專利名稱：豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程和生物殺蟲劑的技術領域，具體是指一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白及其制備方法和在制備防治儲糧害蟲的生物殺蟲劑中的應用。
背景技術：
儲糧害蟲的危害是世界上糧食儲藏中的一個重要問題，它們能夠嚴重降低儲糧的產量和質量。我國每年糧食收獲后由于儲糧害蟲造成約3％～5％的損失。據國家糧食局相關統(tǒng)計數字表明2004年中國的糧食總產量約為4.5億噸，農戶儲糧約為2.7億噸，若能將儲糧損失由10％減少到4％左右，就等于增產了1620萬噸糧食，這相當于我國產糧大省山東一年的小麥產量。因此，儲糧害蟲的防治工作應引起大家的高度重視。這在當前我國人口不斷增加，耕地面積不斷減少，糧食產量逐年下降，糧食缺口日益增大的形勢下，減少已經收獲糧食的損失，開發(fā)“無形糧田”，有著特別重要的意義。
經多年來的研究成果表明將谷物與豌豆(Pisum sativum)混合儲藏時，米象(Sitophilus oryzae)、玉米象(Sitophilus zeamais)和谷象(Sitophilus granarius)等儲糧害蟲存活與繁殖現象明顯減少，其中，起關鍵作用的主要成分是豌豆白蛋白家族成分的亞組分1b(Pea Albumin 1b，PA1b)。這種組分的氨基酸序列與豆種子蛋白的超家族成員如凝集素、蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑和其它的一些低分子量白蛋白序列表現出一定的同源性。該組分由37個氨基酸構成，其中富含6個半胱氨酸，構成3個分子內二硫鍵，空間結構高度緊密、異常穩(wěn)定。與一般的蛋白相比，其生化性質及其抗蟲作用機理有著很大的不同。但在對米象、玉米象、谷象和蚜蟲等多種昆蟲的喂食實驗中，都表現出具有顯著的毒性作用，是自然界中高效的生物殺蟲劑，是未來安全性為首要特征的生物農藥開發(fā)應用的又一重要資源。

發(fā)明內容
為了解決上述現有技術的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白。本發(fā)明采用DNA體外重組的方法，構建出表達豌豆白蛋白亞組分PA1b的基因工程菌，通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方式規(guī)模化獲得重組蛋白，并以此為基料，配制針對儲糧害蟲防治的生物殺蟲劑。
本發(fā)明的另一個目的在于提供上述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白在防治儲糧害蟲的生物殺蟲劑中的應用。
本發(fā)明的目的通過下述技術方案來實現一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，包括如下步驟(1)重組蛋白生產的基因工程菌構建選擇分泌型的畢赤酵母表達質粒pPICZαA/B/C(Invitrogen Co.)作為目的基因的表達載體，使目的蛋白上游與α因子分泌信號肽和Glu-Lys-Arg識別序列(該序列能被氨基肽酶Kex2識別)直接融合，從而使表達蛋白直接分泌在發(fā)酵培養(yǎng)基中，利于后面的分離、純化過程。
設計上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTTCTT GCA ACG GTG TTT G-3′，下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGTGGT GGT GG-3′；以豌豆cDNA文庫為模板，進行RT-PCR擴增獲得目的基因片段，目的基因片段與表達載體pPICZαA/B/C經內切酶Xho I和Not I雙酶切后連接，構建表達產物的重組質粒pPICZαA/B/C-1b；重組質粒pPICZαA/B/C-1b經Sal I處理成線狀后，采用電轉化的方法將其導入畢赤酵母細胞(Pichia pastoris strain GS115，his4)，在含Zeocin選擇壓力的YPD培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達能力的基因工程轉化菌。
(2)重組蛋白的發(fā)酵生產第一步，富集菌體基因工程轉化菌接種到MGYH液體培養(yǎng)基中，在25～30℃下培養(yǎng)至A600約為2.6。在室溫下，將發(fā)酵液進行低速離心，收集細胞。
第二步，誘導重組蛋白表達將上一步收集的細胞用BMMH液體培養(yǎng)基重新懸浮細胞至A600為0.1，然后培養(yǎng)，誘導抗蟲蛋白表達，每24h添加100％甲醇至甲醇濃度為0.5％，維持誘導壓力，促使重組蛋白表達。
(3)重組蛋白的分離純化經甲醇誘導重組蛋白表達的發(fā)酵液離心除去細胞后，上清液采用Ultrafree-15超濾膜(10K，Millipore Co.)分離，濾液采用HPLC(高效液相色譜法)分離，收集滯留時間為28～30min的分部組分真空干燥，經冷凍干燥獲得到由37個氨基酸殘基組成的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白。
所述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的氨基酸殘基序列為Ala Ser CysAsn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly Thr Ser Ala Cys Arg CysIle Pro Val Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys Arg Asn Pro Ser Gly。
所述步驟(1)中RT-PCR擴增反應參數94℃5min，94℃60s，55℃50s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃10min。
所述步驟(2)中MGYH培養(yǎng)基組成為1.34％YNB(Yeast Nitrogen Base，酵母氮源基料，Invitrogen公司的酵母培養(yǎng)基產品)，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸。
所述步驟(2)中BMMH培養(yǎng)基組成為100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％甲醇和0.004％組氨酸。
所述步驟(3)中HPLC分離條件分離柱為5μNucleosil-300C18(Hypersil)，洗脫液采用線性梯度乙腈(20～100％，v/v，內含0.1％三氟乙酸)，流速1ml/min。
本發(fā)明的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白就是通過上述方法制備而成。所述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的氨基酸殘基序列為Ala Ser Cys AsnGly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile ProVal Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys Arg Asn Pro Ser Gly。
上述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白在制備防治儲糧害蟲的生物殺蟲劑中的應用，將豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白100μg溶于167μl水中，然后將其與250mg小麥粉混合，制成小團，干燥，即制得防治儲糧害蟲的生物殺蟲劑。
本發(fā)明與現有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明通過獨特的工藝，簡便的方法，使豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的規(guī)模化生產成為現實。畢赤酵母表達PA1b的成本低，產量高，分離純化工藝簡便，在資源的產業(yè)化生產上具有獨特的優(yōu)勢。


圖1為構建畢赤酵母基因工程菌的Northern blot分析圖。
圖2為0.5％甲醇誘導重組蛋白表達的SDS-PAGE分析圖。
圖3為HPLC分離重組蛋白的分部收集示意圖。
圖4為重組蛋白分離純化SDS-PAGE分析圖。
圖5為表達蛋白對糧儲象蟲的毒性實驗對比圖。
具體實施例方式
下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1(1)重組蛋白生產的基因工程菌構建；選擇分泌型的畢赤酵母表達質粒pPICZαA/B/C作為目的基因的表達載體，使目的蛋白上游與α因子分泌信號肽和Glu-Lys-Arg識別序列(該序列能被氨基肽酶Kex2識別)直接融合，從而使表達蛋白直接分泌在發(fā)酵培養(yǎng)基中，利于后面的分離、純化過程。
設計上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTTCTT GCA ACG GTG TTT G-3′，下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGTGGT GGT GG-3′；以豌豆cDNA文庫為模板，進行RT-PCR擴增獲得目的基因片段(94℃5min，94℃60s，55℃50s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃10min)。目的基因片段與表達載體pPICZαA/B/C經內切酶Xho I和Not I雙酶切后連接，構建表達產物的重組質粒pPICZαA/B/C-1b。約10μg重組質粒pPICZαA/B/C-1b經Sal I處理成線狀后，采用電轉化的方法(電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω，電擊時間4～10msec)將其導入畢赤酵母細胞(Pichiapastoris strain GS115，his4)。在含100μg/ml Zeocin選擇壓力的YPD培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達能力的基因工程轉化菌。采用Northern blot雜交技術進行檢測，結果顯示部分轉化菌株中(如G9和G22)目的蛋白mRNA存在轉錄的情況，表明目的蛋白表達的基因工程轉化菌已成功構建，如圖1所示，MRNA分子量標記(0.24-9.5kb)；C對照(GS115)；2、5、8、9、22轉化子不同菌株。
(2)對菌體采用兩步培養(yǎng)法第一步，菌體在含有酵母膏和蛋白胨等豐富營養(yǎng)成分的MGYH培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，離心收集細胞。第二步，細胞在含最低營養(yǎng)成分的BMMH培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并添加甲醇，使0.5％甲醇誘導重組蛋白表達，確定誘導時間。
第一步，富集菌體基因工程轉化菌接種到含50ml MGYH培養(yǎng)基(1.34％YNB，Yeast Nitrogen Base，Invitrogen公司的酵母培養(yǎng)基產品)，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸)的250ml三角瓶中，在30℃下培養(yǎng)24h(A600約2.6)，搖床轉速約300r/min。室溫(30℃)下，發(fā)酵液在離心力3000×g下離心10min，移去上清液，收集細胞。
第二步，誘導重組蛋白表達將上一步收集的細胞用約200ml BMMH培養(yǎng)基(100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％甲醇(v/v)和0.004％組氨酸(w/v))，重新懸浮細胞至A600為0.1，放入1L燒瓶中培養(yǎng)，誘導抗蟲蛋白表達。每24h添加100％甲醇至甲醇濃度為0.5％，維持誘導壓力，促使重組蛋白表達。表達的抗蟲融合蛋白分子量約為4.5Kb。圖2表明不同誘導時間對重組蛋白合成的影響，M蛋白質分子量標記；24、48、72、96、1200.5％甲醇的誘導時間。由圖2可知，0.5％的甲醇誘導72小時，融合蛋白開始表達，到96小時開始維持較高的表達量，120小時后開始出現溶菌現象。
(3)重組蛋白的分離純化取200ml經96小時誘導的發(fā)酵液，3000×g離心除菌后，上清液采用Ultrafree-15超濾膜(10K)分離。濾液進一步用HPLC分離，分離柱為5μNucleosil-300 C18(Hypersil)，洗脫液采用線性梯度acetonitrile(20～100％，v/v，內含0.1％trifluoroacetic acid)，流速1ml/min。收集滯留時間為28～30min的分部組分進行真空干燥。由于重組蛋白分子量較小，通過超濾，已除去了大部分雜蛋白，再經HPLC分離，蛋白得到了進一步純化。經冷凍干燥獲得由37個氨基酸殘基組成的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白。重組蛋白的產量約為20mg/L，如圖3、圖4所示。圖3中，1原始菌株對照；2重組菌株分離蛋白。圖4中，M蛋白質分子量標記；1對照；2HPLC分離組分；3超濾分離組分。
(4)用重組蛋白喂食象鼻蟲(Sitophilus oryzae)進行毒性試驗實驗室中，象鼻蟲(Sitophilus oryzae)在27.5℃和70％的相對濕度下生長，喂食小麥或豌豆。實驗用象鼻蟲約培養(yǎng)近30代。
將從發(fā)酵液中提取的重組蛋白100μg溶于167μl水中，然后將其與250mg小麥粉混合，制成小團干燥后，分別給30個抗性和敏感性成蟲喂食，每天觀察象鼻蟲死亡個數，直到敏感性蟲死亡率達到95％，利用軟件(StatViewprogram of SAS Institute Inc.)分析半致死劑量LC50。結果表明，重組蛋白對敏感型蟲表現出很高的毒性，半致死劑量達到4.7，與來源于天然植物豌豆活性蛋白的毒性一致；而對抗性蟲的毒性效果不明顯，如圖5所示，米象(Sitophilusoryzae)累積存活比例示意圖，實驗樣品轉化菌株GS22表達的PA1b重組蛋白；實驗材料敏感/抗性株系。
綜上所述，本發(fā)明通過獨特的工藝，簡便的方法，是豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的規(guī)?；a成為現實。畢赤酵母表達PA1b的成本低，產量高，分離純化工藝簡便，在資源的產業(yè)化生產上具有獨特的優(yōu)勢。
SEQUENCE LISTING<110>華南理工大學<120>豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白及其制備方法和應用<130>30<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>40<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>上游引物Xho I-PA-F<400>1ctctcgagaa aagagaggct gcttcttgca acggtgtttg 40<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>下游引物Not I-PA-R<400>2gatctcagtg gtggtggtgg 20<210>3<211>37<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的氨基酸殘基序列
<400>3Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly1 5 10 15Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys20 25 30Arg Asn Pro Ser Gly3權利要求
1.一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)重組蛋白生產的基因工程菌構建設計上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTTCTT GCA ACG GTG TTT G-3′，下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGTGGT GGT GG-3′；以豌豆cDNA文庫為模板，進行RT-PCR擴增獲得目的基因片段，目的基因片段與表達載體pPICZαA/B/C經內切酶Xho I和Not I雙酶切后連接，構建表達產物的重組質粒pPICZαA/B/C-1b；重組質粒pPICZαA/B/C-1b經Sal I處理成線狀后，采用電轉化的方法將其導入畢赤酵母細胞，在含Zeocin選擇壓力的YPD培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達能力的基因工程轉化菌；(2)重組蛋白的發(fā)酵生產第一步，富集菌體基因工程轉化菌接種到MGYH液體培養(yǎng)基中，在25～30℃下培養(yǎng)至A600為2.6；在室溫下，將發(fā)酵液進行低速離心，收集細胞；第二步，誘導重組蛋白表達將上一步收集的細胞用BMMH液體培養(yǎng)基重新懸浮細胞至A600為0.1，然后培養(yǎng)，誘導抗蟲蛋白表達，每24h添加100％甲醇至甲醇濃度為0.5％，維持誘導壓力，促使重組蛋白表達；(3)重組蛋白的分離純化經甲醇誘導重組蛋白表達的發(fā)酵液離心除去細胞后，上清液采用Ultrafree-15超濾膜分離，濾液采用HPLC分離，收集滯留時間為28～30min的分部組分真空干燥，經冷凍干燥獲得豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白。
2.根據權利要求1所述的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中RT-PCR擴增反應參數94℃ 5min，94℃ 60s，55℃ 50s，72℃ 50s，35個循環(huán)，72℃ 10min。
3.根據權利要求1所述的一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中MGYH培養(yǎng)基組成為1.34％YNB，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸。
4.根據權利要求1所述的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中BMMH培養(yǎng)基組成為100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％甲醇和0.004％組氨酸。
5.根據權利要求1所述的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中HPLC分離條件分離柱為5μ Nucleosil-300 C18，洗脫液采用線性梯度乙腈，流速1ml/min。
6.一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白，其特征在于所述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的氨基酸殘基序列為Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro PheGlu Met Pro Pro Cys Gly Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile GlyTyr Cys Arg Asn Pro Ser Gly。
7.權利要求6所述的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白在制備防治儲糧害蟲的生物殺蟲劑中的應用，其特征在于將豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白100μg溶于167μl水中，然后將其與250mg小麥粉混合，制成小團，干燥，即制得防治儲糧害蟲的生物殺蟲劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和生物殺蟲劑的技術領域，提供了一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白及其制備方法，該方法包括重組蛋白生產的基因工程菌構建；重組蛋白的發(fā)酵生產；重組蛋白的分離純化。本發(fā)明還提供了上述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白在制備防治儲糧害蟲的生物殺蟲劑中的應用。本發(fā)明通過獨特的工藝，簡便的方法，使豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的規(guī)?；a成為現實。畢赤酵母表達PA1b的成本低，產量高，分離純化工藝簡便。
文檔編號C12N1/19GK101033465SQ20071002655
公開日2007年9月12日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權日2007年1月26日
發(fā)明者張毅, 許喜林 申請人:華南理工大學