專利名稱：核酸目的序列的檢測探針及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說是一種運用免疫層析試紙 來檢測核酸目的序列的方法。更具體的說，是一種涉及應(yīng)用限制性切 刻內(nèi)切酶、修飾的寡核苷酸的探針及免疫層析試紙檢測目標(biāo)序列的方 法。
背景技術(shù)：
熒光RT- PCR技術(shù)是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的，該技術(shù)將熒光 素標(biāo)記的探針與引物放在一起，在熒光PCR儀中反應(yīng)，電腦對整個反 應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)測，避免了交叉污染，提高了檢測敏感性，已成功用于 人丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等的檢測，但此類以RT-PCR為基礎(chǔ)的檢 測方法需要昂貴的PCR儀來進(jìn)行反應(yīng)，耗時較長， 一般需要1 2小時 反應(yīng)，不利于現(xiàn)場檢測，局限了其應(yīng)用于基層及家庭。為了克服傳統(tǒng)PCR的這個缺點，在近幾年里，等溫PCR的方法得到 了發(fā)展和應(yīng)用。由于等溫PCR沒有升降溫過程，反應(yīng)條件易于控制， 設(shè)備簡單，而且在靈敏度和特異性方面絲毫不遜色于傳統(tǒng)的PCR，因 而成為未來核酸檢測的主要發(fā)展方向。目前常用的等溫技術(shù)有以下幾 類① 基于DNA解旋酶的等溫擴(kuò)增(Helicase-d印endent isothermal DNA amplification, HDA):它主要是利用DNA解旋酶將DNA雙螺旋打開成 單鏈，隨后單鏈結(jié)合蛋白與單鏈DNA相結(jié)合，穩(wěn)定單鏈DNA，然后擴(kuò)增 引物與單鏈DNA模板相結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA。② 鏈替代擴(kuò)增(Strand displacement amplification, SDA):它主 要是依賴于限制性內(nèi)切酶和DNA聚合酶兩種酶的共同協(xié)作來完成。目 前該方法已應(yīng)用于細(xì)菌的檢測、建立體外進(jìn)化模型、核酸定量及芯片 雜交等多個方面。③ 核酸依賴的擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA):該反應(yīng)由一對引物指導(dǎo)的連續(xù)均一的體外特異核苷酸序列等 溫擴(kuò)增酶促過程。反應(yīng)在42 "C進(jìn)行，擴(kuò)增速度與PCR—樣快，在3小 時內(nèi)可擴(kuò)增1000萬倍。由于反應(yīng)不需高溫變性步驟，所以NASBA不會 受到雙鏈DNA的污染。同時由于外來雙鏈DNA無T7啟動子序列，不可能 被擴(kuò)增，這就大大提高了NASBA反應(yīng)的特異性。NASBA均一地等溫擴(kuò)增 特性擴(kuò)大了它的應(yīng)用范圍，技術(shù)適于檢測和定量特異RNA，并且用 NASBA也可以應(yīng)用于擴(kuò)增雙鏈DNA。④ QP復(fù)制Qe復(fù)制是依賴于QP復(fù)制酶(Q-beta r印licase)可以指 數(shù)式放大重組DNA分子。⑤ 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(Transcription-mediated amplification, TMA): TMA是利用RNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶在等溫條件下擴(kuò)增目的DNA或RNA的 擴(kuò)增方法。該方法用于HIV的定量檢測，靈敏度高于RT-PCR和bDNA方 法。TMA主要用于RNA擴(kuò)增。⑥滾環(huán)復(fù)制(Rolling circle amplification, RCA):該方法既可以進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增又可以用于信號放大擴(kuò)增。該方法可直接應(yīng)用于突 變檢測和SNP的檢測。等溫擴(kuò)增是核酸檢測的發(fā)展趨勢，但以上等溫技術(shù)仍存在嚴(yán)重不 足，如① 這些方法的實現(xiàn)都需要多種酶的配合，反應(yīng)體系復(fù)雜，優(yōu)化反應(yīng)條 件不易，且在這些方法中的所用到的酶或試劑大多價格昂貴，如HAD 反應(yīng)中的解旋酶、Q—e反應(yīng)中的QP復(fù)制酶、RCA反應(yīng)中的029DNA 聚合酶等。② 反應(yīng)過程雖然簡單，但反應(yīng)前的模板要處理或精制，這部分的抵消 了等溫擴(kuò)增的優(yōu)勢。③ RCA反應(yīng)是所有等溫擴(kuò)增中敏感性最高的，但是它的反應(yīng)過程復(fù)雜， 中間有多次的更換反應(yīng)體系的過程。④ 等溫擴(kuò)增的后期檢測仍然沒能擺脫儀器的限制，這使得此類方法的 運用受到很大的局限性，不便于在公共場所、偏遠(yuǎn)地區(qū)開展快速的篩査。正是由于上述的不足，使得在現(xiàn)階段等溫擴(kuò)增未能得到大規(guī)模的 運用。如何簡化等溫擴(kuò)增的反應(yīng)體系，簡化反應(yīng)前模板的處理過程， 增強(qiáng)特異性和敏感性，并且運用一些快速檢測的技術(shù)平臺，開發(fā)出快 速、簡便的核酸診斷產(chǎn)品，將是未來等溫擴(kuò)增進(jìn)一步的發(fā)展方向。因 此，迫切需要建立一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、適合于大規(guī)模現(xiàn)場篩查的 檢測核酸目的序列的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，而提供一種 檢測系統(tǒng)簡單、使用快速方便、適于大規(guī)模現(xiàn)場篩査核酸目的序列的方法。本發(fā)明的目的通過以下的方案來實現(xiàn)設(shè)計單鏈DNA "報告探針"，所說的"報告探針"與目標(biāo)基因序列互補(bǔ)，形成核酸切刻內(nèi)切酶識別位點，并可使核酸切刻內(nèi)切酶在"報 告探針"上切刻。反應(yīng)后的溶液在磁場作用下，未被切刻的探針和切 刻后生物素標(biāo)記的一段探針被吸附下來，而特定物質(zhì)標(biāo)記的探針游離 于溶液中，因此，可以用試紙直接檢測反應(yīng)液。核酸目的序列的檢測探針，其與目標(biāo)基因序列互補(bǔ)，形成核酸切 刻內(nèi)切酶識別位點，并且探針上的適當(dāng)位置分別修飾了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。例如探針 的3'端修飾了生物素，5'端修飾了具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的 小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)；或者探針的5'端修飾了生物素，3' 端修飾了具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì); 或者探針的中間不同位置分別標(biāo)記了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨 基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，例如SMD或SM2。核酸目的序列的檢測方法包括在待檢樣品中加入如權(quán)利要求1 所述的探針及切刻內(nèi)切酶、探針與磁珠孵育、等溫反應(yīng)、探針分離、 檢測等步驟?？梢韵葘⑻结樑c磁珠孵育，形成帶磁珠的探針，再在待檢樣品中加入這樣的探針及切刻內(nèi)切酶進(jìn)行等溫反應(yīng)，然后放置于磁 場，分離3'端探針和5 '端探針，用試紙條檢測；也可以在待檢 樣品中直接加入探針及切刻內(nèi)切酶進(jìn)行等溫反應(yīng)，反應(yīng)完后，反應(yīng)液再與磁珠孵育，然后放置于磁場中，分離3'端探針和5'端探針， 用試紙條檢測。探針與磁珠孵育的時間為30分鐘。用免疫層析試紙 檢測待檢樣品中是否有目標(biāo)基因序列存在，例如用SMD免疫層析試紙 檢測待檢樣品中是否有目標(biāo)基因序列存在；或者用SM2免疫層析試紙 檢測待檢樣品中是否有目標(biāo)基因序列存在。所述的切刻內(nèi)切酶為Nt. BstNBI或者為Nt. BstNBI的同功酶。用本發(fā)明的方法檢測核酸目的序列樣品，包括按以下順序進(jìn)行的(1) 在待檢樣品中加入"報告探針"及切刻內(nèi)切酶，"報告探針" 與核酸目標(biāo)基因序列雜交，形成切刻內(nèi)切酶識別序列位點，該位點僅 可以使切刻內(nèi)切酶在"報告探針"鏈切刻，形成兩段較短的片段，在 恒定的反應(yīng)溫度下，短片段形成的雙鏈不穩(wěn)定，與目標(biāo)基因脫離，成 為3'部分"報告探針"和5'部分"報告探針"；(2) 與被切刻的"報告探針"分離的目標(biāo)基因序列又與另一完整的 "報告探針"雜交，重復(fù)(1)中所述反應(yīng)，產(chǎn)生新的3'部分"報告探針"和5'部分"報告探針"；(3) 將反應(yīng)液放置于磁場中， 一部分"報告探針"由于交聯(lián)在磁珠 上，而被吸附沉積下來，另一部分標(biāo)記有特定物質(zhì)的"報告探針"游離于溶液中。(4)通過用針對特定物質(zhì)的免疫層析試紙檢測部分"報告探針"中 所標(biāo)記的這種物質(zhì)從而檢測待檢樣品中是否有目標(biāo)基因序列存在。本發(fā)明同其他核酸檢測方法相比，有如下優(yōu)點①在同一個溫度條件下完成反應(yīng)，避免了使用價格昂貴的PCR溫 度循環(huán)儀，可不受條件限制而可以普遍使用；②通過設(shè)計合成特殊結(jié) 構(gòu)的檢測探針，以便分離檢測，消除背景干擾，具有很好的特異性； ③不需要DNA聚合酶等復(fù)雜酶及反應(yīng)體系，反應(yīng)體系簡單；④檢測速 度快，5-10分鐘內(nèi)完成反應(yīng)，20-30分鐘完成檢測并得到結(jié)果；⑤可 同時檢測多種不同目標(biāo)序列，可用于病毒的分型；⑥可同時檢測DNA 及RNA;⑦原理簡單，操作簡便，易于推廣應(yīng)用；⑧工藝易于實現(xiàn)， 容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明可應(yīng)用于檢測各種DNA、 RNA。本發(fā)明的檢測系統(tǒng)主要使用 單位有醫(yī)院、公檢法部門、防疫站等國家監(jiān)測部門等，特別是偏遠(yuǎn)基 層單位、家庭以及機(jī)場車站等公共場所提供一種機(jī)簡便、快捷的核酸 篩査手段。本發(fā)明的技術(shù)方案的最顯著的特點是成本低、操作簡便、 快速、不需儀器設(shè)備，因此，最適合于不具專業(yè)人員和設(shè)備的場所， 包括傳染病的疫情監(jiān)測、進(jìn)出口快速檢驗檢疫、可疑標(biāo)本排査、密 切接觸者篩查。


圖l為本發(fā)明技術(shù)方案的等溫反應(yīng)步驟流程示意圖；圖2為本發(fā)明使用第一種修飾方法修飾的"報告探針"示意圖； 圖3為本發(fā)明使用"報告探針"第一種檢測模式步驟流程示意圖； 圖4為本發(fā)明SMD免疫層析試紙結(jié)構(gòu)示意圖；圖5為本發(fā)明運用SMD免疫層析試紙檢測反應(yīng)步驟及檢測結(jié)果示 意圖；圖6為本發(fā)明技術(shù)方案運用SMD免疫層析試紙及第一種檢測模式檢測RNA的結(jié)果；圖7為H5N1 HA基因的目標(biāo)序列與探針的結(jié)合形式。 圖8為本發(fā)明將SMD連接到DNA探針上的原理示意圖。 圖9為本發(fā)明將SM2連接到DNA探針上的原理示意圖。 圖10為本發(fā)明方案將具有琥珀酰胺酯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)連接到DNA探針上的原理示意圖。圖11為本發(fā)明方案檢測目標(biāo)基因的第二種模式示意圖。 圖12為用本發(fā)明方案檢測目標(biāo)基因的第二種模式檢測H5N1 HA基因的結(jié)果。以下為對上述各圖的說明在圖1中，A表示探針和目標(biāo)序列互補(bǔ)，形成核酸切刻內(nèi)切酶的識 別位點，切刻內(nèi)切酶可以識別該位點并在探針上進(jìn)行切刻，將探針切 刻成兩個小片段。B表示反應(yīng)過程，(1):模板與N個拷貝的"報告 探針"反應(yīng)， 一個拷貝的探針與目標(biāo)基因序列雜交，形成核酸切刻內(nèi)切酶的識別位點；余下N-1個拷貝的"報告探針"；(2):切刻內(nèi)切酶可以識別該位點并在探針上進(jìn)行切刻，將探針切刻成兩個小片段， 在恒定的反應(yīng)溫度下，小片段與目標(biāo)基因序列的結(jié)合不穩(wěn)定，而從目標(biāo)序列上脫離下來，使目標(biāo)序列又形成單鏈。(3):目標(biāo)序列又可以重新與余下的N-1個拷貝的"報告探針"雜交，重復(fù)(1)中的反應(yīng)。 在圖2中，"報告探針"的一部分修飾了生物素，另一部分修飾 了SMD，"報告探針"中的生物素與磁珠上的鏈霉親和素結(jié)合，形成完整的"報告探針"。對圖3的A-D的圖示過程說明如下A:在反應(yīng)液中加入足夠量的 完整的"報告探針"；B.在恒定的溫度下，反應(yīng)液中存在的目標(biāo)序列 可以與完整的"報告探針"進(jìn)行雜交；C.切刻內(nèi)切酶可以識別酶切位 點并在探針上進(jìn)行切刻，將探針切刻成游離的修飾了SMD的一段探針 和連接在磁珠上的一段探針，在恒定的反應(yīng)溫度下，兩個小片段探針 與目標(biāo)基因序列的結(jié)合不穩(wěn)定，而從目標(biāo)序列上脫離下來，使目標(biāo)序 列又形成單鏈并又可以重新與新的"報告探針"雜交，重復(fù)B-C的反 應(yīng)；D:反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液置于磁場中，生物素修飾的一段探針 隨磁珠而沉積下來，上清中含有SMD修飾的一段探針。在圖4中，免疫層析試紙的結(jié)合墊上是膠體金標(biāo)記的SMD的單抗， 檢測線上是BSA-SMD，質(zhì)控線上是二抗。在圖5中，A為免疫層析試紙檢測SMD結(jié)果為陽性的示意圖，當(dāng)反 應(yīng)液中含有SMD， SMD可以與膠體金標(biāo)記的SMD單抗結(jié)合，封閉了其與 檢測線上的BSA-SMD的結(jié)合位點，使檢測線上不出現(xiàn)紅色條帶；結(jié)合了SMD的膠體金標(biāo)記的SMD單抗在質(zhì)控線上結(jié)合二抗，使質(zhì)控線上出現(xiàn) 紅色條帶。B為免疫層析試紙檢測SMD陰性的示意圖，當(dāng)反應(yīng)液中不含 有SMD，膠體僉標(biāo)記的SMD單抗可以與檢測線上的BSA-SMD結(jié)合，使檢 測線上出現(xiàn)紅色條帶；膠體金標(biāo)記的SMD單抗在質(zhì)控線上結(jié)合二抗， 使質(zhì)控線上也出現(xiàn)紅色條帶。
在圖6中，1， 2， 3號試紙分別為檢測RNA模板濃度為2.5X1012、 6.25X1011、 7.8X1(T拷貝的檢測結(jié)果，4號為用水檢測的結(jié)果，5號 為用其他無關(guān)的RNA做目標(biāo)序列檢測的結(jié)果。
圖7所示為H5N1 HA基因的目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式。所檢 測的目標(biāo)序列選用H5N1 HA基因的一段序列，報告探針序列為5'-GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATT-3'
圖8為本發(fā)明將SMD連接到DNA探針上的原理示意圖。先對DNA 探針上5，端磷酸化后加入琥珀酰胺酯對其進(jìn)行酯化，形成琥珀酰胺酯 的結(jié)構(gòu)，然后可以和SMD的氨基進(jìn)行反應(yīng)。
圖9為本發(fā)明將SM2連接到DNA探針上的原理示意圖。先對DNA 探針上5，端磷酸化后加入琥珀酰胺酯對其進(jìn)行酯化，形成琥珀酰胺酯 的結(jié)構(gòu)，然后可以和SM2的氨基進(jìn)行反應(yīng)。
圖10為將具有琥珀酰胺酯結(jié)構(gòu)的物質(zhì)連接到DNA探針上的原理 示意圖。
圖ll為本發(fā)明方案檢測目標(biāo)基因的第二種模式示意圖。A:在待 檢目標(biāo)序列中加入標(biāo)記了生物素和特定物質(zhì)的探針以及切刻內(nèi)切酶。 B:在恒定的溫度下，探針和反應(yīng)液中待檢目標(biāo)序列進(jìn)行雜交，切刻內(nèi)切酶識別切刻位點，并將探針切刻為標(biāo)記了生物素的一段探針及標(biāo) 記了特定物質(zhì)的一段探針。在恒定的反應(yīng)溫度下，兩個小片段探針與 目標(biāo)基因序列的結(jié)合不穩(wěn)定，而從目標(biāo)序列上脫離下來，使目標(biāo)序列 又形成單鏈并又可以重新與新的"報告探針"雜交，重復(fù)A-B的反應(yīng)；
C:反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液與磁珠孵育30min后置于磁場中，生物素修 飾的一段探針隨磁珠而沉積下來，上清中含有特定物質(zhì)修飾的一段探 針，可以直接用檢測這種特定物質(zhì)的試紙來檢測反應(yīng)液從而達(dá)到檢測 目標(biāo)基因序列的目的。
圖12為用本發(fā)明方案檢測目標(biāo)基因的第二種模式檢測H5N1 HA基 因的結(jié)果。1號試紙為檢測RNA模板的檢測結(jié)果，2號為用水檢測的結(jié) 果。
具體實麄方式
以下通過應(yīng)用本發(fā)明方案檢測H5N1對本發(fā)明的具體實施細(xì)節(jié)作 進(jìn)一步的說明。
禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起禽類(家禽和野 禽)感染的一種烈性傳染病。該病是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的A類傳 染病，我國也列為一類動物疾病。禽流感不但對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的損 失，也能直接感染人并且致人死亡。
禽流感病毒傳染性高，變異性強(qiáng)，流行性快，危害大。據(jù)報道， 截至2006年5月12日，世界衛(wèi)生組織公布2003年至2006年期間， 僅我國就有18例禽流感病例，死亡數(shù)達(dá)12例，僅2006年禽流感病例數(shù)就達(dá)10例，死亡數(shù)為7例。
禽流感病毒為負(fù)鏈單股RNA病毒，基因組是分節(jié)段的，由8個片段 組成，共編碼8種結(jié)構(gòu)蛋自和2種非結(jié)構(gòu)蛋白。每個RNA片段都由核蛋 白包被形成RNP復(fù)合體。我們的檢測是針對其中HA基因的一段保守序 列進(jìn)行的，因而可以達(dá)到檢測的要求。
我們針對H5N1病毒基因的HA基因中一段保守區(qū)域相對應(yīng)的序列 進(jìn)行檢測。
實施例一本發(fā)明的技術(shù)方案針對H5N1 RNA的檢測 目的在于演示本發(fā)明方案對RNA目標(biāo)基因檢測的可行性及其靈敏 度和特異性。
本方法檢測過程如圖3所示，"目標(biāo)基因序列"是H5N1 RNA病毒 HA基因的一段區(qū)域，根據(jù)該目標(biāo)序列，設(shè)計單鏈DNA"報告探針"(RP)。 在RP的3'部分標(biāo)記生物素，5'部分標(biāo)記SMD (磺胺對甲氧嘧啶)，并 用磁珠與之交聯(lián)，在55。C恒溫反應(yīng)條件下，RP與"目標(biāo)基因序列"結(jié) 合，在N.BstNBI酶作用下，RP被切刻成兩段較短的片段，與目標(biāo)基因 結(jié)合不穩(wěn)定，而與其脫離，新的探針又可以結(jié)合在目標(biāo)序列上，重復(fù) 上述反應(yīng)，最終形成被切刻探針的拷貝數(shù)增多，即檢測信號的放大。 將反應(yīng)液置于磁場中，標(biāo)記生物素的一部分探針及未參與反應(yīng)的探針 由于磁珠的作用沉積下來，而被切刻的標(biāo)記SMD的一段較短探針游離 于溶液中，用SMD檢測試紙對此溶液進(jìn)行檢測，以實現(xiàn)通過檢測被切 刻探針上的SMD而達(dá)到檢測目標(biāo)序列基因。以下為目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式
所檢測的目標(biāo)序列選用H5N1 HA基因的一段序列，其序列如下 cgcaagcttGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTT AAAGCCGAATGACGCTATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCA TTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCA GCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAA GTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCC ACAACATACACCCTCTCACCATCGGatccggg (3'端和5'端分別含 有HindIII和BamHI的酶切位點) 報告探針序列
5，國GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATT-3'
如圖7所示為目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式。 以下為SMD-H5-RP-Magnabead的制備方法
磁珠(Pierce)用同體積的PBS緩沖液洗3次，足夠的SMD-H5-RP 與磁珠在室溫下孵育10-30分鐘，孵育后溶液置于磁場中，使磁珠沉 積下來，去除上清。磁珠沉積物用10pl的雙蒸水重懸，已備后續(xù)反應(yīng) 之用。
檢測步驟
(1)在30nl反應(yīng)體系中分別加入2. 5X1012、 6.25X1011、 7.8X 1(T拷貝的H5N1 HA RNA和足夠的報告探針，以及3^1的10XNEB緩沖液 3 (NEB England Biolabs) ， 5個單位的N. BstNI酶(NEB England Biolabs)。(2) 在微量恒溫器上或恒溫水浴中55"反應(yīng)20分鐘。
(3) 將反應(yīng)液放置于磁場中l(wèi)-2分鐘，使磁珠全部被吸附下來，
(4) 將SMD試紙插入上清溶液中，5-10分鐘內(nèi)讀取試紙結(jié)果。 反應(yīng)結(jié)果如圖6所示1， 2， 3號試紙分別為檢測RNA模板濃度為
2.5X1012、 6.25X1011、 7. 8X 10'?？截惖臋z測結(jié)果,4號為用水檢測的 結(jié)果，5號為用其他無關(guān)的RNA做目標(biāo)序列檢測的結(jié)果。
實施例二.-本發(fā)明方案中運用探針修飾的第一種方法標(biāo)記SMD。 探針修飾的第一種方法是在探針的3，端修飾了生物素，5 '端修飾
了具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)；如圖 8所示，其標(biāo)記原理是先對DNA探針上5，端磷酸化后加入琥珀酰胺酯 對其進(jìn)行酯化，形成琥珀酰胺酯的結(jié)構(gòu)，然后可以和SMD的氨基進(jìn)
行反應(yīng)。
實麄例三本發(fā)明方案中運用探針修飾的第一種方法標(biāo)記SM2。 探針修飾的第一種方法是在探針的3'端修飾了生物素，5'端修 飾了具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)；如 圖9所示，其標(biāo)記原理是先對DNA探針上5，端磷酸化后加入琥珀酰胺 酯對其進(jìn)行酯化，形成琥珀酰胺酯的結(jié)構(gòu)，然后可以和SM2的氨基進(jìn) 行反應(yīng)。實施例四本發(fā)明方案中探針修飾的第二種方法。 探針的5，端修飾了生物素，3'端修飾了具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié) 構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。
實施例五本發(fā)明方案中探針修飾的第三種方法。 探針的中間不同位置分別標(biāo)記了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨 基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。
實施例六本發(fā)明方案檢測目標(biāo)基因的第一種檢測模式。 本方法檢測過程如圖3所示，"目標(biāo)基因序列"是和H5N1 RNA病 毒HA基因的一段區(qū)域，根據(jù)該目標(biāo)序列，設(shè)計單鏈DNA "報告探針"
(RP) 。 RP按實施例一中的修飾方法修飾之后，即探針的3'端修飾了 生物素，5'端修飾SMD (磺胺對甲氧嘧啶)后，與鏈霉親和素標(biāo)記 的磁珠孵育，形成帶磁珠的探針，在下述反應(yīng)條件下，RP與"目標(biāo)基 因序列"結(jié)合，在N.BstNBI酶作用下，RP被切刻成兩段較短的片段， 與目標(biāo)基因結(jié)合不穩(wěn)定，而與其脫離，新的探針又可以結(jié)合在目標(biāo)序 列上，重復(fù)上述反應(yīng)，最終形成被切刻探針的拷貝數(shù)增多，即檢測信 號的放大。將反應(yīng)液置于磁場中，被切刻的標(biāo)記SMD的一段較短探針 游離于溶液中，用SMD檢測試紙對此溶液進(jìn)行檢測，以實現(xiàn)通過檢測 被切刻探針上的SMD而達(dá)到檢測目標(biāo)序列基因。 以下為目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式所檢測的目標(biāo)序列選用H5N1 HA基因的一段序列，其序列如下 cgcaagcttGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTT AAAGCCGAATGACGCTATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCA TTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCA GCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAA GTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCC ACAACATACACCCTCTCACCATCGGatccggg (3'端和5'分別含有 HindIII和BamHI的酶切位點)
報告探針序列
5 ，-GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATT-3'
如圖7所示為目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式。 以下為SMD-H5-RP-Magnabead的制備方法
磁珠(Pierce)用同體積的PBS緩沖液洗3次，足夠的SMD-H5-RP 與磁珠在室溫下孵育30min，孵育后溶液置于磁場中，使磁珠沉積下 來，去除上清。磁珠沉積物用10pl的雙蒸水重懸，已備后續(xù)反應(yīng)之用。
檢測步驟
(1)在30jil反應(yīng)體系中分別加入2. 5X1012、 6.25X10ll、 7.8X 10W拷貝的H5N1 HARNA和足夠的報告探針，以及3pl的10XNEB緩沖液 3 (NEB England Biolabs) ， 5個單位的N. BstNI酶(NEB England Biolabs)。
(2) 在微量恒溫器上或恒溫水浴中55'C反應(yīng)20分鐘。
(3) 將反應(yīng)液放置于磁場中l(wèi)-2分鐘，使磁珠全部被吸附下來，(4)將SMD試紙插入上清溶液中，5-IO分鐘內(nèi)讀取試紙結(jié)果。 反應(yīng)結(jié)果如圖6所示1， 2， 3號試紙分別為檢測RNA模板濃度為 2. 5X1012、 6.25X1011、 7. 8X 101()拷貝的檢測結(jié)果，4號為用水檢測的 結(jié)果，5號為用其他無關(guān)的RNA做目標(biāo)序列檢測的結(jié)果。
實施例七本發(fā)明方案檢測目標(biāo)基因的第二種檢測模式。 探針按實施例一中的修飾方法修飾之后，直接進(jìn)行等溫反應(yīng)，反 應(yīng)完后，反應(yīng)液與磁珠孵育30min，再放置于磁場中，分離3'端探針 和5'端探針，用試紙條檢測。
本方法檢測過程如圖ll所示，"目標(biāo)基因序列"是和H5N1 RNA病 毒HA基因的一段區(qū)域，根據(jù)該目標(biāo)序列，設(shè)計單鏈DNA "報告探針" (RP) 。 RP按實施例一中的修飾方法修飾之后，即探針的3'端修飾了 生物素，5'端修飾SMD (磺胺對甲氧嘧啶)后，直接進(jìn)行等溫檢測 反應(yīng)，在恒溫反應(yīng)條件下，RP與"目標(biāo)基因序列"結(jié)合，在N.BstNBI 酶作用下，RP被切刻成兩段較短的片段，與目標(biāo)基因結(jié)合不穩(wěn)定，而 與其脫離，新的探針又可以結(jié)合在目標(biāo)序列上，重復(fù)上述反應(yīng)，最終 形成被切刻探針的拷貝數(shù)增多，即檢測信號的放大。反應(yīng)完后，反應(yīng) 液與磁珠孵育30min。再將反應(yīng)液置于磁場中，被切刻的標(biāo)記SMD的一 段較短探針游離于溶液中，用SMD檢測試紙對此溶液進(jìn)行檢測，以實 現(xiàn)通過檢測被切刻探針上的SMD而達(dá)到檢測目標(biāo)序列基因。
以下為目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式
所檢測的目標(biāo)序列選用H5N1 HA基因的一段序列，其序列如下cgcaagcttGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTT
AAAGCCGAATGACGCTATCAACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCA
TTGCTCCAGAATATGCATACAAAATTGTCAAGAAAGGGGACTCA
GCAATTATGAAAAGTGAATTGGAATATGGTAACTGCAACACCAA
GTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTAGTATGCCATTCC
ACAACATACACCCTCTCACCATCGGatccggg (3'端和5'分別含有
HindIII和Bamffl的酶切位點)
報告探針序列
5 ，-GCTGAGTCCCCTTTCTTGACAATT-3'
如圖7所示為目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式。
檢測步驟
(1)在30pl反應(yīng)體系中加入H5Nl HARNA和足夠的報告探針，以 及3(il的10XNEB緩沖液3 (NEB England Biolabs) , 5個單位的N. BstNI 酶(NEB England Biolabs)。
(2) 在微量恒溫器上或恒溫水浴中55。C反應(yīng)20分鐘。
(3) 將反應(yīng)液與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠孵育30min。
(4) 將反應(yīng)液放置于磁場中l(wèi)-2分鐘，使磁珠全部被吸附下來，
(5) 將SMD試紙插入上清溶液中，5-IO分鐘內(nèi)讀取試紙結(jié)果。 反應(yīng)結(jié)果如圖12所示1號試紙為檢測RNA模板的檢測結(jié)果，2號
為用水檢測的結(jié)果。
實施例八本發(fā)明技術(shù)方案針對MRSA (耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)的mecA基因的部分序 列的檢測。
以下為目標(biāo)基因序列與探針的結(jié)合形式，所檢測的目標(biāo)序列選用 MRSAmecA基因的一段序列，其序列如下
cgactta^Bt^iiiiniBtiatp^tpptcccattaaetctgaagaattaaaacaaaaagaatataaagge tataaagatg敏ggagftaitgiit^^agiEpBCtozaaaaactttacgataaaaagctccaacatgaag
報告探針序列
5、-NH2- (A) 6-cgagtccctttttaccaataactgcatcatc- bio-3、 檢測步驟
(1)在30pl反應(yīng)體系中加入MRSAmecA和足夠的報告探針，以及 3pl的10XNEB緩沖液3 (NEB England Biolabs) ， 5個單位的N. BstNI 酶(NEB England Biolabs)。
(2 )在微量恒溫器上或恒溫水浴中55 °C反應(yīng)20分鐘。
(3) 將反應(yīng)液與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠孵育30min。
(4) 將反應(yīng)液放置于磁場中1-2分鐘，使磁珠全部被吸附下來，
(5) 將SMD試紙插入上清溶液中，5-IO分鐘內(nèi)讀取試紙結(jié)果。
權(quán)利要求
1. 一種核酸目的序列的檢測探針，其與目標(biāo)基因序列互補(bǔ)，形成核酸切刻內(nèi)切酶識別位點，并且探針上的適當(dāng)位置分別修飾了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測探針，其特征在于探針的3'端修飾 了生物素，5'端修飾了具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、 多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測探針，其特征在于探針的5'端修飾 了生物素，3'端修飾了具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多 肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測探針，其特征在于探針的中間不同位 置分別標(biāo)記了生物素及具有琥珀酰胺酯或氨基結(jié)構(gòu)的小分子、多 肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的檢測探針，其特征在于所 述的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)可以為SMD(磺胺對甲氧嘧啶)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的檢測探針，其特征在于所 述的小分子、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)可以為SM2 (磺胺二甲氧嘧啶)。
7、 一種核酸目的序列的檢測方法，包括在待檢樣品中加入如權(quán) 利要求l所述的探針及切刻內(nèi)切酶、探針與磁珠孵育、等溫反應(yīng)、 探針分離、檢測等步驟。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述生物因子包含細(xì)菌菌落， 以及其中所述第一種顏色包括紅色且所述第二種顏色包括藍(lán)色。
9. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述內(nèi)部包括約75%所述生長 介質(zhì)的生長區(qū)域且所述周邊部分包含約25%所述生長介質(zhì)的生長區(qū)域。
10. —種方法，包括 接收生物生長介質(zhì)的一幅或多幅圖像；識別與所述生物生長介質(zhì)內(nèi)部相關(guān)的第一種顏色生物因子的數(shù)量；識別與所述生物生長介質(zhì)內(nèi)部相關(guān)的第二種顏色生物因子的數(shù)量；識別與所述生物生長介質(zhì)周邊部分相關(guān)的第一種顏色生物因子的 數(shù)量；識別與所述生物生長介質(zhì)周邊部分相關(guān)的第二種顏色生物因子的數(shù)量；當(dāng)與所述內(nèi)部相關(guān)的第一種顏色生物因子的數(shù)量大于第一閾值， 且與所述內(nèi)部相關(guān)的第二種顏色生物因子的數(shù)量小于第二閾值時，將 與所述周邊部分相關(guān)的第二種顏色生物因子的數(shù)量改變?yōu)榘ㄔ谂c所 述周邊部分相關(guān)的第一種顏色生物因子的數(shù)量之內(nèi)。
11. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述生物因子包含細(xì)菌菌落， 以及其中所述第一種顏色包含紅色且所述第二種顏色包括藍(lán)色。
12. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述內(nèi)部包括約75%所述生 長介質(zhì)的生長區(qū)域且所述周邊部分包含約25%所述生長介質(zhì)的生長區(qū) 域。
13. —種方法，包括
全文摘要
本發(fā)明涉及一種運用免疫層析試紙檢測核酸目的序列的方法。檢測探針含有切刻內(nèi)切酶識別位點，并且在探針的3’部分標(biāo)記生物素，5’部分標(biāo)記SMD(磺胺對甲氧嘧啶)。探針通過與鏈酶親合素標(biāo)記的磁珠孵育，形成完整的反應(yīng)探針。這種完整的檢測探針與核酸目的序列雜交后，切刻內(nèi)切酶識別探針上的酶切位點并將探針切刻為兩段，降低了其與目的序列結(jié)合的穩(wěn)定性并與目的序列分離。目的序列能與另一完整的探針再次雜交并被切刻內(nèi)切酶切刻。因此，在反應(yīng)體系中，形成一種檢測信號的放大模式。反應(yīng)液在磁場作用后，帶磁珠一段的探針被吸附而沉積下來，而帶SMD的一段探針在溶液中呈游離狀態(tài)。用免疫層析試紙可以檢測溶液中帶SMD的探針而達(dá)到檢測目的序列的效果。該方法簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、適合于大規(guī)?，F(xiàn)場篩查的檢測核酸目的序列。
文檔編號C12Q1/68GK101215600SQ20071002620
公開日2008年7月9日 申請日期2007年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月4日
發(fā)明者濤 彭, 曾令文, 翔 李, 高文娟 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院