本發(fā)明屬于食品添加劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高效溫和降低卵白蛋白致敏性的方法。

背景技術(shù)：

雞蛋因營(yíng)養(yǎng)豐富、成本低廉等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于日常膳食與食品加工中。然而，作為主要食物致敏原之一，其致敏性迫使全球2%的兒童及嬰幼兒在身體發(fā)育關(guān)鍵階段難以接觸該優(yōu)質(zhì)蛋白源；尤其在中國(guó)、日本等亞洲國(guó)家兒童群體中，超過一半的食物過敏由雞蛋引起。目前，針對(duì)雞蛋過敏尚無特別有效的治療手段，嚴(yán)格避免對(duì)蛋品的攝入是預(yù)防雞蛋過敏最有效的方式。但是，隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展，過敏人群幾乎無法徹底避免與含蛋食品的接觸。因此，探究有效的脫敏方法對(duì)于提升雞蛋及蛋制品的安全性，具有重要意義。

食物過敏主要分為ige介導(dǎo)和非ige介導(dǎo)兩大類，雞蛋過敏是ige介導(dǎo)的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，主要致敏原包括卵白蛋白、卵類粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白與溶菌酶等四種蛋清蛋白。致敏蛋白分子中抗原表位（數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)氨基酸殘基）是致敏原與抗體結(jié)合進(jìn)而觸發(fā)過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，因而也是揭示致敏反應(yīng)本質(zhì)的關(guān)鍵。根據(jù)表位的結(jié)構(gòu)差異可將其分為線性表位（連續(xù)氨基酸殘基）與構(gòu)象表位（非連續(xù)氨基酸殘基）。

卵白蛋白是一種含有3%糖基組分的磷糖球蛋白，約占蛋清蛋白的54%，分子量為44.5kda；其分子含有4個(gè)巰基和1個(gè)二硫鍵。卵白蛋白包含5個(gè)ige結(jié)合表位，并證明其均為線性表位（l38t49,d95a102,e191v200,v243e248，g251n260），其中4個(gè)暴露于分子表面，且二級(jí)結(jié)構(gòu)都含有β-sheet與β-turn。目前，酶法水解致敏蛋白是食物脫敏的有效手段之一。但是，卵白蛋白由于分子內(nèi)含有疏水內(nèi)核、二硫鍵、糖基化等特殊結(jié)構(gòu)，因而對(duì)常見蛋白酶表現(xiàn)出較高抗性。近年來學(xué)者開始嘗試在酶法基礎(chǔ)上結(jié)合物理手段對(duì)致敏蛋白協(xié)同處理，取得較好的脫敏效果。例如，jimenez-saiz(2011)等人研究了熱處理后卵白蛋白在模擬消化模型中的水解情況，證明熱處理能夠提升致敏蛋白對(duì)消化酶的敏感性，使其水解產(chǎn)物ige結(jié)合能力降低；畢井輝探究了不同處理方式對(duì)全蛋清致敏性的影響，結(jié)果表明高壓煮沸與木瓜蛋白酶協(xié)同處理能夠較大程度降低卵白蛋白的抗原性。這些研究為低敏性蛋制品的發(fā)展提供了參考。但是，這些方法由于高溫高壓等物理?xiàng)l件過于劇烈，容易導(dǎo)致蛋制品品質(zhì)下降。因此，探尋高效溫和的脫敏方法有助于從根本上提高雞蛋脫敏的有效性。

前人研究表明，反復(fù)凍融能夠促使蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性，使原本包藏與內(nèi)核的疏水基團(tuán)暴露至分子表面，同時(shí)引起蛋白質(zhì)二硫鍵發(fā)生變化。而這些疏水基團(tuán)、二硫鍵與卵白蛋白的抗原表位及抗原性具有直接聯(lián)系。那么，反復(fù)凍融是否能夠促使抗原表位暴露進(jìn)而提高其對(duì)蛋白酶的敏感度，從而提升酶法脫敏的效率值得深入研究。同時(shí)，區(qū)別于高溫高壓等物理方法，反復(fù)凍融能夠最大程度上保持或提高蛋白質(zhì)的加工特性（起泡性、乳化性、凝膠性等）；前人研究結(jié)果表明，利用反復(fù)凍融處理大豆蛋白可以改善其加工特性，在工業(yè)上經(jīng)濟(jì)且簡(jiǎn)單可行。這些研究結(jié)果為將反復(fù)凍融作為預(yù)處理手段應(yīng)用于低敏性蛋制品開發(fā)提供理論參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

要解決的技術(shù)問題：針對(duì)上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是公開一種高效溫和降低卵白蛋白致敏性的方法。

技術(shù)方案：本發(fā)明的目的是通過下述方案實(shí)現(xiàn)：

一種高效溫和降低卵白蛋白致敏性的方法，所述的方法步驟如下：

（1）卵白蛋白提取

用分蛋器將蛋清與蛋黃分離，在蛋清中加入1-8倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌1-6h，調(diào)ph至6.0；向其中加入10wt%-60wt%的peg-8000作為表面活性劑，磁力攪拌2h；在4℃、15000g下離心10min，收集上清液；將收集的液體在4℃下用去離子水透析4次，冷凍干燥即得卵清蛋白；

（2）反復(fù)凍融處理

將步驟（1）所得卵清蛋白按其在天然蛋清中的比例5.4%復(fù)溶于去離子水中，-20℃凍存12h，之后于20℃解凍12h，重復(fù)3-7次，最后冷凍干燥得到蛋白樣品；

（3）酶處理

將步驟（2）處理后的卵白蛋白按照酶與蛋白1:100-300的質(zhì)量比加入轉(zhuǎn)糖基酶，在ph8.0，溫度25℃條件下處理2h，之后按照酶與蛋白1:100-300的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，調(diào)ph至8.0，于25℃條件下處理2h，得到最終的卵白蛋白水解樣品，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物；

優(yōu)選的，所述的方法步驟（1）中在蛋清中加入3倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌2h；

優(yōu)選的，所述的方法步驟（1）中加入15wt%的peg-8000作為表面活性劑；

優(yōu)選的，所述的方法步驟（2）中反復(fù)凍融處理次數(shù)為5次；

優(yōu)選的，所述的方法步驟（3）中轉(zhuǎn)糖基酶與蛋白比例為1:200；

優(yōu)選的，所述的方法步驟（3）中胰蛋白酶與蛋白比例為1:200；

以上任一所述的一種高效溫和降低卵白蛋白致敏性的方法制備得到的卵白蛋白。

本發(fā)明的有益效果：相比傳統(tǒng)強(qiáng)烈物理手段（高溫、高壓、超聲波等）結(jié)合酶處理的方法，本發(fā)明通過反復(fù)凍融預(yù)處理方法促使卵白蛋白致敏部位暴露至分子表面，結(jié)合轉(zhuǎn)糖基酶與胰蛋白酶協(xié)同處理降低卵白蛋白糖鏈及抗原表位，達(dá)到顯著降低卵白蛋白及雞蛋食物致敏性的目的。該方法相比其他高溫高壓等物理手段協(xié)同酶法處理降低雞蛋致敏性的傳統(tǒng)方法而言，顯著提高了雞蛋脫敏的針對(duì)性與有效性，并最大程度減小了對(duì)雞蛋蛋白營(yíng)養(yǎng)及品質(zhì)的破壞，是一種高效溫和的雞蛋脫敏方法。該方法具有應(yīng)用于低敏性蛋制品工業(yè)開發(fā)的前景。

附圖說明

圖1是反復(fù)凍融0,5,10次后卵白蛋白疏水性的變化趨勢(shì)；

圖2是反復(fù)凍融0,5,10次后卵白蛋白游離巰基含量的變化趨勢(shì)；

圖3是反復(fù)凍融0,5,10次后卵白蛋白雙酶水解度的變化趨勢(shì)；

圖4是反復(fù)凍融0,5,10次及雙酶水解前后卵白蛋白致敏性的變化趨勢(shì)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

1.疏水性測(cè)定

用磷酸鹽緩沖液將蛋白樣品分別稀釋至不同濃度0.005%，0.01%,0.05%,0.1%,0.2%五個(gè)不同濃度。取20μl的熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（ans）溶液添加至4ml的蛋白樣品中。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，其中激發(fā)波長(zhǎng)為390nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470nm。熒光強(qiáng)度與蛋白濃度之間的初始斜率即為蛋白的表面疏水特性（ho）。

2.游離巰基含量的測(cè)定

將40mg蛋白樣品溶解在4ml的sds-tge緩沖液中，溶解30min,每隔10min漩渦振蕩一次。之后向其中加入0.04ml的ellman’s試劑，反應(yīng)30min。之后離心（10000×g，20min）后取上清液，并于412nm波長(zhǎng)下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值；以sds-tge溶液作為空白對(duì)照。結(jié)果計(jì)算：用還原型谷胱甘肽作為標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終結(jié)果表示為mmol巰基/g蛋白。

3.水解度的測(cè)定

采用ph滴定法對(duì)不同凍融次數(shù)的蛋白樣品水解度（degreeofhydrolysis,dh）進(jìn)行測(cè)定。dh按照以下公式進(jìn)行計(jì)算（胰蛋白酶/轉(zhuǎn)糖基酶：蛋白=1:200）：

dh(%)=[(vnaoh×nnaoh)/(α×mp×htot)]×100

其中，α是α-氨基基團(tuán)的解離度，mp是psv的質(zhì)量（g），htot是底物中肽鍵的數(shù)量（毫當(dāng)量/g蛋白）。naoh濃度是0.25m。在25°c，ph8.0的條件下α值為0.88，雞蛋蛋白的htot值為8.38。

反應(yīng)條件：25°c；去離子水體系；ph8.0.

4.致敏性的測(cè)定

將以上所有樣品（凍融0次、凍融5次、凍融10次、凍融0次+雙酶水解、凍融5次+雙酶水解、凍融10次+雙酶水解）按照蛋清蛋白檢測(cè)試劑盒（德國(guó)拜發(fā)，r6402）使用說明，對(duì)其中蛋白的抗原性進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)施例1

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器將蛋清與蛋黃分離，在蛋清中加入1倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌2h，調(diào)ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力攪拌2h；在4℃、15000g下離心10min，收集上清液；將收集的液體在4℃下用去離子水透析4次，冷凍干燥即得卵清蛋白；

（2）反復(fù)凍融處理：將步驟（1）所得卵清蛋白按其在天然蛋清中的比例（5.4%）復(fù)溶于去離子水中，-20℃凍存12h，之后于20℃解凍12h，分別重復(fù)3次后，最后冷凍干燥得到蛋白樣品；

（3）酶處理：將步驟（2）處理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入轉(zhuǎn)糖基酶，在ph8.0，溫度25℃條件下處理2h，之后按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，調(diào)ph至8.0，于25℃條件下處理2h，得到最終的卵白蛋白水解樣品，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物。

實(shí)施例2

（1）卵白蛋白提?。河梅值捌鲗⒌扒迮c蛋黃分離，在蛋清中加入8倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌2h，調(diào)ph至6.0；向其中加入50%（w/w）的peg-8000，磁力攪拌2h；在4℃、15000g下離心10min，收集上清液；將收集的液體在4℃下用去離子水透析4次，冷凍干燥即得卵清蛋白；

（2）反復(fù)凍融處理：將步驟（1）所得卵清蛋白按其在天然蛋清中的比例（5.4%）復(fù)溶于去離子水中，-20℃凍存12h，之后于20℃解凍12h，分別重復(fù)7次后，最后冷凍干燥得到蛋白樣品；

（3）酶處理：將步驟（2）處理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入轉(zhuǎn)糖基酶，在ph8.0，溫度25℃條件下處理2h，之后按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，調(diào)ph至8.0，于25℃條件下處理2h，得到最終的卵白蛋白水解樣品，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物。

實(shí)施例3

（1）卵白蛋白提?。河梅值捌鲗⒌扒迮c蛋黃分離，在蛋清中加入3倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌2h，調(diào)ph至6.0；向其中加入15%（w/w）的peg-8000，磁力攪拌2h；在4℃、15000g下離心10min，收集上清液；將收集的液體在4℃下用去離子水透析4次，冷凍干燥即得卵清蛋白；

（2）反復(fù)凍融處理：將步驟（1）所得卵清蛋白按其在天然蛋清中的比例（5.4%）復(fù)溶于去離子水中，-20℃凍存12h，之后于20℃解凍12h，分別重復(fù)5次后，最后冷凍干燥得到蛋白樣品；

（3）酶處理：將步驟（2）處理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入轉(zhuǎn)糖基酶，在ph8.0，溫度25℃條件下處理2h，之后按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，調(diào)ph至8.0，于25℃條件下處理2h，得到最終的卵白蛋白水解樣品，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物。

對(duì)比例1

（1）卵白蛋白提?。河梅值捌鲗⒌扒迮c蛋黃分離，在蛋清中加入1倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌2h，調(diào)ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力攪拌2h；在4℃、15000g下離心10min，收集上清液；將收集的液體在4℃下用去離子水透析4次，冷凍干燥即得卵清蛋白；

（2）加熱預(yù)處理：將步驟（1）所得卵清蛋白按10mg/ml的比例復(fù)溶于去離子水中，于80℃水浴20min，待自然冷卻至室溫后，冷凍干燥得到蛋白樣品；

（3）酶處理：將步驟（2）處理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，調(diào)ph至8.0，于50℃條件下處理2h，得到最終的卵白蛋白水解樣品，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物。

對(duì)比例2

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器將蛋清與蛋黃分離，在蛋清中加入1倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌2h，調(diào)ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力攪拌2h；在4℃、15000g下離心10min，收集上清液；將收集的液體在4℃下用去離子水透析4次，冷凍干燥即得卵清蛋白；

（2）超聲預(yù)處理：將步驟（1）所得卵清蛋白按10mg/ml的比例復(fù)溶于去離子水中，超聲方式為工作5s,停止5s，功率1000w，反復(fù)進(jìn)行20min后，冷凍干燥得到蛋白樣品；

（3）酶處理：將步驟（2）處理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，調(diào)ph至8.0，于50℃條件下處理2h，得到最終的卵白蛋白水解樣品，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物。

對(duì)比例3

（1）卵白蛋白提?。河梅值捌鲗⒌扒迮c蛋黃分離，在蛋清中加入1倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌2h，調(diào)ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力攪拌2h；在4℃、15000g下離心10min，收集上清液；將收集的液體在4℃下用去離子水透析4次，冷凍干燥即得卵清蛋白；

（2）高溫高壓預(yù)處理：將步驟（1）所得卵清蛋白按10mg/ml的比例復(fù)溶于去離子水中，放置于高壓滅菌鍋中（121℃）處理20min后，冷凍干燥得到蛋白樣品；

（3）酶處理：將步驟（2）處理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，調(diào)ph至8.0，于50℃條件下處理2h，得到最終的卵白蛋白水解樣品，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物。

對(duì)比例4

（1）卵白蛋白提取：用分蛋器將蛋清與蛋黃分離，在蛋清中加入1倍體積的50mmol/l的nacl溶液混合攪拌2h，調(diào)ph至6.0；向其中加入10%（w/w）的peg-8000，磁力攪拌2h；在4℃、15000g下離心10min，收集上清液；將收集的液體在4℃下用去離子水透析4次，冷凍干燥即得卵清蛋白；

（2）高溫高壓預(yù)處理：將步驟（1）所得卵清蛋白按10mg/ml的比例復(fù)溶于去離子水中，放置于高壓滅菌鍋中（121℃）處理20min后，冷凍干燥得到蛋白樣品；

（3）酶處理：將步驟（2）處理后的卵白蛋白按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入轉(zhuǎn)木瓜蛋白酶，在ph7.0，溫度25℃條件下處理2h，之后按照1:200（wt/wt，酶：蛋白）的比例加入胰蛋白酶，調(diào)ph至8.0，于50℃條件下處理2h，得到最終的卵白蛋白水解樣品，冷凍干燥后得到最終產(chǎn)物。

以上選用常用物理預(yù)處理手段（加熱、超聲、高溫高壓）與常用蛋白酶（胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）進(jìn)行實(shí)施例對(duì)比。結(jié)果表明，對(duì)比例1、2、3、4中ova的水解度分別為17.4%，20.2%，27.5%，31.1%；抗原性分別為0.64，0.72，0.56，0.47。由此看出，與本發(fā)明涉及的處理方法相比，加熱、超聲等物理預(yù)處理加單一酶（胰蛋白酶）水解處理效果較弱。而高溫高壓加復(fù)合酶法（胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）協(xié)同處理脫敏效果較好，與本發(fā)明涉及方法效果相當(dāng)。但是，高溫高壓等處理方法條件過于劇烈，容易導(dǎo)致最終蛋制品品質(zhì)降低。這也是本發(fā)明涉及溫和高效雞蛋脫敏方法的創(chuàng)新之處。