專利名稱：用于激活PPR－γ受體而治療自身免疫性疾病和阿爾茨海默病的提取自穿心蓮的半日花烷 ...的制作方法
免疫藥理學(xué)和生物藥劑學(xué)的主要目標(biāo)是不斷尋找治療免疫性疾病癥狀和改變免疫性疾病病程的新的治療方法。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病的特征是免疫系統(tǒng)對自身組織產(chǎn)生自發(fā)反應(yīng)。該反應(yīng)由T淋巴細胞對自身抗原的識別而引發(fā)，T淋巴細胞能夠觸發(fā)體液(自身抗體產(chǎn)生)和細胞(淋巴細胞和巨噬細胞細胞毒活性增加)的免疫應(yīng)答。自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕病，牛皮癬，全身性皮肌炎，多發(fā)性硬化癥，紅斑狼瘡或抗原的惡性免疫應(yīng)答，如哮喘、藥物或食物過敏等等。這些疾病都是限制性的，慢性的，在一些情況下是致命的，至今沒有有效的療法。因此，任何能夠引起疾病減輕或病程縮短的藥物、醫(yī)學(xué)或介質(zhì)都是使病人健康的重要手段。
對治療自身免疫性疾病的探索導(dǎo)致人們主要致力于發(fā)現(xiàn)適宜的藥物或方法。
目前，該疾病的治療主要是基于免疫抑制藥物如糖皮質(zhì)激素、神經(jīng)鈣蛋白(calcineurin)抑制劑和抗增殖-抗代謝物的應(yīng)用。然而，由于這些藥理療法作用于許多不同的靶位，會引起全身的免疫功能下降或者由于長期使用而導(dǎo)致不同細胞毒性效應(yīng)的缺點，因此將會非特異性地抑制免疫系統(tǒng)，使患者具有感染和患癌癥的風(fēng)險。由于腎毒性和致糖尿病的效應(yīng)，神經(jīng)鈣蛋白和糖皮質(zhì)激素顯示其它缺點，限制其在一些臨床病癥(如腎功能不全、糖尿病)中的應(yīng)用。
最新的免疫抑制治療進展是抗CD3單克隆抗體；抗IL-2受體單克隆抗體和抗TNFα單克隆抗體。盡管這些療法顯示出顯著的免疫抑制效應(yīng)，但其伴隨著過敏性反應(yīng)、機會性感染(肺結(jié)核)和贅生物、發(fā)熱、蕁麻疹、低血壓、呼吸困難，成為組合物或藥物使用中的重要問題。在注射使用中，三分之一的患者出現(xiàn)瘙癢、腫脹和疼痛。
發(fā)明簡述本發(fā)明要求的組合物能夠降低表現(xiàn)自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)特征的免疫應(yīng)答，減輕疾病癥狀縮短病程，同時維持“免疫耐受力”。
換言之，本發(fā)明公開的組合物的主要特征是由于其固有的免疫耐受性，即缺少對抗原的特異性反應(yīng)的活性狀態(tài)，不引起目前免疫抑制藥所具有的副反應(yīng)。特別地，此組合物通過激活PPARγ受體減少NF-κB因子而抑制干擾素γ、IL-2的合成和表達。
因此該半日花烷型二萜的新的組合物的特征就是選擇性地降低涉及自身免疫性疾病發(fā)病機理的細胞因子的過表達。
最近對涉及急性和慢性炎癥疾病和癌癥的介質(zhì)的科學(xué)認識取得了進展，為尋找有效療法提供了新的策略。傳統(tǒng)的途徑包括直接靶向干預(yù)如使用特異性抗體、受體拮抗劑或酶抑制劑等均具有顯著的副作用(如變態(tài)反應(yīng)、胃腸潰瘍、出血等)。最近涉及許多種介質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)機制的闡述方面有所突破，增加了人們在定向于基因轉(zhuǎn)錄(如COX2，iNOS，IL1β，TNFα，ICAM，等)水平的治療方法方面的興趣。
最重要的介質(zhì)之一是NF-κB，它屬于與包括多種多肽Re1/NF-κB家族組合的二聚體轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物密切關(guān)聯(lián)的家族。該家族由哺乳動物的五種單個基因產(chǎn)物，Re1A(p65)、NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p49/p100)、c-Re1和Re1B組成，這些基因產(chǎn)物形成雜型-或同型-二聚體。這些蛋白質(zhì)均具有包含DNA結(jié)合和二聚體化功能域的高度同源的300個氨基酸“Re1同源域”。Re1同源域的末端C-端是一個核轉(zhuǎn)位序列，對NF-κB從細胞質(zhì)向細胞核中的轉(zhuǎn)運十分重要。另外，p65和cRe1在C-端具有有效的反式激活功能域。
NF-κB的活性由它與多種蛋白質(zhì)抑制劑IκB家族的相互作用調(diào)節(jié)。這種相互作用有效地阻斷NF-κB蛋白質(zhì)上的細胞核定域化序列，防止二聚體向細胞核內(nèi)的移動。相當(dāng)多種刺激物通過類似于多重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的方式激活NF-κB。包括細菌產(chǎn)物(LPS)、一些病毒(HIV-1，HTLV-1)、炎癥細胞因子(TNFα，IL-1)和環(huán)境應(yīng)激。然而對所有的刺激物都相同的是IκB的磷酸化作用和后續(xù)的降解作用。IκB通過最近確定的IκB激酶(IKK-α和IKK-β)而發(fā)生兩個N-端絲氨酸的磷酸化。定向誘變研究表明這些磷酸化作用對后續(xù)的NF-κB激活十分關(guān)鍵，因為一旦磷酸化就標(biāo)志著蛋白質(zhì)經(jīng)由泛激素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。沒有IκB，活性NF-κB復(fù)合物能夠轉(zhuǎn)移至細胞核中，有選擇性地結(jié)合于優(yōu)選的基因獨特性增強子序列上。被NF-κB調(diào)節(jié)的基因是許多細胞因子、細胞粘附分子和急變期蛋白質(zhì)。
已知NF-κB在多種促炎介質(zhì)包括IL-6和IL-8等細胞因子的可調(diào)型表達中發(fā)揮重要作用。細胞粘附分子，如ICAM和VCAM，和可誘導(dǎo)的氧化一氮合酶(iNOS)。這些介質(zhì)已知在炎癥位置的粒細胞補充中起關(guān)鍵作用，在iNOS的情況下在一些炎癥和自身免疫性疾病中可能導(dǎo)致器官損傷。
NF-κB在炎癥病癥中的重要性在氣管炎包括哮喘的研究中得到進一步的證實，其中NF-κB被激活。這種激活源于這些病癥的特異的細胞因子產(chǎn)物和白血球滲透物的增多。而且，已知吸入類固醇可以減輕氣道高反應(yīng)性和抑制哮喘氣道中炎癥應(yīng)答。根據(jù)最近關(guān)于糖皮質(zhì)類固醇抑制NF-κB的發(fā)現(xiàn)，可以推測這些效應(yīng)是通過NF-κB的抑制而介導(dǎo)的。
更多關(guān)于NF-κB在炎癥病癥中的作用的證據(jù)來源于風(fēng)濕病樣滑膜的研究。雖然NF-κB通常作為一種惰性的細胞質(zhì)復(fù)合物，但是近來免疫組織化學(xué)研究表明NF-κB存在于細胞核中，因此在細胞中包括風(fēng)濕病樣滑膜細胞中是有活性的。此外，NF-κB在人類滑膜細胞中對TNF-α的刺激產(chǎn)生響應(yīng)而被活化。如此分布可能是這些組織特異性的細胞因子和類花生酸產(chǎn)物增加的根本機制。參見Roshak，A.K.等，J.Biol.Chem.，271，31496-31501(1996)。
NF-κB/Re1和IκB蛋白還可能在致瘤性轉(zhuǎn)化中起重要作用。由于過度表達、基因增殖、基因重排或易位，家族成員在體外和體內(nèi)伴隨著細胞轉(zhuǎn)化。而且，在某些人類淋巴瘤中這種編碼這些蛋白質(zhì)的基因發(fā)生重排和/或增殖的幾率為20-25％。此外，已經(jīng)報道了NF-κB在調(diào)節(jié)細胞凋亡中的作用，強化了該轉(zhuǎn)錄因子在控制細胞增殖中的作用。
近十年前曾鑒定出水楊酸鈉及其半合成衍生物阿司匹林的Kopp&Ghosh報道了第一個植物衍生的NF-κB調(diào)節(jié)者。在此發(fā)現(xiàn)之后，許多不同化學(xué)類別的新的天然產(chǎn)物被證實具有NF-κB抑制活性。
在文獻C.Wahl等J.Clin.Invest.101(5)，1163-1174(1998)，R.W.Sullivan等J.Med.Chem.41，413-419(1998)，J.W.Pierce等J.Biol.Chem.272，21096-21103(1997)中描述了一些NF-κB抑制劑。已知海洋天然產(chǎn)物hymenialdisine能夠抑制NF-κB，Roshak，A.等JPET，283，955-961(1997)，Breton，J.J和Chabot-Fletcher，M.C.，JPET，282，459-466(1997)。水楊苯胺類是已知的化合物，在M.T.Clark，R.A.Coburn.R.T.Evans，R.J.Genco，J.Med.Chem.，1986，29，25-29中有所描述。
最近，抑制NF-κB的重要機制暗示過氧化物酶體受體的可能的激活作用。
已知作為“過氧化物酶體增殖子激活受體”(PPARs)的過氧化物酶體受體[注意該術(shù)語的常規(guī)應(yīng)用，在科學(xué)界以縮略語表示，該縮略語用于標(biāo)識該受體]涉及自身免疫性疾病和其它疾病，如糖尿病、心血管和胃腸疾病以及阿爾茨海默病。目前用于PPARγ拮抗劑的藥劑仍然處于試驗期，由于其作用機制而導(dǎo)致了對人類健康不利的明顯副作用。因此，為了預(yù)防、治療和/或緩和上述的疾病或病癥需要開發(fā)出新的毒性更小的能夠更精確地調(diào)整這些受體的藥劑。
這種新的組合物更加精確地調(diào)節(jié)這些受體，因此能夠更有效地預(yù)防、治療和/或緩和自身免疫性疾病，而不引起對患者不利的副作用。
過氧化物酶體增殖子活化受體(PPARs)是細胞核激素受體超家族中的成員，是調(diào)節(jié)基因表達的配體活化轉(zhuǎn)錄因子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PPARs的多種亞型。包括PPARα、PPARβ或NUC1、PPARγ和PPARδ。
PPARγ固有的特征是作為脂肪細胞分化和脂類代謝的重要調(diào)節(jié)者。PPARγ的表達被不同啟動因子引導(dǎo)，產(chǎn)生三種PPARγ異構(gòu)型?，F(xiàn)在已經(jīng)明確PPARγ也存在于其它的細胞類型中，包括成纖維細胞、肌細胞、乳腺細胞、大鼠脾臟的白髓和紅髓、人類骨髓前體以及巨噬細胞/單核細胞。此外，PPARγ還出現(xiàn)在動脈粥樣硬化斑塊巨噬泡沫細胞中。一類抗糖尿病藥噻唑烷二酮類對PPARγ配體具有高親和力說明PPARγ在葡萄糖代謝中起重要作用。噻唑烷二酮類最初由于在胰島素抵抗嚙齒動物模型中能夠降低葡萄糖水平(和循環(huán)脂肪酸水平)而用于治療2型糖尿病。噻唑烷二酮類通過與PPARγ直接相互作用而調(diào)節(jié)其療效的發(fā)現(xiàn)確立了PPARγ是葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑。雖然最初被描述為脂類和葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)劑，但是最近PPARγ也被證明在細胞增殖和惡性腫瘤中發(fā)揮作用。PPARγ配體已顯示出介導(dǎo)對細胞增殖和惡性腫瘤的正的和負的效應(yīng)。
除了噻唑烷二酮類抗糖尿病藥外，許多非甾體抗炎藥也具有PPARγ配體功能，盡管后者親和力相對較低。
前列腺素D2(PGD2)脫水產(chǎn)物PGJ2是已發(fā)現(xiàn)的第一個內(nèi)源性PPARγ配體。其它的PGD2脫水產(chǎn)物，15-去氧-Δ12，14-PGJ2(15d-PGJ2)也是一種天然存在的物質(zhì)，能夠直接與PPARγ結(jié)合，是一種使PPARγ活化的有效配體。
將PPARs和巨噬細胞聯(lián)系在一起的最早發(fā)現(xiàn)之一是PPARγ在人類和鼠類粥樣硬化病變的巨噬細胞衍生的泡沫細胞中高度表達。后來，證實了PPARγ在人類和鼠類單核細胞/巨噬細胞中表達。從功能上，已經(jīng)表明PPARγ在單核細胞的分化和激活以及在炎癥活性調(diào)節(jié)中起重要作用。
許多研究證實PPARγ配體抑制巨噬細胞-炎癥應(yīng)答。用人類和鼠類單核細胞/巨噬細胞以及單核細胞/巨噬細胞系已經(jīng)證明了PPARγ活化的抗炎效應(yīng)。巨噬細胞的活化通常導(dǎo)致一些不同的促炎癥介質(zhì)的分泌。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用15d-PGJ2或者噻唑烷二酮類治療可以抑制許多介質(zhì)(如明膠酶B、IL-6、THF-α和IL-1β)的分泌，還可以降低可誘導(dǎo)NOS(iNOS)的誘導(dǎo)表達以及清除受體-A基因的轉(zhuǎn)錄。
在幾種人類自身免疫疾病和自身免疫疾病的動物模型中研究了PPARγ的關(guān)聯(lián)性。Kawahito等證實在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者中滑液組織表達PPARγ。發(fā)現(xiàn)了PPARγ在巨噬細胞中高度表達，在滑液-內(nèi)層成纖維細胞和ECs中中度表達。在體外，PPARγ被15d-PGJ2和曲格列酮活化從而誘導(dǎo)了滑膜細胞細胞凋亡。
已經(jīng)提示PPARγ在新分離出來的T細胞中是機能相關(guān)的，或者在激活早期是機能相關(guān)的。該研究還證實兩種PPARγ配體介導(dǎo)T-細胞克隆分泌IL-2的抑制作用，而不抑制IL-2誘導(dǎo)的這些克隆的增殖。
一些研究考察了PPARγ配體在修飾自身免疫疾病動物模型中的作用。Su等證明在炎癥性腸病小鼠模型中噻唑烷二酮類顯著減輕結(jié)腸炎癥。表明這種效應(yīng)可能是直接作用于結(jié)腸上皮細胞的結(jié)果，該上皮細胞表達了高水平的PPARγ并能夠產(chǎn)生炎性細胞因子。Kawahito等證明腹膜內(nèi)施用PPAR配體、15d-PGJ2和曲格列酮改善佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎。Nino等考察了噻唑烷二酮對實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎的作用，發(fā)現(xiàn)這種治療減輕了炎癥并在多發(fā)性硬化癥小鼠模型中減少了臨床癥狀。最后，Reilly等證明腎小球系膜細胞在狼瘡性腎炎中是炎癥應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)者，一旦被激活將分泌炎癥介質(zhì)包括NO和環(huán)氧合酶產(chǎn)物，因此持續(xù)局部的炎癥應(yīng)答。綜合上述研究，PPARs的相關(guān)性和PPAR激動劑在炎癥和自身免疫性致病機理導(dǎo)致疾病中的治療應(yīng)用或許將繼續(xù)為一個研究焦點。
最近，15d-PGJ2對于PPARγ特異性的問題至少已被部分澄清。NF-κB是與炎癥和免疫有關(guān)的基因的關(guān)鍵激活子。在這種激活作用中，IκB激酶復(fù)合物(IKK)磷酸化NF-κB抑制劑(IκB蛋白)導(dǎo)致其與泛激素(ubiquitin)結(jié)合繼而被蛋白體降解。這使游離的NF-κB二聚體轉(zhuǎn)移至細胞核中，誘導(dǎo)靶基因。Rossi等證實環(huán)戊酮PGs包括15d-PGJ2直接抑制和修飾IKK亞單位IKK2。因此防止了抑制性IκB蛋白的磷酸化，使這些蛋白質(zhì)靶向于泛激素的結(jié)合和降解。繼而防止NF-κB的激活。同樣，Castrillo等表示在用LPS和IFN-α處理的RAW264.7巨噬細胞中，用15d-PGJ2孵化導(dǎo)致對IKK2活性的明顯抑制并且抑制了抑制性IκB蛋白的降解。這將部分地抑制NF-κB的活性，破壞需要NF-κB激活作用的基因的表達，如2型NOS和環(huán)氧化酶2。
因此，可以推斷PPARγ和NF-κB是自身免疫疾病中的重要介質(zhì)，這將促使制藥企業(yè)去尋找能夠作用于這些介質(zhì)的新的選擇性藥物和藥品。
另一方面，阿爾茨海默疾病(AD)的特征是腦中的β淀粉狀蛋白原纖維在細胞外沉積，激活了淀粉樣蛋白斑有關(guān)的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞。激活的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞繼而分泌多種炎性產(chǎn)物。Kitamura等使用特異性抗體測定了正常人和AD患者腦中的PPARγ和COX-1、COX-2，發(fā)現(xiàn)這些部分在AD患者腦中的表達增加。非甾體抗炎藥(NSAIDs)能夠有效降低AD發(fā)病率和發(fā)病危險，延遲疾病進程。Combs等證實NSAIDs、噻唑烷二酮類和PGJ2都是PPARγ的激動劑，抑制β淀粉狀蛋白受激而導(dǎo)致的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和單核細胞分泌炎性產(chǎn)物。PPARγ激動劑抑制β-淀粉狀蛋白刺激的IL-6和TNF-α的基因的表達以及COX-2的表達。Heneka等證實向大鼠小腦中顯微注射LPS和IFN-α誘導(dǎo)小腦顆粒細胞中iNOS的表達，進而導(dǎo)致細胞死亡。共同注射PPARγ激動劑(包括曲格列酮和15d-PGJ2)誘導(dǎo)iNOS表達和細胞死亡，而共同注射選擇性COX抑制劑沒有這種效果。總的來說，對AD的研究表明PPARγ激動劑能夠調(diào)整腦中的炎癥應(yīng)答，NSAIDs對PPARγ有效因而對治療AD有益。
鑒于之前所披露的信息可以得出結(jié)論至今仍然沒有從藥用植物中分離出PPARγ激動劑的前體?，F(xiàn)在，仍無具有這種性質(zhì)的藥物、組合物或藥品能夠治療自身免疫性疾病。
而這種新的組合物能夠減少在自身免疫性疾病和神經(jīng)變性疾病中增多的致炎細胞因子產(chǎn)物。
另外，本發(fā)明的組合物毒性低，沒有顯示出任何有害副作用。
綜合目前的現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員無法推斷出所述組合物的應(yīng)用，其中所述組合物具有的性質(zhì)適用于上述疾病，能夠維持免疫耐受性，不引起目前用于治療這些疾病的其它藥物所發(fā)生的副作用。
穿心蓮Andrographis paniculata(Nees)是爵床科藥用植物，產(chǎn)自亞洲的印度、馬來群島、中國、韓國等地。由于具有有益作用，因而在這些國家中其新鮮和干燥植物或其成分被廣泛用于多種疾病，如普通感冒、肝病、糖尿病等。
附圖簡述

圖1表示使用FURA2-AM指示劑標(biāo)記的HL-60細胞通過340/380nm測定出的PAF誘導(dǎo)的鈣取代的典型圖。細胞在單獨存在維甲酸或者維甲酸與實施例1-2描述的本發(fā)明組合物(下文公開)(3.5μg/mL)共同存在的情況下分化。
圖2是描述由包含PPARγ啟動子的載體所轉(zhuǎn)染的HL-60細胞中螢蟲素酶的相對活性以及本發(fā)明的組合物效果的柱形圖。
圖3是表示本發(fā)明組合物抑制由刀豆素CONA激活的T細胞中的IL-2和INF-γ濃度的柱形圖。
圖4表示本發(fā)明組合物抑制IκBα的降解，柱形圖表示本發(fā)明組合物對包含NFκB啟動子的載體所轉(zhuǎn)染的HL-60細胞中螢蟲素酶相對活性的抑制百分比。
圖5是表示體外用硫磺素染色而觀察到的本發(fā)明組合物對β淀粉狀蛋白形成的抑制作用的顯微照片。
發(fā)明詳述本申請描述了一種新的組合物，它是用本文公開的步驟從穿心蓮中提取的穿心蓮內(nèi)酯類(andrographolides)混合物，能夠誘導(dǎo)PPAR-γ的激動作用，抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活。
穿心蓮內(nèi)酯類組合物的描述本申請請求保護的組合物包括半日花烷型二萜類的混合物，得自穿心蓮干燥提取物，具有如下通式C20H30O5穿心蓮內(nèi)酯C20H30O414-去氧穿心蓮內(nèi)酯C26H41O8新穿心蓮內(nèi)酯。
這些穿心蓮內(nèi)酯化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和性質(zhì)如下-穿心蓮內(nèi)酯i.通式C20H30O5
ii.分子量350.46iii.分子命名3-[2-[十氫-6-羥基-5-(羥基-甲基)-5，ha-二甲基-2-亞甲基-1-萘基]亞乙基]二-氫-4-羥基-2(3h)-呋喃酮。
iv.分子結(jié)構(gòu)式 -14-去氧穿心蓮內(nèi)酯i.通式C20H30O4ii.分子量336.46iii.分子結(jié)構(gòu)式 -新穿心蓮內(nèi)酯i.通式C20H41O8ii.分子量326.46iii.分子結(jié)構(gòu)式
本發(fā)明組合物通常由下述穿心蓮內(nèi)酯類的混合物組成穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯。其中所述的單個組分在干提取物的含量為穿心蓮內(nèi)酯大約20-40％w/w，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯大約3-6％w/w，新穿心蓮內(nèi)酯大約0.2-0.8％w/w。終提物中這些組分的優(yōu)選含量為穿心蓮內(nèi)酯大約25-35％w/w，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯大約4.5-5.5％w/w，新穿心蓮內(nèi)酯大約0.4-0.8％w/w.
在一個比較優(yōu)選的實施方案中，新的提取物包含穿心蓮內(nèi)酯 24.6％14-去氧穿心蓮內(nèi)酯4.8％新穿心蓮內(nèi)酯 0.6％。
所述處方可以制備成與藥學(xué)可接受載體組合的藥物，如片劑，以穿心蓮內(nèi)酯類混合物大約1-6.5mg/kg BW/天的劑量給藥。
a)每天1-5mg穿心蓮內(nèi)酯/kgb)每天0.2-1mg14-去氧穿心蓮內(nèi)酯/kgc)每天0.02-0.12mg新穿心蓮內(nèi)酯/kg。
本文公開的實施例能夠有效地治療前述的自身免疫性疾病以及阿爾茨海默疾病，而不影響其它的處方和給藥方案。
因此當(dāng)以片劑形式以及上述指示劑量給藥時，組合物及其藥物制劑特別提供了一種治療多種自身免疫性疾病如炎癥，特別是糖尿病、炎癥性腸病、自身免疫性疾病(紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的醫(yī)藥品。
由于其作用機理，本文公開的化合物和藥物組合物還能夠治療AIDS和組織器官排異反應(yīng)。
由本發(fā)明組合物特別是具體披露的處方而制備的藥物組合物可以為經(jīng)腸、胃腸道外、皮膚、眼睛、鼻、耳、直腸、陰道、尿道、頰、咽-氣管-支氣管給藥的劑型。
穿心蓮內(nèi)酯原料的制備和分析方法活性成分穿心蓮Andrographis paniculataNees(Burm.f.)科 爵床科用藥部位草。
在發(fā)明者監(jiān)控下種植的植物的葉、莖及更上部包括種子經(jīng)日曬晾干。手工除去雜質(zhì)，原料切成1-1.5cm長的段，儲存于通風(fēng)處。進行常規(guī)分析以評價其同一性依照歐洲藥典進行放大鏡和顯微鏡分析、感觀分析和TLC分析(薄層色譜法)。
獲得穿心蓮干提取物的方法穿心蓮的提取方法是用第1部分中的極性溶劑連續(xù)滲濾粉碎的干燥植物(地上部分)。
經(jīng)分析的藥物原料在刀-錘研磨機(0.8cm2)中粉碎至適宜的粒度。將粉碎的原料裝入不銹鋼滲濾器中，加入50℃的萃取溶劑。滲濾時間大約為6天(6×24小時)進行兩個萃取循環(huán)。滲濾液收集在不銹鋼桶中直至滲濾完成。滲濾液直接轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)單元中以除去溶劑和大部分的水。蒸發(fā)在LUWA薄膜蒸發(fā)儀中于140-158(60-70℃)真空度0.65-0.85巴條件下進行。蒸發(fā)過程進行3-4個循環(huán)，每天30分鐘共4次，萃取物以混合狀態(tài)保存。當(dāng)濃縮提取物中還含有一定量水分時進行如下分析灰分含量、HCL-灰分、干燥失重、pH值、TLC鑒定和HPLC(高效液相色譜法)，分析穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯。然后濃縮提取物轉(zhuǎn)移至真空干燥箱中。干燥前，最終的干燥提取物包裹于塑料袋中，置于纖維筒中以進行后續(xù)的分析。
制備穿心蓮30％提取物的方法將從發(fā)明者直接控制的農(nóng)田中得到的穿心蓮的葉/莖切割并篩分。地上部分進行上述的分析鑒定，然后萃取。
地上部分置于不銹鋼提取容器中真空下用低極性的溶劑(A)如正己烷或氯仿提取。連續(xù)萃取后，除去溶劑，用具有較高極性的第二種溶劑(B)如石油醚40∶60或者乙酸乙酯處理殘渣，一次萃取后除去溶劑，殘渣用更高極性的溶劑(C)如乙醇或水處理。
恢復(fù)第三種溶劑并蒸發(fā)至余下含30-40％水分物質(zhì)，殘渣用前面描述的低極性溶劑處理，過濾該物質(zhì)并在真空下干燥直至含水量小于5％。顆粒磨成細粉，以穿心蓮內(nèi)酯計不少于30％的半日花烷型二萜類。
萃取詳述第1步將精細切碎的穿心蓮葉/莖裝入有3-5倍w/w量溶劑A的SS反應(yīng)器中。
第2步藥材反復(fù)萃取4-6小時，除去溶劑。
第3步用比溶劑A極性高的溶劑B處理殘渣，一次萃取3-5小時。
第4步除去溶劑B，殘渣用比溶劑A或B極性高的溶劑C萃取。
第5步溶劑C在殘渣中流通3-5小時，將SS蒸發(fā)儀上抽真空除去溶劑，殘渣再用溶劑C萃取，此過程重復(fù)3-4次。
第6步從洗脫液中除去溶劑C，合并得到的團塊。
第7步第4-7步得到的團塊用溶劑A或B處理，殘渣在溫度不超過60℃真空下干燥。
第8步第7步得到的干燥團塊用具有不銹鋼結(jié)網(wǎng)的GMP研磨機在100-200ASTM下磨粉。
第9步第8步得到的粉末通過自動濾篩篩分，直接裝入可迅速密封的滅菌的PP袋。
上述得到的粉末用本文所述的實驗設(shè)計進行分析，終提物中含有25-35％w/w穿心蓮內(nèi)酯，大約4.5-5.5％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯，大約0.4-0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
穿心蓮的鑒定——TLC
試驗溶液向1g草藥提取物中加入20mL甲醇，振搖大約1小時，通過濾器倒出甲醇。殘渣加入20mL甲醇振搖，過濾，與第一次的萃取液混合(得到40mL試驗溶液)。
參比溶液1穿心蓮內(nèi)酯(A)、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯(DA)和新穿心蓮內(nèi)酯(NA)溶于甲醇。2用與試驗提取物相同的方法處理參比提取物。20-30μL試驗溶液上樣于TLC-板上(硅膠GF254作為涂層物質(zhì))，用77體積的乙酸乙酯、15體積的甲醇和8體積的水混合物(77∶15∶8)展開15cm以上。隨后，在空氣中干燥薄層色譜板，在UV(254nM)下檢測。色譜板上的幾個黑斑符合穿心蓮內(nèi)酯Rf0.65-0.7，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯Rf0.75-0.8，新穿心蓮內(nèi)酯Rf0.60-0.65。
半日花烷型二萜類的HPLC定量方法用丙酮(4∶1)萃取三種化合物，然后用反相RP-C18 licrospher柱(4*125mm)HPLC分析。按照Burgos等1999，Acta Hort.(ISHS)50183-86所述，流動相由乙腈26％和磷酸0.5％組成，流速為1.1mL/min，在228nm下檢測。
穿心蓮干提取物的標(biāo)準(zhǔn)為最低含有30％總穿心蓮內(nèi)酯，包括大約20-40％w/w穿心蓮內(nèi)酯、3-6％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和0.2-0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
本發(fā)明的組合物沒有被目前的現(xiàn)有技術(shù)所公開，沒有教導(dǎo)用相同的組合物解決關(guān)于自身免疫性疾病和AD的方法學(xué)問題。
本發(fā)明的組合物可以口服或經(jīng)胃腸外給藥，胃腸外給藥包括靜脈注射、皮下注射、肌內(nèi)注射和動脈內(nèi)注射。
本發(fā)明藥物組合物的適宜劑量將依據(jù)特定的處方、用法、患者的年齡、體重和性別、飲食、患者疾病狀況、輔助藥物和副作用等而改變。可以理解普通的專業(yè)醫(yī)生能夠很容易地確定該藥物化合物的適宜劑量，并開處方。該藥物組合物的優(yōu)選日劑量為每公斤體重1-6.5mg穿心蓮內(nèi)酯類混合物。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)，可以與藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑一起制備本發(fā)明的藥物組合物，如單位劑型。制劑的非限定性例子包括，但不限定于，滅菌溶液、溶液、混懸液或乳劑、提取液、酏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、搽劑、洗劑和軟膏劑。
本發(fā)明還包括含有穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯半日花烷型化合物與通常用于制備組合物的藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明藥物組合物中，藥學(xué)可接受的載體可以是制備藥物制劑常用的任意一種，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素(HPMC)、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油，但是不限定于這些。另外，本發(fā)明的藥物組合物可以含有任意一種潤濕劑、甜味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、矯味劑、芳香劑、潤滑劑或這些物質(zhì)的混合物。
通常，組合物含有20-40％，優(yōu)選25-35％，最優(yōu)選30％w/w的穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯半日花烷的混合物，以及藥學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)口服途徑單劑量或者分份劑量施用于有需要的哺乳動物。因此，對于口服給藥而言，化合物可以與適宜固體載體組合形成膠囊、片劑、粉末劑。另外，藥物組合物可以含有其它組分如調(diào)味劑、甜味劑、賦形劑等等。
另外，本發(fā)明還提供一種用含有穿心蓮內(nèi)酯類混合物的組合物治療患者的方法，包括為有需要的患者靜脈內(nèi)施用包含本發(fā)明組合物的溶液以及經(jīng)口服施用含有本發(fā)明組合物的片劑。注射溶液劑的優(yōu)選劑量是大約60-210mg/天，最優(yōu)選60-80mg/天組合物，每天注射1、2或3次。
每毫升該注射溶液劑中大約含有8-16mg組合物。給藥時，組合物優(yōu)選用0.9％生理鹽水稀釋至大約1∶5至1∶10體積。
下面的實施例僅用于說明，而不限定本發(fā)明的范圍。那些技術(shù)人員能夠想到的合理的變化也不排除在本發(fā)明的范圍之外。
本發(fā)明的藥物組合物既適合小量的測定制備，也適于大規(guī)模的制藥企業(yè)制備。按照制藥工業(yè)的常規(guī)技術(shù)包括濕法制粒、干法制粒、直接壓片、流化床制粒，當(dāng)需要時，制備片劑，或者其它適宜的方法得到預(yù)期的口服或胃腸道外給藥的產(chǎn)品。
下面實施例中的百分比均以重量表示。
實施例制備包含活性劑的片劑的典型方法的實例為首先將活性劑與粘合劑如明膠、乙基纖維素等等混合?；旌线^程適宜在標(biāo)準(zhǔn)的V-攪拌機中通常是無水條件下進行。接下來，剛剛制備的混合物用普通壓片機預(yù)壓，預(yù)壓片制備為片劑。用適宜的包衣材料如蟲膠、甲基纖維素、巴西棕櫚蠟、苯乙烯-馬來酸共聚物等等包衣新制備的片劑。
用上述公開的本領(lǐng)域公知的制造技術(shù)和Remington的Pharmaceutical Science，第39章，Mack出版公司1965中的方法制備口服給藥的包含30mg直至40mg的穿心蓮內(nèi)酯混合物的壓制片。
本發(fā)明處方的優(yōu)選的藥物組合物如下面實施例所示。
實施例1以草藥穿心蓮Andrographis panculata Nees.中得到的干提取物為藥物組合物制備本發(fā)明的片劑，干提取物中含有穿心蓮內(nèi)酯混合物。
制備片劑是將干提取物(穿心蓮內(nèi)酯混合物)活性化合物、土豆淀粉、滑石粉、明膠、羥丙甲基纖維素、無水二氧化硅、聚乙二醇和碳酸鈣在干燥條件下在常規(guī)的V-攪拌機中混合直至所有成分混合均勻。然后混合物通過標(biāo)準(zhǔn)光篩，在無水環(huán)境中干燥，然后與硬脂酸鎂混合，壓片，用蟲膠包衣。其它包含116-162mg的片劑以類似的方式制備。
實施例2以草藥穿心蓮Andrographis panculata Nees.中得到的干提取物為藥物組合物制備本發(fā)明的膠囊。
制備口服使用的包含30mg至40mg穿心蓮內(nèi)酯混合物的膠囊，基本上是將干提取物(穿心蓮內(nèi)酯混合物)與載體混合，包封于聚合物通常是明膠等的囊殼中。膠囊可以是本領(lǐng)域已知的軟膠囊，即包裹的化合物直接分散于可食用的相容的載體中，也可以是硬膠囊，基本上由無毒的固體如滑石粉、硬脂酸鈣、碳酸鈣等與新組合物混合而成。根據(jù)治療的適應(yīng)癥通常使用含30mg或40mg的膠囊。
單劑量、多劑量給藥劑量或者每日劑量均依據(jù)使用的本發(fā)明化合物不同而改變，因為化合物的效力、給藥途徑的選擇、患者的體型及疾病的性質(zhì)都是不同的。一般口服給藥劑量是每天80-160mg，正常的口服劑量為120mg，每日給藥3次；通常靜脈內(nèi)給藥劑量為60-80mg，如果有指示則在隨后期間內(nèi)給藥70-100mg，通常的肌內(nèi)注射劑量為每24小時70-100mg，每日注射1-2次。
由于具有理想的生理學(xué)效應(yīng)，本發(fā)明的包含干提取物(包含穿心蓮內(nèi)酯混合物)的新的有用的藥物組合物可以從遞藥系統(tǒng)如皮膚遞藥系統(tǒng)、胃腸遞藥系統(tǒng)等給藥以產(chǎn)生預(yù)期的生理學(xué)效應(yīng)，其中遞藥裝置由天然和合成的聚合物材料制成。構(gòu)造含控制給藥化合物的遞藥系統(tǒng)的典型的材料包括聚氯乙烯、聚異戊二烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚二甲基硅氧烷、丙烯酸酯和異丁烯酸酯的親水性水凝膠、聚醋酸乙烯酯、丙烯乙烯乙酸酯共聚物等等。
實施例N°3對于片劑按照制藥工業(yè)常規(guī)的技術(shù)制備包含上述組合物的蟲膠包衣片劑的方法包括在必要時進行混合、制粒、壓片。
實施例1中的特定的組合物與足夠量的穿心蓮干提取物完全混合。為了制備包含穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯的片劑，將混合物直接與實施例N°1中提及的非活性成分一起壓片，然而用蟲膠包衣。
實施例N°4組合物誘導(dǎo)的HL-60細胞分化化學(xué)試劑May Grunwald-Giemsa，NBT，維甲酸，細胞松弛素B，青霉素，鏈霉素，谷氨酰胺，胎牛血清(Sigma)。RPMI1640(GIBCO)、胎牛血清購自Boehringer Mannheim，全反式維甲酸和穿心蓮內(nèi)酯購自Aldrich。其它分離物由印度的Amsar Pvt.有限公司提供。FURA2-AM購自Molecular Probes(USA)。四唑氮藍購自Sigma。
細胞培養(yǎng)HL-60細胞在補充20％熱滅活胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100pg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中在37℃含有5％CO2的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)。細胞以3×105個細胞/mL每周接種兩次。單獨加入100nM全反式維甲酸或者與組合物(17.5μg/mL)一起誘導(dǎo)分化，在梅格吉染色后評價形態(tài)學(xué)的改變和減少NBT’(11)的能力。未分化的培養(yǎng)物含有3％以下的NBT陽性細胞。在用維甲酸處理5天后研究分化的培養(yǎng)物。
鈣測量[Ca2+]c將HL-60粒細胞(2×107/mL)保存在37℃含有2μM fura-2/AM的加入0.1％胎牛血清的Ca2+培養(yǎng)基中45分鐘，然后稀釋至107細胞/mL，冰存。臨用前，離心0.5mL該細胞混懸液，在包含5μg/mL細胞松弛素B的2.4mL指示培養(yǎng)基中重新懸浮。在恒溫的小杯(37℃)(LS55熒光計，Perkin-Elmer公司)中于340和380nm激發(fā)波長和505nm發(fā)射波長下測定Fura-2熒光(F)。
實施例N°5用組合物抑制T細胞中IL-2和IFN-γ產(chǎn)物。
化學(xué)試劑刀豆素A和RPMI1640培養(yǎng)基購自Sigma。
細胞培養(yǎng)Rochefeller小鼠用乙醚處死，將腘神經(jīng)節(jié)和脾置于盛有5mL培養(yǎng)基RPMI1640的Petri盤中。將這些器官在RPMI1640無菌溶液中破碎以獲得淋巴細胞，將淋巴細胞重新懸浮在1mLRPMI1640培養(yǎng)基中，用Neubauer管定量。最后，淋巴細胞懸浮液的濃度調(diào)節(jié)到每mLRPMI中含有4×106個細胞。完成后，淋巴細胞就在存在或不存在組合物的情況下培養(yǎng)。為此，24孔聚苯乙烯培養(yǎng)皿(每孔2mL)中包含1mL細胞和不同濃度的組合物以及1mL有絲分裂原劑刀豆素A(CONA，0μg/mL和10μg/mL)。
培養(yǎng)皿在37℃恒溫箱濕度5％和CO2環(huán)境中孵化24小時，然后每個加入2mL的樣品，以3200rpm離心1分鐘。然后將細胞冷凍成0.6mL部分，用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)檢測細胞因子。
IL-2和IFN-γ的ELISA化學(xué)試劑IL-2和IFN-γ購自Pharmingen；TNB購自Pierce；H2O2和H2SO4購自Merck。
為了測定細胞因子(IL-2和IFN)，使用能夠捕獲抗原的第一抗體，能夠與過氧化酶軛合的第二抗體和用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用ELISA“高結(jié)合”的96孔聚苯乙烯皿。每孔100μL的第一抗體用pH9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋以幫助吸附于孔上，于4℃孵化過夜，以保證結(jié)合到固體部分。然后移出孔中的內(nèi)容物，每孔用300μLTween20，0.05％p/v和PBS pH7.0清洗三次。然后孔中填充200μL無脂肪牛奶和PBS，室溫孵化1小時。完成之后，如上所述移出孔中內(nèi)容物，清洗。然后，加入包含抗原的測試樣品，每孔100μl，兩個復(fù)孔，和對細胞因子特異的校正曲線，并在室溫孵育2小時。然后按上一實驗方法移去孔中內(nèi)容物并清洗5次。然后加入與過氧化酶軛合的第二抗體，每孔用10％PBS和SBF溶液稀釋，每孔加100μL，在室溫下放置1小時。然后，清洗7次，每孔用100μLTMB和H2O2溶液顯色，暗處培養(yǎng)30分鐘，每孔加入50μL2M的H2SO4終止反應(yīng)。用ELISA 450ηm濾光片測定反應(yīng)產(chǎn)物(E1x800萬能Microplate Reader，BioteK)。
實施例N°6用組合物激活PPAR-γ受體。
化學(xué)試劑二甲基亞砜購自Merck。其它所有試劑均購自PROMEGA。
轉(zhuǎn)錄測定用pCMX-hPPARγ1、細胞巨化病毒啟動因子控制下的人類PPARγ1表達載體轉(zhuǎn)染HL-60細胞。
測定螢蟲素酶和β-半乳糖苷酶活性；螢蟲素酶活性被標(biāo)準(zhǔn)化為HL-60中標(biāo)準(zhǔn)的β-半乳糖苷酶。
質(zhì)粒表達GAL4-DNA結(jié)合區(qū)域(DBD)和mPPARγ配體結(jié)合區(qū)域的質(zhì)粒(pGAL4DBD-mPPARr)由插入小鼠的PPARγ1配體結(jié)合域(氨基酸162-475)構(gòu)成，作為ScaI/BamHI片段從pGBTmPPARγ1結(jié)構(gòu)內(nèi)分離成pCMXGa 14 DBD。
用DMSO或者17.5μg/mL本發(fā)明組合物處理細胞，用化學(xué)發(fā)光法測定螢蟲素酶活性。
實施例N°7組合物在中性粒細胞中抑制NF-κB。
化學(xué)試劑二甲基亞砜(DMSO)購自Merck；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco，USA；四唑氮藍購自Sigma，pRLTK，pGL3和二元-螢蟲素酶受體測定系統(tǒng)(promega)；Fugene6購自Roche；細胞培養(yǎng)使用從急性髓細胞樣白血病中得到的髓樣細胞系HL-60。該細胞可在1.3％二甲基亞砜存在下分化(Santos-Beneit等，2000)。該細胞保存在37℃5％CO2補充了2mM L-谷氨酰胺、10％高溫滅活胎牛血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。用1.3％DMSO孵化4天使該細胞分化為中性粒細胞。分化的細胞用四唑氮藍(NBT)分析。
NFκB-pGL3載體在HL-60細胞中的轉(zhuǎn)染以及螢蟲素酶測定如其它部分中所述，HL-60細胞經(jīng)4天培養(yǎng)分化成中性粒細胞。在第4天，細胞被pGL3-NFκB載體轉(zhuǎn)染，并且使用作為轉(zhuǎn)染內(nèi)控的pRL-TK(Promega)載體，這是一個包含單純性皰疹病毒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶啟動子的表達載體，能夠使Renilia螢蟲素酶水平適度表達。這些載體通過基于脂質(zhì)體(Fugene6，Roche)的系統(tǒng)轉(zhuǎn)染至細胞。一旦轉(zhuǎn)染完成，細胞保存24小時，然后在存在或者不存在本發(fā)明組合物的情況下用PAF或fMLP在不同時間激活。然后，細胞提取物保存在-70℃直至測定螢蟲素酶的活性。使用帶有螢火蟲酶(pGL3)底物和Renilla(pRL)螢蟲素酶的商購二元-螢蟲素酶報告測定系統(tǒng)(Promega)，以化學(xué)發(fā)光法測定螢蟲素酶的活性。
IκBa免疫印跡化學(xué)試劑fMLP、PMSF和PAF購自Calbiochem。Tris、NaCl、NP-40、去氧膽鹽、十二烷基硫酸鈉、iprotease抑制劑和巰基乙醇購自Merck。
中性粒細胞預(yù)孵化10分鐘，然后用fMLP(0.1μM)和PAF(0.1μM)刺激60分鐘。為了分析蛋白質(zhì)，將細胞溶于溶解栓中(50mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％去氧膽鹽，0.1％十二烷基硫酸鈉，1mM Na2VO4，1mM PMSF和10μg/mL de iprotease抑制劑)。蛋白質(zhì)用Bradford方法定量，用聚丙烯酰胺凝膠電泳法在12％變性條件下(SDS/PAGE)重溶解，使電子轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜。用抗IκBα抗體孵化膜，繼而用過氧化酶共軛的第二抗體孵化，最后用化學(xué)發(fā)光法(ECL)觀察。作為凝膠中蛋白質(zhì)含量的對照，抗體用提餾溶液(100mM2-巰基乙醇，2％SDS，62.5mMTris-HCl，pH6.7)處理，用抗肌動蛋白抗體孵化。最后，用獲得的信號進行每種抗體的光密度計分析。
實施例N°8在野生型大鼠中用組合物抑制β-淀粉狀蛋白的形成淀粉狀蛋白的形成為了檢測淀粉狀蛋白的形成使用兩種輔助技術(shù)，硫代黃素-T熒光法(Levine，1993；Soto等，1995；Reyes等，1997，Inestrosa等，2000)和剛果紅結(jié)合法(Alvarez等，1998)。簡而言之，分析硫代黃素-T是基于當(dāng)硫代黃素與淀粉狀蛋白纖維結(jié)合時發(fā)射熒光，當(dāng)用450nm激發(fā)時在482nm的發(fā)射加強。剛果紅分析是測定形成的淀粉狀蛋白量的特異性定量方法?，F(xiàn)在這些技術(shù)用于驗證特異性的淀粉狀蛋白的形成。
實施例9穿心蓮內(nèi)酯組合物中化合物的描述本發(fā)明的典型的組合物是片劑形式的藥物制劑，由下述化合物的混合物構(gòu)成穿心蓮內(nèi)酯 24.6％14-去氧穿心蓮內(nèi)酯4.8％新穿心蓮內(nèi)酯 0.6％為了之后制備不同的藥物制劑，提供下述劑量a)每日1-5mg穿心蓮內(nèi)酯/kgb)每日0.2-1mg14-去氧穿心蓮內(nèi)酯/kgc)每日0.02-0.12mg新穿心蓮內(nèi)酯/kg。
實施例N°10口服給藥治療紅斑狼瘡的臨床效果使用實施例7中的穿心蓮內(nèi)酯類混合物，狼瘡癥狀在給藥3個月后恢復(fù)正常。另外，組合物不影響其它傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥的正常的治療效果。
實施例N°11口服給藥治療多發(fā)性硬化癥的臨床效果使用實施例7中的穿心蓮內(nèi)酯類混合物，疾病癥狀在以本發(fā)明組合物治療3個月后恢復(fù)正常。而且，組合物不影響其它治療。
實施例N°12口服給藥治療關(guān)節(jié)病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床效果單獨使用實施例7中所述的穿心蓮內(nèi)酯組合物，或者同時使用葡糖胺或硫酸軟骨素或者其它抗炎藥，骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)僵硬癥狀都在3個月后恢復(fù)正常。另外，組合物與傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥不同，不會影響這兩種蛋白多糖組分的正常關(guān)節(jié)重建效果。
實施例N°13口服給藥治療糖尿病的臨床效果使用實施例7中描述的穿心蓮內(nèi)酯類混合物，糖水平在5周后恢復(fù)正常。另外，組合物不影響其它降糖藥的正常重建效果。
實施例N°14口服給藥治療AIDS的臨床效果將實施例7中描述的口服制劑給予兩名HIV陽性患者。治療3個月內(nèi)恢復(fù)正常的CD4計數(shù)。
實施例N°15口服給藥治療阿爾茨海默疾病的臨床效果將實施例7中所述的口服制劑給予已被醫(yī)生診斷并經(jīng)獨立檢驗委員會的神經(jīng)學(xué)家確認為阿爾茨海默疾病(AD)早期的患者。臨床試驗前2周，患者進行適當(dāng)?shù)木裆窠?jīng)學(xué)檢驗如細微精神狀態(tài)檢查(MMSE)，阿爾茨海默疾病評價(ADAS)，Boston命名測驗(BNT)和特征試驗(TT)。
神經(jīng)精神測驗在臨床試驗的第0天、6周和3個月重復(fù)進行。試驗由不了解患者治療方案的神經(jīng)精神學(xué)家進行。
在研究開始時患者被隨機指定接受測試制劑或者安慰劑。測試制劑和安慰劑以口服給藥，每日一次或兩次。在研究期間允許進行糖尿病、高血壓的治療。3個觀察期中的每個階段測試試劑和安慰劑的得分進行統(tǒng)計學(xué)比較。在臨床測試期間，測試得分體現(xiàn)出不經(jīng)治療的AD的自然病程明顯惡化。用上述制劑組合物治療的患者情況得到改善，臨床試驗期間患者的得分保持不變或得到改善。
在試驗研究開始時，患者隨機接受組合物或是安慰劑。組合物和安慰劑每日給藥兩次。在試驗期間，患者允許接受糖尿病、高血壓等疾病的治療。所有試驗期間的關(guān)于組合物和安慰劑的結(jié)果進行了統(tǒng)計學(xué)比較。使用了安慰劑的患者可觀察到明顯惡化。以組合物治療的患者在一定程度上改善測試得分。
如上所述，很顯然本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不能輕易的確定本發(fā)明的實質(zhì)特征，在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以進行多種的變化和/或修飾以適應(yīng)多種應(yīng)用和病癥。因此這些變化和修飾是合理的、恰當(dāng)?shù)?、可預(yù)見的，等同于下列權(quán)利要求的全部范圍。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.含有從植物穿心蓮干燥提取物中得到的具有下述通式的半日花烷型二萜類混合物的組合物C20H30O5穿心蓮內(nèi)酯C20H30O414-去氧穿心蓮內(nèi)酯C26H41O8新穿心蓮內(nèi)酯其中半日花烷型二萜類混合物中各二萜類半日花烷存在量為大約20-大約40％w/w穿心蓮內(nèi)酯，大約3-大約6％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和大約0.2-大約0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
2.按照權(quán)利要求1的組合物，其中穿心蓮內(nèi)酯成分的特征是i.)通式C20H30O5ii.)分子量350.46iii.)分子命名3-[2-[十氫-6-羥基-5-(羥基甲基)-5，ha-二甲基-2-亞甲基-1-萘基]亞乙基]-二氫-4-羥基-2(3h)-呋喃酮iv.)分子結(jié)構(gòu) 3.按照權(quán)利要求1的組合物，其中14-去氧穿心蓮內(nèi)酯組分的特征是i.)通式C20H30O4ii.)分子量336.46iii.)分子命名
iv.)分子結(jié)構(gòu) 4.按照權(quán)利要求1的組合物，其中新穿心蓮內(nèi)酯組分的特征是i.)通式C26H41O8ii.)分子量345.89iii.)分子命名iv.)分子結(jié)構(gòu) 5.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備醫(yī)藥品、藥物、藥劑的用途。
6.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于治療自身免疫性疾病的藥物的用途。
7.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。
8.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療lupusexanthematous的藥物的用途。
9.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療多發(fā)性硬化癥的藥物的用途。
10.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的藥物的用途。
11.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)的藥物的用途。
12.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療牛皮癬的藥物的用途。
13.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療全身性皮肌炎的藥物的用途。
14.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。
15.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的藥物的用途。
16.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于治療糖尿病的藥物的用途。
17.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于治療組織和器官移植患者的排異反應(yīng)的藥物的用途。
18.藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求1的組合物和藥學(xué)可接受的載體。
19.按照權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于各種半日花烷型二萜存在量為大約25-35％w/w穿心蓮內(nèi)酯，大約4.5-大約5.5％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和大約0.4-大約0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
20.按照權(quán)利要求19的藥物組合物，其特征在于各種半日花烷型二萜存在量為24.6％w/w穿心蓮內(nèi)酯，4.8％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和0.6％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
21.按照權(quán)利要求18-20任一項的藥物組合物，其特征在于其為片劑藥物制劑形式。
22.按照權(quán)利要求21的藥物組合物，其特征在于以下述劑量口服給予下述分子a)每日1-5mg穿心蓮內(nèi)酯/kg；b)每日0.02-0.5mg14-去氧穿心蓮內(nèi)酯/kg；c)每日0.001-0.02mg新穿心蓮內(nèi)酯/kg。
23.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療自身免疫性疾病的用途。
24.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。
25.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療lupusexanthematous的用途。
26.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療多發(fā)性硬化癥的用途。
27.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的用途。
28.按照權(quán)利要求21或22的組合物用于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)的用途。
29.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療牛皮癬的用途。
30.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療全身性皮肌炎的用途。
31.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療骨關(guān)節(jié)炎的用途。
32.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的用途。
33.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療糖尿病的用途。
34.按照權(quán)利要求21或22的藥物組合物用于治療器官和組織移植患者的排異反應(yīng)的用途。
35.按照權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于其可以是適宜的經(jīng)腸內(nèi)、胃腸道外、皮膚、眼睛、鼻、耳、直腸、陰道、尿道、頰、咽-氣管-支氣管的藥物劑型，其中該藥物組合物包含含有半日花烷型二萜混合物的干提取物，其中混合物中各種半日花烷型二萜存在量為大約20-大約40％w/w穿心蓮內(nèi)酯、大約3-大約6％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和大約0.2-大約0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
36.按照權(quán)利要求35的藥物組合物，其特征在于各種半日花烷型二萜存在量為大約25-大約35％w/w穿心蓮內(nèi)酯、大約4.5-大約5.5％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和大約0.4-大約0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
37.按照權(quán)利要求36的藥物組合物，其特征在于各種半日花烷型二萜存在量為24.6％w/w穿心蓮內(nèi)酯、4.8％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和0.6％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
38.按照權(quán)利要求35-37任一項的藥物組合物，其特征在于以相應(yīng)的途徑按下述劑量給藥a)每日1-5mg穿心蓮內(nèi)酯/kgb)每日0.02-0.5mg14-去氧穿心蓮內(nèi)酯/kgc)每日0.001-0.02mg新穿心蓮內(nèi)酯/kg。
39.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療自身免疫性疾病的用途。
40.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。
41.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療lupusexanthematous的用途。
42.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療多發(fā)性硬化癥的用途。
43.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的用途。
44.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)的用途。
45.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療牛皮癬的用途。
46.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療全身性皮肌炎的用途。
47.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療骨關(guān)節(jié)炎的用途。
48.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的用途。
49.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療糖尿病的用途。
50.按照權(quán)利要求35至38任一項的藥物組合物用于治療器官和組織移植患者排異反應(yīng)的用途。
權(quán)利要求
1.含有從植物穿心蓮干燥提取物中得到的具有下述通式的半日花烷型二萜類混合物的組合物C20H30O5穿心蓮內(nèi)酯C20H30O414-去氧穿心蓮內(nèi)酯C26H41O8新穿心蓮內(nèi)酯。
2.按照權(quán)利要求1的組合物，其中穿心蓮內(nèi)酯成分的特征是i.)通式C20H30O5ii.)分子量350.46iii.)分子命名3-[2-[十氫-6-羥基-5-(羥基甲基)-5，ha-二甲基-2-亞甲基-1-萘基]亞乙基]-二氫-4-羥基-2(3h)-呋喃酮iv.)分子結(jié)構(gòu)
3.按照權(quán)利要求1的組合物，其中14-去氧穿心蓮內(nèi)酯組分的特征是i.)通式C20H30O4ii.)分子量336.46iii.)分子命名iv.)分子結(jié)構(gòu)
4.按照權(quán)利要求1的組合物，其中新穿心蓮內(nèi)酯組分的特征是i.)通式C26H41O8ii.)分子量345.89iii.)分子命名iv.)分子結(jié)構(gòu)
5.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備醫(yī)藥品、藥物、藥劑的用途。
6.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于治療自身免疫性疾病的藥物的用途。
7.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。
8.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療lupusexanthematous的藥物的用途。
9.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療多發(fā)性硬化癥的藥物的用途。
10.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的藥物的用途。
11.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)的藥物的用途。
12.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療牛皮癬的藥物的用途。
13.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療全身性皮肌炎的藥物的用途。
14.按照權(quán)利要求1的組合物特別用于制備適于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物的用途。
15.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的藥物的用途。
16.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于治療糖尿病的藥物的用途。
17.按照權(quán)利要求1的組合物用于制備適于治療組織和器官移植患者的排異反應(yīng)的藥物的用途。
18.藥物組合物，其特征在于包含權(quán)利要求1的組合物和藥學(xué)可接受的載體。
19.按照權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于最終的干提取物中半日花烷型二萜類混合物包含20-40％w/w穿心蓮內(nèi)酯，大約3-6％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和大約0.2-0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
20.按照權(quán)利要求19的藥物組合物，其特征在于最終的干提取物中半日花烷型二萜類混合物包含大約25-35％w/w穿心蓮內(nèi)酯，大約4.5-5.5％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和大約0.4-0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
21.按照權(quán)利要求20的藥物組合物，其特征在于基于最終的干提取物，半日花烷型二萜類混合物包含24.6％w/w穿心蓮內(nèi)酯，4.8％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和0.6％w/w新穿心蓮內(nèi)酯。
22.按照權(quán)利要求18-21任一項的藥物組合物，其特征在于其為片劑藥物制劑形式。
23.按照權(quán)利要求22的藥物組合物，其特征在于以下述劑量口服給予下述分子a)每日1-5mg穿心蓮內(nèi)酯/kg；b)每日0.2-1mg14-去氧穿心蓮內(nèi)酯/kg；c)每日0.02-0.12mg新穿心蓮內(nèi)酯/kg。
24.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療自身免疫性疾病的用途。
25.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。
26.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療lupusexanthema tous的用途。
27.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療多發(fā)性硬化癥的用途。
28.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的用途。
29.按照權(quán)利要求22或23的組合物用于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)的用途。
30.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療牛皮癬的用途。
31.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療全身性皮肌炎的用途。
32.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療骨關(guān)節(jié)炎的用途。
33.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的用途。
34.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療糖尿病的用途。
35.按照權(quán)利要求22或23的藥物組合物用于治療器官和組織移植患者的排異反應(yīng)的用途。
36.按照權(quán)利要求18的藥物組合物，其特征在于其可以是適宜的經(jīng)腸內(nèi)、胃腸道外、皮膚、眼睛、鼻、耳、直腸、陰道、尿道、頰、咽-氣管-支氣管的藥物劑型，其中該藥物組合物包含含有穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯的半日花烷型二萜混合物的干提取物。
37.按照權(quán)利要求36的藥物組合物，其特征在于半日花烷型二萜混合物包含20-40％w/w穿心蓮內(nèi)酯、大約3-6％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、大約0.2-0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯，該重量百分比是基于最終的干提取物重量。
38.按照權(quán)利要求37的藥物組合物，其特征在于半日花烷型二萜混合物包含大約25-35％w/w穿心蓮內(nèi)酯、大約4.5-5.5％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、大約0.4-0.8％w/w新穿心蓮內(nèi)酯，該重量百分比是基于最終的干提取物重量。
39.按照權(quán)利要求38的藥物組合物，其特征在于半日花烷型二萜混合物包含24.6％w/w穿心蓮內(nèi)酯、4.8％w/w14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、0.6％w/w新穿心蓮內(nèi)酯，該重量百分比是基于最終的干提取物重量。
40.按照權(quán)利要求36的藥物組合物，其特征在于以一定的途徑按下述劑量給藥a)每日1-5mg穿心蓮內(nèi)酯/kgb)每日0.2-1mg14-去氧穿心蓮內(nèi)酯/kgc)每日0.02-0.12mg新穿心蓮內(nèi)酯/kg。
41.按照權(quán)利要求36至40的藥物組合物用于治療自身免疫性疾病的用途。
42.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。
43.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療lupusexanthema tous的用途。
44.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療多發(fā)性硬化癥的用途。
45.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的用途。
46.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)的用途。
47.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療牛皮癬的用途。
48.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療全身性皮肌炎的用途。
49.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療骨關(guān)節(jié)炎的用途。
50.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的用途。
51.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療糖尿病的用途。
52.按照權(quán)利要求36至40任一項的藥物組合物用于治療器官和組織移植患者排異反應(yīng)的用途。
全文摘要
由鑒定為半日花烷型二萜類分子構(gòu)成的組合物，由珍貴植物穿心蓮干燥草藥經(jīng)特殊提取工藝而得到，用于治療人和動物自身免疫性疾病，毒性低無明顯副作用。而且，該新的組合物用于制備用于預(yù)防和治療阿爾茨海默病的藥物組合物。所述組合物激活PPARγ受體減少核因子κB，由此抑制促炎癥反應(yīng)細胞因子的合成。此外，這一新的組合物因其自身的治療特性克服了現(xiàn)有的產(chǎn)品、醫(yī)藥品和工藝的所帶來的毒性水平顯著和/或引起不良副作用的弊端。本發(fā)明用于免疫藥理學(xué)、人類或獸類臨床和臨床前藥理學(xué)、制藥技術(shù)、風(fēng)濕病學(xué)、臨床免疫學(xué)、免疫療法、器官和組織移植以及如AIDS的免疫缺陷疾病。
文檔編號A61P37/00GK1921872SQ200480042233
公開日2007年2月28日 申請日期2004年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月3日
發(fā)明者J·L·漢克奧羅斯科, R·A·布爾戈斯阿吉萊拉 申請人:智利南方大學(xué)