專利名稱：：淺色黃姑魚泌乳激素基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種泌乳激素基因序列，尤其涉及一種淺色黃姑魚泌乳激素的基因序列。
背景技術(shù)：
：泌乳激素(Prolactin,PRL)是一種多肽激素，由前腺垂體的特異的催乳素細(xì)胞合成和分泌，其名稱最早來自它能刺激鴿子嗉囊的上皮細(xì)胞增生，生成嗉囊乳。它也是現(xiàn)在PRL生物測定的依據(jù)。1928年，法國學(xué)者Stxicher和Grueler證實(shí)了有一種能誘導(dǎo)野兔乳汁分泌的垂體因子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PRL除具有促進(jìn)乳腺發(fā)育、啟動(dòng)泌乳和維持泌乳的功能外，還參與個(gè)體生殖生理的調(diào)控、免疫活動(dòng)及滲透壓調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳遞等。另外，人們還了解到，PRL的合成和分泌不只局限在垂體，生物體的其他組織和器官也具有這個(gè)能力。八十年代以來的研究證實(shí)，機(jī)體內(nèi)存在免疫一神經(jīng)一內(nèi)分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。其中最引人矚目的激素就是泌乳激素。PRL不僅可以通過內(nèi)分泌機(jī)制影響免疫系統(tǒng)的功能，而且還作為一種由免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生、釋放的細(xì)胞因子，以旁分泌和自分泌方式調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的反應(yīng)。自從1959年P(guān)ick-ford和Phillips發(fā)現(xiàn)用PRL來處理垂體切除的Killifish,可使移入淡水中的Killifish存活以來，到1974年P(guān)RL己經(jīng)有80多種功能被發(fā)現(xiàn)(Nico11,1974)，直到現(xiàn)在已經(jīng)有300多種功能。許多PRL的功能已經(jīng)被證實(shí)。主要功能是l)水和電解質(zhì)平衡；2)代謝；3)生長和發(fā)育；4)繁殖；5)腦和行為；6)免疫調(diào)節(jié)。在魚類，PRL的生物學(xué)作用同在其他脊椎動(dòng)物中一樣，是多重的、變化的，包括參與滲透壓調(diào)節(jié)、生殖、代謝、行為和產(chǎn)生黏液。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種淺色黃姑魚的泌乳激素基因序列，為淺色黃姑魚的健康養(yǎng)殖和可持續(xù)發(fā)展提供新的理論依據(jù)。根據(jù)魚類的PRL基因的保守性,以簡并引物NcPRL-FW和NcPRL-RV1、NcPRL-RV2進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一輪PCR擴(kuò)增用一般反應(yīng)程序，退火溫度采用5(TC，72°C延伸2分鐘，其擴(kuò)增產(chǎn)物中有一條2000bp左右的片段，與設(shè)計(jì)引物時(shí)預(yù)測片段大小一致，但條帶太弱，所以進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，以便進(jìn)一步確定目的片段。第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)程序前25個(gè)循環(huán)，首先第一循環(huán)用7(TC退火，然后每過一循環(huán)退火溫度就下降0.8'C,最后10個(gè)循環(huán)用5(TC退火，72'C延伸2分鐘。從電泳結(jié)果中可知，第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物比較模糊，目的條帶不是很明顯，而第二輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物目的條帶比較明顯，片段大小在2000bp左右，跟設(shè)計(jì)引物時(shí)預(yù)測片段大小一致。經(jīng)過二輪PCR擴(kuò)增可基本確定目的片段，故將這個(gè)2000bp的片段克隆、測序。測序結(jié)果經(jīng)http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站blastn比對(duì)，結(jié)果與其他魚類PRL的堿基序列相似，與河艫(戸rcay/ave;ycera)和金頭鯛(^ara^awrato)的PRL基因序列相似最高。根據(jù)已擴(kuò)出的PRL中間片段序列，設(shè)計(jì)特異引物5-PRL-R1和5-PRL-R2。首先以特異引物NcPRL-FW與兩個(gè)反向特異引物5-PRL-R1、5-PRL-R2分別以淺色黃姑魚DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在56度退火溫度下都可擴(kuò)出與預(yù)期目的片段大小相一致的條帶。NcPRL-FW和5-PRL-R1的PCR產(chǎn)物大小約120bp，而與5-PRL-R2的PCR產(chǎn)物大小在100bp左右。再以5-PRL-Rl為引物，DNA為模板進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增。一般情況下都看不見PCR產(chǎn)物條帶，用PCR純化試劑盒直接回收PCR產(chǎn)物，為了引入另一端的引物，進(jìn)行加尾反應(yīng)，然后采用nested的引物5-PRL-R2和AAP，以加尾產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。從電泳結(jié)果來看，PCR產(chǎn)物呈一片彌散帶。將與預(yù)期大小片段相近的一段彌散帶割膠回收，在本實(shí)驗(yàn)中割取900bp2000bp之間的凝膠帶回收。將該段回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑10個(gè)單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增篩選，分別以5-PRL-R2和3端通用引物AP與NcPRL-FW和5-PRL-R2為引物，直接以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選。其中5-PRL-R2和AAP為引物，主要檢測目的片段的大小，而NcPRL-FW和5-PRL-R2為引物，則檢測是否可擴(kuò)出跟引物設(shè)計(jì)預(yù)期大小的片段。選取兩次PCR擴(kuò)增都可擴(kuò)出產(chǎn)物，且以5-PRL-R2和AP擴(kuò)增出的最大片段的菌液送測序公司測序。利用http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastn分析，結(jié)果與其他動(dòng)物PRL的堿基序列相似，可初步確定其為淺色黃姑魚的PRL基因部分序列。用特異引物3—PRL-F1做單引物PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物用PCR試劑盒直接純化回收，根據(jù)加尾反應(yīng)說明書進(jìn)行加尾反應(yīng)。再用nest-PCR引物3-PRL-F2和AAP，以加尾反應(yīng)產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1X瓊脂糖凝膠電泳，在UV/EB下觀察，呈現(xiàn)一片彌散帶，割取在900b^2000bp之間的彌散帶回收，連接構(gòu)建克麟體PMD18-T-3-PRL，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LB選擇平板上獲得許多個(gè)分離良好的單個(gè)白色菌落，隨機(jī)挑取10個(gè)白色菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)兩次菌落PCR鑒定，得到10個(gè)陽性克隆，分別命名為pMD18-T-3-PRLl、pMD18-T-3-PRL2…pMD18-T-3-PRL9、pMD18-T-3陽PRL10，取片段長度大的陽性克隆pMD18-T-3-PRL，送上海聯(lián)合基因生物技術(shù)有限公司測序。利用http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/blastn分析測定的序列，結(jié)果與其他動(dòng)物PRL的堿基序列相似，可初步確定其為淺色黃姑魚的PRL基因部分序列。運(yùn)用clustalx軟件將所得三段DNA序列進(jìn)行比對(duì)拼接為一條完整DNA序列，即為淺色黃姑魚PRL基因序歹i」，如SEQIDNO.l所述。淺色黃姑魚PRL基因組序列全長3839bp,包括5'端的非編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)域500bp和3'端非編碼區(qū)392bp。淺色黃姑魚PRL基因含5個(gè)外顯子(分別為43bp、113bp、108bp、183bp、192bp)和4個(gè)內(nèi)含子(分別為800bp、401bp、1015bp、92bp)，其開放閱讀框(ORF)共計(jì)639bp。利用SSRHunter軟件分析，發(fā)現(xiàn)淺色黃姑魚的基因組PRL中有個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，分別是(CA)w、(TGL和(AT)5序列。通過基因擴(kuò)增獲得淺色黃姑魚PRL基因序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物qcPRL-Fl和qcPRL-Rl。qcPRL-Fl和qcPRL-Rl引物以淺色黃姑魚腦垂體cDNA文庫為模板，擴(kuò)增得到約900bp的片段。按前述方法將PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，與PMD18-T載體連接構(gòu)建克隆載體PMD18-T-PRL，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，在LB選擇平板上獲得若干個(gè)分離良好的單個(gè)白色菌落，隨機(jī)挑取10個(gè)白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR鑒定得到5個(gè)陽性克隆，分別命名為PMD18-T-PRL1、PMD18-T-PRL1、PMD18-T-PRL2、PMD18-T-PRL3、PMD18-T-PRL4和PMD18-T-PRL5，取PMD18-T-PRL3在上海聯(lián)合科技生物有限公司測序。菌落PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果，得到約900bp的片段。淺色黃姑魚PRL基因的cDNA序列如SEQIDN0.2所述，全長900bp。開放閱讀框(ORF)為639bp，可翻譯成由212個(gè)氨基酸殘基組成的前體蛋白，分子量約為23.39kDa，理論等電點(diǎn)約為8.80。利用軟件SignalP分析顯示，淺色黃姑魚PRL氨基酸序列前24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，經(jīng)轉(zhuǎn)膜剪切后形成188個(gè)氨基酸的成熟肽。該序列上有5個(gè)半胱氨酸殘基，一個(gè)在信號(hào)肽區(qū)，蛋白加工過程中，該半胱氨酸將隨信號(hào)肽被切除。同源性分析表明，淺色黃姑魚PRLcDNA序列與金鱸(尸erca/7sKesc朋s)和斜帶石斑魚(^w'/7ep力e7^cw》J't/es)的PRLcDNA的同源性最高，達(dá)到87%，而淺色黃姑魚PRL前體氨基酸序列，則與同屬鱸形亞目的舌齒鱸(AhZra力和斜帶石斑魚(^^7印/ze7^cw'oWes)的PRL前體氨基酸序列同源性最高，分別為85%(E=4e-101)和86%(E:2e-則。研究得最深入的是PRL在廣鹽性真骨魚類的滲透壓調(diào)節(jié)和在淡水適應(yīng)中的作用。同時(shí)，在淡水中PRL水平足夠高時(shí)，它也可以競爭性地與GH受體結(jié)合，發(fā)揮促生長活性。圖1是PRL基因中間序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；M:腦bp腿Marker;1:PCRproductwithNcPRL-FWandNcPRL-RV2primes;2:PCRproductwithNcPRL-FWandNcPRL-RVlprimes;圖2是引物NcPRL-FW與5-PRL-Rl、R2的PCR擴(kuò)增電泳圖；M:lOObpDNAMarker;1:PCRproductwithNcPRL-FWand5-PRL-Rlprimes;2:PCRproductwithNcPRL-FWand5-PRL-R2primes;圖3是PRL基因5'端序列PCR產(chǎn)物電泳圖；M:lOObpDNAmarker;1，2:PCRproducts;圖4是PRL基因5'端序列菌液PCR電泳圖；M:層bpDNAmarker,Upperrow:PCRproductswithNcPRL-FWand5-PRL-R2primes;Lowerrow::PCRproductswith5-PRL-R2andAPprimes;圖5是淺色黃姑魚PRLcDNA片段的篩選擴(kuò)增；M:lOObpDNAMarker;1-2:PCRproducts;圖6是PRLcDNA片段菌液PCR電泳圖；M:100bp腿marker;1-4:菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。具體實(shí)施方式一、淺色黃姑魚PRL基因序列的克隆1淺色黃姑魚PRL中間片段1.1引物設(shè)計(jì)魚類PRL基因具有較高的保守性，根據(jù)與淺色黃姑魚親緣關(guān)系較近的斜帶石斑魚(五p/"epfe/usco!'o!Vfc)、金頭鯛(SpflA^做rato)和河鱸(尸em;r/tm'加'fo)的PRL基因序列，綜合比較其他魚類的PRL基因序列的同源性，設(shè)計(jì)三條兼并引物，用于擴(kuò)增淺色黃姑魚PRL基因的中間片段，引物序列如下NcPRL-FW:5,-TG(C/T)TGT(A/G)(T/C)ATGGTGGCAGCGTGC-3，NcPRL-RV1:5，陽GAGTCGCGGCGGAAGCAGGACA陽3'NcPRL-RV2:5,-CTGTAGGGCAG(C/T)GAGG(C/A)GATG陽3，1.2PRL基因組DNA中間片段的PGR擴(kuò)增1.2.1第一輪PGR擴(kuò)增以淺色黃姑魚DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，建立如下反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系10x￡x~Buffer(Mg2+)5|oL2.5mMdNTPMixture恥10一NcPRL-FW1.0(iLlO一NcPRL-RVl1.0DNA模板1.0ddH2037.75pL7b歸a￡x7l^(5U/nL)終體積50^反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性5min;以下35個(gè)循環(huán)94°C45s，57°C45s,72°C2min;72'C延伸10min，最后4'C保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.2第二輪PCR擴(kuò)增第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍為模板，以NcPRL-FW和NcPRL-RV2為引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系同上。1.3PGR產(chǎn)物凝膠回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離。割膠回收跟預(yù)期估計(jì)大小相近的片段。方法參照DNA凝膠回收試劑盒(DNAGelExtractionKit)使用說明書進(jìn)行(1)使用0.5XTBE制作的1.2%瓊脂糖凝膠對(duì)目的DNA進(jìn)行電泳分離。(2)在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體。(3)稱量凝膠重量，計(jì)算膠塊體積。以lmg重量換算成lpL計(jì)算。(4)根據(jù)凝膠濃度，按下表所提供的參數(shù)加BufferDE-A:凝膠濃度BufferDE-A體積<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(5)均勻混合后于75。C加熱，每隔23分鐘混合一次，直至凝膠塊完全融化。(6)按BufferDE-A體積的50%加入BufferDE-B，均勻混合。當(dāng)回收的DNA片段小于500bp時(shí)，應(yīng)再加入終濃度為20%的異丙醇。(7)將試劑盒中DNA-prepTube按置于2mlMicrofUgeTube中，將步驟6中的混合液移入DNA-prepTube中，2500Xg(或5500rpm)離心1分鐘。(8)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofogeTube中，加入500pLBufferWl，2500Xg(或5500rpm)離心1分鐘。(9)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700pL已加無水乙醇的BufferW2，2500Xg(或5500rpm)離心1分鐘，以同樣的方法再用700pLBufferW2洗滌一次。(10)將DNA-prepTube置于1.5ml離心管中，1200Xg離心1分鐘。(11)將DNA-prepTube置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在silica膜中央加入253(HiLEluent或去離子水，室溫靜置1分鐘。1200Xg離心1分鐘洗脫DNA。1.4PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化連接采用T-A克隆法。此方法是利用普通DNATaq酶在PCR擴(kuò)增過程中，以非模板依賴方式在擴(kuò)增產(chǎn)物的3'端加脫氧腺苷(A)的特性，使PCR產(chǎn)物在3'端多出一個(gè)未配對(duì)的堿基A。利用線性化的T載體3'端凸出一個(gè)脫氧胸苷(T)的特性，在T4DNA連接酶作用下，將PCR產(chǎn)物與T載體相連，形成重組載體。參照T載體使用說明書，建立如下連接反應(yīng)體系_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將上述反應(yīng)混合物混勻后，置于PCR儀中16'C連接過夜。轉(zhuǎn)化(1)￡co〃(DH5a)感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)(1)從經(jīng)37。C培養(yǎng)16~20h的新鮮平板上，用無菌牙簽挑取一白色單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基中，37'C搖菌過夜(200300轉(zhuǎn)/分)。第二天按l:100比例取過夜的菌液500nL加入50mlLB培養(yǎng)基中，37。C劇烈搖菌2-3h(300轉(zhuǎn)/分)，待OD咖值約為0.3~0.4時(shí)，停止培養(yǎng)。(2)將細(xì)菌轉(zhuǎn)入一50mL無菌離心管中，冰浴10min。(3)4000xg，4'C離心10min，回收細(xì)菌，用10mL冰冷的0.1mol/LCaCl2重懸沉淀細(xì)胞。(4)4000xg，4'C離心10min，回收細(xì)菌，沉淀重懸于2mL冰上預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2中。(5)每份200pL感受態(tài)細(xì)胞分裝于1.5mL離心管中，于4'C貯存?zhèn)溆茫蚣?0%的滅菌甘油，于-7(TC凍存。(2)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化(化學(xué)轉(zhuǎn)化)(1)取DH5a感受態(tài)細(xì)胞200pL置于冰上，加入5~10連接產(chǎn)物，輕旋混勻。(2)置冰上放置30min，其間輕輕搖動(dòng)2~3次。(3)迅速于42'C水浴中熱激90s，再迅速置冰上冷卻2-3min。(4)加入800pLLB培養(yǎng)基，37°C，150rpm輕搖培養(yǎng)45~60min。(5)5000rpm離心2min，回收細(xì)胞，用100~200LB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，均勻涂布于含有100pg/mLAmp的選擇培養(yǎng)基平板上(含有5pLIPTG(200mgmL")和50pLX-gal(20mgmL—1))上，將平板放于37'C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。1.5菌液PCR鑒定假陽性克隆直接取隨機(jī)挑取的單克隆菌液進(jìn)行PCR鑒定。25^L反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)體系10x&7^Buffer2.52.5mMdNTPMixture2(oL10一NcPRL-FWO單10pMNcPRL-RV2O單菌液1.0|iLddH2018.375pL7^幽￡xr一5u/nL)0.125nL終體積25nL反應(yīng)程序同第二輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。.1.6序列測定、分析將菌液PCR和酶切鑒定均為陽性的克隆放大培養(yǎng)分裝，送上海博亞生物技術(shù)有限公司用AB377自動(dòng)測序儀進(jìn)行序列測定。2.PRL基因5'端序列和3'端序列的克隆為了取得淺色黃姑魚PRL基因5'端和3'端序列，采用染色體步移法，根據(jù)上述己取得的中間序列，設(shè)計(jì)合成4條基因特異性引物(見表4-l)。在第一輪擴(kuò)增反應(yīng)中利用基因特異性引物F1或R1進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增；然后，進(jìn)行加尾反應(yīng)；在第二輪擴(kuò)增反應(yīng)中利用基因特異性引物F2或R2和錨式引物AAP(見表4-l)擴(kuò)增DNA。2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)已測定的淺色黃姑魚PRL基因組DNA中間序列，用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)并由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成4條基因特異性引物3-PRL-Fl、3-PRL-F2和5-PRL-R1以及錨式引物01igo(dT)n-adapter、AAP與通用接頭引物Adaptorprimer。表4-l實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列Tab.4-1Oligonucleotideprimersusedinexperiments_引物名稱name引物序歹'Jsequence(5，—3，)用途information5-PRL-R1GACCAGGTCTTGACTGAGCATTG前兩條用于PRL基因5-PRL-R2AAGGGAGTGTAGCGTGTCAGAC5端岸列的擴(kuò)增3-PRL-FlATGTCACTGGCTCGCTCA用于PRL基因3端序列的3-PRL-F2CTGTTAAGACCCTGCCTCACCCA擴(kuò)增AAPGGCCACGCGTCGACTAGTACG,6用于接出未知端序列的Oligo(dT)i7-adarrterGGCCACGCGTCGACTAGTACTi7引物AdaDtorDiimerGGCCACGCGTCGACTAGTAC2.2prl基因5'端序列的克隆2.2.1pgr擴(kuò)增為了檢測設(shè)計(jì)的特異引物的可行性。以淺色黃姑魚DNA為模板，以5-PRL-R1與NcPRL-FW和5-PRL-R2與NcPRL-FW為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立如下反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系io必r"《Buffer(Mg2+)5(jL2.5mMdNTPMixture4j^L105-PRL-R1或5-PRL-R21.0^10一NcPRL陽FW1.0nLDNA模板1.0ddH2037.75nL0.25pL終體積50nL反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性4min;以下35個(gè)循環(huán)94°C30s，54°C30s,72。Clmin;72'C延伸10min，最后4"保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。2.2.2單引物pcr擴(kuò)增以淺色黃姑魚DNA為模板，以PRL-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建立如下反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系10x￡x7^Buffer(Mg2+)5|uL2.5mMdNTPMixture4jaL10pM5-PRL-R11.0pLDNA模板1.0ddH2038.75pLra扁aficT^(5U/pL)0.25nL終體積50nL反應(yīng)參數(shù)為94'C預(yù)變性5min;以下35個(gè)循環(huán)94。C30s，56。C30s，72°C4min;72匸延伸10min，最后4"C保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.2.3PCR產(chǎn)物直接純化回收直接取PCR產(chǎn)物用PCR清潔試劑盒(V-gene)純化回收。具體操作步驟參照PCR清潔試劑盒說明書進(jìn)行，步驟同1.3。2.2.4加尾反應(yīng)在冰上向微量離心管中加入以下成分PCR產(chǎn)物加尾反應(yīng)體系DEPC陽treatedWater6.5|iLTerminalTransferase5xBuffer5jjL2mMdCTP2.5純化的PCR產(chǎn)物_10總體積24輕柔混勻，于PCR儀上94。C孵育23min，立即于冰上冷卻2min，簡短離心后置于冰上，加入lnL末端轉(zhuǎn)移酶(TdT),輕旋混勻，置于PCR儀上37。C孵育60min，接著70。C加熱10min終止反應(yīng)，簡短離心后產(chǎn)物貯于-2(TC備用。2.2.5PGR二次擴(kuò)增以加poly(C)尾的第一鏈cDNA為模板，建立以下反應(yīng)體系，包括第一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10x五;c7^Buffer(Mg2+)5.0)LiL2.5mMdNTPMixture4.0lO^MAAP1.010pM5-PRL-R21.0pL加Poly(C)尾的第一鏈cDNA1.0|iLddH2017.3roKa及o!五x7^(5U/iiL)0.2終體積25pLPCR反應(yīng)參數(shù)為94r預(yù)變性5min;以下25個(gè)循環(huán)94。C變性45s，52"退火45s，72。C延伸60s;循環(huán)結(jié)束后72。C延伸10min，最后4"C保溫。取510PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增效果，結(jié)果見圖3。此PCR產(chǎn)物作為連接PCR產(chǎn)物。2.2.6PCR產(chǎn)物割膠回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離。割膠回收跟預(yù)期估計(jì)大小范圍相近的一段膠。方法參照DNA凝膠回收試劑盒(DNAGelExtractionKit)使用說明書進(jìn)行。2.2.7連接、轉(zhuǎn)化涂平板。方法同1.4。2.2.8PRL基因5'端PCR產(chǎn)物的克隆檢測隨機(jī)挑取幾個(gè)單菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)，直接取菌液進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增鑒定。第一次PCR擴(kuò)增分別以各菌液為模板，PRL-R2+AAP為引物，檢測插入片段的大小。反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)程序同2.3.2.5。第二次PCR擴(kuò)增分別以各菌液為模板，以PRL-F0+PRL-R2為引物，檢測插入片段是否為目的片段，其電泳結(jié)果如圖4所示。反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)程序2.3.2.1。2.2.9序列測定PCR鑒定均為陽性的克隆放大培養(yǎng)分裝，送上海博亞生物技術(shù)有限公司用AB377自動(dòng)測序儀進(jìn)行序列測定。2.3PRL基因3'端序列的克隆步驟方法同PRL基因5'端序列獲得方式。2.3.1PRL基因序列全長拼接運(yùn)用CLUSTAL軟件，將所得的三段DNA序列進(jìn)行比對(duì)拼接為一條完整的DNA序列，即為PRL基因組全長DNA序列。2.3.2序列分析將拼接得到的DNA序列，輸入GenBank-EMBL核酸數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過BLAST程序進(jìn)行相似性比對(duì)檢索。堿基序列翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列，其他特征通過CLUSTALW、DNATools等軟件分析，用Mega2.0計(jì)算其與其他物種的相似百分比，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。二、淺色黃姑魚PRLcDNA序列的獲得1.引物設(shè)計(jì)根據(jù)拼接的PRL基因組DNA序列設(shè)計(jì)二對(duì)特異引物，以其擴(kuò)增PRLcDNA的全長序列，設(shè)計(jì)的引物序列如下qcPRL-Fl:5-ACCAGACCAGCCATGAACA-3qcPRL-Rl:5-GGCTACAGCGTGCAGTTG-32.PRLcDNA的PCR擴(kuò)增淺色黃姑魚腦垂體cDNA文庫為模板進(jìn)行擴(kuò)增，建立如下反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)體系10x￡x7^Buffer(Mg2+)52.5mMdNTPMixture爭10qcPRL-Fl1.0&10[iMqcPRL陽Rl1.0}AcDNA文庫l.Oi^LddH2037.75nL7ixKa/oEx7i^(5U/(xL)0.25nL終體積50|iL反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性5min;以下前5個(gè)循環(huán)94。C30s，50。C30s，72°Clmin;72。C延伸3min，再反應(yīng)35個(gè)循環(huán)94°C30s，58°C30s,72°Clmin;72。C延伸lOmin，最后4'C保溫。擴(kuò)增的？01產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果見圖5。3.PGR產(chǎn)物凝膠回收方法步驟同1.3。4.連接、轉(zhuǎn)化方法步驟同1.4。5.菌液PGR鑒定假陽性克隆用滅菌牙簽隨機(jī)挑取單菌落，接種于含有100pg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37'C，200300rpm搖菌培養(yǎng)34小時(shí)后，直接取菌液進(jìn)行PCR鑒定。25pL反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)體系10x￡Jc7^Buffer(Mg2+)2.5pL2.5mMdNTPMixture2(jLlO^MqcPRL-Fl0單10岸qcPRL-Rl0.5^菌液l単ddH2018.375nL0.125pL終體積25^反應(yīng)程序同GH基因cDNA序列PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。6.序列測定和序列分析將菌液PCR鑒定為陽性的克隆放大培養(yǎng)分裝，送上海博亞生物技術(shù)有限公司用AB377自動(dòng)測序儀進(jìn)行序列測定。http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/對(duì)序列進(jìn)行blast、DNAStar軟件對(duì)序列進(jìn)行翻譯分析、ClustalW1.83對(duì)脊椎動(dòng)物中PRL的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)、Mega2.0軟件對(duì)它們進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析、DNAstar軟件包對(duì)各序列同源性進(jìn)行計(jì)算。圖6是菌落PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果，從圖上可見經(jīng)PCR擴(kuò)增都可得到約900bp的片段。序列表<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所<120>淺色黃姑魚泌乳激素基因序列<160>3<210>1<211>3839<212>DNA<213〉淺色黃姑魚(Nibeacoibor)<220><221>gene<222>(1)...(3839)<220><221〉promoter<222>(1)...(500)<220><221>satellite<222>(231)...(250)<220><221>exonl<222>(501)...(543)<220><221>intronl<222>(544)...(1343)<220><221>satellite<222>(577)...(586)<220><221>exon2<222>(1344)...(1456)<220><221>intron2<222>(1457)...(1857)<220><221>satellite<222>(1474)...(1501)<220><221>exon3<222>(1858)...(1965)<220><221>intron3<222>(1966)...(2980)<220><221>exon4<222>(2981)...(3163)<220><221>intron4<222>(3164)...(3255)<220><221>exon5<222>(3256)...(3444)<400>1tgaccaggccttgactgagcattgtgccacggtgactttttgatttgattgacttcacta60tctataatgcaccttgtgagtgattacttttttcatccctgacagtaaatgagaagatca120gatgagatgatgacatgttcatcagccatttaagcateaaatgattattattacaacata180ctgtggaaacatcagtgtttttattcatccatctaattaagatctttttccacacacaca240cacacacacacgcatgcatgtgcacagacatgcacagcatcatcaacctgttgcatccat300tcacctttccttcaccatgtttctcattatgaactggaccaaacaagttccaaacaatca360gcacacgctccccgagctgctgcataaccaaacgaaacagatgaagccgaggaactataa420aacagagtcaacctccgtgctgaagaggaagaaacagcgaggaagagaagacgcaaaggc480tgacaaagacacgaagagagatggetcagagaaaaateaatggaageaaa530MetAlaGinArgLysHeAsnGlySerLys1510etcttcatgacgggtgagaggagctcagctgctctgtgaaattatgatatata583LeuPheMetThrtattatgtgtgtcatgtgtcagctgatgagaaactattgttcattgtatgtctaagattt643gtttgaggtgatttagaaacagagttacacagtttgtgtgacaggttcattaaaatgttc703cacttggtgcatgctgtatattgattacacttttttaatgatatatattttattgatccc763gagggacattcaagcatccagtagcagcatgagacacagtaaacacacagtgtgcattca823gattagcttatacagcaataaacatgeaatgagctgaatctgcatttgaatgaagecaga883gtagtttgacatgtgcaaagaagaaatgaaacacactgggatactgtgacctaagagctt943tataaatagaaaactttataaaagtaaaactagaataacatctttcatataaaaataaga1003aatagacctacaaaaaaactgtctacagttaactgaggctctagacactgaatgaagatc1063acagcattgcaaactgagtctaaatccttttcataataaccgctgUgttaaagaatatc1123acaatatattgagattttttatatattattgtggagaggtaaaatactgagatataatac1183ttcatggatatgagctacagctgctggtcgatcactgaatctgctgaacctcagagaact1243ttagttcactgctgctgattcataaactcctctgacacactgtatgtatgtgacatttgt1303gatagctctgatgtctctgtcatgtctccgtgctccacagtgttgtatgtggtggca1360ValLeuTyrValValAla1520gcgtgcggtgetgttcccateagegacctgetcgacegggcatctcag1408AlaCysGlyAlaValProlieSerAspLeuLeuAspArgAlaSerGin253035cgctctgacacgetacacteccttageacaatgetcagtcaagacctg1456ArgSerAspThrLeuHisSerLeuSerThrMetLeuSerGinAspLeu404550gtcagtacctctaatagtgtgtgtatgtgtgtgtgtgagtgtgtgctgagtcctcccaaa1516tgtaaatgttaaagcatatgttaaagttctagttgtgctcatggcttcctgattgecctg1576ageccgaattgcacagggcagcttagttgaacctgtatgtaeigtctattgttgttgttU1636tttcatgtcttcagcaacagaaaagatgagagattcagtttagctcttgtteatgeaggt1696cataccaggagttttttatgatctaaaacttccaattagccaaatgttcctgtcccagtt1756tattttttttacatttatttgcagggtaaacagttcattgtgattgtacagtacaatata1816aaagcatctcttctcctaatcgtcctatgtccctcccccaggactctcatttccctcca1875AspSerHisPheProPro55ataggceggatgattatgcctcgccccteaatgtgccacacctectct1923lieGlyArgMetlieMetProArgProSerMetCysHisThrSerSer606570ctgcagacacccaatgacaaggagcaagccctgcaagtateagtgagtcact1975LeuGinThrProAsnAspLysGluGinAlaLeuGinValSer758085gctcctccttattcctcctttctactccgcttccatttgtttcactgatgtcctgattat2035atttacttcatcattgtggtatcaggcatgagtacagacaaagatgtaataaatagacta2095ccgcagctttcacccaaataactaagtgagtgaatgttttaaeteittgaagcaagcctcaa2155tttattttgagagaacttgctgaagttgaacaagtcttacatgaatgtacctgatttcac2215catgacaacatgtatatgaagcagcgttgatggatatgacatgatatgaaaattagegag2275caagagagtgtgacatacaagtctgtgtaaaggtaattccaagatttctaatacgtgaaa2335tatgttgaaaatagttgctgaaaacatgtgaaaagattttgaaggatatattagtgaaat2395gtggagttagaggttcaaacagtttgtcaccagttttcagtccaggattttgtgggcggt2455ccttaaagggtggctcgatgacacgctgaggtcaccctgagcatacccctgcacccctag2515cagagagatagagatgaattcatctcactcagagtgtttcaaagttagttatgtcatttt2575ctgaactcatctgacacattggccaatgttgcccacaagtggacgtggcttcagcacatt2635cagaggacacgcccccacagtcctggagctgagaattcatttttacctgattttgacacc2695taatttcataaacttgttgatatttttaatcattcaaatttggctggttgattaatggca2755ctttcttttttggtctgacaaactaagaacacatttatttcttctttacatggcctttaa2815cttgaagagatttgtaacatttactgtaggccaacaagtgaattagatgatctttggaag2875acacaggtggttgtccatgcacagactggtttagtgaaaagcatgcttttgatctcttca2935gcgtactgtattgtcttaatattatccttttggcttcttctgcaggagteagacctg3992GluSerAspLeu卯a(chǎn)tgteactggetcgcteactgetccaagcctggtctgaccccetagaa3040MetSerLeuAlaArgSerLeuLeuGinAlaTrpSerAspProLeuGlu95100105gtcctgtecacttctgttaagaccctgcctcacccagcccaaaacage3088ValLeuSerThrSerValLysThrLeuProHisProAlaGinAsnSer110115120atatecaacaagateaaggagctgcaggagcactecaagagectggga3136lieSerAsnLyslieLysGluLeuGinGluHisSerLysSerLeuGly125130135140gacggcctgaacatettatctggcaaggtgagcaagtgagaaaatgatgaatccata3193AspGlyMetAsnlieLeuSerGlyLys145tgaagacattttgagttgcttttcgcaaacgtctttacttccttgctttgtttctcgttc3253agatgggtccggcggetcagaccatetecteactgccctacagaggtggc3303MetGlyProAlaAlaGinThrlieSerSerLeuProTyrArgGlyGly150155160165aatgacateggccaggataggatttecaaactgaccaacttccatttc3351AsnAsplieGlyGinAspArglieSerLysLeuThrAsnPheHisPhe170175180ctgUgtectgcttccgcagggacteceacaagattgacagettcetc3399LeuLeuSerCysPheArgArgAspSerHisLyslieAspSerPheLeu185190195aaagtcetccgctgccgtgcggcaaaactgcaacctgagatgtgttaa3447LysValLeuArgCysArgAlaAlaLysLeuGinProGluMetCys*200205210agagtgagagtgaagcageeagcttcactttgagggagacttttctaaaagcttgtattg3507tctgccaactatagattagcatgttttagaaatctgcatgatttgagctgtcagagggtg3567aagttagggaggggttacacagcccatacacaaatgattgaagtgacaccttttactgat3627cgtggtgcccaaaattgeceaattgttaatgtgactgtgtttactcaaaaatataaggta3687aggcattttaggttgggaaggtttatcctattgtccagacttgctatggttcattggaca3747gagcatgggtcacacactttcccgggtctttccagcttctggcattataaactgtgactc3807ctcctcatcttttccttccactacaccatttc3839<210>2<211>749<212>cDNA<213>淺色黃姑魚(Nibeacoibor)<220><221>CDS<222>(38)...(676)<220><221>sig_peptide<222>(38)...(106)<400>2agagaagacgcaaaggctgacaaagacacgaagagagatggetcagagaaaaate55MetAlaGinArgLyslie15aatggaageaaaetcttcatgacggtgttgtatgtggtggcagcgtgc103AsnGlySerLysLeuPheMetThrValLeuTyrValValAlaAlaCys101520ggtgetgttcccateagegacctgetcgacegggcatctcagcgctct151GlyAlaValProlieSerAspLeuLeuAspArgAlaSerGinArgSer253035gacacgetacacteccttageacaatgetcagtcaagacctggactct199AspThrLeuHisSerLeuSerThrMetLeuSerGinAspLeuAspSer404550catttccctccaataggceggatgattatgcctcgccccteaatgtgcHisPheProProlieGlyArgMetlieMetProArgProSerMetCys55606570cacacctectctctgcagacacccaatgacaaggagcaagccctgcaaHisThrSerSerLeuGinThrProAsnAspLysGluGinAlaLeuGin758085gtateagagteagacctgatgteactggetcgcteactgetccaagccValSerGluSerAspLeuMetSerLeuAlaArgSerLeuLeuGinAla9095100tggtctgaccccetagaagtcctgtecacttctgttaagaccctgcctTrpSerAspProLeuGluValLeuSerThrSerValLysThrLeuPro105110115cacccagcccaaaacageatatecaacaagateaaggagctgcaggagHisProAlaGinAsnSerlieSerAsnLyslieLysGluLeuGinGlu120125130cactecaagagectgggagacggaatgaacatettatctggcaagatgHisSerLysSerLeuGlyAspGlyMetAsnlieLeuSerGlyLysMet135140145150ggtccggcggetcagaccatetecteactgccctacagaggtggcaatGlyProAlaAlaGinThrlieSerSerLeuProTyrArgGlyGlyAsn155160165gacateggccaggataggatttecaaactgaccaacttccatttcctgAsplieGlyGinAspArglieSerLysLeuThrAsnPheHisPheLeu170175180ttgtectgcttccgcagggacteccacaagattgacagettcetcaaaLeuSerCysPheArgArgAspSerHisLyslieAspSerPheLeuLys185190195gtcetccgctgccgtgcggcaaaactgcaacctgagatgtgttaaValLeuArgCysArgAlaAlaLysLeuGinProGluMetCys*200205210agagtgagagtgaagcageeagcttcactttgagggagacttttctaaaagcttgtattgtctaccaactata247295343391439487535583631676736749<210>3<211>212<212>PRT<213>淺色黃姑魚(Nibeacoibor)<400>3MetAlaGinArgLyslieAsnGlySerLysLeuPheMetThrValLeu151015TyrValValAlaAlaCysGlyAlaValProlieSerAspLeuLeuAsp202530ArgAlaSerGinArgSerAspThrLeuHisSerLeuSerThrMetLeu354045SerGinAspLeuAspSerHisPheProProlieGlyArgMetlieMet505560ProArgProSerMetCysHisThrSerSerLeuGinThrProAsnAsp65707580LysGluGinAlaLeuGinValSerGluSerAspLeuMetSerLeuAla85卯95ArgSerLeuLeuGinAlaTrpSerAspProLeuGluValLeuSerThr100105110SerValLysThrLeuProHisProAlaGinAsnSerlieSerAsnLys115120125lieLysGluLeuGinGluHisSerLysSerLeuGlyAspGlyMetAsn130135140lieLeuSerGlyLysMetGlyProAlaAlaGinThrlieSerSerLeu145150155160ProTyrArgGlyGlyAsnAsplieGlyGinAspArglieSerLysLeu165170175ThrAsnPheHisPheLeuLeuSerCysPheArgArgAspSerHisLys180185190lieAspSerPheLeuLysValLeuArgCysArgAlaAlaLysLeuGin195200205ProGluMetCys210權(quán)利要求1.一種淺色黃姑魚泌乳激素的基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所述。2、權(quán)利要求l所述的淺色黃姑魚泌乳激素的基因的cDNA的序列，如SEQIDNO.2所述。3、權(quán)利要求1所述的淺色黃姑魚泌乳激素的基因的PRT序列，如SEQIDNO.3所述。全文摘要本發(fā)明公開了一種淺色黃姑魚泌乳激素基因序列，根據(jù)魚類的PRL基因的保守性，以簡并引物NcPRL-FW和NcPRL-RV1、NcPRL-RV2進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PRL中間片段序列；再以所得的PRL中間片段序列設(shè)計(jì)特異引物5-PRL-R1和5-PRL-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；通過基因擴(kuò)增獲得淺色黃姑魚PRL基因序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物qcPRL-F1和qcPRL-R1。qcPRL-F1和qcPRL-R1引物以淺色黃姑魚腦垂體cDNA文庫為模板，擴(kuò)增得到約900bp的片段。研究得最深入的是PRL在廣鹽性真骨魚類的滲透壓調(diào)節(jié)和在淡水適應(yīng)中的作用。同時(shí)，在淡水中PRL水平足夠高時(shí)，它也可以競爭性地與GH受體結(jié)合，發(fā)揮促生長活性。文檔編號(hào)C12N15/16GK101225392SQ200710026380公開日2008年7月23日申請日期2007年1月18日優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日發(fā)明者張殿昌,江世貴,邵艷卿申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所