專利名稱：穆賽來斯酒的保健功能及其成分分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穆賽來斯酒(簡稱穆賽來斯，下同)保健功能或藥效學(xué)的研究，同時涉及功能成分的定量分析，屬于藥理學(xué)和食品、藥品分析等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
穆賽來斯，新疆維吾爾人稱夏拉甫或稱麥扎甫，有美酒之意。中世紀詩人歐珎爾·海亞姆在其《柔巴依集》中，稱穆賽來斯是由葡萄汁演化而來的葡萄血，現(xiàn)代作家陳漠先生在《你把雪書下給誰》的散文集中，用60頁的筆墨描述了穆賽來斯的歷史和神奇功能，比喻穆賽來斯是“男人的加油站，女人的美容院”，“讓我們墜入誘惑”。新疆的葉爾羌河域，居住著許多百歲老人，有人說他們之所以長壽，與常年愛喝穆賽來斯有一定的相關(guān)性，藥學(xué)工作者認為適量飲用葡萄酒有益于健康，與法蘭西人愛喝釀造全汁葡萄酒一樣，雖然法國人的飲食習(xí)慣與北美人、西歐人一樣，但心腦血管和癌癥的發(fā)病率遠遠低于北美人和西歐人，提示常喝由葡萄發(fā)酵釀造的穆賽來斯也可能可以降低危及生命的各種疾病發(fā)病率。但以上結(jié)論僅僅是猜測，穆賽來斯的保健功能如何被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所證實？酒中究竟有哪些有益健康的功能成分？這些問題引起我們的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用現(xiàn)代藥效學(xué)和儀器分析手段，對穆賽來斯的功能及保健成分進行了全面的研究，結(jié)果顯示它有增強免疫功能等五方面的作用，同時指出這些作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是花青素、兒茶素、蘆丁和槲皮素等成份。
下面結(jié)合實例對本發(fā)明做進一步的詳細描述，但不以此限制本發(fā)明。
具體實施例方式實施例1穆賽來斯藥效學(xué)研究1.方法1.1材料與試劑動物昆明種小鼠，18～22g，雌雄兼用；Wistar大鼠，130g左右、250g左右，雌雄兼用，新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。
藥品穆賽來斯酒，新疆阿瓦提穆賽來斯酒廠生產(chǎn)，批號040112；地塞米松磷酸鈉注射液，德陽華康有限公司生產(chǎn)，批號000417；綿羊紅細胞(SRBC)；豚鼠血清；都氏試劑。杞天紅景口服液，新疆烏魯木齊尚仁科技有限公司生產(chǎn)，批號030108；2，4-二硝基氯苯(2，4-Dinitrochloro bebzene DNCB)，批號960801。深海魚油。
儀器分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品，型號Spectrumlab 22PC)；電子天平(北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品，型號BS110S)；臺式離心機(上海交亭科學(xué)儀器廠制造，型號TDL80-213)。
1.2實驗內(nèi)容1.2.1對小鼠免疫器官重量的影響健康昆明種小鼠50只，體重18～22g，雌雄各半，隨機均勻分為5組正常對照組(NS0.2ml/10g)；地塞米松組(5mg/kg)；穆賽來斯小劑量組(0.05ml/10g)；穆賽來斯中劑量組(0.1ml/10g)；穆賽來斯大劑量組(0.2ml/10g)。以上各組連續(xù)灌胃給予生理鹽水或藥物15天于第15天末次服用后1小時，剖取胸腺，脾臟稱重，分別以每10g小鼠的胸腺重，脾臟重作為胸腺指數(shù)，脾臟指數(shù)。
1.2.2對小鼠血清溶血素生成的影響動物分組與服用方法同1.2.1，各組動物于服用的第11天，每只小鼠腹腔注射3∶5(SRBC∶NS，V∶V)SRBC懸液0.2ml/只致敏，于第15天末次服用后1小時，摘眼球取血，分離血清，用生理鹽水稀釋500倍，取稀釋血清1mL，依次加入10％SRBC 0.5mL，豚鼠血清(1∶10)1ml，混勻，在37℃溫育30min后，在0℃冰水中終止反應(yīng)，2000r/min離心10min，取上清液1mL加3mL都氏試劑，充分混勻，放置1h，用分光光度計在540nm處測上清液吸光度，另設(shè)不加血清的空白對照，取其上清液作比色時調(diào)“0”基準(zhǔn)。按以下公式計算HC50
i.SRBC半數(shù)溶血吸光度，取10％SRBC0.25ml加都氏試劑4ml放置1h，用分光光度計在540nm處測量其吸光度。
1.2.3對小鼠溶血空斑形成細胞(PFC)能力的影響動物分組與服用方法同1.2.1，各組動物連續(xù)灌胃服用15d，于服用的第15天，末次服用后1h，處死小鼠取脾臟，除去脾脂肪和結(jié)締組織，用注射器針芯經(jīng)銅網(wǎng)(網(wǎng)目100目)輕輕捻碎脾組織，以pH7.4的磷酸緩沖生理鹽水(PBS)制成脾懸液(在光學(xué)顯微鏡下將脾懸液濃度調(diào)至5×10-6個脾細胞/ml)，每管加入脾懸液1mL、0.25％SRBC1mL和豚鼠血清混勻，37℃水溫育1h，1500r.min-1離心5min，取上清液用分光光度計在413nm處測定A值。
1.2.4對2，4-二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響健康昆明種小鼠60只，體重18～22g，雌雄各半，隨機均勻分為6組正常對照組(NS0.2ml/10g)；模型組(NS0.2ml/10g)；杞天紅景口服液組(0.1ml/10g)；穆賽來斯小劑量組(原液0.05ml/10g)；穆賽來斯中劑量組(原液0.1ml/10g)；穆賽來斯大劑量組(原液0.2ml/10g)。以上各組連續(xù)灌胃給予生理鹽水或藥物7天。
上述各組動物于實驗第1天，腹部褪毛3×3cm，然后均勻涂抹5％的DNCB丙酮溶液50ul致敏，次日強化致敏一次，實驗第6天，各組小鼠右耳正反兩面用1％的DNCB丙酮溶液20ul均勻涂抹，進行攻擊，24小時后，將各組小鼠脫頸椎處死，剪下兩耳，用直徑8mm的鋼沖沖下耳片，稱重，以左右兩耳片重之差為耳腫脹度。
1.2.5對小鼠游泳耐力的影響健康昆明種小鼠50只，體重18～22g，雌雄各半，隨機均勻分為5組正常對照組(NS0.2ml/10g)；杞天紅景口服液組(0.1ml/10g)；穆賽來斯小劑量組(0.05ml/10g)；穆賽來斯中劑量組(0.1ml/10g)；穆賽來斯大劑量組(0.2ml/10g)。以上各組連續(xù)灌胃給予生理鹽水或藥物10天于第10天末次服用后2小時，進行低溫游泳實驗，以小白鼠無力浮起沉入水底為指標(biāo)，記錄每只小鼠的游泳時間。
1.2.6對大鼠肝臟、心臟組織中SOD活力、MDA、GSH含量的影響健康成年Wistar大鼠，250g左右，40只，雌雄兼用，隨機分為4組正常對照組(NS2ml/100g)；穆賽來斯小劑量組(0.5ml/100g)；穆賽來斯中劑量組(1ml/100g)；穆賽來斯大劑量組(2ml/100g)。另取幼年大鼠10只，130g左右，作為對照組。上述各組大鼠連續(xù)灌胃給予生理鹽水或藥物30天。于末次服用后兩小時，斷頸處死，迅速剖取肝臟、心臟組織，用冰生理鹽水制成10％的組織勻漿備用。按照試劑和的說明程序分別測定上述組織中的SOD活力、MDA、GSH的含量。
1.2.7對實驗性高脂血癥大鼠的影響Wistar大鼠，體重175±22.6g，雌雄兼用，隨機分為6組高脂鹽水組(灌胃給予高脂乳劑1ml/100g，第11天灌胃給予生理鹽水2ml/100g，共20天)；正常組(灌胃給予生理鹽水2ml/100g，共20天)；深海魚油組(灌胃給予高脂乳劑1ml/100g，第11天灌胃給予深海魚油100mg/100g，共20天)；穆賽來斯小劑量組(0.5ml/100g)；穆賽來斯中劑量組(1ml/100g)；穆賽來斯大劑量組(2ml/100g)處理方法同前。末次給予乳劑6小時后，各鼠摘眼球取血，制備血清，測定血清重的TG、CHOL、HDLC、LDLC。
1.2.8對大鼠性器官重量的影響Wistar大鼠，200g左右，56只，雌雄兼用，隨機分為4組正常對照組(NS2ml/100g)；穆賽來斯小劑量組(0.5ml/100g)；穆賽來斯中劑量組(1ml/100g)；穆賽來斯大劑量組(2ml/100g)。上述各組大鼠連續(xù)灌胃給予生理鹽水或藥物30天。于末次服用后兩小時斷頸處死，迅速分別剖取睪丸、附睪、精囊腺、子宮、卵巢稱重，計算臟器指數(shù)。
2.實驗結(jié)果2.1對小鼠免疫器官重量的影響實驗結(jié)果(見表1)表明與正常組比較，穆賽來斯各劑量組能明顯使小鼠的胸腺增大，提高胸腺指數(shù)(p＜0.05)，而對脾臟影響不大。提示本品具有一定的增強機體細胞免疫的能力。
表1對小鼠免疫器官重量的影響(x±SD，n＝10)

注與生理鹽水組比較*p＜0.052.2對小鼠血清溶血素抗體生成的影響實驗結(jié)果(見表2)表明，穆賽來斯能明顯提高小鼠血清溶血素抗體生成能力，各劑量組HC50與生理鹽水組比較具有顯著性差異(p＜0.05)。提示本品具有一定的增強機體體液免疫的能力。
2.3對小鼠溶血空斑形成細胞(PFC)的影響實驗結(jié)果(見表2)表明，與生理鹽水組比較，穆賽來斯各劑量組均能明顯提高小鼠的PFC值(p＜0.05)，能增加脾臟溶血空斑形成細胞的數(shù)目。提示本品具有一定的增強機體體液免疫的能力。
表2 對小鼠血清溶血素及溶血空斑形成細胞(PFC)的影響(x±SD，n＝10)

注與生理鹽水組比較*p＜0.052.4對2，4-二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響實驗結(jié)果(見表3)表明，與模型組比較，穆賽來斯各劑量組均能增加小鼠耳腫脹度(p＜0.05)，說明穆賽來斯對2，4-二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)具有明顯的增強作用。提示本品具有一定的增強機體細胞免疫的能力。
表3 對2，4-二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響(x±SD，n＝10)

注與生理鹽水組比較*p＜0.05；與模型組比較☆p＜0.05.
2.5對小鼠游泳耐力的影響實驗結(jié)果(見表4)，與正常組比較，穆賽來斯各劑量均能明顯延長小鼠的游泳時間，尤以中、大劑量的效果更明顯(p＜0.01)，提示本品有一定的抗疲勞作用。
表4 對小鼠游泳耐力的影響(x±SD，n＝10)

注與正常組比較*p＜0.01；與陽性組比較☆p＜0.05.
2.6對大鼠肝臟、心臟組織中SOD活力、MDA、GSH含量的影響實驗結(jié)果(見表5)，與正常組比較，穆賽來斯各劑量組可顯著提高肝臟中SOD活性，降低肢質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，提高還原型GSH的含量，尤以小中劑量效果好，提示其具有一定的清除自由基增強機體抗氧化能力的作用。
表5 對大鼠肝臟、心臟組織中SOD活力、MDA、GSH含量的影響(x±SD，n＝10)

注與正常組比較*p＜0.052.7對實驗性高脂血癥大鼠的影響實驗結(jié)果(見表6)，與模型組比較，穆賽來斯均能明顯降低高脂血癥大鼠血清中總膽固醇含量，低密度脂蛋白含量(p＜0.05)；其中中劑量能提高高密度脂蛋白含量；大、中劑量組與正常組比較可降低甘油三脂含量。提示穆賽來斯酒可能有降低血脂，預(yù)防或減輕動脈粥樣的形成的作用。
表6 對實驗性高脂血癥大鼠的影響(x±SD，n＝10)

注與模型組比較*p＜0.05
2.8對大鼠性器官重量的影響實驗結(jié)果(見表7)，與正常組比較穆賽來斯各劑量組均能增加精囊腺重量，其中小、大劑量效果明顯(p＜0.05)，提示雄激素樣作用。但對其他4種器官無明顯作用。
表7 對大鼠性器官重量的影響(x±SD，n＝7)

注與正常組比較*p＜0.05實施例2穆賽來斯保健功能成分的分析1.HPLC法測定穆賽來斯酒中兒茶素含量1.1色譜條件色譜柱Waters spherisorb ODS B柱(4.6×150mm，5μm)；柱溫40℃；檢測波長280nm；流速0.8mL/min；流動相0.04％檸檬酸水溶液-N，N-二甲基甲酰胺-四氫呋喃(45∶8∶2)。
1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線精密吸取30μg/mL兒茶素對照品溶液1、2、4、6、8、10、12μL，依次進樣，以峰面積積分值(Y)對進樣量(X)進行回歸處理，回歸方程為Y＝952X+1.298，r＝0.9999，表明兒茶素在0.03μg～0.36μg有良好的線性關(guān)系。
1.3進樣精密度試驗精密吸取30μg/mL的兒茶素對照品溶液4μL，連續(xù)進樣5次，峰面積的RSD值為0.96％。
1.4穩(wěn)定性試驗精密吸取處理好的供試品溶液(6號樣)5μL，每間隔2小時進樣一次，共5次，測得兒茶素峰面積的RSD值為1.61％。
精密吸取處理好的供試品溶液(6號樣)5μL，每間隔24小時進樣一次，共4次，測得兒茶素峰面積的RSD值為2.62％。表明被測組分在96小時內(nèi)是穩(wěn)定的。
1.5回收率試驗精密吸取已知含量的樣品(6號樣)50mL，共5份，精密加入30μg/mL的兒茶素對照品溶液4mL，以下按供試品處理法操作。測得兒茶素的平均回收率為99.9％，RSD＝1.37％(n＝5)。
1.6供試品溶液的制備及測定精密吸取樣品溶液50mL，水浴87℃蒸干。用20mL蒸餾水混懸。用乙酸己酯萃取三次，每次20mL，合并萃取液，濃縮至干。浸膏用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，甲醇定容，微孔濾膜過濾后進樣5μL。10個批號的樣品含量數(shù)據(jù)見表8。
表8 10個樣品中兒茶素含量測定結(jié)果

注以上樣品按含量高低排序。
2.HPLC法測定穆塞來斯酒中蘆丁、槲皮素含量2.1色譜條件色譜柱Waters spherisorb ODS B柱(4.6×150mm，5μm)；柱溫35℃；檢測波長360nm；流速0.8ml/min；流動相甲醇-0.25％H3PO4水(45∶55)。
2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線精密吸取蘆丁、槲皮素混合對照品溶液(蘆丁15μg/mL；槲皮素4.2μg/mL)，依次進樣2、4、6、8、10μL，以峰面積積分值(Y)對進樣量(X)進行回歸處理，回歸方程分別為蘆丁Y＝2107X+3.918，(r＝0.9992)；槲皮素Y＝4546X-4.494，(r＝0.9997)。
2.3供試品溶液的制備精密吸取樣品溶液50mL，水浴87℃蒸干。用20mL蒸餾水混懸。然后用乙酸乙酯萃取三次，每次20mL，合并萃取液，濃縮至干。用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，甲醇定容，微孔濾膜過濾后進樣10μL。10個批號的樣品含量數(shù)據(jù)分別見表9和表10。
2.4進樣精密度試驗取蘆丁、槲皮素混合對照品溶液6μL，連續(xù)進樣5次，峰面積的RSD分別為蘆丁0.88％、槲皮素1.78％。
2.5穩(wěn)定性試驗取處理好的供試品溶液(1號樣)10μL，每間隔2小時進樣一次，共5次，測得蘆丁峰面積的RSD為1.07％、槲皮素峰面積的RSD為1.69％。
取處理好的供試品溶液(1號樣)10μL，每間隔24小時進樣一次，共4次，測得蘆丁峰面積的RSD為1.88％、槲皮素峰面積的RSD為2.35％。
2.6回收率試驗精密吸取1號樣品溶液20.0mL，共5份，精密加入25μg/mL蘆丁對照品溶液2.0mL；精密加入21μg//mL槲皮素對照品溶液2.0mL；按供試品處理法操作。測得蘆丁的平均回收率為98.3％(n＝5)，RSD＝1.24％；槲皮素的平均回收率為97.2％(n＝5)，RSD＝0.45％。
表9 10個樣品中蘆丁含量測定結(jié)果

表10 10個樣品中槲皮素含量測定結(jié)果

注以上樣品按含量高低排序。
3.紫外分光光度法測定穆賽來斯酒中花青素的含量3.1儀器與試藥3.1.1UV1800-SPF紫外分光光度計(日本島津公司)；AB104-N型分析天平(德國)RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。
花青素(天津尖峰天然產(chǎn)物公司提供)，穆賽來斯酒(阿瓦提縣科委和阿瓦提縣醫(yī)院提供)，其它試劑均為分析純。
3.1.2實驗方法與結(jié)果3.1.3花青素對照溶液的配制精密稱取干燥至恒重的花青素4.8mg，置于10mi容量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻。
3.1.4供試溶液的制備 精密吸取不同批次麥賽萊斯酒各100ml至蒸發(fā)皿中，分別在水浴溫度85℃條件下蒸干，用蒸餾水20ml混懸，定量轉(zhuǎn)移至100ml分液漏斗中，用20ml乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，濃縮至干，用少量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至10ml的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。再精密吸取0.25ml溶液至10ml容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
3.1.5測定波長的選擇 精密吸取花青素對照品溶液0.5ml置于10ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻。取2.0ml，以甲醇為空白對照，在UV1800紫外分光光度計上，200nm-400nm波長范圍內(nèi)進行紫外圖譜掃描，結(jié)果表明在280±1nm處有最大吸收。
取配制好的批號為030601的供試品溶液2.0ml，以甲醇為空白對照，在UV1800紫外分光光度計上，200nm-400nm波長范圍內(nèi)進行紫外圖譜掃描，與對照品溶液比較在280±1nm有相似的最大吸收，因此選擇280±1nm為測定波長。
3.2.4線性關(guān)系 精密吸取花青素對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。以甲醇為空白對照，在280±1nm處測定吸光度，將所得的數(shù)據(jù)進行回歸處理，得回歸方程，C＝65.87A+0.3043r＝0.9998(n＝5)結(jié)果表明，花青素對照品溶液在9.6～48μg/ml濃度范圍內(nèi)，線性良好，符合比爾定律。
3.2.5日內(nèi)穩(wěn)定性試驗取處理好的批號為030601供試品溶液2.0ml，在室溫下放置，每隔一個小時，以甲醇為空白對照，在280±1nm處測定吸光度值，連續(xù)測定12小時，結(jié)果表明在12小時內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD＝2.29％。
3.2.6日間穩(wěn)定性試驗取處理好的批號為030601供試品溶液2.0ml，在室溫下放置，每隔24小時，以甲醇為空白對照，在280±1nm處測定吸光度值，連續(xù)測定5天，結(jié)果表明在5天之內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD＝3.55％。
3.2.7樣品測定按3.1.4項下操作，測得五個地方穆賽來斯酒中花青素含量為結(jié)果測得阿依巴克鄉(xiāng)6大隊1小隊樣品含量為0.34mg/ml，該鄉(xiāng)9大隊2小隊為0.77mg/ml，該鄉(xiāng)7大隊1小隊為0.22mg/ml；烏魯切勒鎮(zhèn)阿勒盤村為0.26mg/ml；烏魯橋鎮(zhèn)5隊為0.24mg/ml。
3.2.7加樣回收率實驗 精密吸取9ml濃度為1mg/ml的花青素對照品溶液5份，分別加入5份批號為030601的25ml穆賽來斯酒中，按“3。1。4項”操作處理樣品溶液后，在280±1nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算回收率，結(jié)果平均回收率為96.04±1.72，RSD為1.79％(n＝5)。
權(quán)利要求
1.能增強機體細胞免疫和體液免疫能力。
2.抗疲勞，增強機體耐力。
3.降血脂。
4.抗氧化(抗衰老)，能顯著提高肝臟中SOD活性，降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量，提高還原型GSH的含量。
5.雄激素樣作用，能增加精囊腺重量。
6.以上功能的物質(zhì)基礎(chǔ)是花青素、兒茶素、蘆丁和槲皮素。
全文摘要
穆賽來斯酒簡稱穆賽來斯。維吾爾人稱“夏提甫”或“多扎甫”，有濃郁的地方特色。本發(fā)明經(jīng)動物試驗表明它至少有以下五個方面的保健功能一、增加機體細胞免疫功能和體液免疫功能；二、抗疲勞、增強運動耐力；三、降血脂、預(yù)防或減輕動脈粥樣的形成；四、抗氧化(抗衰老)；五、增加性器官精囊腺的重量。本發(fā)明還揭示了以上作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，指出穆賽來斯酒中含有花青素、兒茶素、蘆丁和槲皮素等多種保健成分，并用紫外分光光度法測出了酒中花青素的含量，用HPLC法測出了酒中兒茶素、蘆丁和槲皮素的含量。以上發(fā)明為穆賽來斯商品化提供功能定位依據(jù)和質(zhì)量檢測依據(jù)。
文檔編號A61P3/00GK1824083SQ20051000659
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者毛新民, 堵年生, 李琳琳, 張煊, 康金森, 楊永新, 冉新建, 縱華, 阿布都拉·斯拉義 申請人:阿瓦提縣人民政府, 新疆醫(yī)科大學(xué)