專利名稱：重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的新穩(wěn)定制劑的制作方法
重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白的新穩(wěn)定
制劑本申請要求2009年1月16日提交的美國臨時申請第61/145，440號以及2009年 1月16日提交的美國臨時專利申請第61/145，436號的權(quán)益。美國臨時申請第61/145，440 號以及美國臨時專利申請第61/145，436號的全文通過引用納入本文。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞減少癥是指循環(huán)白細(xì)胞計數(shù)(WBC)的減少，通常定義為WBC計數(shù)< 4000/ mL。白細(xì)胞減少癥中涉及的主要細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞。但是，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量減少可能對總細(xì)胞計數(shù)減少也有影響(Merck Manual (默克手冊)，第17版)。嗜中性白細(xì)胞減少癥的特征為血液嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)的減少，通常引起對細(xì)菌和真菌感染易感性的提高。根據(jù)嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)和感染的相對風(fēng)險將嗜中性白細(xì)胞減少癥分成輕度(1000-1500/mL)、中度(3級，500-1000/mL)或重度G級，< 500/mL)急性和重度嗜中性白細(xì)胞減少癥由于使患者易患迅速致死感染而是一種危及生命的病癥(默克手冊，第17版)。嗜中性白細(xì)胞減少癥可由骨髓中嗜中性粒細(xì)胞生成受損或嗜中性粒細(xì)胞加速破壞引起。當(dāng)嗜中性粒細(xì)胞快速使用而其生成嚴(yán)重受損時，急性嗜中性白細(xì)胞減少癥可能在數(shù)天內(nèi)發(fā)作。慢性嗜中性白細(xì)胞減少癥可能持續(xù)數(shù)月，并通常由脾臟中嗜中性粒細(xì)胞的生成減少或隔離引起。嗜中性白細(xì)胞減少癥可以根據(jù)其是骨髓細(xì)胞外源因子的次生結(jié)果還是存在于骨髓祖細(xì)胞的內(nèi)在缺陷進(jìn)行分類(默克手冊，第17版)。嗜中性白細(xì)胞減少癥及其感染性并發(fā)癥是細(xì)胞毒性化療和其它腫瘤治療如放療、 生物治療、靶向治療和骨髓移植中最為常見和嚴(yán)重的副作用之一。細(xì)胞毒性化療通過破壞快速生長的細(xì)胞來發(fā)揮作用，由于嗜中性粒細(xì)胞前體的高增殖率和血液嗜中性粒細(xì)胞的快速代謝回轉(zhuǎn)而引發(fā)嗜中性白細(xì)胞減少癥(默克手冊，第17版)?；熁颊咧?，嗜中性白細(xì)胞減少癥的最常見癥狀包括發(fā)熱、口瘡和耳感染。顯著嗜中性白細(xì)胞減少癥的患者常發(fā)生化膿性感染，例如敗血癥、皮膚蜂窩組織炎、肝膿腫、疔瘡、肺炎、口腔炎、牙齦炎、圍直腸炎、結(jié)腸炎、鼻竇炎和中耳炎?；熆赡鼙黄妊舆t直至身體能產(chǎn)生更多的嗜中性粒細(xì)胞，可能必須采用較低的劑量，導(dǎo)致治療效果較低。發(fā)明概述本文所述方法和組合物有助于治療、緩解或預(yù)防以白細(xì)胞計數(shù)低于正常值為特征的癥狀。這些癥狀包括但不限于白細(xì)胞減少癥和嗜中性白細(xì)胞減少癥。在第一種實施方式中，描述了在人對象中治療或預(yù)防嗜中性白細(xì)胞減少癥的方法，包括對顯示嗜中性白細(xì)胞減少癥或有產(chǎn)生嗜中性白細(xì)胞減少癥風(fēng)險的人對象施用有效量的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子以治療對象。在示范性實施方式中，所述人對象可能患有非骨髓惡性腫瘤并正接受至少一種骨髓抑制型抗癌藥，該藥物與發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的臨床顯著發(fā)病率相關(guān)。
在第二種實施方式中，描述了在人對象中治療或預(yù)防白細(xì)胞減少癥的方法，包括對顯示白細(xì)胞減少癥或有產(chǎn)生白細(xì)胞減少癥風(fēng)險的人對象施用有效量的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子以治療對象。在第三種實施方式中，描述了在患有非骨髓性惡性腫瘤并在接受至少一種骨髓抑制型抗癌藥的人對象中降低表現(xiàn)為發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的感染發(fā)病率的方法，該抗癌藥物與發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的臨床顯著發(fā)病率相關(guān)，該方法包括給予對象有效劑量的人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子以治療對象。在一些方法中，本文所述的復(fù)合物有助于降低感染的發(fā)病率，例如表現(xiàn)為發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的感染。在一些實施方式中，所述組合物和方法包括由人血清白蛋白 (“HSA”)和人粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)形成的融合多肽。所述融合多肽長度為759 個氨基酸；融合體中的1-585位氨基酸對應(yīng)于成熟形式HSA的氨基酸，而融合體的586-759 位氨基酸對應(yīng)于成熟形式人G-CSF的氨基酸。

圖1顯示了融合蛋白的氨基酸序列。將名為NeUgraninTM( “NEUG”)的融合多肽給予顯示有白細(xì)胞減少癥或嗜中性白細(xì)胞減少癥風(fēng)險的患者。例如，在一些實施方式中，方法包括在人對象中通過給予有效劑量的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子治療對象的白細(xì)胞減少癥或嗜中性白細(xì)胞減少癥。在一些實施方式中，嗜中性白細(xì)胞減少癥是原發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、急性嗜中性白細(xì)胞減少癥、重度慢性嗜中性白細(xì)胞減少癥(SCN)、重度先天性嗜中性白細(xì)胞減少癥 (Kostmann綜合征)、重度嬰兒遺傳性粒細(xì)胞缺乏癥、良性嗜中性白細(xì)胞減少癥、周期性嗜中性白細(xì)胞減少癥、慢性特發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、繼發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、嗜中性白細(xì)胞減少癥相關(guān)綜合征或免疫介導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞減少癥。在其它實施方式中，嗜中性白細(xì)胞減少癥由以下原因造成或與之相關(guān)輻射、酗酒、藥物、過敏性疾病、再生障礙性貧血、自體免疫疾病、T-Y淋巴增生性疾病(T-YLPD)、 脊髓發(fā)育不良、骨髓纖維化、丙種球蛋白異常血癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、癌癥、維生素B12 缺乏、葉酸缺乏、病毒感染、細(xì)菌感染、脾臟疾病、血液透析、移植、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、 浸潤并置換骨髓的轉(zhuǎn)移性實體瘤、毒素、骨髓衰竭、Schwachman-Diamond綜合征、軟骨-毛發(fā)發(fā)育不全、先天性角化不良、IB型糖原貯積病、各種原因?qū)е碌钠⒛[大、和骨髓細(xì)胞或其前體的內(nèi)在缺陷。在一些實施方式中，嗜中性白細(xì)胞減少癥由細(xì)胞毒性化療造成或與之相關(guān)。在一些實施方式中，所述人對象患有非骨髓惡性腫瘤如乳腺癌，并在接受細(xì)胞毒性化療。例如，在一些實施方式中，患者接受至少一種與發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的臨床顯著發(fā)病率有關(guān)的骨髓抑制抗癌藥。在一些實施方式中，所述骨髓抑制抗癌藥是多柔比星或多西他賽。在進(jìn)一步的實施方式中，對至少一個療程，通過靜脈輸液在同一天依次給予約 50mg/m2多柔比星和約75mg/m2多西他賽。在其它實施方式中，對至少一個療程，通過靜脈輸液在同一天依次給予約60mg/m2多柔比星和約75mg/m2多西他賽。在其它實施方式中，方法包括降低人對象感染的發(fā)病率，其表現(xiàn)為發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥。在一些實施方式中，所述人對象患有非骨髓惡性腫瘤并正接受至少一種骨髓抑制型抗癌藥，該藥物與發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的臨床顯著發(fā)病率相關(guān)。在一些實施方式中，給予對象有效量的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子以治療患者的嗜中性白細(xì)胞減少癥。
在一些實施方式中，降低對象中嗜中性白細(xì)胞減少癥的持續(xù)時間或嚴(yán)重程度或消除嗜中性白細(xì)胞減少癥。例如，在一些實施方式中，消除對象的4級或3級嗜中性白細(xì)胞減少癥。在其它實施方式中，縮短4級或3級嗜中性白細(xì)胞減少癥的持續(xù)時間。例如，在一些實施方式中，對象的4級嗜中性白細(xì)胞減少癥持續(xù)時間少于5天；在一些實施方式中，對象的4級嗜中性白細(xì)胞減少癥持續(xù)時間少于4天、少于3天或少于2天。在其它實施方式中， 對象的3級嗜中性白細(xì)胞減少癥持續(xù)得到消除，和/或?qū)ο蟮?級嗜中性白細(xì)胞減少癥持續(xù)時間比未接受人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子治療的對象縮短。在一些實施方式中，給予重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起對象的血液白細(xì)胞計數(shù)(“WBC”)增加或降低WBC損失。例如，在一些實施方式中，對象的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量升高；對象的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量降低受到抑制，對象的最低嗜中性粒細(xì)胞絕對計數(shù) (“ANC”)增加，對象的ANC恢復(fù)提高，和/或?qū)ο蟮腁NC恢復(fù)時間縮短。在一些實施方式中，給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量從約 40μ g/kg到約500μ g/kg ；在其它實施方式中，給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量從約50 μ g/kg到約450 μ g/kg。在另一些實施方式中，給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量為約50 μ g/kg、約100 μ g/kg、約150 μ g/kg、約200 μ g/kg 或約250 μ g/kg。在進(jìn)一步的實施方式中，給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量為約300 μ g/kg、約350 μ g/kg或約400 μ g/kg。在另外的實施方式中，給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量為約450 μ g/kg。在其它實施方式中，給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量為約20-100mg。在進(jìn)一步實施方式中， 給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量為約30-60mg。在進(jìn)一步實施方式中，給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量為約30mg、約40mg、約50mg或約 60mg。在一些實施方式中，重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子在化療(例如，給予骨髓抑制抗癌藥)后給藥。例如，在一些實施方式中，重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子在化療期間給藥、或在化療施用2小時內(nèi)、4小時內(nèi)、6小時內(nèi)、12小時內(nèi)、18小時內(nèi)、M小時內(nèi)或48小時內(nèi)給藥。在本發(fā)明的另一實施方式中，重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子可在給予骨髓抑制抗癌藥后給藥。例如，重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的給藥時間可選自下組(a)給予骨髓抑制抗癌藥后至少2小時；(b)給予骨髓抑制抗癌藥后至少4小時；(c)給予骨髓抑制抗癌藥后至少6小時；(d)給予骨髓抑制抗癌藥后至少12小時；(e)給予骨髓抑制抗癌藥后至少18小時；(f)給予骨髓抑制抗癌藥后至少M小時；(g)給予骨髓抑制抗癌藥后至少48小時；或(h)在骨髓抑制抗癌藥給藥期間或基本與之同時。在一些實施方式中，在化療治療期間或之后給予的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起WBC升高和/或引起ANC升高。例如，在一些實施方式中，ANC和WBC在化療后10天內(nèi)回復(fù)正常。在其它實施方式中，ANC和WBC在化療后11天、12天、13天、14天或 15天內(nèi)回復(fù)正常。在一些實施方式中，化療施用后14天，用重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子治療的患者中ANC的升高低于用等劑量聚乙二醇化非格司亭治療的患者中ANC的升高。在一些實施方式中，給予重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞升高。例如，在一些實施方式中，對象中淋巴細(xì)胞、 單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量增加。在其它實施方式中，對象中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量減少被抑制。在一些實施方式中，特別是對于治療或預(yù)防嗜中性白細(xì)胞減少癥的方法，所得結(jié)果可選自下組(a)對象的4級嗜中性白細(xì)胞減少癥被消除；(b)對象的4級嗜中性白細(xì)胞減少癥得以減輕；(c)對象的重度嗜中性白細(xì)胞減少癥持續(xù)時間縮短；(d)對象的3級嗜中性白細(xì)胞減少癥的持續(xù)被消除；(e)對象的3級嗜中性白細(xì)胞減少癥持續(xù)時間縮短；或(f) 其任意組合。在一些實施方式中，特別是對于治療或預(yù)防嗜中性白細(xì)胞減少癥的方法，給予重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起血液白細(xì)胞計數(shù)(WBC)的升高。在另一些實施方式中，特別是對于治療或預(yù)防嗜中性白細(xì)胞減少癥的方法，所得結(jié)果選自下組(a)對象的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量增加；(b)對象的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量減少被抑制；(c)對象的最低嗜中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(ANC)增加；(d)對象的ANC恢復(fù)提高；(e)對象的ANC恢復(fù)時間縮短；或 (f)其任意組合。在一些實施方式中，給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量選自下組(a)從約 50 μ g/kg 至約 450 μ g/kg ； (b)約 50 μ g/kg ； (C)約 150 μ g/kg ； (d)約 300 μ g/kg ； (e)約 450 μ g/kg ； (f)從約 30mg 至約 60mg ； (g)約 30mg ； (h)約 40mg ；⑴約 50mg ； (j)約60mg ；或(k)其任意組合。在一些實施方式中，要治療或預(yù)防的嗜中性白細(xì)胞減少癥選自原發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、急性嗜中性白細(xì)胞減少癥、重度慢性嗜中性白細(xì)胞減少癥(SCN)、重度先天性嗜中性白細(xì)胞減少癥(Kostmarm綜合征)、重度嬰兒遺傳性粒細(xì)胞缺乏癥、良性嗜中性白細(xì)胞減少癥、周期性嗜中性白細(xì)胞減少癥、慢性特發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、繼發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、嗜中性白細(xì)胞減少癥相關(guān)綜合征和免疫介導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞減少癥。此外，嗜中性白細(xì)胞減少癥可能由以下原因造成或與之相關(guān)，例如，輻射、酗酒、藥物、過敏性疾病、再生障礙性貧血、自體免疫疾病、T-Y淋巴增生性疾病(Τ-γ LPD)、脊髓發(fā)育不良、骨髓纖維化、丙種球蛋白異常血癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、癌癥、維生素B12缺乏、葉酸缺乏、病毒感染、細(xì)菌感染、脾臟疾病、血液透析、移植、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、浸潤并置換骨髓的轉(zhuǎn)移性實體瘤、毒素、骨髓衰竭、Schwachman-Diamond綜合征、軟骨-毛發(fā)發(fā)育不全、先天性角化不良、IB型糖原貯積病、各種原因?qū)е碌钠⒛[大、和骨髓細(xì)胞或其前體的內(nèi)在缺陷。在本發(fā)明的實施方式中，當(dāng)人對象患有非骨髓惡性腫瘤時，所述非骨髓惡性腫瘤可包括乳腺癌。在本發(fā)明的實施方式中，當(dāng)給予骨髓抑制抗癌藥時，所述骨髓抑制抗癌藥可包括多柔比星和多西他賽。例如，對至少一個療程，可通過靜脈輸液在同一天依次給予約50mg/ m2多柔比星和約75mg/m2多西他賽。或者，對至少一個療程，可通過靜脈輸液在同一天依次給予約60mg/m2多柔比星和約75mg/m2多西他賽。在本發(fā)明的一些實施方式中，ANC和WBC在治療后選自下組的時間段內(nèi)回復(fù)正常 (a)化療后10天；(b)化療后11天；(c)化療后12天；(d)化療后13天；(e)化療后14天； 或(f)化療后15天。在另一實施方式中，化療施用后14天，用重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子治療的患者中ANC的升高低于用等劑量聚乙二醇化非格司亭治療的患者中ANC的升高。在本發(fā)明的一些實施方式中，給予重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞或其任意組合的升高。在其它實施方式中，對象中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞或其任意組合的數(shù)量增加。在本發(fā)明的其它實施方式中，對象中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)量減少被抑制。上述總體說明和以下的附圖簡要說明與詳細(xì)說明都是示范性和說明性的，并旨在為本發(fā)明要求保護(hù)的范圍提供進(jìn)一步說明。通過本發(fā)明的以下詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢和新特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。附圖簡要說明圖1A-1C 圖IA顯示名為"Neugranin " ( ‘‘NEUG”)的所述重組人白蛋白-粒細(xì)胞集落刺激因子(“rHA-G-CSF”)融合蛋白的核酸序列和氨基酸序列；圖IB顯示人G-CSF 的氨基酸序列；圖IC顯示人血清白蛋白的氨基酸序列。圖2顯示I期對象的嗜中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(“ANC”)圖。對象在研究化療后的第 1 療程中接受 300μ g/kg NEUG (η = 19),450μ g/kg NEUG (η = 20)或 6mg 聚乙二醇化非格司亭(Neulasta ) (η = 9)。圖3顯示I期研究中人對象內(nèi)NEUG的藥代動力學(xué)。在沒有化療的乳腺癌患病對象中，測量指定劑量NEUG 050 μ g/kg、300 μ g/kg或150 μ g/kg)皮下給藥的血清NEUG濃度。 正方形450 μ g/kg療程0 ；三角形300 μ g/kg療程0 ；圓形150 μ g/kg療程0。圖4顯示NEUG在化療第1療程中的藥代動力學(xué)/藥效學(xué)(“H(/PD”)(I期研究)。 在第1療程給藥多柔比星/多西他賽后1天，患者接受450 μ g/kgNEUG。ANC顯示為空心菱形；NEUG濃度顯示為實心正方形。3級和4級嗜中性白細(xì)胞減少癥的臨界值用虛線顯示。 NEUG的定量下限(“LL0Q”)顯示為6ng/ml處的點線。圖5顯示在化療第1療程開始后一天接受30mg NEUG或6mg聚乙二醇化非格司亭 (Neulasta )的患者的ANC曲線(II期研究)。3級和4級嗜中性白細(xì)胞減少癥的臨界值用虛線顯示。圖6顯示I期研究化療療程。圖7A和7B顯示對象在I期研究中的ANC和血液白細(xì)胞計數(shù)(“WBC”)計數(shù)。圖 8 顯示用 NEUG (Albugranin)或 Neupogen ⑧的 NSF-60 細(xì)胞增殖圖。圖9顯示用NEUG或Neulasta的NSF-60細(xì)胞增殖圖。圖10顯示BDF-I小鼠在NEUG (Albugranin)和Neupogen單次SC給藥后的外周血嗜中性粒細(xì)胞(Gr. 1+)水平圖(時間過程)。Gr. 1+細(xì)胞總數(shù)表示為組平均值+/-SEM。圖11顯示在NEUG(Albugranin)和Neupogen單次SC給藥后，外周血造血祖細(xì)胞 (c-kit+)的水平圖(時間過程)。c-kit+細(xì)胞總數(shù)表示為組平均值+/-SEM。圖 12A和 12B顯示BDF-I 小鼠中 NEUG(Albugranin)或Neulasta 單次皮下(“SC”) 給藥后外周血粒細(xì)胞(Gr. 1+)水平。12A顯示單劑量Neulasta或NEUG后應(yīng)答的時間過程， 12B顯示了 NEUG或Neulasta的相對效力。圖13列表顯示I期所用NEUG藥物產(chǎn)品的組成。圖14列表顯示11期所用NEUG藥物產(chǎn)品的組成。
圖15顯示在NEUG(Albugranin)或Neulasta 單次皮下給藥后，外周造血祖細(xì)胞 (c-kit+)的水平(時間過程)。c-kit+的總數(shù)表示為各組計算所得的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用異方差t-檢驗分析治療組間的差異。圖 16 顯示在 5-FU (150 μ g/kg) IP 注射后 1 天，NEUG (Albugranin)或 Neulasta 單次皮下給藥后的外周血嗜中性粒細(xì)胞(Gr. 1+)的水平(時間過程)。每天計算GR. 1+細(xì)胞的總數(shù)，表示為各組計算所得的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。用方差不等的雙樣本t-檢驗評估治療組間的差異。與載劑對照相比，用任一種藥劑在所有劑量水平下的治療都引起嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加。圖17顯示NEUG(Albugranin)對外周血嗜中性粒細(xì)胞相對百分比的影響。各研究日的嗜中性粒細(xì)胞的相對百分比表示為組平均值+/-SEM。NEUG 100 μ g/kg Q7的第8、9天的數(shù)據(jù)分別表示為第9、10天以便于和其它組作比較。對照為每四天一次共4次SC給予鹽水或者每天一次共14次SC給予Neupogen 。第1_14天視為治療期，第15- 天為恢復(fù)期。圖 18 顯示 NEUG(Albugranin) SC、NEUG IV、或 Neulasta SC 重復(fù)劑量給藥對猴的嗜中性粒細(xì)胞移動影響的比較。直至第22天的各研究日的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)(K/μΙ)表示為組平均值+/-SEM。箭頭標(biāo)明劑量給藥。NEUG以1. Omg/kg/劑量通過SC(n = 6)或IV(η =6)給藥，Neulasta 以 0. 22mg/kg/ 劑量(1. Omg/kg NEUG 的等摩爾劑量)通過 SC (n = 6) 給藥。NEUG載劑通過SC給藥作為對照(n = 2)。圖19Α和19Β列表顯示體內(nèi)藥代動力學(xué)研究的小結(jié)。圖20列表顯示提供安全性數(shù)據(jù)的體內(nèi)非臨床研究的小結(jié)。圖21是NEUG發(fā)酵和純化的示范性概況的流程圖。圖22顯示I期A部分中(療程0或化療前)對象從治療到第14天的嗜中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(ANC)的中位數(shù)。在第4天，圖中線條由高到低分別是300 μ g/kg、450 μ g/kg、 150 μ g/kg 禾口 50 μ g/kg ο圖23A和2 顯示I期B部分中各治療對象的曲線下面積(AUC)，基于第0_15天的ANC數(shù)值。圖23A為圖表；圖23A中的數(shù)據(jù)總結(jié)于表23B中。圖M顯示II期治療對象的曲線下面積(AUC)，基于第1療程第0-15天所得ANC 值(固定劑量組)。對所有II期對象，計算AUCanc(第0-15天)。用Neugranin治療的患者接受0. 3-lmg/kg(根據(jù)劑量除以基線體重計算)的劑量。體重調(diào)整的劑量范圍分成四組并對AUCaic作圖(左圖)。對所有用聚乙二醇化非格司亭治療的對象(N = 112)，也計算并比較了 Neugranin 30mg (N = 10)、40mg(N= 105)或 50mg(N= 105)的 AUCanc。數(shù)據(jù)顯示為平均值士 SEM。發(fā)明詳述本文公開了用于治療、預(yù)防和減輕以白細(xì)胞計數(shù)減低為特征的癥狀和疾病的組合物和方法。本文所述的方法和組合物包括由人血清白蛋白(“HSA”)和人粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)形成的融合多肽。在一個優(yōu)選實施方式中，所述融合多肽長度為約759個氨基酸；融合體中的1-585位氨基酸對應(yīng)于成熟形式HSA的氨基酸，而融合體的586-759位氨基酸對應(yīng)于成熟形式人G-CSF的氨基酸。圖1顯示了融合蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明還包括含G-CSF變體或片段的融合蛋白，和含白蛋白或白蛋白的片段或變體的融合蛋白。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的治療性白蛋白融合蛋白的多核苷酸、治療性白蛋白融合蛋白、組合物、藥物組合物、制劑和試劑盒。本發(fā)明也包括轉(zhuǎn)化有治療性白蛋白融合蛋白的編碼多核苷酸的宿主細(xì)胞，和采用這些多核苷酸和/或宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的方法。在一個實施方式中，本發(fā)明所述的白蛋白融合蛋白具有延長的保存期限。在第二個實施方式中，本發(fā)明所述的白蛋白融合蛋白比相應(yīng)未融合的G-CSF分子
更穩(wěn)定。本發(fā)明還包括經(jīng)修飾包含本發(fā)明所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因生物，優(yōu)選修飾成表達(dá)本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。本發(fā)明一般涉及編碼白蛋白融合蛋白的多核苷酸；白蛋白融合蛋白；和采用白蛋白融合蛋白或編碼白蛋白融合蛋白的多核苷酸治療、預(yù)防或改善疾病或失調(diào)。如本文所用， “白蛋白融合蛋白”指通過將至少一分子白蛋白(或其片段或變體)與至少一分子G-CSF(或其片段或變體)融合形成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白包含G-CSF的至少一個片段或變體和人血清白蛋白的至少一個片段或變體，兩者通過基因融合(即，所述白蛋白融合蛋白通過核酸的翻譯產(chǎn)生，該核酸中編碼全部或部分G-CSF的多核苷酸與編碼全部或部分白蛋白的多核苷酸在讀框內(nèi)連接)彼此結(jié)合。G-CSF和白蛋白一旦成為白蛋白融合蛋白的部分，就可各自稱作白蛋白融合蛋白的“部分”、“區(qū)段”或“組成”(例如，“G-CSF蛋白部分” 或“白蛋白蛋白部分”)。在一個高度優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白包含至少一分子的G-CSF或其片段或變體(包括但不限于，G-CSF蛋白質(zhì)的成熟形式)和至少一分子的白蛋白或其片段或變體(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白通過宿主細(xì)胞加工并分泌到周圍的培養(yǎng)基中。在表達(dá)用宿主的分泌途徑中發(fā)生的初生白蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于，信號肽切割；二硫鍵形成；適當(dāng)折疊；碳水化合物的添加和加工(例如，N-和 0-連接糖基化)；特異性蛋白水解切割；和裝配成多聚體蛋白。本發(fā)明的白蛋白融合蛋白優(yōu)選為已加工形式。在最優(yōu)選的實施方式中，所述“白蛋白融合蛋白的加工形式，，是指經(jīng)過N 末端信號肽切割的白蛋白融合蛋白產(chǎn)物，本文也稱為“成熟的白蛋白融合蛋白”。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了編碼白蛋白融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含G-CSF和血清白蛋白或由其組成。在進(jìn)一步實施方式中，本發(fā)明提供了包含G-CSF 和血清白蛋白或由其組成的白蛋白融合蛋白。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了包含G-CSF 的生物活性和/或治療活性片段和血清白蛋白，或由其組成的白蛋白融合蛋白。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治療活性變體和血清白蛋白，或由其組成的白蛋白融合蛋白。在優(yōu)選的實施方式中，所述白蛋白融合蛋白的血清白蛋白組成是血清白蛋白的成熟部分。本發(fā)明還包括編碼這些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。在進(jìn)一步實施方式中，本發(fā)明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性片段，或由其組成。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性變體，或由其組成。 在優(yōu)選的實施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的成熟部分。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的胞外可溶結(jié)構(gòu)域。在替代的實施方式中，所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分是G-CSF蛋白的活性部分。本發(fā)明還包括編碼這些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。
在進(jìn)一步實施方式中，本發(fā)明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白的生物活性和/或治療活性片段或變體和血清白蛋白的生物活性和/或治療活性片段或變體，或由其組成。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供的白蛋白融合蛋白包含G-CSF蛋白的成熟形式和血清白蛋白的成熟形式，或由其組成。本發(fā)明還包括編碼這些白蛋白融合蛋白的多核苷酸。I.定義如本文所用，“多核苷酸”是具有編碼融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子，包含在讀框內(nèi)連接的至少一分子白蛋白(或其片段或變體)與至少一分子粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(或其片段或變體)，或由其組成。如本文所用，“白蛋白融合構(gòu)建物”指包含在讀框內(nèi)連接的編碼至少一分子白蛋白(或其片段或變體)的多核苷酸與編碼至少一分子G-CSF (或其片段或變體)的至少一個多核苷酸、或由其組成的核酸分子；以及還包含，例如一種或一種以上下列元件(1)功能性自我復(fù)制載體(包括但不限于，穿梭載體、表達(dá)載體、整合載體和/或復(fù)制系統(tǒng))，( 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(例如，啟動子區(qū)如可調(diào)節(jié)或可誘導(dǎo)的啟動子、組成型啟動子)，C3)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，(4)前導(dǎo)序列，和(5)選擇性標(biāo)記。編碼G-CSF和白蛋白的多核苷酸一旦成為白蛋白融合構(gòu)建物的部分，可各自稱作白蛋白融合構(gòu)建物的“部分”、“區(qū)域”或“組成”。所述顯示“治療活性”的G-CSF多肽或具有“治療活性”的G-CSF蛋白質(zhì)是指具有一種或多種已知的G-CSF蛋白相關(guān)生物學(xué)和/或治療活性的G-CSF多肽。作為非限制性示例，“G-CSF治療蛋白”是可用于治療、預(yù)防或改善疾病、癥狀或紊亂的G-CSF蛋白質(zhì)。作為非限制性示例，“G-CSF治療蛋白”可以與特定細(xì)胞類型(正常(如淋巴細(xì)胞)或非正常(如癌細(xì)胞))特異性結(jié)合并因此可用于將化合物(藥物或細(xì)胞毒劑)特異性靶向到該細(xì)胞類型。II.粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是刺激嗜中性粒細(xì)胞生成的造血生長因子。當(dāng)有要刺激的存活前體細(xì)胞時，給予G-CSF可快速誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞白細(xì)胞增多。G-CSF的另一重要體內(nèi)活性是移動造血祖細(xì)胞進(jìn)入外周血液(Duhrsen等，1988，Molineux等，1999 ；Roberts等，1994)。該效應(yīng)不但包括嗜中性粒細(xì)胞譜系，還擴(kuò)展到其它單譜系與多譜系祖細(xì)胞和多能造血干細(xì)胞(Molineux等，1999)。G-CSF通過激發(fā)嗜中性粒細(xì)胞來增強(qiáng)作為抗感染的防御機(jī)制部分的細(xì)胞事件，從而增強(qiáng)其針對經(jīng)調(diào)理金黃色葡萄球菌(Maphylococcusaureus)的吞噬和抗菌活性。G-CSF還引起嗜中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞的趨化性和嗜中性粒細(xì)胞的附著(You等，1989 ；Wang等，1988)。目前已批準(zhǔn)重組G-CSF產(chǎn)品用于多種臨床癥狀以刺激嗜中性粒細(xì)胞的增殖和分化。在臨床試驗中，非格司亭(filgrastim，重組甲硫氨?；薌-CSF ；Neupogen Amgen，Thousand Oaks, CA)提高了外周嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量，從而縮短了骨髓抑制化療后嗜中性白細(xì)胞減少癥的持續(xù)時間。重組G-CSF(非格司亭)通過每日皮下(SC)注射給藥。G-CSF的另一重組形式是聚乙二醇化非格司亭，一種聚乙二醇偶聯(lián)的rG-CSF (Neulasta )，用其每療程一次來替代每日一次rG-CSF療法以降低接受骨髓抑制行抗癌藥患者的發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥發(fā)病率已被證明是安全有效的(Holmes，0' Shaughnessy 等，2002 ；Green 等，2003 ；Neulasta SmPC2007)。在基于年齡、醫(yī)療記錄、疾病特征和化療方案的骨髓毒性確定的高風(fēng)險患者中，為預(yù)防發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥推薦用G-CSF進(jìn)行初步預(yù)防。美國臨床腫瘤學(xué)會(American Society of Clinical Oncology)和歐洲癌癥研究和治療組織(EuropeanOrganization for Research and Treatment of Cancer)推薦當(dāng)發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥風(fēng)險達(dá)約20%時采用G-CSF。美國國家綜合性癌癥中心網(wǎng)絡(luò)(U. S. NationalComprehensive Cancer Center Network)推薦的G-CSF預(yù)防的可選指標(biāo)為發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥風(fēng)險為10-20%，G-CSF預(yù)防的確定性指標(biāo)為發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥風(fēng)險至少為 20%。(Smith 等，2006 ；Vogel 等，2005 ；Timmer-Bonte 等，2006，NCCN 指南)。推薦用集落刺激因子預(yù)防以緩解某些化療方案的毒性。然而，這些治療的附加成本在美國和特別是歐洲部分地區(qū)是重要考慮因素，可能引起預(yù)防性G-CSF治療的應(yīng)用不足，也可能限制患者進(jìn)行強(qiáng)劑量化療方案的資格(Timmer-Bonte等，2006 ；Adams等，2006，NCCN指南)。G-CSF蛋白可以用野生型多核苷酸序列編碼(例如，全長或成熟的)，或在某些情況下所述序列可以是野生型多核苷酸序列的變體(例如編碼野生型G-CSF蛋白的多核苷酸，其中該多核苷酸的DNA序列為了例如在特定種類中表達(dá)而優(yōu)化；或者編碼野生型G-CSF蛋白的變體的多核苷酸(即定點突變；等位基因變體))。III.人血清白蛋白人血清白蛋白(HSA或HA)是人循環(huán)系統(tǒng)中自然產(chǎn)生的最常見血液蛋白，測得為約40克白蛋白/升并在循環(huán)中保持逾20天。白蛋白是載體蛋白，在生理濃度下具有最小活性。盡管HSA缺乏酶或免疫功能，它在體內(nèi)廣泛分布，并已知是血液中各種物質(zhì)的載體(例如，激素、脂肪酸、未偶聯(lián)膽紅素等(Yeh等，199幻。HSA和重組HA(rHA)在人體中都具有同樣的長循環(huán)半衰期。研究顯示，與人白蛋白遺傳融合的治療蛋白能具有白蛋白的循環(huán)半衰期特征(Syed等，1997)。例如，在兔中，與白蛋白融合的⑶4半衰期是未融合⑶4的140倍(Yeh等，1992)。人血清白蛋白負(fù)責(zé)血清滲透壓的顯著部分以及作為內(nèi)源和外源配體載體起作用，其成熟形式是有585個氨基酸的蛋白質(zhì)(如美國專利第7，592，010號中圖1所示)。目前，臨床使用的HA通過從人血中提取制得。在EP 330 451和EP 361 991中公開了微生物中重組HA(rHA)的生產(chǎn)。IV.多肽和多核苷酸的片段和變體A.片段本發(fā)明還涉及本發(fā)明中G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的片段。本發(fā)明還涉及本發(fā)明中編碼G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白片段的多核苷酸。盡管從蛋白的N末端刪除一個或多個氨基酸會引起本發(fā)明中G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白的一種或多種生物學(xué)功能的改變或喪失，其它治療活性和/或功能活性(例如，生物活性、多聚體化的能力、結(jié)合配體的能力)仍可以保持。例如，當(dāng)從N末端去除的殘基少于完整多肽的主要殘基時，N末端缺失多肽對識別所述多肽完整或成熟形式的抗體的誘導(dǎo)和/或結(jié)合能力一般仍被保留。通過本文所述的以及本領(lǐng)域已知曉的常規(guī)方法，可容易地確定缺少完整多肽的N末端殘基的特定多肽是否保留該免疫活性。缺失大量N末端氨基酸殘基的突變蛋白保留某些生物或免疫活性并非不可能。事實上，由少至6個氨基酸殘基組成的肽常能引起免疫反應(yīng)。因此，對應(yīng)于本發(fā)明白蛋白融合蛋白中G-CSF蛋白部分的G-CSF片段包括全長蛋白和從參比多肽(即，G-CSF蛋白、或由多核苷酸或白蛋白融合構(gòu)建物編碼的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)氨基酸序列的氨基末端缺失一個或多個殘基的多肽。具體地，可以用通式m至q描述N末端缺失，其中q是表示參比多肽(例如，G-CSF蛋白、或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)的氨基酸殘基總數(shù)的整數(shù)，m限定為從2到q減6范圍內(nèi)的任何整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。此外，對應(yīng)于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的血清白蛋白多肽片段包括全長蛋白和從參比多肽(即，血清白蛋白、或白蛋白融合蛋白的血清白蛋白部分)氨基酸序列的氨基末端缺失一個或多個殘基的多肽。在優(yōu)選的實施方式中，可以用通式m至585描述N末端缺失，其中585是成熟人血清白蛋白的氨基酸殘基總數(shù)的整數(shù)，m限定為2到579范圍內(nèi)的任意整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。在另外的實施方式中，可以用通式m至609描述N末端缺失，其中609是表示全長人血清白蛋白的氨基酸殘基總數(shù)的整數(shù)，m限定為2到603范圍內(nèi)的任意整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。此外，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白片段包括全長白蛋白融合蛋白和在所述白蛋白融合蛋白的氨基末端有一個或多個殘基缺失的多肽。具體地，可以用通式m至q描述N末端缺失，其中q是表示白蛋白融合蛋白氨基酸殘基總數(shù)的整數(shù)，m限定為2到q減6范圍內(nèi)的任意整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。如上所述，盡管從參比多肽(例如，G-CSF蛋白；血清白蛋白；或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白)的N末端或C末端刪除一個或多個氨基酸會引起該蛋白的一種或多種生物學(xué)功能的改變或喪失，但其它治療活性和/或功能活性(例如，生物活性、多聚體化的能力、結(jié)合配體的能力)仍可以保持。例如，當(dāng)從C末端去除的殘基少于完整或成熟多肽的主要殘基時，C末端缺失多肽對識別所述多肽完整或成熟形式的抗體的誘導(dǎo)和/或結(jié)合能力一般仍被保留。通過本文所述的和/或本領(lǐng)域已知曉的常規(guī)方法，可容易確定缺少參比多肽的N末端殘基和/或C末端殘基的特定多肽是否保留治療活性。本發(fā)明還提供了在對應(yīng)于本發(fā)明白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的G-CSF蛋白氨基酸序列的羧基末端有一個或多個殘基缺失的多肽。具體地，可以用通式1至η描述C末端缺失，其中η是從6到q減1范圍內(nèi)的任何整數(shù)，而其中q是表示參比多肽(例如，G-CSF蛋白、或由多核苷酸或白蛋白融合構(gòu)建物編碼的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分)的氨基酸殘基總數(shù)的整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。此外，本發(fā)明提供了在對應(yīng)于本發(fā)明的白蛋白融合蛋白中白蛋白部分的白蛋白氨基酸序列的羧基末端有一個或多個殘基缺失的多肽。具體地，可用通式1至η描述C末端缺失，其中η是從6到584范圍內(nèi)的任意整數(shù)，其中584表示成熟人血清白蛋白的氨基酸殘基總數(shù)減1的整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。具體地，可用通式1至η描述C末端缺失，其中η是從6到608范圍內(nèi)的任意整數(shù)，其中608是表示人血清白蛋白的氨基酸殘基總數(shù)減1的整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。此外，本發(fā)明提供了在本發(fā)明的白蛋白融合蛋白羧基末端有一個或一個以上殘基缺失的多肽。具體地，可用通式1至η描述C末端缺失，其中η是從6到q減1范圍內(nèi)的任意整數(shù)，其中q是表示本發(fā)明白蛋白融合蛋白的氨基酸殘基總數(shù)的整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。另外，上述的任何N或C末端缺失可以組合產(chǎn)生N和C末端缺失的參比多肽。本發(fā)明還提供了在氨基和羧基末端都有一個或一個以上氨基酸缺失的多肽，可通常表示為具有參比多肽(例如，G-CSF蛋白、或本發(fā)明白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分、或血清白蛋白、或本發(fā)明白蛋白融合蛋白的白蛋白部分、或白蛋白融合蛋白、或由本發(fā)明的多核苷酸或白蛋白融合構(gòu)建物編碼的白蛋白融合蛋白)的m至η殘基，其中η和m為如上所述的整數(shù)。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。本申請還涉及所含多肽與本文提出的參比G-CSF多肽或參比白蛋白多肽或其片段有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方式中，本申請涉及的蛋白質(zhì)所含多肽與上述缺失氨基酸N和C末端的參比多肽至少有約80 %、約85 %、約90 %、約91 %、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的優(yōu)選多肽片段包含顯示G-CSF蛋白或血清白蛋白多肽序列的治療活性和/或功能活性(例如生物活性)的氨基酸序列，或者由其組成，該氨基酸序列是片段。其它優(yōu)選的多肽片段是生物活性片段。生物活性片段是那些展示的活性與本發(fā)明多肽的活性相似，但未必相同的片段。片段的生物活性可包括所需活性的改善或不良活性的減弱。B.變體“變體”是指與參比核酸或多肽不同但保留其基本性質(zhì)的多核苷酸或核酸。通常，變體總體上與參比核酸或多肽密切相似并在很多區(qū)段與之相同。本文所用“變體”是指在序列上分別與G-CSF蛋白、白蛋白和/或白蛋白融合蛋白不同，但仍保留其如本文另述或本領(lǐng)域已知的至少一種功能和/或治療性質(zhì)的本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分、本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分、或本發(fā)明的白蛋白融合蛋白。通常，變體與白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所對應(yīng)的G-CSF蛋白、白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所對應(yīng)的白蛋白、和/或白蛋白融合蛋白的氨基酸序列在整體上非常相似，并在很多區(qū)段相同。本發(fā)明也包括編碼這些變體的核酸。本發(fā)明還涉及包含，與例如如本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所對應(yīng)的G-CSF蛋白、本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所對應(yīng)的白蛋白和/或白蛋白融合蛋白至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%相同的氨基酸序列，或由其組成的蛋白質(zhì)。還提供了這些多肽的片段。本發(fā)明進(jìn)一步包括的多肽是由在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件(例如，在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中以約45°C雜交從而過濾結(jié)合的DNA，然后在0. Ix SSC，0. 2% SDS中以約50_65°C清洗一次或多次)、在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件(例如，在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中以約45°C雜交從而過濾結(jié)合的DNA，然后在0. Ix SSC，0.2% SDS中以約68°C清洗一次或多次)或者在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件(參見，例如，Ausubel, F.M.等編著，1989，Current protocol in Molecular Biology (Mifif，Green publishingassociates, Inc.禾口 John Wiley & Sons Inc. , New York,6. 3. 1-6. 3. 6 禾口 2. 10. 3 各頁)下與本發(fā)明白蛋白融合蛋白的編碼核酸分子的補(bǔ)體雜交的多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的多核苷酸。所述多肽的氨基酸序列與查詢氨基酸序列至少，例如95% “相同”，意味著查詢氨基酸序列的每100個氨基酸中對象多肽序列中可包括最多5個氨基酸變化，除此之外對象多肽的氨基酸序列與查詢序列相同。換而言之，為得到氨基酸序列與查詢氨基酸序列至少95%相同的多肽，對象序列中最多有5%的氨基酸殘基可被插入、缺失或用其它氨基酸取代。參比序列的這些變化可以發(fā)生在參比氨基酸序列的氨基或羧基末端或這些末端位置之間的任何地方，可以散布于參比序列的各殘基間，或者在參比序列內(nèi)的一個或一個以上相鄰基團(tuán)中。作為實踐問題，可以采用已知的計算機(jī)程序來常規(guī)確定任何特定多肽是否與例如本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列或其片段(例如所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分或所述白蛋白融合蛋白的白蛋白部分)具有至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同。確定查詢序列(本發(fā)明的某序列)與對象序列之間的最佳總體匹配的優(yōu)選方法可以采用基于Brutlag等(Comp. App. Biosci. 6 :237-245(1990))的算法的FASTDB計算機(jī)程序，該方法也稱為整體序列比對。在序列比對中，查詢和對象序列或者都是核苷酸序列，或者都是氨基酸序列。整體序列比對的結(jié)果表示為相同百分?jǐn)?shù)。FASTDB氨基酸比對中所用的優(yōu)選參數(shù)為矩陣(Matrix) = PAM 0，k_ 元組(k-tuple) = 2，錯配罰分(Mismatch Penalty) = 1，連接罰分(Joining Penalty) =20，隨機(jī)分組長度(Randomization Group Length) =0,臨界分值(CutoffScore) = 1，窗口尺寸(Window Size)=序列長度，缺口罰分(Gap Penalty) = 5，缺口尺寸罰分(Gap Size Penalty) = 0. 05，窗口尺寸=取500或?qū)ο蟀被嵝蛄虚L度中較短者ο若對象序列比查詢序列短是由于N或C末端缺失而非內(nèi)部缺失，必須對結(jié)果進(jìn)行人工校正。這是因為FASTDB程序在計算整體相同百分?jǐn)?shù)時并不考慮對象序列的N和C末端截斷。對于相對查詢序列在N和C末端有截斷的對象序列，通過計算查詢序列中在對象序列N和C末端而不與相應(yīng)的對象殘基匹配/對齊的殘基數(shù)占查詢序列總堿基數(shù)的百分比來校正相同百分?jǐn)?shù)。通過FASTDB序列比對的結(jié)果確定殘基是否匹配/對齊。然后通過上述FASTDB程序采用特定參數(shù)計算所得相同百分?jǐn)?shù)中減去該百分值，獲得最終的相同百分?jǐn)?shù)得分。該最終相同百分?jǐn)?shù)得分用于本發(fā)明的目的。為了人工調(diào)整相同百分?jǐn)?shù)得分，僅考慮對象序列N和C末端未與查詢序列匹配/對齊的殘基。即，只查詢對象序列N和C末端殘基最遠(yuǎn)端外側(cè)的殘基位置。例如，90個氨基酸殘基的對象序列與100個殘基的查詢序列比對以確定相同百分?jǐn)?shù)。缺失發(fā)生在對象序列的N末端，因此FASTDB比對并未顯示N末端最初10個殘基的匹配/對齊。這10個未配對殘基代表序列的10% (N和C末端未匹配殘基數(shù)/查詢序列的總殘基數(shù))，因此從FASTDB程序計算得到的相同百分?jǐn)?shù)得分中減去10%。若其余90個殘基為理想匹配，那么最終的相同百分?jǐn)?shù)將是90%。在另一示例中，比較90個殘基的對象序列與100個殘基的查詢序列。這次缺失為內(nèi)部缺失，因此對象序列的N或C末端沒有與查詢不匹配/對齊的殘基。該情況下，F(xiàn)ASTDB計算所得相同百分?jǐn)?shù)不用人工校正。再次，只對在FASTDB比對中顯示為對象序列N和C末端外側(cè)，未與查詢序列匹配/對齊的殘基位置進(jìn)行人工校正。沒有為本發(fā)明目的進(jìn)行其它人工校正。
變體通常和與變體具有相同長度的正常HA或G-CSF蛋白長度具有至少約75%(在其它實施方式中，至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99% )的序列相同性。通過BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool (基礎(chǔ)本地比對搜索工具))分析，采用為序列相似性搜索調(diào)整過的blastp、blastn、blastx、tblastn 禾口 tblastx 所用算法(Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87 :2264-2268(1990)和 Altschul，J. Mol. Evol. 36 :290-300 (1993)，通過引用全文納入)確定核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或相同性。BLAST程序所用方法首先考慮查詢序列和數(shù)據(jù)庫序列之間的相似區(qū)段，然后評估所有一致匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性，最后僅總結(jié)出那些滿足預(yù)選的顯著性閾值的匹配者。關(guān)于序列數(shù)據(jù)庫相似性搜索的基本問題的討論，參見Altschul等(Nature Genetics 6 119-1^(1994))，其全文通過引用納入本文。直方圖、描述、對齊、預(yù)期(即，針對數(shù)據(jù)庫序列報告匹配者的統(tǒng)計學(xué)顯著性)、臨界值、矩陣和篩選的搜索參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。Blastp、blastx、tblastn 和 tblastx 采用的默認(rèn)計分矩陣是 BL0SUM62 矩陣(Henikoff 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89 10915-10919 (1992)，通過引用全文納入)。對于 blastn,計分矩陣用M( S卩，匹配殘基配對的獎勵計分)與N(S卩，錯配殘基的罰分)的比值設(shè)定，其中M和N的默認(rèn)值分別為5和-4。四項blastn參數(shù)可作如下調(diào)整Q-10(缺口產(chǎn)生罰分)；R=10(缺口延伸罰分)；wink= 1(在沿查詢序列的各wink. sup. th位置產(chǎn)生字命中)；以及gapw =16(設(shè)定產(chǎn)生帶缺口對齊的窗口寬度)。Blastp的相應(yīng)參數(shù)設(shè)定為Q = 9 ;R = 2 ；wink =1和gapw = 32。在GCG包1. 0版中可在序列間進(jìn)行Bestfit比較，采用DNA參數(shù)GAP =50 (缺口產(chǎn)生罰分)和LEN = 3 (缺口延伸罰分)，蛋白質(zhì)比較中的相應(yīng)設(shè)定為GAP = 8和LEN = 2。本發(fā)明的多核苷酸變體可含有在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩者內(nèi)的變化。特別優(yōu)選的多核苷酸變體包含產(chǎn)生沉默取代、添加或缺失的變化，但不改變所編碼多肽的性質(zhì)或活性。優(yōu)選因遺傳密碼簡并性導(dǎo)致的沉默取代所產(chǎn)生的核苷酸變體。此外，也優(yōu)選多肽變體中低于50個、低于40個、低于30個、低于20個、低于10個、或5-50個、5-25個、5-10個、1-5個或1-2個氨基酸被以任意組合取代、缺失或添加?？梢詾槎喾N原因產(chǎn)生多核苷酸變體，例如為優(yōu)化特定宿主中密碼子的表達(dá)(將人mRNA中的密碼子變成細(xì)菌宿主如酵母或大腸桿菌中優(yōu)選的密碼子)。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明中編碼白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸優(yōu)化以在酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明編碼白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的多核苷酸優(yōu)化以在酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。在更進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明中編碼白蛋白融合蛋白的多核苷酸優(yōu)化以在酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。在另一實施方式中，在本文所述嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，編碼白蛋白融合蛋白G-CSF蛋白部分的密碼子優(yōu)化多核苷酸不和編碼G-CSF蛋白的野生型多核苷酸雜交。在進(jìn)一步的實施方式中，在本文所述嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，編碼白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的密碼子優(yōu)化多核苷酸不和編碼白蛋白的野生型多核苷酸雜交。在另一個實施方式中，在本文所述嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，編碼白蛋白融合蛋白的密碼子優(yōu)化多核苷酸不和編碼G-CSF蛋白部分或白蛋白部分的野生型多核苷酸雜交。
在另外的實施方式中，編碼白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分的多核苷酸不包含該G-CSF蛋白的天然產(chǎn)生序列，或不由其組成。在進(jìn)一步的實施方式中，編碼白蛋白融合蛋白的白蛋白部分的多核苷酸不包含該白蛋白的天然產(chǎn)生序列，或不由其組成。在另外的實施方式中，編碼白蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含G-CSF蛋白部分或白蛋白部分的天然產(chǎn)生序列，或不由其組成。采用已知的蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的方法，可以產(chǎn)生變體以改善或改變本發(fā)明多肽的特性。例如，可以從本發(fā)明多肽的N或C末端刪除一個或多個氨基酸而不顯著損失生物學(xué)功能。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的變體具有保守取代?！氨Ｊ厝〈笔侵冈诮M內(nèi)交換，例如脂族或疏水氨基酸Ala、Val, Leu和Ile的取代；羥基殘基Ser和Tar的取代；酸性殘基Asp和Glu的取代；酰胺殘基Asn和Gln的取代；堿性殘基Lys、Arg和His的取代；芳香族殘基Wie、Tyr和Trp的取代；以及小尺寸氨基酸Ala、kr、Hir、Met和Gly的取代。提供了關(guān)于如何制備表型沉默的氨基酸取代的指南，例如，Bowie等，"Deciphering the Message in Protein Sequences :Tolerance to Amino AcidSubstitutions (解碼蛋白質(zhì)序列的信息對氨基酸取代的容差)，，，Science 247 1306-1310(1990)，其中作者表明有兩種主要策略研究氨基酸序列對變化的容差。第一種策略通過進(jìn)化過程中的自然選擇探索氨基酸取代的容差。通過比較不同物種間的氨基酸序列鑒別保守氨基酸。這些保守氨基酸可能對于蛋白質(zhì)功能很重要。相反，其取代為自然選擇容忍的氨基酸位置表明這些位置對于蛋白質(zhì)功能并非關(guān)鍵。因此，容忍氨基酸取代的位置可被改變而仍保持所述蛋白質(zhì)的生物活性。第二種策略采用遺傳工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸變化以鑒別蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵性區(qū)段。例如，可采用定點突變或丙氨酸掃描突變(在分子的各殘基處引入單個丙氨酸突變)。參見 Cunningham 和 Wells，Science 244:1081-1085(1989)。然后，可測試所得突變分子的生物學(xué)活性。如作者所指出，這兩種策略揭示了蛋白質(zhì)對氨基酸取代的驚人容差。作者進(jìn)一步指出，在蛋白質(zhì)的某些氨基酸位置哪些氨基酸變化是可能允許的。例如，大多數(shù)被包埋(在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中)的氨基酸殘基要求非極性側(cè)鏈，而通常表面?zhèn)孺湹奶匦詷O少是保守的。此外，可容忍的保守氨基酸取代涉及脂族或疏水氨基酸Ala、Val、LeU和Ile的取代；羥基殘基Ser和Thr的取代；酸性殘基Asp和Glu的取代；酰胺殘基Asn和Gln的取代；堿性殘基Lys、Arg和His的取代；芳香族殘基Wie、Tyr和Trp的取代；以及小尺寸氨基酸Ala、Ser, Thr、Met和Gly的取代。除了保守氨基酸取代，本發(fā)明的變體包括(i)含一個或一個以上非保守氨基酸殘基取代的多肽，其中被取代的氨基酸殘基可以由或不由該遺傳密碼編碼，或者(ii)含有一個或一個以上具有取代基團(tuán)的氨基酸殘基取代的多肽，或(iii)與另一化合物，例如提高多肽穩(wěn)定性和/或溶解度的化合物(如聚乙二醇)融合或化學(xué)偶聯(lián)的多肽，(iv)包含額外氨基酸，例如IgG Fc融合區(qū)肽的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本文教導(dǎo)下認(rèn)為這些多肽變體是在本文范圍內(nèi)的。例如，包含帶電氨基酸被其它帶電或中性氨基酸取代的多肽變體可產(chǎn)生特性改善的蛋白質(zhì)，例如較少聚集。藥物制劑的聚集減低活性并因聚集體的免疫原活性提高了清除。參見 Pinckard 等，Clin. Exp. Immunol. 2 :331-340 (1967) ；Robbins 等，Diabetes36 :838-845 (1987) ；Cleland 等，Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993)。在特定的實施方式中，本發(fā)明的多肽包含白蛋白融合蛋白氨基酸序列、G-CSF蛋白和/或人血清白蛋白氨基酸序列的片段或變體，或由其組成，其中所述片段或變體與參比氨基酸序列相比，具有1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150個氨基酸殘基的添加、取代和/或缺失。在優(yōu)選的實施方式中，所述氨基酸取代是保守的。本發(fā)明也包括編碼這些多肽的核酸。本發(fā)明的多肽可以由通過肽鍵或修飾的肽鍵，即肽等排物彼此連接的氨基酸組成，并可包含20種基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。所述多肽可以通過天然過程修飾，例如翻譯后加工，或者通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾。這些修飾在基礎(chǔ)文章和更具體的專著以及大量研究文獻(xiàn)中已詳盡描述。修飾可發(fā)生在多肽的任何地方，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。應(yīng)當(dāng)了解相同類型的修飾可以在給定多肽的多個位置以相同或不同程度出現(xiàn)。并且，給定多肽也可包含許多類型的修飾。多肽可以是分支的，例如因泛素化造成，它們可以是含有或不含分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支和分支環(huán)狀多肽可以由翻譯后的自然過程造成也可通過合成方法產(chǎn)生。修飾包括乙?；Ⅴ；DP-核糖基化、酰胺化、共價結(jié)合黃素、共價結(jié)合血紅素部分、共價結(jié)合核苷酸或核苷酸衍生物、共價結(jié)合脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物、共價結(jié)合磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?； -羧化、糖基化、GPI錨體形成、羥基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)氨基酸加成如精氨?；?、以及泛素化。(參見，例如 PROTEINS—STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (蛋白質(zhì)結(jié)合和分子性質(zhì))，第 2版，Τ· E. Creighton，W. H. Freeman and Company, New York (1993) ；P0ST-TRANSLATI0NALC0VALENT MODIFICATION OF PROTEINS (蛋白質(zhì)翻譯后的共價修飾)，B. C. Johnson 編著，Academic Press, New York,第 1—12 頁(1983) ；Seifter 等，Meth. Enzymol. 182 626-646 (1990) ；Rattan 等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663 :4862 (1992))。C.功能活性“具功能活性的多肽”是指能顯示與G-CSF蛋白的全長、前蛋白、和/或成熟形式相關(guān)的一種或一種以上已知功能活性的多肽。這些功能活性包括但不限于，生物學(xué)活性、抗原性[與抗多肽抗體結(jié)合(或與多肽競爭結(jié)合)的能力]、免疫原性(產(chǎn)生結(jié)合本發(fā)明特定多肽的抗體的能力)、與本發(fā)明的多肽形成多聚體的能力、和與多肽的受體或配體結(jié)合的能力?！熬呱飳W(xué)活性的多肽”是指如特定生物學(xué)實驗所檢測，劑量依賴或不依賴性地顯示與本發(fā)明的G-CSF蛋白包括其成熟形式相似，但未必相同活性的多肽。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的白蛋白融合蛋白具有未與白蛋白融合的G-CSF蛋白部分(或其片段或變體)相關(guān)的至少一種生物學(xué)和/或治療活性?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知試驗或?qū)λ鼈冏鞒Ｒ?guī)改良以及本文所述試驗以試驗其本發(fā)明的白蛋白融合蛋白的功能活性(例如，生物學(xué)活性)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所對應(yīng)的G-CSF蛋白片段進(jìn)行常規(guī)試驗。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本領(lǐng)域已知試驗和/或下文實施例部分所述試驗對白蛋白融合蛋白的白蛋白部分所對應(yīng)的白蛋白片段進(jìn)行常規(guī)試驗分析活性。例如，在一個實施方式中，試驗白蛋白融合蛋白結(jié)合或與G-CSF蛋白競爭結(jié)合抗G-CSF多肽抗體和/或抗白蛋白抗體的能力，可以采用本領(lǐng)域已知的各種免疫試驗，包括但不限于，使用例如放射免疫試驗、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫試驗、免疫放射試驗、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散試驗、原位免疫試驗(例如，采用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)記)Jestern印跡、沉淀反應(yīng)、聚集試驗(例如凝膠聚集試驗、血凝試驗)、補(bǔ)體固定試驗、免疫熒光試驗、蛋白質(zhì)A試驗和免疫電泳試驗等技術(shù)的競爭性和非競爭性試驗系統(tǒng)。在一種實施方式中，通過檢測初次抗體上的標(biāo)記測得抗體的結(jié)合。在另一個實施方式中，通過檢測二次抗體或試劑與初次抗體的結(jié)合測得初次抗體。在另外一實施方式中，標(biāo)記所述二次抗體。本領(lǐng)域已知并在本發(fā)明范圍內(nèi)有多種方法用于在免疫試驗中檢測結(jié)合。在一個優(yōu)選實施方式中，識別了 G-CSF蛋白質(zhì)的結(jié)合伴侶(例如，受體或配體)，例如，可以通過本領(lǐng)域熟知的方法如還原和非還原性凝膠層析、蛋白親和層析及親和印跡法，分析白蛋白融合蛋白與該結(jié)合伴侶的結(jié)合，所述融合蛋白包含G-CSF蛋白作為融合體的 G-CSF 蛋白部分。一般參見 Phizicky 等，Microbiol. Rev. 59 :94-123 (1995)。在另一實施方式中，可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)常規(guī)分析白蛋白融合蛋白與融合體G-CSF蛋白部分所對應(yīng)G-CSF多肽的受體結(jié)合的生理關(guān)聯(lián)能力。在另一個實施方式中，評估白蛋白融合蛋白形成多聚體的能力，可以通過本領(lǐng)域熟知的方法，例如還原和非還原性凝膠層析、蛋白親和層析及親和印跡分析多聚體與其它組分的結(jié)合。通常參見Phizicky等，同上。可用于分析蛋白結(jié)合和交叉反應(yīng)性或鑒定的免疫試驗包括但不限于使用諸如Western印跡、放射性免疫實驗、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫試驗、免疫沉淀試驗、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散試驗、凝集試驗、補(bǔ)體固定實驗、免疫放射分析、熒光免疫分析、蛋白A免疫試驗等技術(shù)的競爭性和非競爭性測定系統(tǒng)。這類實驗是本領(lǐng)域熟知的常規(guī)實驗(參見例如，Ausubel等編，1994，Current Protocols in MolecularBiology (新編分子生物學(xué)實驗)，第1卷，John Wiley & Sons, Inc.，New York，通過引用全文納入本文)。與白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分所對應(yīng)的G-CSF蛋白結(jié)合的抗體也可就其對給定蛋白或抗原的結(jié)合親和力加以描述或限定，優(yōu)選其特異性結(jié)合的抗原。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd低于5x10_2M、10_2M、5x10_3M、10_3M、5x10_4M、10_%。更優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或 Kd 低于 5χ1(Γ5Μ、1(Γ5Μ、5χ1(Γ6Μ、1(Γ6Μ、5χ1(Γ7Μ、1(Γ7Μ，5χ1(Γ8Μ 或 1(Γ8Μ。更優(yōu)選的結(jié)合親和力包括解離常數(shù)或Kd低于5x10-、、10_9Μ、5x10、、10_1(ιΜ、5Χ10_"Μ、1(Γ"Μ、5χIOl 1(Γ12Μ、5X101 10 Μ、5Χ10 Μ、1(ΓμΜ、5X10、、或 IO-15M0 此外，本文描述的試驗和本領(lǐng)域已知的試驗可以常規(guī)應(yīng)用于檢測白蛋白融合蛋白及其片段、變體、衍生物引起所述白蛋白融合蛋白的G-CSF蛋白部分和/或白蛋白部分相關(guān)的生物學(xué)活性和/或G-CSF活性(體內(nèi)或體外)的能力。其它方法會是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并在本發(fā)明范圍內(nèi)。V. G-CSF和HSA的融合蛋白重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子(rHA-G-CSF)是G-CSF類似物。rHA-G-CSF的例子見美國專利第5，665，863號以及美國專利第7，041，478號的描述，兩者都通過引用納入本文。rHA-G-CSF的另一例子是美國特華生物藥物有限公司(Teva BiopharmaceuticalsUSA LTD.)開發(fā)的Neugranin (“NEUG”)。NEUG是分子量約為85kDa的融合多肽。NEUG是759個氨基酸的單鏈多肽，1-585位殘基對應(yīng)于HSA的成熟形式，586-759位殘基對應(yīng)于人G-CSF的成熟形式。圖1顯示了 NEUG融合蛋白的氨基酸序列。VI.產(chǎn)牛融合蛋白生產(chǎn)rHA-G-CSF的合成過程的示范性方法見美國專利申請第11/929，828號的描述，其全文通過引用納入本文。在一些實施方式中，采用遺傳工程改造的表達(dá)NEUG融合蛋白的酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))宿主系統(tǒng)生成NEUG。采用本領(lǐng)域熟知的方法(例如通過一系列層析和過濾步驟，如親和層析及離子交換層析)從酵母培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基中收集并純化NEUG。在一種非限制性的示例中，如下開發(fā)NEUG融合構(gòu)建物。從英國牛津大學(xué)F. E. Baral 1 e博士實驗室的人cDNA文庫中分離出全長白蛋白cDNA。該克隆作為質(zhì)粒PAT153ALB送往英國諾丁漢的Delta Biotechnology Limited。此外，修飾6-氨基酸HSA前肽(RGVFRR)以促進(jìn)酵母中的更有效加工(RSLDKR)。NEUG的生產(chǎn)質(zhì)粒，基于PSAC35改良的表達(dá)質(zhì)粒，是基于野生型釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的2-μ質(zhì)粒?；赑SAC35的表達(dá)載體(參見例如，專利EP 286424Β、美國專利第5，637，504號)含有來自釀酒酵母的LEU2基因作為選擇標(biāo)記，該基因補(bǔ)充釀酒酵母生產(chǎn)宿主中的亮氨酸缺陷。該生產(chǎn)質(zhì)粒還包含強(qiáng)酵母啟動子PRB1，和來自質(zhì)粒pUC9的可在大腸桿菌中克隆和增殖的序列。此外，一旦轉(zhuǎn)化到酵母中，所述質(zhì)粒消除在大腸桿菌中增殖所需的PUC9衍生序列。這通過側(cè)翼FLP識別靶標(biāo)(FRT)和進(jìn)入酵母后質(zhì)粒表達(dá)酵母FLP重組酶而實現(xiàn)。因此，用于生產(chǎn)NEUG的生物體中沒有細(xì)菌DNA。這通過在產(chǎn)生主細(xì)胞庫后從酵母中取出2μπι質(zhì)粒并測序得到證實。如上所述，名為CID1643(pSAC35 :HSA. GCSF (T31-P204))的 NEUG 生產(chǎn)質(zhì)粒是從基于PSAC35的表達(dá)載體衍生得到。通過PCR擴(kuò)增與人G-CSFT31-P204對應(yīng)的區(qū)段，添加適當(dāng)?shù)?’和3’限制性位點以允許與HSA開放讀框3’末端的無縫融合。在馬里蘭州羅克維爾(Rockville，MD)的Human Genome Sciences 公司用 NEUG種子瓶制備cGMP主細(xì)胞庫。NEUG主細(xì)胞庫的測試和鑒定在美國賓夕法尼亞州馬爾文的 Charles River Laboratories (Malvern, PA, USA)和美國得克薩斯州休斯敦的 LarkTechnologies (Houston, TX, USA),遵照 ICH 指南 Q5D (Derivation and Characterizationof Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/BiologicalsProducts (用于生產(chǎn)生物技術(shù)/生物產(chǎn)品的細(xì)胞基質(zhì)的產(chǎn)生和鑒定))進(jìn)行。隨后在Charles River Laboratories產(chǎn)生并檢測從該主細(xì)胞庫衍生的cGMP工作細(xì)胞庫。生產(chǎn)NEUG細(xì)胞系庫的所有培養(yǎng)基成分都是合成、生物合成或植物來源。在細(xì)胞系或細(xì)胞庫制備過程中沒有使用動物來源或人源的成分。所述細(xì)胞庫在< _135°C下保存在預(yù)滅菌的1. SmL帶內(nèi)螺口封蓋Nunc聚丙烯管內(nèi)的凍存培養(yǎng)基中。圖21顯示了分離、純化和制備藥用rHSA-G-CSF融合蛋白的非限制性示范方法。用0.2μπι過濾器將配制的藥物物質(zhì)無菌過濾入已滅菌的特富龍(Teflon)瓶中。裝有藥物物質(zhì)的液體在約_80°C (標(biāo)稱值，保存溫度的可接受范圍為約_65°C )下冷凍保存.為改善制劑在運輸和臨床地點存放的穩(wěn)健性，并提供具有預(yù)期的長保存期的穩(wěn)定產(chǎn)品，還可采用本領(lǐng)域已知方法凍干NEUG。VII 白細(xì)胞減少癥和嗜中件白細(xì)胞減少癥的示范件原因如上所述，白細(xì)胞減少癥是循環(huán)血液白細(xì)胞計數(shù)(WBC)的減少，嗜中性白細(xì)胞減少癥以血嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)的減少為特征，常導(dǎo)致對細(xì)菌和真菌感染的易感性提高。下列是能使人對象面臨引起白細(xì)胞減少癥或嗜中性白細(xì)胞減少癥風(fēng)險的因素的不全面列舉藥物(例如，苯妥英、氯霉素、磺胺藥物和化療)；維生素B12或葉酸缺乏；飲酒過量；涉及骨髓的癌癥和其它疾病(例如，再生障礙性貧血、丙種球蛋白異常血癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、脊髓發(fā)育不良、脊髓發(fā)育不良綜合征、骨髓纖維化、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤或浸潤并置換骨髓的轉(zhuǎn)移性實體腫瘤)；病毒感染(例如，流感、HIV、早期傳染性單核細(xì)胞增多癥、兒童病毒疾病)；細(xì)菌感染(例如，結(jié)核)；輻射；毒素(例如，苯和殺蟲劑)；骨髓衰竭(例如，ktiwachman-Diamond綜合征、軟骨毛發(fā)發(fā)育不良、先天性角化不良、IB型糖原貯積病)；脾臟紊亂、各種原因?qū)е碌钠⒛[大；骨髓細(xì)胞或其前體的內(nèi)在缺陷；過敏性疾??；自體免疫疾??；T-γ淋巴增生性疾病(T-YLPD)；血液透析或移植；毒素。大量藥物，例如多種化療方案(如細(xì)胞毒性化療方案)與發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的高風(fēng)險(如風(fēng)險> 20% )。在一些化療方案中，沒有G-CSF治療時的發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥發(fā)病率約為40% (例如靜脈內(nèi)用多柔比星和多西他賽的化療方案)。下表1提供了與發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥相關(guān)的各種癌癥和治療方案的非限制性例子。在一些實施方式中，圖1所示的HSA-G-CSF融合蛋白給予患者以預(yù)防、治療或減輕與這些藥物治療
施用相關(guān)的嗜中性白細(xì)胞減少癥。
表1:與發(fā)熱相t嗜中性白細(xì)胞減少癥相關(guān)的示例性癌癥和治療方案癌癥治療膀胱癌MVAC (甲氨蝶呤、長春堿、多柔比星、順鉬)(新輔助治療、輔藥、轉(zhuǎn)移性)
權(quán)利要求
1.一種在人對象中治療或預(yù)防嗜中性白細(xì)胞減少癥的方法，包括對顯示嗜中性白細(xì)胞減少癥或有產(chǎn)生嗜中性白細(xì)胞減少癥風(fēng)險的人對象施用有效量的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子以治療對象。
2.一種在人對象中治療或預(yù)防白細(xì)胞減少癥的方法，包括對顯示白細(xì)胞減少癥或有產(chǎn)生白細(xì)胞減少癥風(fēng)險的人對象施用有效量的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子以治療對象。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人對象患有非骨髓惡性腫瘤并正接受至少一種骨髓抑制型抗癌藥，所述藥物與發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的臨床顯著發(fā)病率相關(guān)。
4.一種在患有非骨髓性惡性腫瘤并在接受至少一種骨髓抑制型抗癌藥的人對象中降低感染發(fā)病的方法，所述感染表現(xiàn)為發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥，所述抗癌藥物與發(fā)熱性嗜中性白細(xì)胞減少癥的臨床顯著發(fā)病率相關(guān)，所述方法包括給予對象有效劑量的人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子以治療對象。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，(a)對象中4級嗜中性白細(xì)胞減少癥消除；(b)對象中4級嗜中性白細(xì)胞減少癥減輕；(c)對象中重度嗜中性白細(xì)胞減少癥的持續(xù)時間縮短；(d)對象中4級嗜中性白細(xì)胞減少癥的持續(xù)時間低于5天；(e)對象中3級嗜中性白細(xì)胞減少癥的持續(xù)時間消除；(f)對象中3級嗜中性白細(xì)胞減少癥的持續(xù)時間減少；或(g)其任意組合。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述給予重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起血液白細(xì)胞計數(shù)(WBC)升高。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，(a)對象中嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量增加；(b)對象中嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量的降低被抑制；(c)對象中嗜中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(ANC)的最低值增加；(d)對象中恢復(fù)的ANC增加；(e)對象中ANC恢復(fù)的時間縮短；或(f)其任意組合。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述給予對象的重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子的量選自下組(a)從約50 μ g/kg 到約 450 μ g/kg ；(b)約50 μ g/kg ；(C)約 150 μ g/kg ；(d)約300 μ g/kg ；(e)約450 μ g/kg ；(f)從約30mg到約60mg；(g)約30mg ；(h)約 40mg ；⑴約50mg ；(j)約 60mg ；或(k)其任意組合。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述嗜中性白細(xì)胞減少癥選自原發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、急性嗜中性白細(xì)胞減少癥、重度慢性嗜中性白細(xì)胞減少癥 (SCN)、重度先天性嗜中性白細(xì)胞減少癥(Kostmarm綜合征)、重癥嬰兒遺傳性粒細(xì)胞缺乏癥、良性嗜中性白細(xì)胞減少癥、周期性嗜中性白細(xì)胞減少癥、慢性特發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、繼發(fā)性嗜中性白細(xì)胞減少癥、嗜中性白細(xì)胞減少癥相關(guān)綜合征和免疫介導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞減少癥。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述嗜中性白細(xì)胞減少癥是由輻射、酗酒、藥物、過敏性疾病、自體免疫疾病、T-Y淋巴增生性疾病(T-YLPD)、脊髓發(fā)育不良、骨髓纖維化、丙種球蛋白異常血癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿、癌癥、維生素B12缺乏、葉酸缺乏、病毒感染、細(xì)菌感染、脾臟疾病、血液透析、或移植、白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、浸潤并置換骨髓的轉(zhuǎn)移性實體瘤、毒素、骨髓衰竭、Schwachman-Diamond綜合征、軟骨-毛發(fā)發(fā)育不全、先天性角化不良、IB型糖原貯積病、各種原因?qū)е碌钠⒛[大、骨髓細(xì)胞或其前體的內(nèi)在缺陷造成或與之相關(guān)。
11.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子給藥的時間選自下組(a)骨髓抑制性抗癌藥物給藥后至少12小時；(b)骨髓抑制性抗癌藥物給藥后至少18小時；(c)骨髓抑制性抗癌藥物給藥后至少M小時。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，在骨髓抑制性抗癌藥物之前給予重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起WBC升高。
13.如權(quán)利要求11-12中任一項所述的方法，其特征在于，在化療前給予重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起ANC升高。
14.如權(quán)利要求3或11-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述非骨髓惡性腫瘤包括乳腺癌。
15.如權(quán)利要求3或11-14中任一項所述的方法，其特征在于，所述骨髓抑制性抗癌藥物包括多柔比星和多西他賽。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，對至少一個療程，通過靜脈輸液在同一天依次給予約50mg/m2多柔比星和約75mg/m2多西他賽。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，對至少一個療程，通過靜脈輸液在同一天依次給予約60mg/m2多柔比星和約75mg/m2多西他賽。
18.如權(quán)利要求3或11-17中任一項所述的方法，其特征在于，所述ANC和WBC在選自下組的時間段內(nèi)回復(fù)正常(a)截止化療后的第10天；(b)截止化療后的第11天；(c)截止化療后的第12天；(d)截止化療后的第13天；(e)截止化療后的第14天；或(f)截止化療后的第15天。
19.如權(quán)利要求3或11-18所述的方法，其特征在于，在化療給藥后第14天用重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子治療的患者中所述ANC的升高低于用相等劑量聚乙二醇化非格司亭治療的患者中ANC的升高。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，其特征在于，所述給予重組人白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子引起淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、或其任意組合的升高。
21.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法，其特征在于，所述對象中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞或其任意組合的數(shù)量增加。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項所述的方法，其特征在于，所述對象中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞或其任意組合的數(shù)量降低受到抑制。
全文摘要
公開了用于治療、預(yù)防和減輕以白細(xì)胞計數(shù)降低為特征的癥狀和疾病的組合物和方法。本文所述的方法和組合物包括由人血清白蛋白(“HSA”)和人粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)形成的融合多肽。
文檔編號A61K47/48GK102378635SQ201080012723
公開日2012年3月14日 申請日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者A·C·貝爾, J·B·博克, J·赫普斯特 申請人:特瓦制藥工業(yè)有限公司