，rhA20對LPS所致實(shí)驗(yàn)性膿毒癥大鼠血液中IL-6水平具有一定的調(diào)節(jié)作用。
上述結(jié)果表明，重組人A20能夠明顯下調(diào)實(shí)驗(yàn)動物血液TNFα、IL-1和IL-6水平，對實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)炎癥應(yīng)答具有明顯的調(diào)節(jié)能力，可以用于臨床炎癥性疾病的治療，尤其是用于全身性失控性炎癥的治療。
權(quán)利要求
1.一種重組人A20蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨末端為HIV-1Tat穿膜結(jié)構(gòu)域，羧末端為人A20的抗炎功能域，兩者之間由一個中間連接肽連接起來。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人A20蛋白，其特征在于該重組蛋白包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，分子量為93kD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人A20蛋白，其特征在于該重組蛋白也可以是至少包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，分子量可以少到只有28kD。
4.一種如權(quán)利要求1、2或3所述的重組人A20蛋白在制備治療臨床因核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB過度活化引起的各種炎癥相關(guān)性疾病，尤其是用于治療全身性失控性炎癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基因工程重組蛋白，即重組人A20蛋白(recombinant human A20，rhA20)。屬于基因工程產(chǎn)品及其用途領(lǐng)域。它是將HIV－1 Tat的穿膜結(jié)構(gòu)域和人A20的抗炎功能域融合而成的重組蛋白。本發(fā)明還提供了該重組蛋白的氨基酸序列。該重組蛋白具有主動進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞、抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB活性、下調(diào)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的功能，適用于治療臨床各種炎癥性疾病，尤其是用于全身性失控性炎癥的治療。
文檔編號A61P29/00GK1834107SQ20051005712
公開日2006年9月20日 申請日期2005年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者吳麗娟, 蔣建新, 朱佩芳, 王正國 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院