專利名稱：預(yù)測并克服對卵巢癌化療的抗性的方法及預(yù)測結(jié)腸癌發(fā)生的方法
本申請涉及并權(quán)利要求2003年12月31日提交的系列號為60/533,505的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，其公開在此全文引入作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及預(yù)測卵巢癌患者是否會對化療有抗性的方法及確定是否個體患者患結(jié)腸癌的方法。本發(fā)明也涉及監(jiān)測在接受卵巢癌治療的患者中的治療有效性的方法。本發(fā)明還涉及治療卵巢癌及結(jié)腸癌的方法。另外，本發(fā)明涉及篩選能抑制腫瘤細(xì)胞，具體是卵巢癌細(xì)胞或結(jié)腸癌細(xì)胞的生長的化合物的方法。本發(fā)明也涉及具體在對常用化療方案有抗性的卵巢癌細(xì)胞中，降低或抑制對化療藥物治療或療法的抗性的方法。
背景技術(shù)：
卵巢癌是死亡率達(dá)60％的致死性最強的婦科惡性腫瘤。對于此疾病的多個臨床階段的五年存活率如下階段I＞90％，階段II＝80％，階段III＝20％和階段IV＝10％；在此疾病的較晚階段存活率有顯著的降低。對于此疾病的晚期(advanced)階段的標(biāo)準(zhǔn)(Standard-of-care)治療包括減少細(xì)胞數(shù)的手術(shù)后化療。
大多數(shù)患者存活的可能性低，因為所有患者中的大約75％是在疾病的階段III和IV診斷的，且預(yù)后差與疾病在晚期階段的晚診斷相關(guān)。對于現(xiàn)存的化療劑的抗性是另一個主要問題。盡管在最初的治療后75％的患者出現(xiàn)了完全臨床反應(yīng)(complete clinical response)，大多數(shù)會疾病復(fù)發(fā)并需要再治療。不幸的是，絕大多數(shù)會最終患化學(xué)抗性并死于此疾病。
化學(xué)抗性是一種復(fù)雜的現(xiàn)象，它涉及多種基因和基因產(chǎn)物的表達(dá)和生物活性的改變。所述在反應(yīng)性和非反應(yīng)性個體差異表達(dá)的基因或基因家族可被用作分子標(biāo)記物，來預(yù)測哪位患者可能會對在臨床中通常所用的具體化療劑或其組合有抗性。另外，在化學(xué)抗性個體過表達(dá)的基因可以是抑制作用的靶標(biāo)，它可能降低癌細(xì)胞對化療劑或藥劑(agents)的抗性。
與卵巢癌一樣，當(dāng)疾病診斷得早時，患結(jié)腸直腸癌的患者的存活最好。如果癌癥檢出早，結(jié)腸癌患者的5年存活率大約為90％；不幸的是，盡管監(jiān)測和預(yù)防手段增多，只有37％的癌癥發(fā)現(xiàn)于早期階段。當(dāng)癌癥在區(qū)域(regionally)擴散涉及到其他器官時，存活率降到大約64％，并且在癌癥轉(zhuǎn)移后存活率急劇降低(8％)(Cancer Facts and Figures 2002；American CancerSociety publication)。
因此，在疾病進(jìn)行的過程中需要及早鑒定出結(jié)腸癌和卵巢癌，并具體需要鑒定出化學(xué)抗性的癌癥。更具體地，因為癌細(xì)胞的表現(xiàn)在本領(lǐng)域公知，考慮到它們的致瘤性(tumorigenicity)及它們對化療藥物的抗性是由具體基因的不完全確定的組和(defined set)的表達(dá)所介導(dǎo)的，所以本領(lǐng)域需要鑒定可作為卵巢癌中化學(xué)抗性的有效分子標(biāo)記物的基因及基因的集合(collection)或組，以及為卵巢癌和結(jié)腸癌提供臨床有效的治療靶標(biāo)的基因或基因組。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了鑒定這樣的基因的方法和試劑，所述基因涉及對化療藥物治療的抗性、或其表達(dá)受對化療藥物治療的抗性的調(diào)控、或其中所述受調(diào)控的表達(dá)與對化療藥物治療的抗性有關(guān)或?qū)е略摽剐?。具體地，本發(fā)明提供了這樣的基因，所述基因涉及對化療藥物治療的抗性、或其表達(dá)受對化療藥物治療的抗性調(diào)控，或其中所述受調(diào)控的表達(dá)與對化療藥物治療的抗性有關(guān)或?qū)е略摽剐?，以及多種基因的受調(diào)控基因表達(dá)的模式，其中所述模式是化療藥物抗性細(xì)胞，具體為藥物抗性卵巢癌細(xì)胞的特征。本發(fā)明還提供了鑒定與一或多種所述基因的表達(dá)或活性相互作用或?qū)ζ溆杏绊懙幕衔锏姆椒?。本發(fā)明還提供了用作化療劑的替代或與其聯(lián)用的所述化合物，所述化療劑治療卵巢癌，具體治療對通常的化療有抗性或發(fā)展出抗性的癌癥。本發(fā)明還提供了監(jiān)測化療的方法和試劑來鑒別其腫瘤對化療劑是有抗性的或已變?yōu)橛锌剐缘幕颊摺?br> 本發(fā)明提供了鑒定化合物的方法，所述化合物降低化療藥物抗性并抑制、推遲或預(yù)防有化療劑抗性的腫瘤細(xì)胞、最優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞的生長，所述方法包含如下步驟(a)使化療藥物抗性細(xì)胞接觸被試化合物，所述細(xì)胞在化療藥物存在的條件下生長了一段時間或在使得所述細(xì)胞對所述藥物有抗性的化療藥物濃度條件下生長，并且其中所述細(xì)胞表達(dá)至少一種在化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)的基因，其中所述過表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶(Calpain)2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白(Calponin)2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白(Grancalcin)，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1或KIAA0082(如表1所列GenBank登錄號所鑒定)；(b)測定所述細(xì)胞的一或多種所述基因或基因產(chǎn)物在被試化合物存在或缺無時的表達(dá)或活性；和/或(c)比較細(xì)胞生長和/或至少一種所述基因或基因產(chǎn)物在被試化合物存在或缺無時的表達(dá)或活性，其中如果所述基因或基因產(chǎn)物在被試化合物存在時的表達(dá)或活性相對于所述基因在被試化合物缺無時的表達(dá)降低，或如果細(xì)胞生長在所述化合物存在時受抑制，或兩種情況都出現(xiàn)，那么該化合物被鑒定為抑制化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞生長的化合物。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
本發(fā)明還提供鑒定這樣的化合物的方法，所述化合物可降低藥物抗性并抑制、推遲或預(yù)防有化療劑抗性的腫瘤細(xì)胞、最優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞的生長，所述方法包含如下步驟a)使細(xì)胞接觸被試化合物，其中所述細(xì)胞在化療藥物存在的條件下生長了一段時間或在使得所述細(xì)胞對所述藥物有抗性的化療藥物濃度下生長，并且其中所述細(xì)胞表達(dá)與在化學(xué)敏感性細(xì)胞中的情況相比在化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞中以較低水平表達(dá)的基因，其中所述基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10(如表1所列GenBank登錄號所鑒定)；b)測定在被試化合物存在或缺無時所述細(xì)胞的細(xì)胞生長和/或基因表達(dá)或基因產(chǎn)物活性；和c)比較在被試化合物存在或缺無時的基因表達(dá)或基因產(chǎn)物活性，其中如果(i)所述基因的表達(dá)或基因產(chǎn)物的活性在被試化合物存在時相比所述基因的表達(dá)或基因產(chǎn)物的活性在被試化合物缺無時升高，和/或(ii)如果細(xì)胞生長在所述化合物存在時受抑制，和/或(iii)如果細(xì)胞生長受抑制且所述基因表達(dá)和/或活性升高，那么該化合物被鑒定為抑制化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞生長的化合物。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
本發(fā)明提供了降低化療藥物抗性和/或抑制、推遲或預(yù)防腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包含使所述腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞基因的至少一種抑制劑接觸的步驟，所述步驟在化療藥物存在一段時間、或該化療藥物的濃度使得所述細(xì)胞在缺乏細(xì)胞基因抑制劑時對所述藥物有抗性的條件下進(jìn)行，其中所述細(xì)胞基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1或KIAA0082。在優(yōu)選的具體實施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是人腫瘤細(xì)胞，更優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞。在具體方面，根據(jù)本發(fā)明鑒定的一或多種基因用具體設(shè)計為靶向一或多種所述基因的反義RNA或siRNA分子來抑制。其他方面，所述基因的基因產(chǎn)物用這些蛋白的抑制劑來抑制。
本發(fā)明提供了降低腫瘤細(xì)胞的藥物抗性的方法，所述方法包含使所述腫瘤細(xì)胞與至少一種提高細(xì)胞基因的表達(dá)或活性的化合物接觸的步驟，其中所述細(xì)胞基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10，所述步驟中的條件為化療藥物缺無或存在一段時間或該藥物以使得可提高HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10的表達(dá)或活性的化合物缺無時所述細(xì)胞對其有抗性的濃度存在。在優(yōu)選的具體實施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是人腫瘤細(xì)胞，更優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞。
本發(fā)明也提供了抑制、推遲或預(yù)防腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包含使所述腫瘤細(xì)胞與至少一種提高細(xì)胞基因的表達(dá)或活性的化合物接觸的步驟，其中所述細(xì)胞基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10，所述步驟中的條件為在化療藥物缺無或存在一段時間或該化療藥物以使得存在所述提高HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10的表達(dá)或活性的化合物時的細(xì)胞增殖相對于該所述化合物缺無時的細(xì)胞增殖變慢或受抑制的濃度存在。在優(yōu)選的具體實施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是人腫瘤細(xì)胞，更優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了抑制、推遲或預(yù)防腫瘤細(xì)胞、最優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞生長的方法，所述方法包含使所述腫瘤細(xì)胞接觸一或多種化療劑與細(xì)胞基因的至少一種抑制劑的組合的步驟，其中所述細(xì)胞基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，粒鈣蛋白，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，或KIAA0082。在一個具體方面，所述細(xì)胞基因是MetAP2，所述化療劑是基于鉑的化療劑(platinum-based)，并且所述至少一種抑制劑是煙曲霉素(fumagillin)或煙曲霉素的衍生物。在另一個具體方面，所述細(xì)胞基因是需鈣蛋白酶2，所述化療劑是基于鉑的化療劑，并且所述至少一種抑制劑是N-乙?；?亮氨?；?亮氨?；?正亮氨酸(N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal，ALLN)或其衍生物。表1所示細(xì)胞基因的抑制劑可以是，例如具體設(shè)計為靶向表1所示基因的siRNA分子或shRNA分子，或小分子抑制劑。
另一方面，本發(fā)明提供了抑制、推遲或預(yù)防腫瘤細(xì)胞、最優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞生長的方法，所述方法包含使所述腫瘤細(xì)胞接觸化療劑或藥劑與至少一種提高細(xì)胞基因的表達(dá)或活性的化合物的步驟，其中所述細(xì)胞基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10。在優(yōu)選的具體實施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是人腫瘤細(xì)胞，更優(yōu)選卵巢癌細(xì)胞。
本發(fā)明也提供預(yù)測卵巢癌患者的腫瘤是否對化療有抗性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)對應(yīng)于在亞部分(a)中檢測的一或多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物，檢測所述一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在對照樣本中的量，所述樣本包括非腫瘤組織樣本，最優(yōu)選來自腫瘤來源的組織或來自對化療反應(yīng)良好的患者的組織樣本，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；和(c)比較在步驟(a)中測定的所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的量和在步驟(b)中檢測的所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的量，其中如果步驟(a)中的檢出量比步驟(b)中的檢出量高至少20％的因數(shù)，那么預(yù)測所述患者對化療有抗性。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。在具體方面，所述對照樣本是得自對化療有反應(yīng)的癌癥患者的生物樣本。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
在具體方面，當(dāng)在來自癌癥患者的生物樣本中表達(dá)的MetAP2的測得量高于在對化療藥物有反應(yīng)的個體中或在來自不患卵巢癌的個體的卵巢組織中的檢出量時，所述方法可預(yù)測所述患者會對基于鉑的化療有抗性。
本發(fā)明也提供預(yù)測卵巢癌患者的腫瘤是否對化療有抗性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1，或MPP10；(b)對應(yīng)于在亞部分(a)中檢測的一或多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物，檢測所述一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在對照樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；和(c)比較在步驟(a)中測定的被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的量和在步驟(b)中檢測的被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的量，其中如果在步驟(a)中的檢出量比在步驟(b)中的檢出量高至少20％、更優(yōu)選至少50％的因數(shù)，那么預(yù)測所述患者對化療有抗性。在具體方面，所述對照樣本是得自對化療有反應(yīng)的癌癥患者的生物樣本。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
本發(fā)明還提供監(jiān)測在卵巢癌患者、具體為接受化療的卵巢癌患者中的疾病進(jìn)展的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(c)比較步驟(a)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量和步驟(b)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中通過檢測被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在隨后收集的生物樣本中的量相對于其在步驟(a)中的生物樣本中的量的變化來監(jiān)測疾病進(jìn)展，并且在步驟(b)中所述被表達(dá)的基因或表達(dá)的基因產(chǎn)物的檢出量高于步驟(a)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量時檢測到疾病的進(jìn)展。在某些具體實施方案中，所述患者在檢測步驟(a)中的基因表達(dá)量與檢測步驟(b)中的檢出量之間的時期接受化療或其他治療。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。在優(yōu)選具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
本發(fā)明還提供監(jiān)測在卵巢癌患者、具體為接受化療的卵巢癌患者中的疾病進(jìn)展的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(c)比較步驟(a)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量和步驟(b)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中通過檢測被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在隨后收集的生物樣本中的量相對于其在步驟(a)中的生物樣本中的量的變化來監(jiān)測疾病進(jìn)展，并且在步驟(b)中所述被表達(dá)的基因或表達(dá)的基因產(chǎn)物的檢出量低于或等于步驟(a)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量時檢測到疾病的進(jìn)展。在某些具體實施方案中，所述患者在檢測步驟(a)中的基因表達(dá)量與檢測步驟(b)中的檢出量之間的時期接受化療或其他治療。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
另外，本發(fā)明提供監(jiān)測藥物組合物作為治療患者的癌癥、具體為卵巢癌或結(jié)腸癌的藥劑的有效性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)將一定量的藥物組合物給予所述患者；(c)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(d)比較步驟(a)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量和步驟(c)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中通過檢測被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在隨后收集的生物樣本中的量相對于其在步驟(a)中的生物樣本中的量的變化來監(jiān)測所述藥物組合物的有效性，并且其中在步驟(c)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量低于步驟(a)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量時，且在所述藥物組合物存在時腫瘤生長下降(即減慢、推遲或抑制)時，所述藥物組合物是有效的。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
本發(fā)明也提供監(jiān)測藥物組合物作為治療患者的癌癥、具體為卵巢癌或結(jié)腸癌的藥劑的有效性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)將一定量的藥物組合物給予所述患者；(c)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(d)比較步驟(a)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量和步驟(c)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中通過檢測被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在隨后收集的生物樣本中的量相對于其在步驟(a)中的生物樣本中的量的變化來監(jiān)測所述藥物組合物的有效性，并且其中如果步驟(c)中所述被表達(dá)的基因或表達(dá)的基因產(chǎn)物的檢出量高于步驟(a)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，且在所述藥物組合物存在時腫瘤生長下降(即減慢、推遲或抑制)，所述藥物組合物是有效的。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
本發(fā)明也提供檢測檢測結(jié)腸癌的方法，所述方法包含如下步驟(a)從動物、優(yōu)選人獲得生物樣本；(b)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在所述生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，或MetAP2；(c)檢測在對照樣本中檢出的所述一或多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的量，所述對照樣本包括非腫瘤結(jié)腸組織樣本；(d)比較所述一或多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在步驟(b)中的量和在步驟(c)中的量，其中如果步驟(b)中的量與步驟(c)中的量相比有差別，則可檢出結(jié)腸癌。在步驟(a)中用的生物樣本和步驟(c)中用的生物樣本中檢出的差別可以是一或多種所述基因的過表達(dá)，或可以是一或多種所述基因的缺乏或不足表達(dá)(underexpression)。例如，如果S100A10，S100A11，SPARC和/或MetAP2在步驟(b)中的量比步驟(c)中的量高，和/或如果需鈣蛋白酶2在步驟(b)中的量低于在步驟(c)中的量，則檢出了結(jié)腸癌。在某些具體實施方案中，所述動物是人，優(yōu)選患結(jié)腸癌的人。優(yōu)選，所述生物樣本是結(jié)腸組織樣本，更優(yōu)選息肉并更優(yōu)選腺癌性息肉(adematous polyp)，它們在本領(lǐng)域常用作結(jié)腸篩選活性的組織樣本。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明提供了診斷動物、優(yōu)選人的癌癥和/或化療藥物抗性的方法，所述方法包含檢測兩或多種被表達(dá)基因或由其編碼的基因產(chǎn)物的量的改變模式的步驟。在具體的具體實施方案中，所述被表達(dá)的基因是表1所示的基因。通常地，本發(fā)明的這些方法包含如下步驟(a)從動物、優(yōu)選人獲得生物樣本；(b)檢測兩或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在所述生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因如表1所示；(c)檢測兩或多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在對照樣本中的檢出量；(d)通過比較兩或多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在步驟(b)中的量和在步驟(c)中的量，確定所述兩或多種被表達(dá)基因或由其編碼的基因產(chǎn)物的量的改變模式，其中所述模式與癌癥例如結(jié)腸或卵巢癌、或藥物抗性例如順鉑(cis-platin)抗性相關(guān)。在某些具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
本發(fā)明也提供了檢測患卵巢癌的動物的化療藥物抗性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述動物的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)對應(yīng)于在亞部分(a)中檢測的所述多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物，檢測所述多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在對照樣本中的量，所述對照樣本包含非腫瘤卵巢組織或來自對化療有反應(yīng)的患者的腫瘤組織，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；和(c)比較在步驟(a)中測定的所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的量和步驟(b)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中如果步驟(a)中的檢出量比步驟(b)中的檢出量高至少20％的因數(shù)，則預(yù)測所述患者對化療有抗性。如本文所公開，其中在步驟(a)中的檢出量比在步驟(b)中的檢出量高至少20％的因數(shù)的多種所述基因，可限定對化療藥物有抗性的腫瘤樣本所特有的基因表達(dá)模式。在具體方面，所述對照樣本是得自對化療有反應(yīng)的患者的生物樣本。優(yōu)選地，一或多種所述基因的表達(dá)在步驟(a)中所檢測的腫瘤樣本中的水平比在步驟(b)中所檢測的對照樣本中的水平高。在優(yōu)選的具體實施方案中，所述動物是人，最優(yōu)選人癌癥患者。如本文所公開，本發(fā)明還提供了預(yù)測對所述化療藥物的抗性的基因表達(dá)模式，條件是所述基因表達(dá)模式被檢出。在優(yōu)選的具體實施方案中，通過用對本發(fā)明所鑒定的多種基因產(chǎn)物特異的核酸(基因)探針或抗體等的陣列測定生物樣本來檢測基因表達(dá)。
有利地，一些本文鑒定的基因從未被認(rèn)識到與卵巢癌或結(jié)腸癌有關(guān)，并可證明是其干涉這些疾病的新靶標(biāo)。
通過下面對某些優(yōu)選的具體實施方案及權(quán)利要求書更具體的描述，本發(fā)明的具體優(yōu)選的具體實施方案將會變得明顯。
附圖簡述

圖1是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示S100A10在對化療藥物抗性增加的卵巢癌細(xì)胞系中以升高的水平表達(dá)。
圖2是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示S100A11在對化療藥物抗性增加的卵巢癌細(xì)胞系中以升高的水平表達(dá)。
圖3是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示S100A10和S100A11的mRNA在對化療抗性較強的患者腫瘤樣本中水平相對在來自反應(yīng)性較強的患者的樣本中的水平升高。
圖4是定量實時PCR結(jié)果的圖示，其顯示SPARC在化學(xué)抗性細(xì)胞系中以升高的水平表達(dá)。
圖5是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片，其顯示SPARCmRNA在取自癌癥已經(jīng)復(fù)發(fā)的患者的樣品中升高。
圖6是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示需鈣蛋白酶2mRNA的水平在化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞系中升高。
圖7是Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示粒鈣蛋白mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中的水平相對于在對順鉑處理敏感的細(xì)胞系中的水平升高。
圖8是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示MetAP2蛋白質(zhì)的表達(dá)在高度化學(xué)抗性的細(xì)胞系OVCA 429中升高，并在對順鉑處理敏感的Hey細(xì)胞系中下調(diào)。
圖9是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示在組織樣本中的MetAP2蛋白質(zhì)的表達(dá)，所述組織樣本得自三個對基于順鉑的化療抗性水平不同的患者。相比具有中等(CAP2)和低(CAP1)化療抗性水平的患者，在患抗性最強的腫瘤(CAP3)的患者樣本中MetAP2升高得最多。
圖10是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示可檢出eIF5的兩種轉(zhuǎn)錄物，并且這兩者的表達(dá)水平在對順鉑抗性水平最高的卵巢癌細(xì)胞系中是升高的。
圖11是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示在腫瘤復(fù)發(fā)前(CAP2)和腫瘤復(fù)發(fā)后(CAP2+)的化學(xué)抗性患者腫瘤樣本中的eIF5表達(dá)。
圖12是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示eIF2Bε的mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖13是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示eEF1ε mRNA在對順鉑抗性最強的卵巢癌細(xì)胞系中下調(diào)。
圖14顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示相對于敏感細(xì)胞系，SAPK/Erk1 mRNA水平在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高。
圖15顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示TESK2 mRNA在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高。
圖16顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示FAST激酶mRNA在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高。
圖17是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示KLK6的表達(dá)水平在被試的對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高。
圖18是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示HMT1的表達(dá)水平在對順鉑有抗性的細(xì)胞中下調(diào)。
圖19是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示ARA9的mRNA在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高。
圖20是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示鈣調(diào)理蛋白2的表達(dá)在化學(xué)抗性細(xì)胞系中與在化學(xué)敏感的卵巢癌細(xì)胞系中相比升高。
圖21是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示神經(jīng)元細(xì)胞凋亡抑制型蛋白(neuronal apoptosis inhibitoryprotein)的基因表達(dá)在對順鉑抗性最強的細(xì)胞系中降低。
圖22是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示RNPS1水平在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高。
圖23是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示HSF2的mRNA水平在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖24是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示W(wǎng)DR1的mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中的水平與在化學(xué)敏感細(xì)胞系中的水平相比升高。
圖25是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示Ft1 mRNA的水平在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高。
圖26是顯示Northern印跡分析結(jié)果的放射自顯影照片及該Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示NME4 mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖27顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示ADAR1 mRNA在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高。
圖28顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示NBR1 mRNA在化學(xué)抗性最強的細(xì)胞系OVCA 429中的水平與在其他被試細(xì)胞系中的水平相比升高。
圖29顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示鋅指蛋白262的mRNA在順鉑抗性最強的細(xì)胞系中相比其他被試細(xì)胞系升高。
圖30顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示MRPL4 mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖31顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示HYA22 mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中相比化學(xué)敏感的細(xì)胞系升高。
圖32顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示vinexinβ的mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖33顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示G-CSFR的mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖34顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示SRB1mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖35顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示IGFBP-7 mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖36顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示RAB22A mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中降低并在反應(yīng)性更強的細(xì)胞系中升高。
圖37顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示KIAA0082 mRNA的表達(dá)在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高。
圖38顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示NCOR2的mRNA在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中的水平與敏感的細(xì)胞系中的水平相比降低。
圖39顯示了基于MTT分析結(jié)果，根據(jù)五個卵巢癌細(xì)胞系對順鉑的敏感性水平對其進(jìn)行的等級劃分。
圖40(上圖)圖示了濃度升高的煙曲霉素對暴露于該藥物4小時后的OVCA 429細(xì)胞存活的影響。下示在0.1μg/ml煙曲霉素存在時順鉑的作用增強，但當(dāng)在10μg/ml煙曲霉素存在時用順鉑處理所述細(xì)胞4小時不導(dǎo)致順鉑作用的增強。
圖41(上圖)圖示了濃度升高的煙曲霉素對暴露于該藥物8小時后的OVCA 429細(xì)胞存活的影響。
圖41(下圖)圖示在0.1μg/ml煙曲霉素存在時順鉑的作用增強，但存在10μg/ml煙曲霉素時用順鉑處理所述細(xì)胞8小時不導(dǎo)致順鉑作用的增強。
圖42(上圖)圖示了濃度升高的煙曲霉素對暴露于該藥物24小時后的OVCA 429細(xì)胞存活的作用。
圖42(下圖)圖示在0.1μg/ml煙曲霉素存在時順鉑的細(xì)胞毒性作用增強，但當(dāng)存在10μg/ml煙曲霉素時用順鉑處理細(xì)胞24小時不導(dǎo)致順鉑作用的增強。
圖43是三種siRNA(#1，SEQ ID NO4；#2，SEQ ID NO5；和#3，SEQ IDNO6)的示意圖，所述三種siRNA被設(shè)計為靶向MetAP-2信使RNA的不同區(qū)域。
圖44顯示了通過定量實時PCR測定的siRNA #1對于MetAP-2在OVCA429中的表達(dá)水平的影響。
圖45圖示在siRNA #1存在時將OVCA 429暴露于順鉑后，通過MTT分析測定對細(xì)胞存活定量。
圖46是進(jìn)行MTT分析后含OVCA 429細(xì)胞的96孔板的照片(定量顯示在圖45)，該照片顯示順鉑對用MetAP-2siRNA #1轉(zhuǎn)染的這些細(xì)胞的作用。
圖47是三種siRNA(#1，SEQ ID NO1；#2，SEQ ID NO2；和#3，SEQ IDNO3)的示意圖，所述三種siRNA被設(shè)計為靶向SPARC信使的不同區(qū)域。
圖48圖示在用圖47所示的siRNAs轉(zhuǎn)染的OVCA 429細(xì)胞中的SPARC表達(dá)的定量實時PCR分析結(jié)果。
圖49是進(jìn)行MTT分析后含OVCA 429細(xì)胞的96孔板的照片，來確定順鉑在SPARC siRNA #2存在時對OVCA 429細(xì)胞的作用。
圖50圖示siRNA-介導(dǎo)的SPARC基因表達(dá)降低對OVCA 429細(xì)胞的順鉑敏感性的影響。
圖51顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示MT1 mRNA在對順鉑最敏感的細(xì)胞系(Hey)中顯著升高。
圖52顯示了Northern印跡結(jié)果的圖示，顯示MPP10 mRNA隨著對順鉑的敏感性的提高而增加。
圖53圖示siRNA-介導(dǎo)的需鈣蛋白酶2基因表達(dá)降低在OVCA 429細(xì)胞中的影響。
圖54圖示需鈣蛋白酶2siRNA #3對OVCA 429細(xì)胞的順鉑敏感性的影響。
圖55圖示需鈣蛋白酶2抑制劑ALLN對OVCA 429細(xì)胞的順鉑敏感性的影響。
圖56圖示siRNA-介導(dǎo)的SA100A1O基因表達(dá)降低對OVCA 429細(xì)胞的順鉑敏感性的影響。
圖57圖示siRNAs對OVCA429細(xì)胞中的S100A11基因mRNA表達(dá)水平的影響。
圖58圖示在正常和結(jié)腸癌細(xì)胞cDNA中的MetAp-2mRNA表達(dá)水平。
圖59圖示在正常和結(jié)腸癌細(xì)胞cDNA中的SPARC mRNA表達(dá)水平。
圖60圖示在正常和結(jié)腸癌細(xì)胞cDNA中的S100A11 mRNA表達(dá)水平。
圖61圖示在正常和結(jié)腸癌細(xì)胞cDNA中的S100A10 mRNA表達(dá)水平。
圖62圖示在正常和結(jié)腸癌細(xì)胞cDNA中的需鈣蛋白酶-2mRNA表達(dá)水平。
圖63顯示腫瘤體積為兩只裸鼠體重的函數(shù)，這兩只裸鼠注射了OVCAR-3細(xì)胞(15百萬/每次注射，得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection)，Manassas，VA，保藏號HTB-161)，并在35天后用順鉑以4μg/kg體重、通過IP注射、每周三次、持續(xù)處理2周，之后的1周不處理或用單獨的生理鹽水溶液作為對照來處理。
圖64是顯示針對需鈣蛋白酶2或S100A11的siRNAs在OVCAR-3細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)的圖。在對照道(lane)，在無處理或含有無關(guān)GFP siRNA的細(xì)胞(cells without treatment or the irrelevant GFPsiRNA)中測定兩種mRNA的表達(dá)。需鈣蛋白酶2和S100A11的mRNA表達(dá)在相關(guān)的siRNA道中明顯降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了抑制、推遲或預(yù)防腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包含在化療藥物以所述細(xì)胞產(chǎn)生抗性的濃度存在時使所述腫瘤細(xì)胞接觸一或多種細(xì)胞基因的表達(dá)或活性的至少一種調(diào)節(jié)劑的步驟，其中所述細(xì)胞基因是表1所示的基因，并且其中使所述腫瘤細(xì)胞接觸所述基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑會降低、抑制、推遲或預(yù)防所述腫瘤細(xì)胞的藥物抗性。所述腫瘤細(xì)胞可以是例如，卵巢癌。在一個具體實施方案中，可以在體內(nèi)接觸所述腫瘤細(xì)胞(例如未從患者取出的細(xì)胞)。
本文所用術(shù)語“生物樣本”包括但不限于得自動物、優(yōu)選哺乳動物、最優(yōu)選人的組織或體液。例如，生物樣本可以是活體解剖材料、骨髓樣本、血、血漿、血清或或其細(xì)胞級分，尿、唾液、淚液或來自生物來源的細(xì)胞。在一個具體實施方案中，所述哺乳動物是疑似患有或以前診斷出患有或需要篩查癌癥、具體為卵巢癌或結(jié)腸癌的人。在某些具體實施方案中，生物樣本是組織樣本。
本文所用術(shù)語“卵巢癌”據(jù)理解通常指上皮卵巢癌，其包括所有診斷為來自卵巢組織的人癌癥的幾乎80％的一些癌癥。其余的癌癥，包括源自種系(germline)的卵巢癌和透明細(xì)胞(clear cell)卵巢癌，是罕見并通常被誤診的。鑒于在這些少數(shù)腫瘤類型中也發(fā)現(xiàn)本文公開的基因表達(dá)的改變，本發(fā)明的方法和組合物可以適用于所述疾病。
本文所用的基因表達(dá)或基因產(chǎn)物活性的“調(diào)節(jié)劑”可以是任何會造成基因表達(dá)或基因產(chǎn)物活性升高或降低的化學(xué)化合物、核酸分子、肽或多肽。在某些具體實施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑是造成一或多種細(xì)胞基因的表達(dá)或活性升高的化合物，所述一或多種細(xì)胞基因的表達(dá)或活性在對化療劑有抗性的腫瘤細(xì)胞中是降低的；這些調(diào)節(jié)劑在本文被稱為“活化劑”。在其他具體實施方案中，調(diào)節(jié)劑是一或多種細(xì)胞基因、具體為其表達(dá)在對化療劑有抗性的腫瘤細(xì)胞中升高的基因的表達(dá)或活性的抑制劑；這些調(diào)節(jié)劑在本文被稱為“抑制劑”。
本文所用的“抑制劑”可以是任何能降低基因產(chǎn)物活性或直接干擾基因表達(dá)的化學(xué)化合物、核酸分子、肽或多肽，如抗基因產(chǎn)物的抗體。例如本發(fā)明的抑制劑能直接或間接地抑制基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。直接抑制可通過，諸如結(jié)合蛋白質(zhì)從而預(yù)防該蛋白質(zhì)結(jié)合意向的靶標(biāo)，如受體進(jìn)行來實現(xiàn)。間接抑制可通過，諸如結(jié)合蛋白質(zhì)的意向靶標(biāo)，如受體或結(jié)合配偶體，從而阻斷或降低所述蛋白質(zhì)的活性來實現(xiàn)。并且，本發(fā)明的抑制劑可通過降低或抑制所述基因的表達(dá)等來抑制基因，這可通過干擾基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯、翻譯后修飾)，例如通過干擾所述基因的mRNA并阻斷所述基因產(chǎn)物的翻譯或通過基因產(chǎn)物的翻譯后修飾，或通過造成細(xì)胞內(nèi)定位的改變來進(jìn)行。
本文所用的“活化劑”可以是任何能提高基因產(chǎn)物活性(例如通過穩(wěn)定化所述基因產(chǎn)物，預(yù)防其蛋白水解降解或增強其酶活性或結(jié)合活性或直接活化基因表達(dá))的化學(xué)化合物、核酸分子、肽或多肽。本發(fā)明的活化劑可直接或間接地增強基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。直接活化可通過，諸如結(jié)合蛋白質(zhì)從而增強該蛋白質(zhì)與意向靶標(biāo)，如受體的結(jié)合來實現(xiàn)。間接活化可通過，諸如結(jié)合蛋白質(zhì)的意向靶標(biāo)，如受體或結(jié)合配偶體，并增強活性，例如通過提高所述靶標(biāo)的有效濃度來實現(xiàn)。并且，本發(fā)明的活化劑可通過，提高所述基因的表達(dá)來活化基因，這可通過例如提高基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯、翻譯后修飾)，例如通過穩(wěn)定化所述基因的mRNA或阻斷所述mRNA轉(zhuǎn)錄物的降解，或通過基因產(chǎn)物的翻譯后修飾，或通過造成細(xì)胞內(nèi)定位的改變來進(jìn)行。
如本文所述，在化學(xué)抗性卵巢腫瘤細(xì)胞中的數(shù)種基因的表達(dá)顯著不同于其在化學(xué)敏感卵巢腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。表1提供了用下面實施例中所述的方法鑒定的所述基因的列表。該表也匯總了在對廣泛使用的化療劑順鉑敏感或有抗性的細(xì)胞中的這些基因的表達(dá)模式。
表1



已經(jīng)報道在表1中以粗體顯示的染色體位置與卵巢癌有關(guān)(Pejoic，1995，Ann.Med.2773-78)。
在一個具體實施方案中，表1所示細(xì)胞基因的抑制劑可以是，例如，小分子抑制劑，抗體，核酸如反義核酸，短干擾RNA(siRNA)分子，或短發(fā)夾RNA(shRNA)分子。另外，這些抑制劑可以用本文所述的方法或用本領(lǐng)域已知方法具體地設(shè)計。例如針對表1所示的基因所編碼的蛋白質(zhì)的抗體，具體為中和抗體并優(yōu)選單克隆抗體，可用如“AntibodiesA Laboratory Manual”byHarlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，1988)所述的常用手段來產(chǎn)生，其引入本文作為參考。
在具體的具體實施方案中，本發(fā)明的抑制劑是結(jié)合編碼靶基因的mRNA的siRNA，其中所述靶基因是表1所示的基因。
在優(yōu)選具體實施方案中，本發(fā)明提供的某些抑制劑是短干擾RNA(siRNA)種類(species)。本文所用術(shù)語“短干擾RNA”或“siRNA”指能夠起RNA干擾作用的雙鏈核酸分子或“RNAi”，如下所述，例如Bass，2001，Nature411428-429；Elbashir et al.，2001，Nature411494-498；和Kreutzer等，國際PCT公開號WO 00/44895；Zernicka-Goetz等，國際PCT公開號WO 01/36646；Fire，國際PCT公開號WO 99/32619；Plaetinck等，國際PCT公開號WO00/01846；Mello and Fire，國際PCT公開號WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，國際PCT公開號WO 99/07409；和Li等，國際PCT公開號WO 00/44914。本文所用的siRNA分子不需被限制為那些僅包含RNA的分子，其還包括具有RNAi能力或活性的經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸和非核苷酸。
已經(jīng)在多種體系中研究了短干擾RNA介導(dǎo)的RNAi。Fire等首先在C.elegans中觀察RNAi(1998，Nature391806)。Wianny and Goetz描述了在小鼠胚胎中通過dsRNA介導(dǎo)的RNAi(1999，Nature Cell Biol.270)。Hammond等描述了用dsRNA轉(zhuǎn)染的果蠅細(xì)胞中的RNAi(2000，Nature404293)。Elbashir等描述了通過向培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞(包括人胚胎腎細(xì)胞和HeLa細(xì)胞)中引入合成的21個核苷酸的RNAs的雙鏈體而誘導(dǎo)的RNAi(2001，Nature411494)。這些研究已經(jīng)顯示包含21個核苷酸的siRNA雙鏈體在含有兩個核苷酸3′-突出端時是最活躍的。而且，用2′-脫氧或2′-O-甲基核苷酸取代一或兩條siRNA鏈會消除(abolish)RNAi活性，而用脫氧核苷酸取代3′-末端siRNA核苷酸顯示是可耐受的。在siRNA雙鏈體中心的錯配序列也顯示會消除RNAi活性。另外，這些研究也表明切割點在靶RNA中的位置是由siRNA引導(dǎo)序列的5′-末端而不是3′-末端來限定的(Elbashir等，2001，EMBO J.206877)。其他研究表明siRNA雙鏈體的靶-互補鏈上的5′-磷酸是siRNA活性所需的并且ATP在細(xì)胞中用于維持所述siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen等，2001，Cell107309)。然而，缺乏5′-磷酸的siRNA分子在外源性引入時是有活性的，這提示siRNA構(gòu)建體的5′-磷酸化可能在體內(nèi)出現(xiàn)。化學(xué)修飾的siRNA可為了某種應(yīng)用被直接注射到血流中。
在某些具體實施方案中，本發(fā)明以允許本發(fā)明siRNA分子表達(dá)的方式，提供了包含編碼至少一個所述siRNA分子的核酸序列的表達(dá)載體。例如所述載體可包含編碼包含雙鏈體的siRNA分子雙鏈的序列。所述載體也可包含編碼自身互補從而形成siRNA分子的單個核酸分子的序列。這些表達(dá)載體的非限制性實施例見下所述，Paul等，2002，Nature Biotechnology 19505；Miyagishi and Taira，2002，Nature Biotechnology 19497；Lee等，2002，NatureBiotechnology 19500；和Novina等，2002，Nature Medicine，June 3，2003網(wǎng)上公開。
在某些具體實施方案中，本發(fā)明的siRNA分子可包含遞送載體，包括給予受試者的脂質(zhì)體、載體和稀釋劑及其鹽等，并可在藥物組合物中存在。遞送核酸分子的方法如下所述，例如Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.2139；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995，Maurer等，1999，Mol.Membr.Biol.16129-140；Hofland and Huang，1999，Handb.Exp.Pharmacol.，137165-192；和Lee等，2000，ACS Symp.Ser.752184-192，其全部引入本文作為參考。Beigelman等，美國專利6,395,713和Sullivan等，PCT WO 94/02595進(jìn)一步描述了遞送核酸分子的常用方法。這些方案可用于遞送幾乎任何核酸分子。核酸分子可通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法給予細(xì)胞，包括但不限于包裹在脂質(zhì)體中、通過離子電滲(iontophoresis)、或通過摻入其他遞送載體，諸如水凝膠、環(huán)糊精(cyclodextrins)、生物降解納米膠囊(nanocapsules)及生物膠粘微球(bioadhesivemicrospheres)，或通過蛋白質(zhì)性載體(見例如O′Hare and Normand，國際PCT公開號WO 00/53722)。
或者，核酸/載體的組合可通過直接注射或通過使用輸注泵來局部遞送。直接注射本發(fā)明的核酸分子，無論是皮下、肌內(nèi)還是皮內(nèi)，都可用標(biāo)準(zhǔn)針頭和注射器方法進(jìn)行，或通過無針頭技術(shù)如Conry等，1999，Clin.CancerRes.52330-2337和Barry等，國際PCT公開號WO 99/31262所述的那些。很多本領(lǐng)域內(nèi)的實施例描述了通過滲透泵(見Chun等，1998，NeuroscienceLetters257135-138，D′Aldin等，1998，Mol.Brain Research55151-164，Dryden等，1998，J.Endocrinol.157169-175，Ghirnikar等，1998，Neuroscience Letters24721-24)或直接輸注(Broaddus等，1997，Neurosurg.Focus3，article 4)遞送寡核苷酸的方法。其他遞送途徑包括但不限于口服遞送(如以藥片或藥丸的形式)和/或經(jīng)鞘內(nèi)遞送(Gold，1997，Neuroscience761153-1158)。對于核酸遞送和給予的更具體的描述見Sullivan等，PCT WO 94/02595，Draper等，PCTWO93/23569，Beigelman等，PCT WO99/05094，和Klimuk等，PCTWO99/04819，其全部引入本文作為參考。
或者，本發(fā)明的某些siRNA分子可以在細(xì)胞內(nèi)從真核生物啟動子表達(dá)(見例如Izant and Weintraub，1985，Science229345；McGarry and Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA83399；Scanlon等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8810591-5；Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.23-15；Dropulic等，1992，J.Virol.661432-41；Weerasinghe等，1991，J.Virol.655531-4；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910802-6；Chen等，1992，NucleicAcids Res.204581-9；Sarver等，1990，Science2471222-1225；Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.232259；Good等，1997，Gene Therapy445；Miyagishi等，2001，Nucleic Acids Research292502；and Kunkel and Pederson，1989 Nucleic Acids Research177371)。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識到任何核酸都可用合適的DNA/RNA載體在真核生物細(xì)胞中表達(dá)。這些核酸的活性可通過它們通過有酶活性的核酸(enzymatic nucleic acid)從原始轉(zhuǎn)錄物釋放而得到加強(Draper等，PCT WO 93/23569，和Sullivan等，PCT WO 94/02595；Ohkawa等，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.2715-6；Taira等，1991，NucleicAcids Res.195125-30；Ventura等，1993，Nucleic Acids Res.213249-55；Chowrira等，1994，J.Biol.Chem.26925856)。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的RNA分子可以從插入DNA或RNA載體的轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)(見例如，Couture等，1996，TIG12510)。所述重組載體可以是DNA質(zhì)粒或病毒載體。表達(dá)病毒載體的siRNA可以基于如下病毒來構(gòu)建，例如但不限于腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒或甲病毒(alphavirus)。在另一具體實施方案中，基于pol III的構(gòu)建體用來表達(dá)本發(fā)明的核酸分子(見例如，Thompson，美國專利5,902,880和6,146,886)。能表達(dá)所述siRNA分子的重組載體可以如上遞送并保持在靶細(xì)胞中。或者，可用提供核酸分子瞬時表達(dá)的病毒載體。必要時可重復(fù)給予這些載體。一旦表達(dá)，所述siRNA分子與靶mRNA相互作用并產(chǎn)生RNAi反應(yīng)?？梢匀斫o予表達(dá)siRNA分子的載體，如通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)給予，通過給予從受試者取出(ex-planted)之后重新導(dǎo)入(reintroduction)所述受試者的靶細(xì)胞，或通過任何其他可引入理想靶細(xì)胞的方法(綜述見Couture等，1996，TIG.12510)。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼至少一個本發(fā)明siRNA分子的核酸序列的表達(dá)載體。所述表達(dá)載體可編碼siRNA雙鏈體的一或兩條鏈，或單條自身雜交成siRNA雙鏈體的自身互補鏈。編碼所述siRNA分子的核酸序列可以允許所述siRNA分子表達(dá)的方式可操作地連接(見例如Paul等，2002，Nature Biotechnology19505；Miyagishi and Taira，2002，NatureBiotechnology19497；Lee等，2002，Nature Biotechnology19500；和Novina等，2002，Nature Medicine，online publication June 3)。本文所用術(shù)語“可操作地連接”指側(cè)翼序列的排列，其中所述側(cè)翼序列被構(gòu)型或裝配以執(zhí)行它們通常的功能。因此，可操作地連接于編碼序列的側(cè)翼序列可以影響所述編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，當(dāng)啟動子能指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，該編碼序列可操作地與所述啟動子連接。只要編碼序列正確地發(fā)揮功能，側(cè)翼序列就不需要與編碼序列鄰接。因此，例如間插型未翻譯的但已轉(zhuǎn)錄的序列可存在于啟動子序列和編碼序列之間，并且所述啟動子序列仍被認(rèn)為是“可操作地連接于”所述編碼序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了表達(dá)載體，其包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(例如真核生物pol I、II或III起始區(qū))；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(例如真核生物pol I、II或III終止區(qū))；和c)編碼至少一個本發(fā)明siRNA分子的核酸序列；其中所述序列以允許所述siRNA分子表達(dá)和/或遞送的方式可操作地連接于所述起始區(qū)和所述終止區(qū)。所述載體任選包括可操作地連接在編碼本發(fā)明siRNA的序列的5′側(cè)或3′-側(cè)的蛋白質(zhì)的開放閱讀框架(ORF)；和/或內(nèi)含子(間插序列)。
所述siRNA分子序列的轉(zhuǎn)錄可以源自真核生物RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的啟動子。pol II或pol III啟動子的轉(zhuǎn)錄物在所有細(xì)胞都以高水平表達(dá)；在已知細(xì)胞類型中已知的polII啟動子的水平依賴于存在于其旁邊的基因調(diào)節(jié)序列(增強子、沉默基因等等)的性質(zhì)。也使用原核生物RNA聚合酶啟動子，前提是該原核生物RNA聚合酶在合適的細(xì)胞中表達(dá)(Elroy-Stein and Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876743-7；Gao and Huang 1993，Nucleic Acids Res.212867-72；Lieber等，1993，Methods Enzymol.21747-66；Zhou等，1990，Mol.Cell.Biol.104529-37)。多個研究者已經(jīng)闡述了從這些啟動子表達(dá)的核酸分子可在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮功能(例如Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.23-15；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910802-6；Chen等，1992，Nucleic Acids Res.204581-9；Yu等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906340-4；L′Huillier等，1992，EMBO J.114411-8；Lisziewicz等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A908000-4；Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.232259；Sullenger and Cech，1993，Science2621566)。更具體地，轉(zhuǎn)錄單元如源自編碼U6小核(snRNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的那些，可用于在細(xì)胞中產(chǎn)生高濃度的所需RNA分子如siRNA(Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.232259；Couture等，1996，TIG12510；Noonberg等，1994，Nucleic Acid Res.222830；Noonberg等，美國專利5,624,803；Good等，1997，Gene Ther.445；Beigelman等，國際PCT公開號WO 96/18736。上述siRNA轉(zhuǎn)錄單元可被摻入多種引入哺乳動物細(xì)胞的載體中，包括但不限于質(zhì)粒DNA載體、病毒DNA載體(如腺病毒或腺伴隨病毒載體)、或病毒RNA載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒或甲病毒載體；綜述見Couture等，1996，TIG12510)。
在另一具體實施方案中，本發(fā)明以允許本發(fā)明siRNA分子表達(dá)的方式提供了包含編碼至少一個所述siRNA分子的核酸序列的表達(dá)載體。在具體的具體實施方案中，所述表達(dá)載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；和c)編碼所述siRNA分子的至少一條鏈的核酸序列；其中所述序列以允許所述siRNA分子表達(dá)和/或遞送的方式可操作地連接于所述起始區(qū)和所述終止區(qū)。
在另一具體實施方案中，所述表達(dá)載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)開放閱讀框架；和d)編碼siRNA分子的至少一條鏈的核酸序列；其中所述序列可操作地連接到所述開放閱讀框架的3′-末端；并且其中所述序列以允許所述siRNA分子表達(dá)和/或遞送的方式可操作地連接于所述起始區(qū)、所述開放閱讀框架和所述終止區(qū)。
在另一具體實施方案中，所述表達(dá)載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)內(nèi)含子；和d)編碼至少一個siRNA分子的核酸序列；其中所述序列以允許所述核酸分子表達(dá)和/或遞送的方式可操作地連接于所述起始區(qū)、所述內(nèi)含子和所述終止區(qū)。
在另一具體實施方案中，所述表達(dá)載體包含a)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；b)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；c)內(nèi)含子；d)開放閱讀框架；和e)編碼siRNA分子的至少一條鏈的核酸序列；其中所述序列可操作地連接到所述開放閱讀框架的3′-末端；并且其中所述序列以允許所述siRNA分子表達(dá)和/或遞送的方式可操作地連接于所述起始區(qū)、所述內(nèi)含子、所述開放閱讀框架和所述終止區(qū)。
在一個具體實施方案中，腫瘤細(xì)胞的生長通過使所述腫瘤細(xì)胞接觸抑制SPARC的siRNA而受抑制?；蛘撸瞿[瘤細(xì)胞可在化療藥物以所述腫瘤細(xì)胞有抗性的濃度存在時與siRNA接觸。作為SPARC抑制劑的siRNA分子實例包括，例如AATCC TGT CCA GGT GGA AGT A(SEQ ID NO1)；AAGCT CCA CCT GGA CTA CAT C(SEQ ID NO2)；和AATGA CAA GTA CAT CGC CCT G(SEQ ID NO3)。
在另一具體實施方案中，腫瘤細(xì)胞的生長通過使所述腫瘤細(xì)胞接觸抑制MetAP2/p67的siRNA而受抑制。或者，所述腫瘤細(xì)胞可在化療藥物以所述腫瘤細(xì)胞有抗性的濃度存在時接觸所述siRNA。作為MetAP2/p67抑制劑的siRNA分子實例包括，例如AAAGA TCA GCA TTG GAA GAT A(SEQ ID NO4)；AAGCA CAT CGA CAA GTT AGA A(SEQ ID NO5)；和AAACA GTG CCG ATT GTG AAA G(SEQ ID NO6)。
在另一具體實施方案中，腫瘤細(xì)胞的生長通過使所述腫瘤細(xì)胞接觸抑制需鈣蛋白酶2的siRNA而受抑制。或者，所述腫瘤細(xì)胞可在化療藥物以所述腫瘤細(xì)胞有抗性的濃度存在時接觸所述siRNA。作為需鈣蛋白酶2抑制劑的siRNA分子實例包括，例如AAGGC ATA CGC CAA GAT CAA C(SEQ ID NO7)；AAACT TCT TCC TGA CGA ATC G(SEQ ID NO8)；和AAACG CTA TTC AAG ATA TTT A(SEQ ID NO9)。
在另一具體實施方案中，腫瘤細(xì)胞的生長通過使所述腫瘤細(xì)胞接觸抑制S100A10的siRNA而受抑制?；蛘撸瞿[瘤細(xì)胞可在化療藥物以所述腫瘤細(xì)胞有抗性的濃度存在時接觸所述siRNA。作為S100A10抑制劑的siRNA分子實例包括，例如AAATG GAA CAC GCC ATG GAA A(SEQ ID NO59)；AAATT CGC TGG GGA TAA AGG C(SEQ ID NO60)；和AATAA TGA AGG ACC TGG ACC A(SEQ ID NO61)。
本發(fā)明也提供抑制、推遲或預(yù)防腫瘤細(xì)胞的生長的方法，該方法包括使所述腫瘤細(xì)胞接觸一或多種化療劑與細(xì)胞基因的至少一種抑制劑的組合的步驟，其中所述細(xì)胞基因是表1所示的基因.優(yōu)選，所述腫瘤細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞?；焺┰诒绢I(lǐng)域已知，其包括例如，順鉑、紫杉醇(paclitaxel)、脫羧鉑氨、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)、六甲基胺(hexamethylamine)、苯丙氨酸氮芥和蒽環(huán)類。
在一個具體實施方案中，表1所示的細(xì)胞基因的抑制劑可以是小分子抑制劑。本文所用的術(shù)語“小分子”指具有小于大約1500g/Mol的分子量的分子。小分子可以是例如，小的有機分子、肽或肽樣分子。舉個例子，適合于本發(fā)明方法的小分子抑制劑可以是需鈣蛋白酶抑制劑，如PD 147631、(25，35)-反-環(huán)氧琥珀酰-L-亮氨酰-酰胺基-3-甲基丁烷乙酯((25，35)-trans-epoxysuccinyl-L-leucy-lamido-3-methylbutane ethyl ester)，(E-64-d)、N-乙?；?亮氨?；?亮氨酰基-正亮氨酸(ALLN)、N-乙酰基-Leu-Leu-Met-al(ALLM或C19H35N3O4S)、或MDL 18270；或MetAP-2抑制劑，如TNP-470(也稱為AGM 1470或C19H28ClNO6)、煙曲霉素(C26H34O7)、順-煙曲霉素(見Kwon等，2000，J.Antibiot.53799-806)、fumagalone(見Zhou等，2003，J.Med.Chem.463452-3454)、或ovalicin(C16H24O4)。也見Han等，2000，Bioorganic & Medicinal Chem.Letters1039-43。
在一個具體實施方案中，表1所示的細(xì)胞基因的抑制劑可以是如上所限定的抑制劑。可用抑制劑的任何組合，例如表1所示的具體基因的多重(multiple)抑制劑、每種抑制一或多種具體基因的抑制劑組合、或抑制表1所示多種基因的抑制劑、或其任意組合。
在具體的具體實施方案中，本發(fā)明方法包含使腫瘤細(xì)胞接觸MetAP2的抑制劑和基于鉑的化療劑的組合的步驟。如果藥劑的主要組分是任選與紫杉醇(taxol)或環(huán)磷酰胺組合的順鉑或脫羧鉑氨，那么化療劑是“基于鉑的化療劑”。MetAP2的抑制劑可以是，例如煙曲霉素或煙曲霉素的衍生物、或MetAP2 siRNA諸如但不限于SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、或SEQ ID NO6。
本發(fā)明也提供了預(yù)測卵巢癌患者的腫瘤是否對化療有抗性的方法。在這些具體實施方案中，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因如表1所示；(b)檢測所述一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在對照樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是表1所示的基因；和(c)比較在步驟(a)中測定的被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的量和步驟(b)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中如果步驟(a)中的檢出量與步驟(b)中的檢出量相差達(dá)至少20％的因數(shù)，那么預(yù)測所述患者對化療有抗性。在一個具體實施方案中，該檢出量可以是表1所示基因的mRNA的量或由表1所示基因編碼的蛋白質(zhì)的量。在另一具體實施方案中，所述對照樣本是來自有反應(yīng)的或正常的受試者的生物樣本，即對治療有反應(yīng)的個體或無癌癥如卵巢癌的個體。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。
在一個具體實施方案中，步驟(a)和步驟(b)中被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082的一或多種，并且如果步驟(a)中所述被表達(dá)基因的量比步驟(b)中所述被表達(dá)基因的量高至少約20％，則預(yù)測患者的腫瘤對化療有抗性。
在具體的具體實施方案中，步驟(a)和步驟(b)中被表達(dá)的基因是Vinexinβ，G-CSFR，KLK6，SPARC，HYA22，需鈣蛋白酶2，SAPK/Erk1，SRB1，ADAR1，MRPL4，eIF5，eIF2Bε，WDR1，NM23D，鋅指蛋白-262MYM，RNPS1，S100A10，S100A11，或MetAP2的一或多種，并且如果步驟(a)中所述被表達(dá)基因的量比步驟(b)中所述被表達(dá)基因的量高至少約20％，則預(yù)測患者的腫瘤對化療有抗性。
在另一具體實施方案中，步驟(a)和步驟(b)中被表達(dá)的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MPP10，或MT1的一或多種，并且如果步驟(a)中所述被表達(dá)基因的量比步驟(b)中所述被表達(dá)基因的量低至少約20％、優(yōu)選約50％，則預(yù)測患者的腫瘤對化療有抗性。
在具體的具體實施方案中，步驟(a)和步驟(b)中被表達(dá)的基因是HMT1，eEF1ε，NAIP，RAB22A或MT1的一或多種，并且如果步驟(a)中所述被表達(dá)基因的量比步驟(b)中所述被表達(dá)基因的量低至少20％、優(yōu)選50％，則預(yù)測患者的腫瘤對化療有抗性。
因此，如本文所公開，本發(fā)明提供了基因表達(dá)或基因產(chǎn)物活性的一或多種模式，其包含多種差異(即以較高或較低量)表達(dá)的所述基因，或其中由所述基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在化療藥物抗性卵巢腫瘤細(xì)胞中的活性與在正常(即非腫瘤或化學(xué)敏感的)細(xì)胞中的活性不同。根據(jù)本發(fā)明方法，用所述差異的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)產(chǎn)物活性的模式來檢測生物樣本、最優(yōu)選腫瘤樣本中的化療藥物抗性細(xì)胞，并因此在醫(yī)生開始與高發(fā)病率和死亡率有關(guān)的無效療程之前可用于預(yù)測來自個體的腫瘤的藥物抗性。
那些本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)理解在本發(fā)明方法的實施中，可評估在患者腫瘤樣本中本發(fā)明鑒定的一或多種基因的表達(dá)。預(yù)計本發(fā)明鑒定的多種基因中的每一種都會顯示在一部分、最優(yōu)選很大一部分的分離自具體卵巢癌患者的個體腫瘤中用本文公開的方法檢測到的差異性基因表達(dá)。也希望隨顯示本發(fā)明公開的差異性基因表達(dá)的所述被分析基因的數(shù)量的增加，用本發(fā)明預(yù)測方法獲得的結(jié)果的可信度會增加。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明方法可用于在實際上用化療劑治療病人之前篩選需要化療的所述病人。因此，本發(fā)明方法可用于篩選患者，從而使護(hù)理者確定是否用具體化療劑治療該患者會無效。根據(jù)本發(fā)明方法預(yù)測為對化療無抗性的患者是用化療和/或表1所示基因的抑制劑治療的候選者。根據(jù)本發(fā)明方法預(yù)測對化療有抗性的患者可以是手術(shù)及其他和/或化療聯(lián)合表1所示基因的抑制劑、或其他治療方法的候選者。
在本發(fā)明方法的實施中，檢測基因表達(dá)可通過檢測編碼本發(fā)明鑒定的任何基因的mRNA在生物樣本中表達(dá)的量，例如通過雜交分析如Northern印跡或斑點印跡，或通過擴增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，更優(yōu)選與mRNA到cDNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)結(jié)合，甚更優(yōu)選用本領(lǐng)域已知的方法作定量實時RT-PCR，這些在本文都具體作了描述。其它方法包括檢測所述一或多種基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的量，在非限制性實施例中通過用蛋白質(zhì)特異性抗血清、更優(yōu)選對本發(fā)明鑒定的任何具體基因特異的抗體、更優(yōu)選單克隆抗體來分析生物樣本。蛋白質(zhì)表達(dá)水平也可通過分析生物樣本中所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物的酶或抗原活性來確定。本發(fā)明也提供了基因或抗體陣列來檢測基因在化療藥物抗性腫瘤、具體為卵巢和結(jié)腸腫瘤中的過表達(dá)或不足表達(dá)，其中在所述陣列中的核酸探針或抗體的排列在腫瘤樣本對化療藥物有抗性的時侯產(chǎn)生了可識別的、優(yōu)選機器可讀的模式，和/或在腫瘤樣本對化療藥物敏感的時候產(chǎn)生不同的可識別模式。
例如，根據(jù)本發(fā)明方法，確定在來自患者的生物樣本中表達(dá)的MetAP2的量，并與在患卵巢癌并對化療有反應(yīng)的人或患卵巢癌但不對化療有反應(yīng)的人中表達(dá)的MetAP2的量作比較。根據(jù)本文，如果化療具有減小腫瘤體積或停止腫瘤生長的作用，那么此人對化療“有反應(yīng)”。另外，術(shù)語“有反應(yīng)的患者”意指在手術(shù)切除后用化療治療并保持沒有疾病的臨床癥狀達(dá)至少6個月的個體。如果MetAP2在患者中的表達(dá)量等于或低于MetAP2在患卵巢癌并對化療有反應(yīng)的人中表達(dá)的量時，那么預(yù)測該患者對某種化療劑(例如基于鉑的化合物)有反應(yīng)。如果MetAP2在患者中的表達(dá)量高于MetAP2在患卵巢癌并對化療有反應(yīng)的人中表達(dá)的量時，那么預(yù)測該患者對化療劑有抗性。同樣，如果MetAP2在患者中的表達(dá)量高于MetAP2在患有癌癥但不對化療有反應(yīng)的人中表達(dá)的量時，那么預(yù)測該患者對化療劑有抗性。
如表1及下面的實施例所示，MetAP2在卵巢癌中的表達(dá)增加與對基于鉑的化療劑順鉑的抗性增加有關(guān)。所以，在一個具體實施方案中，當(dāng)MetAP2在來自癌癥患者的生物樣本中表達(dá)的測得量高于在有反應(yīng)個體中檢出的預(yù)確定量時，本發(fā)明方法可預(yù)測患者的腫瘤會對基于鉑的化療有抗性。在另一具體實施方案中，當(dāng)測定的MetAP2在來自癌癥患者的生物樣本中的表達(dá)量等于在有反應(yīng)個體中檢出的預(yù)確定量，但其中一或多種基因的表達(dá)比在有反應(yīng)患者中的表達(dá)增加，其中所述基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082，和/或一或多種HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10基因的表達(dá)相比在有反應(yīng)患者中的表達(dá)降低時，本發(fā)明方法可預(yù)測患者的腫瘤會對基于鉑的化療有抗性。
本發(fā)明還提供監(jiān)測在卵巢癌患者、具體為接受化療的卵巢癌患者中的疾病進(jìn)展的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2或MT1；(b)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(c)比較步驟(a)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量和步驟(b)中被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中通過檢測被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在隨后收集的生物樣本中的量相對于其在步驟(a)中的生物樣本中的量的變化來監(jiān)測疾病進(jìn)展。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。
如本文所述，當(dāng)步驟(a)和(b)中被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1或KIAA0082，并且步驟(b)中所述被表達(dá)基因或基因產(chǎn)物的檢出量高于步驟(a)中所述被表達(dá)基因或基因產(chǎn)物的量時，檢測到疾病的進(jìn)展。在某些具體實施方案中，所述患者在檢測步驟(a)中的基因表達(dá)量與檢測步驟(b)中的檢出量之間的時期接受化療或其他治療。
如本文所述，當(dāng)步驟(a)和(b)中被表達(dá)的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10，并且步驟(b)中所述被表達(dá)基因或基因產(chǎn)物的檢出量低于步驟(a)中所述被表達(dá)基因或基因產(chǎn)物的量時，檢測疾病的進(jìn)展。
在某些具體實施方案中，所述患者在檢測步驟(a)中的基因表達(dá)量與檢測步驟(b)中的檢出量之間的時期接受化療或其他治療。在某些具體實施方案中，所述檢出量可以是表1所示的基因的mRNA的量或表1所示的基因編碼的蛋白質(zhì)的量。
根據(jù)本發(fā)明監(jiān)測患者的卵巢癌進(jìn)展的方法可用于，例如確定患者是否對某種治療方案，如化療方案有正或負(fù)反應(yīng)(responding positively ornegatiVely)。
例如，當(dāng)S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082在取自開始某治療方案后患者的生物樣本中的表達(dá)量與在所述治療方案開始前或開始時所取的生物樣本中所述基因的表達(dá)量相比相等或較高時，該患者有負(fù)反應(yīng)。另一實施例中，當(dāng)HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10在患者開始某治療方案后取自該患者的生物樣本中的表達(dá)與所述被表達(dá)基因在所述治療方案開始前或開始時所取的生物樣本中的量相比相等或較低時，該患者有負(fù)反應(yīng)。此時，護(hù)理者可確定該治療方案不太有效。
或者，當(dāng)S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082在患者開始某治療方案后一段時間取自該患者的生物樣本中的表達(dá)比所述被表達(dá)基因在所述治療方案開始前或開始時所取的生物樣本中的量低時，該患者有正反應(yīng)，并且不需要改變治療。另外，當(dāng)HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10在患者開始某治療方案后一段時間取自該患者的生物樣本中的表達(dá)比所述被表達(dá)基因在所述治療方案開始前或開始時所取的生物樣本中的量高時，該患者有正反應(yīng)。
另外，本發(fā)明提供監(jiān)測藥物組合物作為治療患者癌癥的藥劑的有效性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)將一定量的藥物組合物給予所述患者；(c)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(d)比較步驟(a)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量和步驟(c)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中通過檢測所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在隨后收集的生物樣本中的量相對于其在步驟(a)中的生物樣本中的量的變化來監(jiān)測所述藥物組合物的有效性。如果基因表達(dá)在用所述藥物組合物治療后收集的生物樣本中相比在用所述藥物組合物治療前收集的生物樣本中較高或相等，并且在用所述藥物組合物治療過程中腫瘤生長未變慢、推遲或被抑制，所述藥物組合物可被認(rèn)為對于治療所述患者的癌癥是無效的。例如，如果S100A10 mRNA在取自用藥物組合物治療后的患者的樣本中的量較高，那么預(yù)測該患者對于用該藥物組合物進(jìn)一步治療是有抗性的。因此，該藥物組合物被認(rèn)為對于所述患者的癌癥無效。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。
本發(fā)明還提供監(jiān)測藥物組合物作為治療患者癌癥的藥劑的有效性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)將一定量的藥物組合物給予所述患者；(c)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(d)比較步驟(a)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量和步驟(c)中所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的檢出量，其中通過檢測所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在用所述藥物組合物治療后收集的生物樣本中相對于在步驟(a)中用的生物樣本(即在用所述藥物組合物治療前)中的量的變化來監(jiān)測所述藥物組合物的有效性。如果一或多種所述基因的基因表達(dá)在隨后收集的生物樣本(即在用所述藥物組合物治療后收集)中相比在之前收集(即在用所述藥物組合物治療前收集)的生物樣本中較低或相等，并且在用所述藥物組合物治療中腫瘤生長未變慢、推遲或被抑制，所述藥物組合物可被認(rèn)為對于治療所述患者的癌癥無效，并且預(yù)測該患者對于用該藥物組合物進(jìn)一步治療有抗性。因此，該藥物組合物被認(rèn)為對于該患者的癌癥無效。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。
本文所用的“藥物組合物”可以是包含化合物的任何配制劑(例如蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、非肽有機分子、無機小分子、或核酸分子)，所述化合物用于治療或檢測治療癌癥如結(jié)腸或卵巢癌的能力。
本發(fā)明也提供鑒定抑制腫瘤細(xì)胞、具體為化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞、最具體為化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞的生長的化合物的方法。在這些具體實施方案中，所述方法包含如下步驟(a)使表達(dá)在化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)的一或多種基因的細(xì)胞接觸被試化合物，其中所述基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)檢測所述基因在所述被試化合物存在和缺無時的表達(dá)；和(c)比較所述基因在所述化合物存在時的表達(dá)和所述基因在所述被試化合物缺無時的表達(dá)，其中當(dāng)所述基因在所述被試化合物存在時的表達(dá)相對所述基因在所述被試化合物缺無時的表達(dá)降低時，該化合物被鑒定為抑制化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞生長的化合物。在具體方面，所述生物樣本是腫瘤樣本。在某些具體實施方案中，所述化合物能在化療藥物存在時抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
另外，本發(fā)明提供了鑒定抑制腫瘤細(xì)胞、具體為化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞、最具體為化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞的生長的化合物的方法，所述方法包含如下步驟(a)使表達(dá)在化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞中以低于正常的水平表達(dá)的一或多種基因的細(xì)胞接觸被試化合物，其中所述基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)檢測所述基因在所述被試化合物存在和缺無時的表達(dá)；和(c)比較所述基因在所述被試化合物存在時和缺無時的表達(dá)，其中當(dāng)所述基因在所述被試化合物存在時的表達(dá)相對所述基因在所述被試化合物缺無時的表達(dá)升高時，該化合物被鑒定為抑制化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞生長的化合物。在一個具體實施方案中，所述化合物能在化療藥物存在時抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
如下實施例，包括所進(jìn)行的試驗及獲得的結(jié)果，均僅為舉例的目的來提供，并非旨在限制本發(fā)明。
實施例實施例1MTT細(xì)胞增殖分析利用MTT細(xì)胞增殖分析，根據(jù)五種卵巢癌細(xì)胞系(OVCA 429，OVCA 433，OVCA 432，HEY和HEYA8)對順鉑的敏感性水平來對其進(jìn)行分級。
使細(xì)胞在含5％胎牛血清(FBS，熱滅活)，1％抗生素/抗真菌的混合物(Invitrogen)的極限Eagle’s培養(yǎng)基(Minimal Eagle’s Media，MEMα，得自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中生長。通過將染料溶解于HBSS(Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution))、過濾該混合物并在-20℃以1ml等份貯存，來制備MTT母液(5mg/mL；CALBIOCHEM，San Diego，CA)。每9ml培養(yǎng)基使用1ml的MTT母液(總體積10ml)。用不透明的蓋覆蓋平板來使細(xì)胞避光。
將每個細(xì)胞系用5，25，50，100和200μM順鉑處理4，8和24小時。在96孔板上用順鉑處理后96小時后進(jìn)行MTT分析。從所述細(xì)胞中取出培養(yǎng)基并將200μl新鮮MTT培養(yǎng)基加入所述細(xì)胞以及作對照的空白孔。在正常細(xì)胞培養(yǎng)條件溫育細(xì)胞3-4小時。然后檢查細(xì)胞的甲晶體形成，這是代謝活性的指標(biāo)。取出培養(yǎng)基并向孔和對照孔加入200μl的2-丙醇。在所有晶體都均勻溶解后，在黑暗中于室溫溫育所述細(xì)胞20分鐘。在570nm在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器(reader)上讀結(jié)果。
圖39(上圖)顯示了在這些研究中使用的5個卵巢癌細(xì)胞系暴露于不同濃度的順鉑4小時之后的MTT分析結(jié)果。根據(jù)每個細(xì)胞系在整個順鉑濃度范圍及所用的處理時間中的表現(xiàn)，以降低的抗性水平將這些細(xì)胞劃分等級為OVCA 429＜OVCA 433＜HEY A8＜OVCA 432＜HEY(下圖)。
對于具體基因，基本如上述進(jìn)行包括使細(xì)胞暴露于siRNA或藥物抑制劑的MTT分析。所述細(xì)胞在用0，3.12，6.25，12.5，25，50，100和200μM順鉑處理24小時前預(yù)先用siRNAs處理48小時。對于組合型藥物處理試驗(煙曲霉素或ALLN)，使所述細(xì)胞接受濃度增加的所述被試藥物及0，3.12，6.25，12.5，25，50，100和200μM順鉑的組合治療24小時。
實施例2cDNA微陣列，Northern印跡，和定量實時PCR分析用實施例1所述的細(xì)胞系進(jìn)行微陣列分析。從每個細(xì)胞系收集細(xì)胞沉淀物(pellet)，并通過將沉淀物溶解在1ml TRI-Reagent(得自Molecular ResearchCenter，Inc，Cincinnati，OH)或Trizol(Invitrogen)中來從所述細(xì)胞分離RNA。然后將樣本靜置5分鐘。通過向樣本加入100μl的1-溴-3-氯丙酮(BCP)來完成相分離。振搖15秒后，在室溫溫育樣本15分鐘，然后在4-25℃以13,000RCF離心16分鐘。用移液管移取上清并置于新的微量離心(microfuge)管中。然后通過將此上清與500μ新鮮異丙酮混合、在室溫溫育10分鐘、再在4-25℃以13,000RCF離心9分鐘來沉淀RNA。然后從試管中取出上清，通過向試管加入1ml的75％乙醇、渦旋振蕩、再在4-25℃以13,000RCF離心6分鐘來洗滌沉淀物。取出液體并空氣干燥所述沉淀物約8分鐘。所述然后將沉淀物溶解于無RNase的水中并置于冰上待用或貯存于-80℃。
用包含已確認(rèn)超過5000個序列的cDNA克隆的微陣列(得自ResearchGenetics Inc.)來研究(interrogate)在這些細(xì)胞中的基因表達(dá)；根據(jù)生產(chǎn)者的說明書進(jìn)行所有的微陣列分析。已知在卵巢組織中表達(dá)每個克隆。用在抗性最強的細(xì)胞系(OVCA 429)中的基因表達(dá)作為在其他所比較細(xì)胞系中的基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。這些數(shù)據(jù)的分析表明OVCA 429相對于更敏感的細(xì)胞系以升高的水平表達(dá)了196個基因并以降低的水平表達(dá)了83個基因。
選擇滿足如下標(biāo)準(zhǔn)的基因作進(jìn)一步分析其表達(dá)與在雙份膜上檢出的標(biāo)準(zhǔn)相比有至少2-倍的差異；在4個細(xì)胞系中的3個檢出其相對于標(biāo)準(zhǔn)(OVCA429)的差異表達(dá)；和其表達(dá)水平與每個細(xì)胞系對順鉑的敏感性一致。過表達(dá)的基因在OVCA 429細(xì)胞中表達(dá)很高，并且表達(dá)通常遞減(tapered off)直到在抗性最弱的細(xì)胞系HEY中達(dá)到了最低的表達(dá)水平(對于在OVCA 429細(xì)胞中以較低水平表達(dá)的基因反之亦然)。
將與在其它細(xì)胞系中的情況相比在抗性最強的細(xì)胞系(OVCA 429)中差異表達(dá)(較高或較低的水平)的基因的Northern印跡分析和定量實時PCR分析用于確認(rèn)微陣列的數(shù)據(jù)并鑒定目的基因來作進(jìn)一步分析。所鑒定出的基因列于表2，表中顯示了基因名稱，在細(xì)胞系中的表達(dá)模式的總結(jié)，及顯示表達(dá)分析結(jié)果的圖。
表2



*GeneCard是在Rehovot，以色列的Weizmann Institute of Science的注冊商標(biāo)，并且在任何時候可以做多次轉(zhuǎn)讓。
Northern印跡分析為確認(rèn)微陣列分析鑒定的表達(dá)模式，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，用NorthernMax Protocol(Ambion Corp.，Austin，TX)來進(jìn)行Northern印跡分析，且DNA探針用Strip-EZ DNA標(biāo)記試劑盒(Ambion)來標(biāo)記。
定量實時PCR合成cDNA是通過將1μg從卵巢癌細(xì)胞系分離的總細(xì)胞RNA，1μl oligodT和水混合至最終體積12μl，在70℃溫育此混合物10分鐘，然后向該混合物加入5μl 2X Reaction Mix，2μl DTT，和1μl的Superscript II Enzyme(Invitrogen)。然后在42℃溫育此反應(yīng)混合物60分鐘。制備從1∶4到1∶256的cDNA稀釋物。用Qiagen QuantiTect SYBR Green PCR Handbook(QiagenCorp.，Valencia，CA)制備終體積為50μl/孔的主混合物(master mixes)。對于平板所用的每個孔，將25μl 2X QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(Qiagen)，0.3μM正向引物，0.3μM反向引物，和無RNase的水加至終體積45μl。
將每個基因的主混合物充分混合，并將合適的體積如下分散到PCR試管或平板中無模板(對照)＝45μl主基因混合物+5μl H2O；緩沖液空白＝25μl H2O+25μl SYBR混合物；及被試樣本＝45μl主基因混合物+5μl cDNA(如上稀釋)。
用ABI Prism 7700(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)序列檢測系統(tǒng)或MJ Research(Waltham，MA)Opticon II系統(tǒng)如下確定序列在95℃進(jìn)行PCR起始活化步驟15分鐘；將樣本在94℃變性15秒，在53℃退火30秒(使用Opticon II系統(tǒng)時是55℃)，并在72℃延伸30秒(在此步驟獲得數(shù)據(jù))；重復(fù)此PCR反應(yīng)50個循環(huán)。通過加入如下步驟95℃ 15秒，60℃ 20秒，和95℃ 20秒來進(jìn)行解鏈曲線分析。
另外，從得自化學(xué)敏感的(即有反應(yīng)的)和化學(xué)抗性的(即無反應(yīng)的)卵巢癌患者的組織樣本制備RNA，所述患者已經(jīng)用基于鉑的化療劑治療過。通過在1ml TRI-Reagent或Trizol中勻漿化50-100mg組織樣本直至該組織液化來分離RNA。然后將所述樣本靜置5分鐘。通過向該樣本加入100μl BCP來完成相分離。振搖15秒后，在室溫溫育樣本15分鐘，再在4-25℃以13,000xg(相對離心力，RCF)離心9分鐘。用移液管取出上清并置于新的微量離心管。然后通過將此上清與500μl新鮮異丙酮混合、在室溫溫育20分鐘、再在4-25℃以13,000RCF離心9分鐘來沉淀RNA。然后從試管中取出上清，通過向試管加入1ml的75％乙醇、渦旋振蕩、再在4-25℃以13,000RCF離心6分鐘來洗滌沉淀物。取出液體并空氣干燥所述沉淀物約8分鐘。然后將該沉淀物溶解于無RNase的水中并置于冰上待用或貯存于-80℃。
用針對表3所示基因的引物進(jìn)行定量實時PCR來檢測化學(xué)敏感和化學(xué)抗性患者的基因表達(dá)改變。用18S RNA的表達(dá)來校對被表達(dá)基因的值。結(jié)果見下表3所示。這些結(jié)果證明了用細(xì)胞系的RNA進(jìn)行實驗的觀察結(jié)果。
表3


*此差異反映了在化學(xué)抗性患者中的基因表達(dá)降低用下述引物序列通過實時PCR來證實基因表達(dá)250654(此基因最初用特異的分子信標(biāo)(beacon)探針來證實，但隨后的研究是用SYBR green進(jìn)行的)分子信標(biāo)證實信標(biāo)FAM-CGCGTATGAACTGGGCTTATGTGACGCG-DABCYL(SEQ ID NO13)側(cè)接的正向引物CTGGGCTCTGCCTTAAACAC(SEQ ID NO14)側(cè)接的反向引物GCTCCCAAAAGTTTGAACCA(SEQ ID NO15)內(nèi)部的正向引物TTGCCTGAGGCTGTAACTGA(SEQ ID NO16)
內(nèi)部的反向引物GCTCCCAAAAGTTTGAACCA(SEQ ID NO62)對于SYBR green正向CCA CTT CTT TGC CAC AAA GT(SEQ ID NO17)反向GAA TTC GGT CAG CTC AGA GT(SEQ ID NO18)810612(此基因用特異的分子信標(biāo)探針來證實)信標(biāo)FAM-CGCCTGGGTGGGTTTGAAGGAGGCG-DABCYL(SEQID NO19)側(cè)接的正向引物ATCGAGTCCCTGATTGCTGT(SEQ ID NO20)側(cè)接的反向引物GCCTGCATGAGGTGGTTAGT(SEQ ID NO21)內(nèi)部正向引物CTTGCCATGACTCCTTCCTC(SEQ ID NO22)內(nèi)部反向引物GCCTGCATGAGGTGGTTAGT(SEQ ID NO63)39093正向GCA GAA GCA CAT CGA CAA GT(SEQ ID NO23)反向GCC TGC ATT TAA TCC ATT CTC(SEQ ID NO24)882511正向TAA CCA CGT CCT GCT GAA GT(SEQ ID NO25)反向GCT TTAAGAAAG TTC TTATCAAC(SEQ ID NO26)950367正向GCA CAG CGG AGT GGT AAG A(SEQ ID NO27)反向CAG AGG AGT CAG ACA CAT TG(SEQ ID NO28)34140正向GTA TAC TTA CTT CAG TGC TGT T(SEQ ID NO29)反向CAT TCT TGC TAT AAC GTT TAA CA(SEQ ID NO30)726147正向CTC TGT GAC TTC GGC ATC A(SEQ ID NO31)反向CAG ACA TCA GAG CGG ACA T(SEQ ID NO32)427980正向AAG AAC TGG GTT CAG TGG AAA(SEQ ID NO33)反向GAG AGT GCA TGG TCT TGA GT(SEQ ID NO34)123980正向AGC CAC CAG CTA AGT ACC TT(SEQ ID NO35)
反向CAT CGA TTT CAA CCG GAA CAA(SEQ ID NO36)824568正向GTG TGT GGA CCT CCA TGT TA(SEQ ID NO37)反向AGC ACA CCA TTA CAG ACA AGT(SEQ ID NO38)1636620正向GGA ACC AGT TTC TGC AGG AA(SEQ ID NO39)反向CTC CAG CAG CAC CTC AAT G(SEQ ID NO40)809639正向ATC CAA GGT TAT GTG GTT TCT T(SEQ ID NO41)反向CAC CTC CTG GGC TTC TGA A(SEQ ID NO42)756687正向GAT CCA TGA AGC TAA TGT ACA A(SEQ ID NO43)反向ACG GGC AGA AGC CTT CGT T(SEQ ID NO44)845441正向CCT GAG GTT CTC CGA GAT G(SEQ ID NO45)反向TCC AGC CCG AAA TTC TCT GT(SEQ ID NO46)68605正向CAA GAG GCG GAA GGG TAA A(SEQ ID NO47)反向1CAG CCG CTC GGG TAG GT(SEQ ID NO48)反向2CAC TAT GGA AGG ACC TTG CT(SEQ ID NO49)838636正向GGA TAC AGG TGT AGG TAA ATC(SEQ ID NO50)反向TCC CAG ATT AGG AAT TTA TGT A(SEQ ID NO51)345077正向CTT CTG GAA CAG GCG AAG A(SEQ ID NO52)反向1GCT GGC CCA GAC GAC GAA(SEQ ID NO53)反向2GCA GAC ACA CGT GGA TGG T(SEQ ID NO54)825214正向GAT GAA GTT AAA TCC TCC TTT G(SEQ ID NO55)反向CCT CTT CTG TGC TGT CAC TT(SEQ ID NO56)297392
正向CCT GCA AGA AGA GCT GCT G(SEQ ID NO57)反向CAC AGC TGT CCT GGC ATC A(SEQ ID NO58)897594正向AGC ACC AGC ACT GGC TCA TCA A(SEQ ID NO 109)反向AGA GCC AGA AGA GCT GCT A(SEQ ID NO 110)713886正向AAC CGA CAA GTG TGA CAA CT(SEQ ID NO 111)’反向TGT GCC TTG CGG GCA GTA(SEQ ID NO 112)884867正向C ACC ACC ACC ACC AAA TGA A(SEQ ID NO 113)反向CA TCC ATT CGA CGC CTT TGA(SEQ ID NO 114)321247正向CCA GCA GCA CAG TCA ACA AA(SEQ ID NO 115)反向TGG TAG CTT CTG CTT CAC AA(SEQ ID NO 116)1630998正向CCA GAG CTG CAC TCA TTC C(SEQ ID NO 117)反向CAC TGT TGG TGA TAA AGC AAT T(SEQ ID NO 118)756595正向GGA TAA AGG CTA CTT AAC AAA G(SEQ ID NO 119)反向CCA CTT TGC CAT CTC TAC AC(SEQ ID NO 120)549728正向GAG CCG AGG AGG TTG AAA G(SEQ ID NO 121)反向CTC CTC TGG GTC TAT AGT GT(SEQ ID NO 122)203003正向GAC CCT GGT GGC GGT GAA(SEQ ID NO 123)反向GGT GCC TGC AGC ATC TTC A(SEQ ID NO 124)814731正向GGA GAG CCC TGG CAC GTA(SEQ ID NO 125)反向CCT TCA TCT GCA GGT TCT TG(SEQ ID NO 126)714196正向ACG ACG GAC ACA TTA ATT ACT(SEQ ID NO 127)
反向TCC ATG CTG CAG CTG ATG A(SEQ ID NO 128)809784正向C CTT CGG CAA AGG GAG AGT(SEQ ID NO 128)反向CTG GAT GAG TTC AGA GAG TTT(SEQ ID NO 130)825293正向GCC TCG ACA GGC AGA GAT(SEQ ID NO 131)反向CTT GTA GCT GAA GAT GTC AAT(SEQ ID NO 132)246120正向CTC TAT GCC CGG GAC AAG T(SEQ ID NO 133)反向AAG ACA TGT CGA AGC CAT ACA(SEQ ID NO 134)’在對順鉑有抗性的卵巢癌細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)的基因的總結(jié)編碼EF-手性(Hand)蛋白質(zhì)的基因鑒定五個編碼鈣-活化性EF-手性蛋白質(zhì)的基因，即S100A10，S100A11，SPARC，需鈣蛋白酶2和粒鈣蛋白。四個基因中的兩個，S100A10和S100A11的位置在第1條染色體的1q21彼此毗連(Pejovic，1995，Ann.Med.2773-78；Ridinger等，1998，Biochimica et Biophysica Acta1448254-263)。第1條染色體的此區(qū)域已經(jīng)被報道為卵巢癌中染色體重排的溫床(hotbed)之一(Pejovic，1995，Ann.Med.2773-78)。S100A10和S100A11的確切生物學(xué)功能未知。S100A10和S100A11都在抗性較強的卵巢癌細(xì)胞系中以較高水平表達(dá)(分別見圖1和圖2)。圖3顯示S100A10和S100A11的mRNA在對化療抗性較強的患者中相對于對化療反應(yīng)性較強的患者中也是升高的。
SPARC(也稱為骨粘連蛋白和BM40)是分泌型蛋白質(zhì)(Lane and Sage，1994，F(xiàn)ASEB J.8163-173)。已經(jīng)顯示SPARC在患腫瘤的卵巢(neoplasticovaries)的基質(zhì)中是高表達(dá)的(Paley等，2000，Gynecologic Oncology78336-341)，并會誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡(Yiu等，2001，Am.J.Pathol.159609-622)。然而，已經(jīng)在黑素瘤(Ledda等，1997，J.Invest.Dermatol.108210-214)和結(jié)腸直腸癌(Porte等，1995，Int.J.Cancer6470-5)中檢出SPARC的高水平，還已經(jīng)報道它在前列腺癌(Thomas等，2000，Clin.CancerRes.61140-9)和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Golembieski等，1999，Iht.J.Dev.Neurosci.17463-72)中促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵入。SPARC的過表達(dá)也有助于乳腺癌細(xì)胞的移動性和侵入性增強(Briggs等，2002，Oncogene217077-91)。如本文所示，發(fā)現(xiàn)SPARC在化學(xué)抗性較強的卵巢癌細(xì)胞系中以較高水平表達(dá)(圖4)。如圖5所示，SPARC mRNA在取自腫瘤復(fù)發(fā)的患者的樣本中也是升高的。
需鈣蛋白酶2是鈣-活化性蛋白酶。近來報道需鈣蛋白酶2活性的抑制劑誘導(dǎo)了在人急性成淋巴細(xì)胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤以及實體腫瘤細(xì)胞中的凋亡(Huang and Wang，2001，TRENDS in Molecular Medicine7355)。需鈣蛋白酶2mRNA的水平在化學(xué)抗性較強的卵巢癌細(xì)胞系中是升高的(圖6)。
粒鈣蛋白是近來描述的Ca2+-結(jié)合型蛋白質(zhì)，其屬于EF-手性蛋白質(zhì)的五(penta)-EF-手性亞家族，并經(jīng)Ca2+結(jié)合易位到膜(Lollike等，2001，J.Biol.Chem.27617762-9)。發(fā)現(xiàn)與對用順鉑處理反應(yīng)性較強的細(xì)胞系相比，粒鈣蛋白mRNA在對順鉑抗性較強的細(xì)胞系中是升高的(圖7)。
編碼參與蛋白質(zhì)翻譯和翻譯控制的蛋白質(zhì)的基因MetAP2蛋氨酸氨基肽酶2(也稱為eIF-2相關(guān)的p67)的表達(dá)從未與卵巢癌有關(guān)。此基因編碼的蛋白質(zhì)似乎具有兩種功能。它從新合成的蛋白質(zhì)除去了第一個蛋氨酸(Li and Chang，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.227152-9)，并且它也與真核生物起始因子2(eIF-2；GTP結(jié)合蛋白質(zhì))相關(guān)并抑制其磷酸化(Wu等，1993，J.Biol.Chem.26810796-10801)。用針對MetAP2的抗體，顯示MetAP2表達(dá)在抗性最強的細(xì)胞系OVCA 429中是升高的并且在Hey(對順鉑最敏感的細(xì)胞系；見圖8)中是下調(diào)的。并且，在檢查組織樣本中的MetAP2 mRNA表達(dá)時，所述樣本來自對基于順鉑的化療具有不同抗性水平的三名患者，顯示出相對于對化療具有中等(CAP2；圖9)和低(CAP1；圖9)水平抗性的患者，MetAP2在來自抗性最強的患者(CAP3；圖9)的樣本中升高得最多。特異性靶向MetAP2的藥物TNP-470現(xiàn)在是臨床試驗中對于多種人類腫瘤的血管生成抑制劑(Kruger and Figg，2000，Expert Opin.Investig.Drugs91383-96)。并且，用反義寡核苷酸降低MetAP2的細(xì)胞水平已經(jīng)顯示誘導(dǎo)凋亡(Datta and Datta，1999，Exp.Cell Res.246376-83)。這些觀察結(jié)果提示此蛋白質(zhì)可以是卵巢癌療法的重要靶標(biāo)。
eIF5是起GTPase-活化劑蛋白質(zhì)作用的翻譯起始和蛋白質(zhì)合成的另一種中心(central)蛋白質(zhì)(Paulin等，2001，Current Biol.1155-9；Das等，2001，J.Bio.Chem.2766720-6)。檢出兩種轉(zhuǎn)錄物且它們的表達(dá)水平在對順鉑抗性水平最強的卵巢癌細(xì)胞系(圖10)和抗性較強的患者(圖11)中都是升高的。
eIF2Bε的mRNA在顯示對順鉑抗性最強的卵巢癌細(xì)胞系中上調(diào)(圖12)。由此基因編碼的蛋白質(zhì)是由5個亞單位組成(comprised of)的鳥苷酸交換因子復(fù)合物的調(diào)節(jié)性ε-亞單元(Proud，2001，Prog.Mol.Subcell.Biol.2695-114)。
eEF1εmRNA在顯示了對順鉑的最高抗性水平的卵巢癌細(xì)胞系中下調(diào)(圖13)。eEFs涉及多肽裝配(Browne and Proud，2002，Eur.J.Biochem.2695360-8)。
激酶SAPK/Erk激酶1是活化JNK1，JNK2和p38但不活化Erk1或Erk2的雙特異性激酶(Cuenda，2000，Int.J.Buochem.Cell Biol.32581-7)。目前未發(fā)現(xiàn)此基因及其蛋白質(zhì)至今都不與卵巢癌有關(guān)。發(fā)現(xiàn)此基因的mRNA水平在抗性較強的細(xì)胞系中相對于較敏感的細(xì)胞系中是升高的(圖14)。
TESK2此絲氨酸/蘇氨酸激酶主要位于細(xì)胞核。然而它在未活化時易位到胞質(zhì)。TESK2特異性磷酸化肌動蛋白絲切蛋白(cofilin)(在Ser-3)，肌動蛋白絲切蛋白是與肌動蛋白解聚因子一起通過刺激肌動蛋白纖絲的解聚和切割(severance)在肌動蛋白纖絲的快速轉(zhuǎn)換(turnover)和基于肌動蛋白的再組織中起主要作用的蛋白質(zhì)(Toshima，2001，J.Biol.Chem.27631449-58)。以前沒有報道過TESK2與卵巢癌的聯(lián)系。TESK2 mRNA在抗性較強的細(xì)胞系中升高(圖15)。
FAST激酶這是Fas-活化的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它被認(rèn)為與Fas介導(dǎo)的凋亡有關(guān)(Tian等，1995，J.Exp.Med.182865-74)。FAST激酶mRNA在化學(xué)抗性較強的細(xì)胞系中升高(圖16)。
其他KLK6這是也稱作酶和甘油磷酸鈣的絲氨酸蛋白酶。此基因?qū)儆谌思る尼尫琶?kallilrein)基因家族，該家族也包括了解得較多的分子，如前列腺特異性基因(PSA)，該基因已經(jīng)被用作前列腺癌的標(biāo)記物并且也作為卵巢癌的標(biāo)記物被研究過(Diamandis，2000，Clinical Biochem.33579-83)。已經(jīng)報道在患卵巢癌的患者中KLK6的血清水平相對于正常對照升高(Diamandis，2000，Clinical Biochem.33579-83)。此基因的表達(dá)水平在化學(xué)抗性較強的被試細(xì)胞系中升高(圖17)。也應(yīng)注意到此基因位于在卵巢癌中通常發(fā)生染色體重排的另一區(qū)域(Pejovic，1995，Ann.Med.2773-78)。
HMT1(也稱作PRMT1)此基因編碼蛋白質(zhì)精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，發(fā)現(xiàn)其兩種變體的表達(dá)在乳腺癌中下調(diào)(Scorlis等，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.278349-59)。HMT1的表達(dá)在對順鉑抗性較強的細(xì)胞中下調(diào)(見圖18)。有趣的是注意到HMT1位于第19條染色體19q13.3上與編碼KLK6殘基的基因相同的染色體區(qū)域。
ARA9(也稱作芳香烴受體相互作用蛋白質(zhì)(AIP)和XAP2)據(jù)認(rèn)為在AHR-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中起作用(Kazlauskas等，2002，J.Biol.Chem.27711795-801)。此基因的mRNA在對順鉑抗性較強的細(xì)胞系中升高(圖19)。它也位于與卵巢癌相關(guān)的、染色體重排頻率升高的另一個區(qū)域，即第11條染色體(在11q 13.3)(Pejovic，1995，Ann.Med.2773-78)。
鈣調(diào)理蛋白2已經(jīng)在肌上皮癌中但未在卵巢癌中被研究過(Mosunjac等，2000，Diagn.Cytophathol.23151-5)。相對于較敏感的卵巢癌細(xì)胞系中的情況，鈣調(diào)理蛋白2的表達(dá)在對順鉑抗性較強的細(xì)胞系中輕微升高(圖20)。
神經(jīng)元凋亡抑制性蛋白質(zhì)(neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP)據(jù)發(fā)現(xiàn)在對順鉑抗性最強的細(xì)胞系中輕微下調(diào)(圖21)。NAIP從未與卵巢癌有聯(lián)系(Tamm等，2000，Clin.Cancer Res.61796-1803)。
RNA結(jié)合性蛋白質(zhì)S1(RNPS1)是前信使mRNA剪接的常用活化劑并可形成參與促進(jìn)凋亡的ASAP及SART3腫瘤抵抗抗原(tumor rejection antigen)的復(fù)合體(Schwerk等，2003，Mol.Cell Biol.232981-90；Harada等，2001，Int.J.Cancer93623-8)。據(jù)發(fā)現(xiàn)其水平在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高(圖22)。
熱休克轉(zhuǎn)錄因子2(HSF2)調(diào)節(jié)熱休克蛋白質(zhì)基因的表達(dá)(Mathew等，1998，Mol.Cell Biol.185091-8)。HSF2也顯示能夠與蛋白磷酸酶2A(PP2A)的催化亞單元競爭結(jié)合其調(diào)節(jié)亞單元PR65，并被認(rèn)為作為新的PP2A調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(Hong等，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.27284-9)。HSF2的mRNA水平在抗性較強的細(xì)胞系中升高(圖23)。
WDR1WD-重復(fù)蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)于所有真核生物中，并在調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞功能包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄和增殖中起重要作用(Li等，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.274117-23)。然而，WDR1的確切功能未知。此基因的mRNA在抗性較強的細(xì)胞系中相對較敏感的細(xì)胞系升高(圖24)。
Ft1此基因的開放閱讀框架顯示了與遍在蛋白結(jié)合酶的相似性，且在小鼠中它的位置與Rb-相關(guān)的p130基因鄰近(Lesche等，1997，Mamm.Genome8879-83)。從細(xì)胞遺傳學(xué)角度，F(xiàn)t1位于第16條染色體的區(qū)域16q12.2，此區(qū)域在人類癌癥中反復(fù)發(fā)生改變。已經(jīng)報道了在卵巢癌中此染色體區(qū)域出現(xiàn)了雜合性的丟失。Ft1 mRNA的水平在對順鉑抗性較強的細(xì)胞系中升高(圖25)。
NME4(也稱作nm23-h4)是在腎細(xì)胞癌中中度過表達(dá)并且在結(jié)腸直腸癌中高度過表達(dá)的二磷酸核苷激酶(Hayer等，2001，Anticancer Res.212821-5)。NME4 mRNA在抗性較強的細(xì)胞系中升高(圖26)。
ADAR1包括ADAR1腺苷脫氨酶所編輯的腺苷到肌苷(adenosine-to-inosine)RNA導(dǎo)致旁路剪接位點產(chǎn)生或密碼子改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能改變(Wang等，2000，Science2901765)。有意思的是還注意到ADAR1基因位于第1條染色體的1q21.1-q21.2上與S100A10和S100A11相同的頻繁重排的染色體區(qū)域中(Pejovic，1995，Ann.Med.2773-78)。ADAR1mRNA在對順鉑抗性較強的細(xì)胞系中升高(圖27)。
NBR1NBR1的確切分子功能未知。(那些本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到在本發(fā)明方法中基因的有用性不依賴于基因的具體或確切概念或功能特征)。作圖研究顯示NBR1基因與BRCA1基因頭對頭(Whitehouse等，2002，Eur.J.Biochem.269538-45)。NBR1未報道與卵巢癌相關(guān)。NBR1 mRNA在順鉑抗性最強的細(xì)胞系OVCA 429中升高(圖28)。
鋅指蛋白262/MYM編碼包含MYM鋅結(jié)合基序的蛋白質(zhì)的基因家族的成員(Smedley等，1999，Genomics60244-7)。此蛋白質(zhì)從未與卵巢癌相關(guān)；然而，與其他被試的細(xì)胞系中的情況相比，此基因的mRNA在化學(xué)抗性最強的細(xì)胞系中升高(圖29)。
MRPL4此基因及其蛋白質(zhì)從未與卵巢癌相關(guān)。然而，此基因位于在卵巢癌中頻繁重排的染色體區(qū)域，第19條染色體的19p13.2(Pejovic，1995，Ann.Med.2773-78)。MRPL4 mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高(圖30)。
HYA22此基因及其蛋白質(zhì)從未與卵巢癌相關(guān)。然而，此基因位于在卵巢癌中與染色體重排有關(guān)的區(qū)域，第3條染色體的3p21.3(Pejovic，1995，Ann.Med.2773-78；Protopopov等，2003，Cancer Res.63404-12；Senchenko等，2003，Oncogene222984-92)。HYA22 mRNA在對順鉑抗性較強的細(xì)胞系中相對較敏感的細(xì)胞系升高(圖31)。
Vinexinβ也稱作SCAM-1，此基因編碼銜接蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)屬于也包括Vinexinβ、CAP/Ponsin和ArgBP2的蛋白質(zhì)家族(Kioka等，2002，CellStructure and Function271-7)?，F(xiàn)有技術(shù)不知道Vinexin與卵巢癌有聯(lián)系。VinexinβmRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高(圖32)。
G-CSFR粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSFR)差不多在原發(fā)的卵巢癌中廣泛表達(dá)。然而，在只有一半的研究的病例中發(fā)現(xiàn)其配體G-CSF表達(dá)在相同細(xì)胞中，這表明存在自分泌系統(tǒng)(Savarese等，2001，Cancer Letters162105-15)。在另外三分之一的病例研究中，發(fā)現(xiàn)G-CSF全部在基質(zhì)中，這表明可能存在旁分泌系統(tǒng)，其中間充質(zhì)細(xì)胞可向表達(dá)所述受體的癌性細(xì)胞提供配體(Savarese等，2001，Cancer Letters162105-15)。原先的回顧性評估顯示僅表達(dá)旁分泌環(huán)(loop)的患者的總體存活與卵巢癌表達(dá)自分泌軸(axis)的患者的情況相比較差(Savarese等，2001，Cancer Letters162105-15)。G-CSF及其受體也可以在正常卵巢和一些良性卵巢腫瘤中共同表達(dá)。G-CSFR mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高(圖33)。
SRB1也稱作CLA-1，此基因編碼了識別帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體和凋亡細(xì)胞的受體。已經(jīng)報道腫瘤細(xì)胞參與了凋亡細(xì)胞和小體的攝入和去除(Fukasawa等，1996，Exp.Cell Res.222246-50)。對這些觀察結(jié)果的生物顯著性了解得不多。從未披露過SRB1的表達(dá)和卵巢癌之間的聯(lián)系。SRB1 mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高(圖34)。
IGFBP-7IGF結(jié)合蛋白質(zhì)的最近鑒定的成員，此蛋白質(zhì)以相對低的親和力結(jié)合IGF-I和IGF-II(Oh，1998，Breast Cancer Res.Treat.47283-93)。IGFBP-7mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中升高(圖35)。
RAB22A屬于Ras蛋白質(zhì)的RAB亞家族(Kauppi等，2002，J.Cell Science115899-911)。RAB22A mRNA在化學(xué)抗性細(xì)胞系中降低并在對順鉑反應(yīng)性較強的細(xì)胞系中升高(圖36)。
KIAA0082KIAA0082是沒有公開信息的全長基因。此基因的mRNA表達(dá)在對順鉑有抗性的細(xì)胞系中升高(圖37)。
NCOR2這是與SMRT緊密相關(guān)的共抑制蛋白質(zhì)，其帶有對甲狀腺激素受體特異的相互作用結(jié)構(gòu)域(Jepsen and Rosenfeld，2002，J.Cell Science115689-98)。此基因的mRNA表達(dá)在化學(xué)抗性細(xì)胞系中的水平相對于對順鉑敏感的細(xì)胞系中的水平降低(圖38)。
MT1金屬硫蛋白1L(MT1)的精確生理功能未知，但以前的研究已經(jīng)報道MT水平在對順鉑有抗性的人類卵巢癌細(xì)胞中升高(Andrews and Howell，1990，Cancer Cells235-43)并且用MT基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞變成對順鉑有抗性(Nakano等，2003，Anticancer Res.23299-304)。據(jù)認(rèn)為MT對于將順鉑螯合在胞質(zhì)中、從而增強細(xì)胞對所述藥物產(chǎn)生抗性的能力有作用(Nakano等，2003，Anticancer Res.23299-304)。矛盾的是，MT1 mRNA的水平顯示在對順鉑最敏感的細(xì)胞(Hey)中顯著升高(圖51)。
MPP10M期磷蛋白(MPP10)大多數(shù)是胞漿(is mostly cytoplasmic)蛋白質(zhì)，但它可以被分泌并且是人類U3核仁小核糖核蛋白的組分。此蛋白質(zhì)的大部分與核仁纖維蛋白(fibrillarin)共定位(Baserga等，1997，Nucleic AcidsSymp.Ser.3664-7)并涉及rRNA的加工。從未有報道此基因或其產(chǎn)物與卵巢癌相關(guān)。MPP10表達(dá)水平隨對順鉑的敏感性增加而增加(圖52)。
實施例3SPARC作為治療靶標(biāo)的體外試驗SPARC在順鉑抗性最強的細(xì)胞系(OVCA 429)中的表達(dá)水平相對在其他被試細(xì)胞系中的表達(dá)水平而言是最高的(圖4)。本領(lǐng)域已知此蛋白質(zhì)是調(diào)節(jié)粘附(adhesion)并能夠在促進(jìn)腫瘤發(fā)展和侵入性的組織重構(gòu)和血管生成中起重要作用的鈣-結(jié)合糖蛋白(Ledda等，1997，J.Invest.Dermatol.108210-214)。
檢測在取自腫瘤大部切除術(shù)(cyto-reductive surgery)前的個體及術(shù)后9個月患者腫瘤已經(jīng)復(fù)發(fā)時的人腹水樣本中SPARC的表達(dá)(圖5；觀察到由于差異性聚腺苷酸化而出現(xiàn)(arise)SPARC的兩種轉(zhuǎn)錄物；Ledda等，1997，J.Invest.Dermatol.108210-214)。術(shù)后SPARC的表達(dá)水平顯著升高并與此患者的預(yù)后差相關(guān)。此觀察結(jié)果也與其他組研究其他形式的實體癌的發(fā)現(xiàn)一致(Golembieski等，1999，Int.J.Dev.Neurosci.17463-72；Briggs等，2002，Oncogene217077-91；Huang and Wang，2001，TRENDS in Molecular Medicine7355；Lollike等，2001，J.Biol.Chem.27617762-9)，這表明升高的SPARC表達(dá)可以是化療成功和疾病在除卵巢癌外的其他類型的實體癌中的發(fā)展的預(yù)測物(predictive)。
為了測試是否降低在抗性最強的卵巢癌細(xì)胞系OVCA 429中的SPARC蛋白質(zhì)表達(dá)水平會降低其對順鉑的抗性的能力，設(shè)計三種針對SPARC信使不同區(qū)域的siRNAs。所用的SPARC siRNA是#1靶序列AATCC TGT CCA GGT GGA AGT A(SEQ ID NO1)；#2靶序列AAGCT CCA CCT GGA CTA CAT C(SEQ ID NO2)；和#3靶序列AATGA CAA GTA CAT CGC CCT G(SEQ ID NO3)。
本發(fā)明描述的siRNA試驗用siPORT Lipid方案(Ambion)來進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染前24小時將細(xì)胞接種(plate)在含10％FBS的MEM∝培養(yǎng)基中，所以細(xì)胞在進(jìn)行試驗時30-70％滿底(confluent)。用無FBS或抗生素的培養(yǎng)基制備siPORT和siRNA復(fù)合物。對于siPORT，對于6孔板以每孔4微升或?qū)τ?6孔板以每孔0.5微升加入培養(yǎng)基，通過渦旋振蕩混合，并在室溫溫育25分鐘。對于siRNA，使用在培養(yǎng)基中稀釋的1-25nM(常使用12-5nM)濃度的siRNA。將所述siPORT加入所述siRNA混合物，并在室溫溫育20分鐘。在用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后，將所述細(xì)胞加入平板(使用96孔板時，以密度4.5×104接種細(xì)胞；使用6孔板時，以密度1-5×105接種細(xì)胞)。將siPORT/siRNA復(fù)合物加到每個平板/孔并輕柔搖動(rock)平板來使復(fù)合物分散在細(xì)胞表面。在于正常細(xì)胞培養(yǎng)條件溫育4小時后，將另外含10％FBS的培養(yǎng)基加入所述細(xì)胞。48小時后，提取總RNA。
根據(jù)生產(chǎn)者的說明書(Ambion)用所述siRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。對于6-孔板，用12.5nM siRNA/孔來轉(zhuǎn)染。在1∶100的稀釋度一式兩份讀取siRNA的OD260讀數(shù)。將所述讀數(shù)取均數(shù)，然后乘以稀釋系數(shù)然后乘以40(OD260為1等于40μg/ml的RNA)來得到siRNA的μg/ml最終濃度。將該數(shù)字除以14(在1nmole平均為21mer的dsRNA中的RNA的μg數(shù))來得到siRNA的μM最終濃度，然后轉(zhuǎn)變?yōu)闈舛扔胣M表示。
這些研究的結(jié)果見圖48所示。所有三種siRNAs降低這些細(xì)胞中的SPARC mRNA水平。僅用siPORT或僅用siRNA #2有義鏈處理細(xì)胞不顯示任何SPARC mRNA表達(dá)的顯著降低。然而，包括所有三種siRNAs的組合處理卻有一些效果(圖48)。
也研究了在SPARC siRNAs存在時OVCA 429細(xì)胞對順鉑有抗性的能力。所述細(xì)胞僅用siPORT處理或僅用siRNA#2有義鏈或完整的siRNA#2轉(zhuǎn)染。讓所述細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后恢復(fù)(recover)48小時，然后用濃度增加的順鉑或作為對照的相應(yīng)濃度的DMSO進(jìn)行處理。使所述細(xì)胞暴露于所述藥物24小時，之后去除所述藥物，并讓所述細(xì)胞再恢復(fù)72小時。用MTT分析來評估此處理對細(xì)胞生存力的影響。結(jié)果見圖49所示；圖50顯示了在定量對所述細(xì)胞的影響后的結(jié)果。所述數(shù)據(jù)提示在暴露于順鉑前用完整的siRNA#2處理所述細(xì)胞可使它們的抗性水平減半(僅用siPORT或有義鏈處理的對照的IC50～25-50μM到在用siRNA#2處理后IC50為～12.5μM)。
這些試驗的結(jié)果表明SPARC是卵巢癌的治療性靶標(biāo)及標(biāo)記物。
實施例4MetAP2/p67作為治療靶標(biāo)的體外實驗MetAP-2/p67是雙功能蛋白質(zhì)，其兩種功能對細(xì)胞生長都重要(Li andChang，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.227152-9；Wu等，1993，J.Biol.Chem.26810796-10801)。在一種功能中，所述蛋白質(zhì)結(jié)合真核生物起始因子2(eIF-2)并抑制其磷酸化，而在另一種功能中它的C-末端結(jié)構(gòu)域具有催化多種細(xì)胞蛋白質(zhì)的N-末端蛋氨酸水解的酶活性(Wu等，1993，J.Biol.Chem.26810796-10801)。eIF-2的磷酸化改變了它的翻譯庫(repertoire)，這允許在不同的磷酸化狀態(tài)翻譯不同的信使。另外，蛋氨酸氨肽酶活性通常對于蛋白質(zhì)功能是重要的，且不去除N-末端蛋氨酸常導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活(Li and Chang，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.227152-9)。
來自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的煙曲霉素與其合成的同系物TNP-470共價結(jié)合并抑制MetAP-2但不是緊密相關(guān)的MetAP-1的蛋氨酸氨肽酶活性(Griffith等，2998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9515183-8)。意識到用煙曲霉素處理多種不同細(xì)胞類型導(dǎo)致MetAP-2表達(dá)升高也是重要的(Wang等，2000，J.Cell.Biochem.77465-73)；據(jù)認(rèn)為該細(xì)胞通過升高其表達(dá)水平來適應(yīng)MetAP-2功能喪失。
本文描述的試驗提示OVCA 429比對順鉑最敏感的細(xì)胞系Hey多表達(dá)了大約7倍的MetAP-2(圖8)。Northern印跡分析也證明在臨床上MetAP-2的表達(dá)水平對于基于順鉑的化療抗性較強的患者而言也是升高的。圖9顯示MetAP-2 mRNA在抗性最強的患者(CAP3)中的水平比抗性最弱的患者(CAP1)中的水平高大約3倍。針對基于順鉑的化療具有中等抗性水平的患者也表現(xiàn)出中等的MetAP-2 mRNA水平。
進(jìn)行基于MTT的分析，其中用單獨的煙曲霉素、用單獨的順鉑以及用不同濃度的順鉑和煙曲霉素的組合處理OVCA 429細(xì)胞達(dá)4，8和24小時。所述結(jié)果見圖40、41和42所示。圖40(上圖)顯示了濃度增加的煙曲霉素對OVCA 429細(xì)胞存活的作用。觀察到一些細(xì)胞死亡，但多達(dá)80％的所述細(xì)胞甚至在很高的煙曲霉素濃度存活。用單獨的順鉑處理所述細(xì)胞(下圖)使IC50為大約100μM順鉑。除了順鉑水平升高之外0.1μg/ml煙曲霉素的存在使IC50降低至大約50μM。然而，在10μg/ml煙曲霉素存在時用順鉑處理細(xì)胞使所述細(xì)胞的存活增強，IC50達(dá)大約200μM。
不考慮溫育時間的長度，順鉑在0.1μg/ml煙曲霉素存在時作用增強，但在10μg/ml煙曲霉素存在時用順鉑處理所述細(xì)胞時作用相反(圖41和42)。這些觀察結(jié)果提示在煙曲霉素的低水平達(dá)到了有利的平衡，并且所述藥物與順鉑的協(xié)同作用導(dǎo)致了更多細(xì)胞的死亡。
設(shè)計靶向MetAP-2信使的不同區(qū)域的三種siRNAs(圖43)，來確定抑制MetAP-2表達(dá)的效果。MetAp-2 siRNAs是#1靶序列AAAGA TCA GCA TTG GAA GAT A(SEQ ID NO4)#2靶序列AAGCA CAT CGA CAA GTT AGA A(SEQ ID NO5)#3靶序列AAACA GTG CCG ATT GTG AAA G(SEQ ID NO6)圖44顯示了siRNA#1對于OVCA 429中的MetAP-2表達(dá)水平的影響。對照細(xì)胞用單獨的相同siRNA的有義鏈轉(zhuǎn)染或用轉(zhuǎn)染劑(siPort脂質(zhì))處理。即使轉(zhuǎn)染有效性并不是100％，用siRNA#1轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞也會使MetAP-2表達(dá)水平減半。對于GAPDH在那些細(xì)胞中的表達(dá)水平幾乎觀察不到影響，這表明基因表達(dá)通常不受這些處理的影響。另外，用siRNAs#2和#3處理所述細(xì)胞不會使MetAP-2表達(dá)降低。
當(dāng)阻斷MetAP-2的表達(dá)時，通過用siRNA#1、單獨的有義鏈#1、或單獨的siPort脂質(zhì)自身來處理OVCA 429細(xì)胞來檢測OVCA 429對順鉑產(chǎn)生抗性的能力。用所述siRNA溫育48小時后，所述細(xì)胞暴露于不同濃度的順鉑或?qū)?yīng)濃度的溶劑DMSO達(dá)24小時。定量此試驗的結(jié)果并見圖45所示。這些結(jié)果表明siRNA#1的存在使OVCA 429的IC50從25μM降低到大約3μM。圖46顯示在進(jìn)行MTT分析后的96孔板的照片。
總體考慮這些結(jié)果表明MetAP-2是治療干擾卵巢癌的有用靶標(biāo)。
實施例5在OVCA 429細(xì)胞中需鈣蛋白酶2和S100A10作為治療性靶標(biāo)及S100A11表達(dá)降低的體外試驗549728(需鈣蛋白酶2)用上述方法設(shè)計了靶向需鈣蛋白酶2信使的不同區(qū)域的三種siRNAs。需鈣蛋白酶2siRNAs是#1AA GGC ATA CGC CAA GAT CAA C(SEQ ID NO7)；#2AA ACT TCT TCC TGA CGA ATC G(SEQ ID NO8)；和#3AA ACG CTA TTC AAG ATA TTT A(SEQ ID NO9)。
如上所述將每個siRNA引入OVCA 429細(xì)胞。圖53顯示在OVCA 429細(xì)胞中擊倒(knockdown)試驗的結(jié)果。用上述方案，序列#1和#3擊倒了基因表達(dá)水平的大約50％。另外，用多種濃度的順鉑處理包含siRNA#3的OVCA429細(xì)胞。通常OVCA 429細(xì)胞的IC50在暴露于所述藥物24小時后是大約25μM順鉑。如圖54所示，需鈣蛋白酶2siRNA#3使IC50降低到3.12μM，從而提高所述細(xì)胞對順鉑的敏感度數(shù)倍。并且，用濃度升高的需鈣蛋白酶抑制劑I(ALLN)在順鉑存在或缺無時處理OVCA 429細(xì)胞。如圖55所示，在順鉑存在時ALLN使這些細(xì)胞的IC50降低到12.5μM。因此對于OVCA 429細(xì)胞對順鉑的敏感性，需鈣蛋白酶2siRNA#3具有比ALLN強的影響。
756595(S100A10)針對S100A10信使制備了三種siRNAs#1AA ATG GAA CAC GCC ATG GAA A(SEQ ID NO59)；#2AA ATT CGC TGG GGA TAA AGG C(SEQ ID NO60)；和#3AA TAA TGA AGG ACC TGG ACC A(SEQ ID NO61)。
如圖56所示，siRNA#3將OVCA 429細(xì)胞的IC50從25μM降低到6.25μM順鉑，從而提高了所述細(xì)胞對順鉑的敏感性。
810612(S100A11)用上述方法設(shè)計了靶向S100A11信使的不同區(qū)域的三種siRNAs。所述S100A11 siRNAs是#1AA AGG ATG GTT ATA ACT ACA C(SEQ ID NO10)；
#2AA GAA ACT GGA CAC CAA CAG T(SEQ ID NO11)；和#3AA TCT GAT TGG TGG CCT AGC T(SEQ ID NO12)。
如上所述將每個siRNA引入OVCA 429細(xì)胞。圖57顯示用上述方法siRNAs#1和2分別擊倒了OVCA 429細(xì)胞中的基因表達(dá)水平的達(dá)50％和25％。
實施例6MetAP-2，SPARC，需鈣蛋白酶-2，S100A10和S100A11在結(jié)腸癌中的表達(dá)從BD Biosciences，Inc.(San Jose，CA)獲得結(jié)腸cDNAs的可商購的匹配組，它們分離自得自非腫瘤組織及鄰近的腫瘤組織的五個個體。
進(jìn)行定量實時PCR試驗來確定MetAP-2，SPARC，S100A10，S100A11和需鈣蛋白酶-2在正常結(jié)腸組織和腫瘤結(jié)腸組織中的表達(dá)水平。圖58顯示了MetAP-2在5對匹配的結(jié)腸cDNAs中的表達(dá)水平。該數(shù)據(jù)表明其中兩名患者的腫瘤cDNA的表達(dá)水平相對于其匹配的非腫瘤cDNA有顯著升高(患者B和C；圖58)。另一名患者顯示腫瘤cDNA相對于它的匹配非腫瘤cDNA僅有輕微的表達(dá)升高(患者A；圖58)。在OVCA 429中的表達(dá)水平被用作參照。以前的報道顯示了人類結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移可以通過MetAP-2抑制劑TNP-470來預(yù)防(Tanaka等，1995，Cancer Res.55836-9)。
圖59顯示相對于它們的匹配非腫瘤cDNA而言，SPARC mRNA的表達(dá)水平在5個匹配腫瘤樣本中的4個升高。圖60顯示在所有匹配腫瘤樣本中，S100A11 mRNA的表達(dá)水平相對于它們的匹配非腫瘤cDNA升高。圖61顯示在5個匹配腫瘤樣本中的4個中，S100A10 mRNA的表達(dá)水平相對于它們的匹配非腫瘤cDNA升高。圖62顯示在所有匹配腫瘤樣本中，需鈣蛋白酶-2mRNA的表達(dá)水平相對于它們的匹配非腫瘤cDNA升高。
總體考慮這些觀察結(jié)果顯示MetAP-2以及SPARC，S100A11，S100A10和需鈣蛋白酶-2是結(jié)腸癌患者的治療靶標(biāo)。
實施例7檢測血清中分泌型蛋白的夾心ELISA用針對目的基因產(chǎn)物的抗體包被96孔微滴板的孔。等份的經(jīng)純化的重組靶基因產(chǎn)物被連續(xù)稀釋，并用于產(chǎn)生定量用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將等份的患者血清加到每個孔中。蓋住平板以使蒸發(fā)最小化并在4℃溫育幾小時過夜。將抗原取出并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌所述孔3次。將300μl的封閉溶液(PBS的3％w/v魚膠溶液(fish gel solution))加入每個孔并在室溫溫育2小時。取出封閉溶液并用PBS洗滌所述孔3次。然后將與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的合適抗體加入每個孔(每孔100μl)并在室溫溫育1-2小時。取出所述抗體并用NP-40溶液(PBS中的0.05％v/v NP-40)洗滌所述孔3次。結(jié)合的檢測通過在室溫向每個孔加入ABTS(Rockland Immunochemicals)(每孔100μl)30分鐘，并用微量培養(yǎng)板讀數(shù)器在405nm讀取吸光度來進(jìn)行的。如果使用堿性磷酸酶偶聯(lián)物(alkaline phosphate conjugate)而不是過氧化物酶，那么用pNPP(Rockland Immunochemicals)而不是ABTS來檢測結(jié)合。
一旦根據(jù)用純化蛋白質(zhì)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定了檢出限，就對一些不患癌癥的受試者和一些被診斷患有癌癥或良性疾病的患者進(jìn)行檢驗，來確定具體所需基因產(chǎn)物的預(yù)測濃度范圍。癌癥患者的預(yù)測范圍決定該范圍可用于鑒別患卵巢癌的患者或患復(fù)發(fā)疾病的患者或?qū)⑺麄兣c相應(yīng)的患者或無癌癥的健康受試者相區(qū)分。
實施例8siRNA-介導(dǎo)的基因表達(dá)“敲除”根據(jù)如上述的方案，檢驗對多種基因特異的siRNAs在卵巢癌細(xì)胞系中降低(或“擊倒”)它們分別的基因的能力。在每項試驗中，相對于與被試siRNAGC-含量匹配的對照(非特異性)siRNA(來自Dharmacon，Inc，Lafayette，CO)檢驗幾種siRNA。有些試驗中，也包括陰性對照(無處理)。表達(dá)被擊倒的水平隨siRNA不同而變化。所述具體基因及針對每個具體基因的siRNA序列見下1.制備了針對SAPK/Erk1的兩種siRNAs(L36870)L36870(726147)#1靶序列(SEQ ID NO64)AAA TGG GAC GAG GAG CTT ATG(始于編碼序列的320bp處)#2靶序列(SEQ ID NO65)AAG CGC ATC ACG ACA AGG ATA(始于編碼序列的831bp處)這兩個序列均成功降低了SAPK的表達(dá)，#2序列使mRNA水平降低了60％。
2.制備了針對eEF1ε的三種siRNAs(BC005291)BC005291(306921)#1靶序列(SEQ ID NO66)AAC AGG ATT GAC TAC TAT AGC(始于編碼序列的123bp處)#2靶序列(SEQ ID NO67)AAT ACA GGG TCA CTC AAG TAG(始于編碼序列的227bp處)#3靶序列(SEQ ID NO68)AAA TAT CTT AAT GTG TCT CGC(始于編碼序列的412bp處)#1和#2靶序列成功降低了eEF1ε的表達(dá)，#1序列使mRNA水平降低了65％。
3.制備了針對G-CSFR的三種siRNAs(M59818)M59818(809639)#1靶序列(SEQ ID NO69)AAG TGT GAG CTG CGC CAC AAG(始于編碼序列的793bp處)。
#2靶序列(SEQ ID NO70)AAG AGC CCC CTT ACC CAC TAC(始于編碼序列的1666bp處)。
#3靶序列(SEQ ID NO71)AAC AGG AAG AAT CCC CTC TGG(始于編碼序列的1957bp處)。
#1和#3靶序列降低了G-CSFR的表達(dá)水平，#1序列使mRNA水平降低了53％。
4.制備了針對ARA9/XAP2的三種siRNAs(U31913)U31913(814731)#1靶序列(SEQ ID NO72)AAA CGT GTG ATA CAG GAA GGC(始于編碼序列的48bp處)#2靶序列(SEQ ID NO73)AAC AAG TAC GAC GAC AAC GTC(始于編碼序列的775bp處)#3靶序列(SEQ ID NO74)AAC GTC AAG GCC TAC TTC AAG(始于編碼序列的790bp處)#2和#3靶序列使得ARA9表達(dá)降低，#3序列使mRNA水平降低了50％。
5.制備了針對RNPS1的三種siRNAs(AF015608)AF015608(897594)#1靶序列(SEQ ID NO75)AAT ATT CAT ACG GCA TGG ACT(始于編碼序列的327bp處)#2靶序列(SEQ ID NO76)AAC CTA AAA TAG AAG ACC CCT(始于編碼序列的680bp處)#3靶序列(SEQ ID NO77)AAA AGA TGC TGA CTC AGA AAA(始于編碼序列的752bp處)所有三個序列均成功降低了RNPS1的表達(dá)，#1序列使mRNA水平降低了35％。
6.制備了針對Fused toes的三種siRNAs(BC001134)BC001134(321247)#1靶序列(SEQ ID NO78)AAC CTA AAA TAG AAG ACC CCT(始于編碼序列的680bp處)#2靶序列(SEQ ID NO79)AAG ACC CCT ATG CAA TTA GCT(始于編碼序列的692bp處)#3靶序列(SEQ ID NO80)AAA AAG CCT GAA GAA CAG CAC(始于編碼序列的769bp處)所有三個序列均成功降低了Fused toes的表達(dá)，#2序列使mRNA水平降低了43％。
7.制備了針對粒鈣蛋白的三種siRNAs(BC005214)BC005214(34140)#1靶序列(SEQ ID NO81)AAA TGG GAT TTA ATG CAT TCA(始于編碼序列的323bp處)#2靶序列(SEQ ID NO82)AAC TTC ATG ACT GTT GAT CAA(始于編碼序列的379bp處)
#3靶序列(SEQ ID NO83)AAC ATC ATG AGT TGC GTC AAG(始于編碼序列的419bp處)所有三個序列均成功降低了粒鈣蛋白的表達(dá)，#2序列使mRNA水平降低了83％。
8.制備了針對SRB1/CLA1/CD3611的三種siRNAs(BC022087)BC022087(756687)#1靶序列(SEQ ID NO84)AAG CAG CAG GTC CTT AAG AAC(始于編碼序列的109bp處)#2靶序列(SEQ ID NO85)AAT CTC ATC AAC AAG TAC TTT(始于編碼序列的565bp處)#3靶序列(SEQ ID NO86)AAT TCA GAA CGT CAG CAC CTG(始于編碼序列的981bp處)#1和#3靶序列使得SRB1表達(dá)降低，#1序列使mRNA水平降低了60％。
9.制備了針對KIAA0082的三種siRNAs(BC031890)BC031890(825293)#1靶序列(SEQ ID NO87)AAG AGG AGA ACT GAC CCA GAA(始于編碼序列的4bp處)#2靶序列(SEQ ID NO88)AAA TGA GCG ATT GGA TGG TGG(始于編碼序列的509bp處)#3靶序列(SEQ ID NO89)AAG ATC ATC AAG GGC TCC AGT(始于編碼序列的2164bp處)#1序列使mRNA水平降低了65％。#2和#3序列對mRNA水平無作用。
10.制備了針對eIF2Bε的三種siRNAs(BC013590)BC013590(1630998)#1靶序列(SEQ ID NO90)AAT GTG GTT CGA ATA ATT ACA(始于編碼序列的352bp處)#2靶序列(SEQ ID NO91)AAA CTC GAG ATG ACT TTG TGC(始于編碼序列的800bp處)
#3靶序列(SEQ ID NO92)AAT CAA CAG CTG CAG AGG TTC(始于編碼序列的2098bp處)#1序列使mRNA水平降低了57％，#2序列使mRNA水平降低了54％，而#3序列使mRNA水平降低了43％。
11.制備了針對鈣調(diào)理蛋白2的三種siRNAs(D83735)D83735(713886)#1靶序列(SEQ ID NO93)AAG GAT GGA ACT ATC TTA TGC(始于編碼序列的163bp處)#2靶序列(SEQ ID NO94)AAT TTC GAC GAT GCC ACC ATG(始于編碼序列的457bp處)#3靶序列(SEQ ID NO95)AAC CGA CAA GTG TGA CAA CTC(始于編碼序列的708bp處)所有三個序列均使基因表達(dá)水平降低，#3序列使mRNA水平降低了75％。
12.制備了針對HYA22的三種siRNAs(D88153)D88153(123980)#1靶序列(SEQ ID NO96)AAA GAA ATG TGT GGT CAT TGA(始于編碼序列的507bp處)#2靶序列(SEQ ID NO97)AAA TCG ATG GAA CTA TAC ATC(始于編碼序列的596bp處)#3靶序列(SEQ ID NO98)AAC TAT ACA TCA GGT GTA TGT(始于編碼序列的606bp處)所有三個序列均使基因表達(dá)水平降低，#3序列使mRNA水平降低了60％。
13.制備了針對CA 125的三種siRNAs(BC009808)BC009808(CA 125)#1靶序列(SEQ ID NO99)AAT GGT TTC ACC CAT CAG AGC(始于編碼序列的235bp處)
#2靶序列(SEQ ID NO100)AAG GGC TCA GCT ACA TTC AAC(始于編碼序列的2203bp處)#3靶序列(SEQ ID NO101)AAT ACA ACG TCC AGC AAC AGT(始于編碼序列的3380bp處)#3序列使mRNA水平降低了50％。
14.制備了針對HMT1的兩個siRNAs(AF222689)并在Hey細(xì)胞中進(jìn)行試驗AF222689#1靶序列(SEQ ID NO102)AAC TCC ATG TTT CAT AAAC CGG(始于編碼序列的202bp處)#2靶序列(SEQ ID NO103)AAC GTG TAT GGC TTC GAC ATG(始于編碼序列的619bp處)兩個序列成功降低了HMT1 mRNA的表達(dá)，#1序列降低了大約70％而#2序列僅降低了剛超過60％。
15.制備了針對MPP10的三種siRNAs(X98494)并在Hey細(xì)胞中進(jìn)行試驗X98494#1靶序列(SEQ ID NO104)AAG TTC CAG AAA TCT GAA ATA(始于編碼序列的357bp處)#2靶序列(SEQ ID NO105)AAG AAA ATC CAG AAC ATG TAG(始于編碼序列的1043bp處)#3靶序列(SEQ ID NO106)AAA ACA GTA GCT TCG GAG AAG始于編碼序列的1414bp處)所有三個序列均降低了mRNA的表達(dá)，#1序列降低了將近90％，而#2和#3序列分別降低了大約30％和40％。
16.制備了針對IGFBP-7的兩個siRNAs(BC017201)并在OVCA 429中進(jìn)行試驗。
BC017201
#1靶序列AAG GTA AAA AGG GGT CAC TAT(始于編碼序列的583bp處).(SEQ ID NO.107)#2靶序列AAA GGG GTC ACT ATG GAG TTC(始于編碼序列的590bp處).(SEQ ID NO.108)與對照相比，僅#1序列使mRNA水平降低了大約60％。
17.制備了針對NM23-D的一個siRNA(BC004880)并在OVCA 429細(xì)胞中進(jìn)行試驗BC004880(203003)#3靶序列AAT GTC ATC CAC GCC AGC GAC(始于自第一個ATG起的442bp處)(SEQ ID NO 135)與對照相比，僅#3序列使mRNA水平降低了大約50％。
18.制備了針對WDR1的三種siRNA(AB010427)并在OVCA 429細(xì)胞中進(jìn)行試驗AB010427#1靶序列AAT GGA AAG TGC GTC ATC CTA(始于自第一個ATG起的106bp處)(SEQ ID NO 136)#2靶序列AAG TTC ACA ATT GGC GAC CAC(始于自第一個ATG起的544bp)(SEQ ID NO 137)#3靶序列AAG TGC TTC AGC ATC GAC AAC(始于自第一個ATG起的1309bp)(SEQ ID NO 138)與對照相比所有的靶序列都降低了mRNA水平，#1降低了大約85％，#2降低了大約75％而#3降低了大約70％。
19.制備了針對Vinexinβ的一種siRNA(AF037261)并在OVCA 429細(xì)胞中進(jìn)行試驗AF037261#2靶序列AAG AGT TAC CTA GAA GCA CCT(SEQ ID NO 139)#1和#3靶序列與對照相比不降低mRNA的水平，但與對照相比#2使mRNA降低了大約50％。
20.制備了針對KLK6的三種siRNA(BC015525)并在OVCA 429細(xì)胞中進(jìn)行試驗BC015525#1靶序列AAA AAA CCG AAT CTT CAG GTC(SEQ ID NO 140)#2靶序列AAA CTC TCT GAA CTC ATC CAG(SEQ ID NO 141)#3靶序列AAC TGG ATC CAA AAA ACC ATT(SEQ ID NO 142)#1靶序列與對照相比沒有降低mRNA水平，但與對照相比#2使mRNA降低了大約42％而#3使mRNA降低了大約55％。
21.制備了針對eIF5的一種siRNA(U49436)并在OVCA 429細(xì)胞中進(jìn)行試驗U49436#1mRNA靶序列AAT GAC CGT TAC ATT GTC AAT(SEQ ID NO 143)#2和#3靶序列與對照相比不降低mRNA的水平，但與對照相比#1使mRNA降低了大約59％。
22.制備了針對鋅指蛋白262/MYM的一個siRNA(AB007885)并在OVCA 429細(xì)胞中進(jìn)行試驗AB007885#3靶序列AAA ATA TGG GAA CCT ACA ATA(始于自第一個ATG起的3058bp處)(SEQ ID NO 144)#1和#2靶序列與對照相比不降低mRNA的水平，但與對照相比#3使mRNA降低了大約45％。
實施例9已被證實的基因的體外功能試驗具體siRNAs增強OVCA 429和OVCAR-3細(xì)胞對順鉑的敏感性的能力，基本如上面實施例3-5所述來進(jìn)行檢測。在每個例子中，對順鉑的敏感性都在特異性siRNAs存在時增強，但不在非特異性(對照)siRNA存在時或在陰性對照(未處理)中增強。此數(shù)據(jù)表明被試基因可以在功能上與卵巢癌細(xì)胞系產(chǎn)生對順鉑的抗性有關(guān)。結(jié)果匯總見表4。
表4體外順鉑敏感性試驗

實施例10體內(nèi)試驗用OVCAR-3細(xì)胞和裸鼠開發(fā)如下方案來檢測腫瘤生長OVCAR-3細(xì)胞(15百萬/注射)接種到裸鼠上臂區(qū)下(under upper arm region)。25天后出現(xiàn)可見腫塊。在接種后大約35天測定所述腫瘤，然后要么將動物用4μg/kg體重的順鉑通過IP注射一周3次、持續(xù)2周進(jìn)行治療，之后1周不進(jìn)行處理，要么僅用作為對照的生理鹽水溶液來處理。圖63顯示腫瘤體積為兩只小鼠體重的函數(shù)。此數(shù)據(jù)表明，在無任何化療時，腫瘤在仍有腫瘤的對照動物中持續(xù)生長(小鼠#1)。接受順鉑處理的動物與此相比，顯示出腫瘤尺寸的穩(wěn)定化(小鼠#2)。也顯示了順鉑治療前后的腫瘤照片。
用表達(dá)針對本發(fā)明所鑒定基因(MetAP-2，SPARC，S100A10，S100A11和需鈣蛋白酶-2)的siRNAs的穩(wěn)定細(xì)胞系重復(fù)此方案。已經(jīng)開發(fā)了表達(dá)需鈣蛋白酶2或S100A11的siRNAs的穩(wěn)定OVCAR-3細(xì)胞系，以及表達(dá)針對綠色熒光蛋白(GFP，細(xì)胞生長-無關(guān)的標(biāo)記蛋白)的穩(wěn)定siRNA的對照OCCAR-3細(xì)胞系；通過實時定量PCR測定的需鈣蛋白酶2和S100A11的表達(dá)及siRNA表達(dá)的影響見圖64所示。十五只小鼠被分成五只一組的三組。第一組作為對照來處理，被注射無siRNA表達(dá)的OCCAR-3細(xì)胞，第二組被注射表達(dá)siRNA的OVCAR-3細(xì)胞，而第三組被注射表達(dá)GFP-特異性siRNA的OVCAR-3細(xì)胞。在可測定的腫瘤變得明顯后，對照組接受了生理鹽水注射，而第二和第三組接受了標(biāo)準(zhǔn)的順鉑處理。如上所述，可觀察到腫瘤生長是體重的函數(shù)。
另一個實驗中，分成五只一組的十五只小鼠接種了未摻雜(即未重組的)的OVCAR-3細(xì)胞，并允許腫瘤生長。第一組作為對照來處理。在可測定的腫瘤變得明顯后，對照組接受了生理鹽水注射，第二組如上述接受了標(biāo)準(zhǔn)的順鉑處理，第三組接受了與TNP-470(臨床可識別的煙曲霉素衍生物)聯(lián)合的標(biāo)準(zhǔn)順鉑處理。如上所述，可觀察到腫瘤生長是體重的函數(shù)。
實施例中公開的信息可匯總?cè)缦卤?



*所有其表達(dá)在藥物抗性的腫瘤細(xì)胞中升高的基因(KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，粒鈣蛋白，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，SRB1，或KIAA0082)都在OVCAR-3或OVCA 429細(xì)胞中進(jìn)行試驗，并且所有其表達(dá)在抗性最強的腫瘤細(xì)胞中降低的基因(MPP10，HMT1，NAIP，EEF1E，RAB22A，NCOR2，或MT1)都在Hey細(xì)胞中進(jìn)行試驗。
應(yīng)該認(rèn)識到前面的說明書著重公開了本發(fā)明的某些具體具體實施方案，對其所做的等同改變或替換都是在所附權(quán)利要求書所述的精神和范圍內(nèi)。
序列表<110>賓夕法尼亞州研究基金會Al-Murrani，Samer<120>預(yù)測并克服對卵巢癌化療的抗性的方法及預(yù)測結(jié)腸癌發(fā)生的方法<130>03-303-A<140>US<141>2004<150>US 60/533,505<151>2003-12-31<160>144<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>1aatcctgtcc aggtggaagt a21<210>2<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>2aagctccacc tggactacat c21<210>3<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>3aatgacaagt acatcgccct g21<210>4<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>4aaagatcagc attggaagat a21<210>5<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>5aagcacatcg acaagttaga a21<210>6<211>21
<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>6aaacagtgcc gattgtgaaa g21<210>7<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>7aaggcatacg ccaagatcaa c21<210>8<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>8aaacttcttc ctgacgaatc g21<210>9<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>9aaacgctatt caagatattt a21<210>10<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>10aaaggatggt tataactaca c21<210>11<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>11aagaaactgg acaccaacag t21<210>12<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>12aatctgattg gtggcctagc t21<210>13<211>28<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>分子信標(biāo)探針(Molecular Beacon Probe)<220>
<221>不確定的<222>(1)..(1)<223>c連接到FAM<220>
<221>不確定的<222>(28)..(28)<223>g連接到DABCYL<400>13cgcgtatgaa ctgggcttat gtgacgcg28<210>14<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>14ctgggctctg ccttaaacac 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>15gctcccaaaa gtttgaacca 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>16ttgcctgagg ctgtaactga 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>17ccacttcttt gccacaaagt 20
<210>18<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>18gaattcggtc agctcagagt 20<210>19<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>分子信標(biāo)探針<220>
<221>不確定的<222>(1)..(1)<223>c連接到FAM<220>
<221>不確定的<222>(25)..(25)<223>g連接到DABCYL<400>19cgcctgggtg ggtttgaagg aggcg 25<210>20<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>20atcgagtccc tgattgctgt 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>21gcctgcatga ggtggttagt 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物
<400>22cttgccatga ctccttcctc 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>23gcagaagcac atcgacaagt 20<210>24<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>24gcctgcattt aatccattct c 21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>25taaccacgtc ctgctgaagt 20<210>26<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>26gctttaagaa agttcttatc aac 23<210>27<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>27gcacagcgga gtggtaaga 19<210>28
<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>28cagaggagtc agacacattg 20<210>29<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>29gtatacttac ttcagtgctg tt 22<210>30<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>30cattcttgct ataacgttta aca 23<210>31<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>31ctctgtgact tcggcatca 19<210>32<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>32cagacatcag agcggacat 19<210>33<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物
<400>33aagaactggg ttcagtggaa a 21<210>34<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>34gagagtgcat ggtcttgagt 20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>35agccaccagc taagtacctt 20<210>36<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>36catcgatttc aaccggaaca a 21<210>37<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>37gtgtgtggac ctccatgtta 20<210>38<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>38agcacaccat tacagacaag t 21<210>39
<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>39ggaaccagtt tctgcaggaa 20<210>40<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>40ctccagcagc acctcaatg 19<210>41<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>41atccaaggtt atgtggtttc tt 22<210>42<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>42cacctcctgg gcttctgaa 19<210>43<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>43gatccatgaa gctaatgtac aa 22<210>44<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物
<400>44acgggcagaa gccttcgtt 19<210>45<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>45cctgaggttc tccgagatg 19<210>46<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>46tccagcccga aattctctgt 20<210>47<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>47caagaggcgg aagggtaaa 19<210>48<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>48cagccgctcg ggtaggt17<210>49<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>49cactatggaa ggaccttgct 20<210>50
<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>50ggatacaggt gtaggtaaat c 21<210>51<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>51tcccagatta ggaatttatg ta 22<210>52<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>52cttctggaac aggcgaaga 19<210>53<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>53gctggcccag acgacgaa 18<210>54<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>54gcagacacac gtggatggt 19<210>55<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物
<400>55gatgaagtta aatcctcctt tg 22<210>56<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>56cctcttctgt gctgtcactt 20<210>57<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>57cctgcaagaa gagctgctg 19<210>58<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>58cacagctgtc ctggcatca 19<210>59<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>59aaatggaaca cgccatggaa a 21<210>60<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>60aaattcgctg gggataaagg c 21<210>61<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>61aataatgaag gacctggacc a 21
<210>62<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>62gctcccaaaa gtttgaacca 20<210>63<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>63gcctgcatga ggtggttagt 20<210>64<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>64aaatgggacg aggagcttat g 21<210>65<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>65aagcgcatca cgacaaggat a 21<210>66<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>66aacaggattg actactatag c 21<210>67<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>67aatacagggt cactcaagta g 21<210>68<211>21<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)<400>68aaatatctta atgtgtctcg c 21<210>69<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>69aagtgtgagc tgcgccacaa g 21<210>70<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>70aagagccccc ttacccacta c 21<210>71<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>71aacaggaaga atcccctctg g 21<210>72<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>72aaacgtgtga tacaggaagg c 21<210>73<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>73aacaagtacg acgacaacgt c 21<210>74<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>74aacgtcaagg cctacttcaa g 21<210>75<211>24<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)
<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>n是a，c，g，或t<400>75sdnaatattc atacggcatg gact24<210>76<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>76aacctaaaat agaagacccc t 21<210>77<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>77aaaagatgct gactcagaaa a 21<210>78<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>78aacctaaaat agaagacccc t 21<210>79<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>79aagaccccta tgcaattagc t 21<210>80<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>80aaaaagcctg aagaacagca c 21<210>81<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>81aaatgggatt taatgcattc a 21<210>82<211>21
<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>82aacttcatga ctgttgatca a 21<210>83<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>83aacatcatga gttgcgtcaa g 21<210>84<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>84aagcagcagg tccttaagaa c 21<210>85<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>85aatctcatca acaagtactt t 21<210>86<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>86aattcagaac gtcagcacct g 21<210>87<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>87aagaggagaa ctgacccaga a 21<210>88<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>88aaatgagcga ttggatggtg g 21<210>89<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)
<400>89aagatcatca agggctccag t 21<210>90<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>90aatgtggttc gaataattac a 21<210>91<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>91aaactcgaga tgactttgtg c 21<210>92<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>92aatcaacagc tgcagaggtt c 21<210>93<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>93aaggatggaa ctatcttatg c 21<210>94<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>94aatttcgacg atgccaccat g 21<210>95<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>95aaccgacaag tgtgacaact c 21<210>96<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>96aaagaaatgt gtggtcattg a 21
<210>97<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>97aaatcgatgg aactatacat c 21<210>98<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>98aactatacat caggtgtatg t 21<210>99<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>99aatggtttca cccatcagag c 21<210>100<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>100aagggctcag ctacattcaa c 21<210>101<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>101aatacaacgt ccagcaacag t 21<210>102<211>22<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>102aactccatgt ttcataaacc gg 22<210>103<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>103aacgtgtatg gcttcgacat g 21<210>104<211>21
<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>104aagttccaga aatctgaaat a 21<210>105<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>105aagaaaatcc agaacatgta g 21<210>106<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>106aaaacagtag cttcggagaa g 21<210>107<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>107aaggtaaaaa ggggtcacta t 21<210>108<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>108aaaggggtca ctatggagtt c 21<210>109<211>22<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>109agcaccagca ctggctcatc aa 22<210>110<211>19<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>110agagccagaa gagctgcta 19<210>111<211>20<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)
<400>111aaccgacaag tgtgacaact 20<210>112<211>18<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>112tgtgccttgc gggcagta 18<210>113<211>20<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>113caccaccacc accaaatgaa 20<210>114<211>20<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>114catccattcg acgcctttga 20<210>115<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>115ccagcagcac agtcaacaa a 21<210>116<211>20<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>116tggtagcttc tgcttcacaa 20<210>117<211>19<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>117ccagagctgc actcattcc 19<210>118<211>22<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>118cactgttggt gataaagcaa tt 22
<210>119<211>22<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>119ggataaaggc tacttaacaa ag 22<210>120<211>20<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>120ccactttgcc atctctacac 20<210>121<211>19<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>121gagccgagga ggttgaa g 19<210>122<211>20<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>122ctcctctggg tctatagtgt 20<210>123<211>18<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>123gaccctggtg gcggtgaa 18<210>124<211>19<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>124ggtgcctgca gcatcttca 19<210>125<211>18<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>125ggagagccct ggcacgta 18<210>126
<211>20<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>126ccttcatctg caggttcttg 20<210>127<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>127acgacggaca cattaattac t 21<210>128<211>19<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>128tccatgctgc agctgatga 19<210>129<211>19<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>129ccttcggcaa agggagagt 19<210>130<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>130ctggatgagt tcagagagtt t 21<210>131<211>18<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>131gcctcgacag gcagagat 18<210>132<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>132cttgtagctg aagatgtcaa t 21<210>133<211>19<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)
<400>133ctctatgccc gggacaagt 19<210>134<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>134aagacatgtc gaagccatac a 21<210>135<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>135aatgtcatcc acgccagcga c 21<210>136<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>136aatggaaagt gcgtcatcct a 21<210>137<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>137aagttcacaa ttggcgacca c 21<210>138<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>138aagtgcttca gcatcgacaa c 21<210>139<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>139aagagttacc tagaagcacc t 21<210>140<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>140aaaaaaccga atcttcaggt c 21
<210>141<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>141aaactctctg aactcatcca g 21<210>142<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>142aactggatcc aaaaaaccat t 21<210>143<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>143aatgaccgtt acattgtcaa t 21<210>144<211>21<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>144aaaatatggg aacctacaat a 2權(quán)利要求
1.一種降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的抗性的方法，所述方法包含使所述腫瘤細(xì)胞接觸細(xì)胞基因的至少一種調(diào)節(jié)劑的步驟，其中所述細(xì)胞基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2或MT1；其中所述細(xì)胞對所述化療藥物的抗性在所述調(diào)節(jié)劑存在時比所述調(diào)節(jié)劑缺無時弱。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化療藥物是順鉑。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是抑制劑并且所述基因是MetAP-2。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抑制劑是siRNA。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO4、SEQ IDNO5或SEQ ID NO6。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抑制劑是煙曲霉素或煙曲霉素的衍生物。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是卵巢癌腫瘤細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是抑制劑并且所述基因是SPARC。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述抑制劑是siRNA。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO3。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是抑制劑并且所述基因是需鈣蛋白酶2。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抑制劑是ALLN或ALLN的衍生物。
13.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抑制劑是siRNA。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO7、SEQ IDNO8或SEQ ID NO9。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是抑制劑并且所述基因是S100A11。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抑制劑是siRNA。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO10、SEQID NO11或SEQ ID NO12。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是抑制劑并且所述基因是S100A10。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述抑制劑是siRNA。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO59、SEQID NO60或SEQ ID NO61。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是抑制劑并且所述基因是KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，粒鈣蛋白，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262 MYM，HYA22，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，SRB1，或KIAA0082。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述抑制劑是siRNA。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO64-108或134-144之一。
24.一種抑制腫瘤細(xì)胞生長的方法，所述方法包含使所述腫瘤細(xì)胞接觸一或多種化療劑與細(xì)胞基因的至少一種抑制劑的組合的步驟，其中所述細(xì)胞基因是SPARC，需鈣蛋白酶2，S100A10，S100A11，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，粒鈣蛋白，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，SRB1，或KIAA0082。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述化療劑是基于鉑的化療劑。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述至少一種抑制劑是MetAP-2活性的抑制劑。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種抑制劑是煙曲霉素或煙曲霉素的衍生物。
28.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞。
29.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述抑制劑是siRNA。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述siRNA被鑒定為SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，或SEQ ID NO64-108或SEQ ID NO134-144之一。
31.一種預(yù)測卵巢癌患者的腫瘤是否對化療藥物有抗性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由該被表達(dá)的基因編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2或MT1；(b)檢測一種或?qū)?yīng)的多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在對照樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2或MT1；(c)比較所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在步驟(a)中的檢出量和所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在步驟(b)中的檢出量，其中當(dāng)步驟(a)中的檢出量與步驟(b)中的檢出量相差至少20％的因數(shù)時，預(yù)測所述患者對所述化療藥物有抗性。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述化療是基于鉑的化療。
33.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述被表達(dá)的基因是MetAP2或SPARC。
34.一種監(jiān)測患者中卵巢癌的疾病進(jìn)展的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由該被表達(dá)的基因編碼的基因產(chǎn)物在取自所述患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，或MT1；(b)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(c)比較所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在步驟(a)中的檢出量和所述被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在步驟(b)中的檢出量，其中如果所述步驟(b)中的檢出量i)不低于步驟(a)中S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，Eif5，Eif2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1或KIAA0082的檢出量；并且ii)不超過步驟(a)中MPP10，HMT1，NAIP，Eef1ε，RAB22A，NCOR2，或MT1的檢出量，則認(rèn)為所述癌癥有進(jìn)展。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述被表達(dá)的基因是Eif5或SPARC。
36.一種鑒定降低化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞的藥物抗性的化合物的方法，所述方法包含如下步驟(a)使細(xì)胞接觸被試化合物及使細(xì)胞對其產(chǎn)生抗性的濃度的化療藥物，所述細(xì)胞表達(dá)在化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞中過表達(dá)的基因，其中所述基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，Eif5，Eif2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)檢測所述基因在所述被試化合物存在和缺無時的表達(dá)；和(c)比較所述基因在所述被試化合物存在和缺無時的表達(dá)，其中如果所述基因在所述被試化合物存在時的表達(dá)相對于所述基因在所述被試化合物缺無時的表達(dá)降低，且腫瘤細(xì)胞生長在所述化合物存在時下降，則該化合物被鑒定為抑制化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞生長的化合物。
37.一種鑒定降低化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞的藥物抗性的化合物的方法，所述方法包含如下步驟(a)使細(xì)胞接觸被試化合物及使細(xì)胞對其產(chǎn)生抗性的濃度的化療藥物，所述細(xì)胞表達(dá)在化學(xué)抗性卵巢癌細(xì)胞中以低于正常的水平表達(dá)的基因，其中所述基因是HMT1，NAIP，Eef1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)檢測所述基因在所述被試化合物存在和缺無時的表達(dá)；和(c)比較所述基因在所述被試化合物存在和缺無時的表達(dá)，其中當(dāng)所述基因在所述被試化合物存在時的表達(dá)相對于所述基因在所述被試化合物缺無時的表達(dá)升高，且腫瘤細(xì)胞生長在所述化合物存在時下降，該化合物被鑒定為抑制化學(xué)抗性腫瘤細(xì)胞生長的化合物。
38.一種監(jiān)測藥物組合物作為治療患者中癌癥的藥劑的有效性的方法，所述方法包含如下步驟(a)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在取自患者的生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，鈣調(diào)理蛋白2，RNPS1，Eif5，Eif2Bε，HSF2，WDR1，F(xiàn)used toes，NM23D，ADAR1，粒鈣蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，鋅指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，F(xiàn)AST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，或MPP10，HMT1，NAIP，Eef1ε，RAB22A，NCOR2，MT1；(b)給予所述患者一定量的所述藥物組合物；(c)用隨后收集自所述患者的生物樣本重復(fù)步驟(a)；和(d)比較所述被表達(dá)基因或基因產(chǎn)物在步驟(a)中的檢出量和所述被表達(dá)基因或基因產(chǎn)物在步驟(c)中的檢出量，其中所述藥物組合物的有效性通過檢測所述被表達(dá)基因或基因產(chǎn)物在隨后收集的生物樣本中的量相對于在步驟(a)中所述生物樣本中的量的變化來進(jìn)行監(jiān)測，且腫瘤細(xì)胞生長在所述組合物存在時下降。
39.一種檢測結(jié)腸癌的方法，所述方法包含如下步驟(a)從患者獲得生物樣本；(b)檢測一或多種被表達(dá)的基因或由其編碼的基因產(chǎn)物在所述生物樣本中的量，其中所述被表達(dá)的基因是S100A10，S100A11，需鈣蛋白酶2，SPARC，或MetAP2；(c)檢測在對照樣本中檢出的所述一或多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的量；(d)比較所述一或多種被表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物在步驟(b)中的檢出量和其在步驟(c)中的檢出量；其中如果所述一或多種基因在步驟(b)中的檢出量與所述一或多種基因在步驟(c)中的檢出量不同，則認(rèn)為檢出結(jié)腸癌。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中如果S100A10，S100A11，SPARC，或MetAP2在步驟(b)中的檢出量相對于其在步驟(c)中的檢出量增加，則認(rèn)為檢出結(jié)腸癌。
41.權(quán)利要求39所述的方法，其中如果需鈣蛋白酶2在步驟(b)中的檢出量相比在步驟(c)中的檢出量降低，則認(rèn)為檢出結(jié)腸癌。
42.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是siRNA或shRNA。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是19，20或21個核苷酸長的siRNA。
44.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑是形成發(fā)夾環(huán)且臂是19，20或21個核苷酸長的shRNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了預(yù)測卵巢癌患者的腫瘤是否對化療有抗性的方法。本發(fā)明也提供了檢測治療、具體為化療在治療卵巢癌的患者中的有效性的方法。本發(fā)明還提供了通過降低所述細(xì)胞中化療藥物抗性來治療卵巢癌的方法。另外，本發(fā)明提供了篩選化合物的方法來鑒定對傳統(tǒng)化療方案有抗性的腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞生長抑制劑。
文檔編號A61K33/24GK1922332SQ200480042148
公開日2007年2月28日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月31日
發(fā)明者薩默·阿爾－穆拉尼 申請人:賓夕法尼亞州研究基金會