專利名稱：抗cd40抗體突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種識(shí)別與免疫相關(guān)的細(xì)胞膜分子CD40的抗CD40抗體。另外，本發(fā)明涉及一種在人抗體恒定區(qū)具有突變或亞單位部分被取代的抗體，從而可降低ADCC和/或CDC活性，但保持激動(dòng)或拮抗活性。
背景技術(shù)：
1.CD40CD40是一種位于細(xì)胞膜表面，在B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)、某些種類的癌細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，分子量為50kDa的抗原。已知CD40在B細(xì)胞和DCs的增殖和分化中具有重要作用。CD40被鑒定為一種在人B細(xì)胞表面表達(dá)的抗原(E.A.Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494，1986；及I.Stamenkovic等，EMBO J.81403，1989)，屬于包括低親和力NGF受體、TNF受體、CD27、OX40和CD30的TNF受體家族成員。最近已克隆出針對(duì)人和鼠CD40s的配體(CD40Ls)，并發(fā)現(xiàn)該配體是II型膜蛋白，在激活的CD4+T細(xì)胞中表達(dá)。而且發(fā)現(xiàn)CD40L可將強(qiáng)激活信號(hào)傳遞到人或鼠B細(xì)胞中。
已發(fā)現(xiàn)CD40在樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)比在B細(xì)胞中更高，而且已表明CD40在樹突狀細(xì)胞中具有重要作用。CD40與CD40L結(jié)合可激活抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，即表達(dá)協(xié)同刺激因子例如CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，或增強(qiáng)IL-2的產(chǎn)生(Caux，C.，等Activation of humandendritic cells through CD40 cross-linking.J.Exp.Med.，1801263，1994；及Shu，U.，等Activated T cells induce interleukin-12 productionby monocyte via CD40-CD40 ligand interaction.Eur.J.Immunol.，251125，1995)。樹突狀細(xì)胞具有強(qiáng)的抗原呈遞能力和強(qiáng)的刺激輔助T(Th)細(xì)胞的能力。而且也認(rèn)為樹突狀細(xì)胞可調(diào)控天然Th細(xì)胞分化為Th1或Th2細(xì)胞。當(dāng)作為骨髓樹突狀細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞在存在GM-CSF和IL-4的條件下培養(yǎng)，并通過(guò)CD40L使其成熟時(shí)，則得到的成熟樹突狀細(xì)胞(DC1)可在體外產(chǎn)生IL-12，并可刺激和激活異源天然Th細(xì)胞，以誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ的T細(xì)胞(即促進(jìn)其分化為Th1)。該作用可被抗IL-12抗體抑制，因此可通過(guò)IL-12起作用。另一方面，將存在于淋巴T區(qū)和外周血的胞漿T細(xì)胞，在存在IL-3和CD40配體的條件下培養(yǎng)時(shí)，得到的淋巴樹突狀細(xì)胞(DC2)不能產(chǎn)生IL-12，也不能刺激和激活異源天然Th細(xì)胞以誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-4的T細(xì)胞，這表明促進(jìn)其分化為Th2。Th1細(xì)胞被認(rèn)為參與細(xì)胞免疫的激活，而Th2細(xì)胞與體液免疫的增強(qiáng)和細(xì)胞免疫的限制有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞毒素T細(xì)胞(CTL)在Th1細(xì)胞的輔助下被激活時(shí)，則它們可消除在細(xì)胞質(zhì)和腫瘤細(xì)胞中生長(zhǎng)的病原體(各種病毒、李斯特菌、結(jié)核菌、弓形體原生動(dòng)物等)。
已表明可識(shí)別在膜表面表達(dá)的CD40的單克隆抗CD40抗體對(duì)B細(xì)胞具有不同的生物活性。通常根據(jù)在CD40和CD40L間的相互作用將單克隆抗CD40抗體劃分為激動(dòng)型或拮抗型抗體。
2.激動(dòng)型抗體已知激動(dòng)型抗體可激活B細(xì)胞。例如，已報(bào)道抗CD40抗體可誘導(dǎo)細(xì)胞黏附(Barrett等，J.Immunol.1461722，1991；及Gordon等，J.Immunol.1401425，1998)，增加細(xì)胞體積(Gordon等，J.Immunol.1401425，1998；及Valle等，Eur.J.Immunol.191463，1989)，誘導(dǎo)僅被抗IgM抗體、抗CD20抗體或佛波酯刺激的B細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂(Clark and Ledbetter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494，1986；Gordon等，LEUCOCYTE TYPING III.A.J.McMicheal ed.OxfordUniversity Press.Oxford.p.426；及Paulie等，J.Immunol.142590，1989)，誘導(dǎo)B細(xì)胞在存在IL-4時(shí)進(jìn)行細(xì)胞分裂(Valle等，Eur.J.Immunol.191463，1989；及Gordon等，Eur.J.Immunol.171535，1987)，誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞在IL-4刺激和T細(xì)胞缺乏的條件下表達(dá)IgE(Jabara等，J.Exp.Med.1721861，1990；及Gascan等，J.Immunol.1478，1991)，誘導(dǎo)那些培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)IgG和IgM(Gascan等，J.Immunol.1478，1991)，通過(guò)IL-4從細(xì)胞中分泌可溶性CD23/FceRII(Gordon and Guy，Immunol.Today 839，1987；及Cairns等，Eur.J.Immunol.18349，1988)，通過(guò)IL-4在細(xì)胞上增強(qiáng)可溶性CD23/FceRII的表達(dá)(Challa，A.，Allergy，54576，1999)，及刺激IL-6的產(chǎn)生(Clarkand Shu，J.Immunol.1451400，1990)。另外，已報(bào)道在存在CDw32+黏附細(xì)胞時(shí)，向人原代培養(yǎng)B細(xì)胞中加入IL-4和抗CD40抗體可導(dǎo)致由其衍生的克隆B細(xì)胞的建立(Bancherauet等，Science 24170，1991)，而且不管抗原受體有活性或無(wú)活性，生發(fā)中心細(xì)胞的凋亡可通過(guò)CD40被抑制(Liu等，Nature 342929，1989)。如上所述，CD40已被鑒定為一種在人B細(xì)胞表面表達(dá)的抗原，因此，主要以誘導(dǎo)人B細(xì)胞增殖和/或分化的能力，或誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的活性為指標(biāo)對(duì)大多數(shù)已分離的抗體進(jìn)行評(píng)估(Katira，A.等，LEUKOCYTE TYPING V.S.F.Schlossossman，等人，547頁(yè)，Oxford University Press.Oxford；W.C.Flansow等人，LEUKOCYTE TYPING V.S.F.Schlossossman，等人，555頁(yè)，Oxford University Press.Oxford；及J.D.Pound等人，International Immunology，1111，1999)。
已表明抗CD40抗體可使DC成熟(Z.H.Zhou等人，Hybridoma，18471，1999)。另外，已報(bào)道CD4T細(xì)胞在促進(jìn)抗原特異的CD8 T細(xì)胞方面的作用是通過(guò)CD40-CD40L信號(hào)途徑激活DC，而且已發(fā)現(xiàn)抗CD40的單克隆抗體(mAb)可代替CD40輔助T細(xì)胞激活樹突狀細(xì)胞(DC)(Shoenberger，S.P.，等人T-cell help for cytotoxic Tlymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions.Nature，480，1998)。而且已發(fā)現(xiàn)對(duì)鼠施用抗CD40抗體可保護(hù)動(dòng)物體免受表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞和不表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的侵襲(French，R.R.，等人CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that eradicateslymphoma and bypasses T-cell help.Nature Medicine，5，1999)。
人們期望激動(dòng)型抗CD40抗體基于上述作用可有效治療由細(xì)菌、病毒等引起的傳染性疾病、癌癥和其它疾病。在WO 02/088186中描述了具有較好激動(dòng)活性的抗CD40抗體。這些激動(dòng)型抗體的代表性實(shí)例是KM341-1-19和2105抗體。產(chǎn)生KM341-1-19抗體的雜交瘤KM341-1-19和產(chǎn)2105抗體的雜交瘤2105分別在2001年9月27日和2002年4月17日根據(jù)布達(dá)佩斯條約在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)綜合技術(shù)研究所進(jìn)行國(guó)際保藏(地址日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番1號(hào)中央第6)。其保藏號(hào)分別是FERM BP-7759(KM341-1-19)和FERM BP-8024(2105)。
3.拮抗型抗體另一方面，如上所述，考慮到CD40在免疫應(yīng)答中具有重要作用，因此期望抑制CD40與其配體的結(jié)合，將可在器官移植和自免疫疾病方面開發(fā)出用于免疫抑制的治療性藥物。Sawada、Hase等人已報(bào)道，患Crohn′s癥的病人的外周血具有更高比例的高表達(dá)CD40的單核細(xì)胞。但并不十分清楚這種抗體是否可抑制CD40與其配體的結(jié)合。這些抑制性抗體可用于CD40的功能分析和治療需激活CD40的疾病。而且也表明針對(duì)CD40配體的抑制性抗體對(duì)由CD40與CD40配體結(jié)合而導(dǎo)致的疾病是有效的。但據(jù)報(bào)道CD40L是在激活的血小板中表達(dá)的(V.Henn等，Nature 391591，1998)，因此，如果將抗CD40L抗體用作治療性藥物，可能導(dǎo)致血栓形成(T.Kawai等，Nat.Med.6114，2000)。從這點(diǎn)上來(lái)說(shuō)，抗CD40抗體作為抑制CD40與其配體結(jié)合的治療性抗體藥物比抗CD40L的抗體更安全?？笴D40抗體可用于抑制CD40L與CD40的結(jié)合，但并不激活CD40本身。
根據(jù)如上所述的功能，這種拮抗型抗CD40抗體可用作治療自免疫疾病和抑制器官、骨髓等移植中的免疫排斥。具有較好拮抗活性的抗CD40抗體在WO 02/088186中進(jìn)行了描述。這些拮抗型抗體的代表性實(shí)例是4D11抗體。產(chǎn)4D11抗體的雜交瘤4D11在2001年9月27日根據(jù)布達(dá)佩斯條約在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)綜合技術(shù)研究所進(jìn)行國(guó)際保藏(地址日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番1號(hào)中央第6)。其保藏號(hào)是FERM BP-7758。
專利文獻(xiàn)1 WO 02/088186發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目標(biāo)是從WO 02/088186所描述的潛在治療性抗CD40抗體中構(gòu)建突變體，使該突變體適于設(shè)計(jì)為藥物。
通過(guò)深入而細(xì)致的研究，本發(fā)明人成功地構(gòu)建了比已知的抗CD40抗體對(duì)疾病具有更好治療效果的激動(dòng)型或拮抗型抗體的新型突變體，并在其基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明中修飾抗CD40抗體的基本思想將在下文中詳細(xì)描述。
本說(shuō)明書將包括作為本發(fā)明優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)(特開)No.2003-431408的說(shuō)明書中的描述和/或附圖。


圖1A-1所示的是根據(jù)CD40序列制備的結(jié)合位點(diǎn)的肽，抗CD40的激動(dòng)型抗體可與之結(jié)合；圖1A-2所示的是根據(jù)CD40序列制備的結(jié)合位點(diǎn)的肽，抗CD40的激動(dòng)型抗體可與之結(jié)合(圖1A-1的續(xù))；圖1B-1所示的是根據(jù)CD40序列制備的結(jié)合位點(diǎn)的肽，抗CD40的拮抗型抗體可與之結(jié)合；圖1B-2所示的是根據(jù)CD40序列制備的結(jié)合位點(diǎn)的肽，抗CD40的拮抗型抗體可與之結(jié)合(圖1B-1的續(xù))；圖2A所示的是抗CD40抗體與CD40突變體的結(jié)合；圖2B所示的是抗CD40抗體與CD40突變體的結(jié)合；圖2C所示的是抗CD40抗體與CD40突變體的結(jié)合；圖3A所示的圖表明具有P331S突變的KM341-1-19抗體在與Ramos細(xì)胞結(jié)合方面與原始的KM341-1-19抗體一樣具有活性；圖3B所示的圖表明具有P331S突變的KM341-1-19抗體在增強(qiáng)Ramos細(xì)胞的CD95表達(dá)方面與原始的KM341-1-19抗體一樣具有活性；圖4A所示的圖表明具有P331S突變的KM341-1-19抗體通過(guò)兔補(bǔ)體具有更低的CDC活性；圖4B所示的圖表明當(dāng)用人的補(bǔ)體時(shí)，G2/4抗體具有更低的補(bǔ)體活性；圖5A-1所示的圖表明將2105抗體的亞類從IgG2轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌膩嗩悤r(shí)對(duì)其與Ramos細(xì)胞的結(jié)合沒(méi)有影響；圖5A-2所示的圖表明將KM341-1-19抗體的亞類從IgG2轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌膩嗩悤r(shí)對(duì)其與Ramos細(xì)胞的結(jié)合沒(méi)有影響；圖5B-1所示的圖表明將2105抗體的亞類從IgG2轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌膩嗩悤r(shí)可降低增強(qiáng)Ramos細(xì)胞CD95表達(dá)的活性；圖5B-2所示的圖表明將KM341-1-19抗體的亞類從IgG2轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌膩嗩悤r(shí)可降低增強(qiáng)Ramos細(xì)胞CD95表達(dá)的活性；圖6A-1所示的圖表明KM341-1-19抗體與Ramos細(xì)胞的結(jié)合能力不依賴于鉸鏈區(qū)的可變結(jié)構(gòu)；圖6A-2所示的圖表明2105抗體與Ramos細(xì)胞的結(jié)合能力不依賴于鉸鏈區(qū)的可變結(jié)構(gòu)；
圖6B-1所示的圖表明鉸鏈區(qū)的上部和中部鉸鏈對(duì)KM341-1-19抗體增強(qiáng)Ramos細(xì)胞CD95表達(dá)的活性非常重要；圖6B-2所示的圖表明上部和中部鉸鏈區(qū)域?qū)?105抗體增強(qiáng)Ramos細(xì)胞CD95表達(dá)的活性非常重要；圖7A所示的圖表明將F72抗體的亞類轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2對(duì)其與Ramos細(xì)胞的結(jié)合沒(méi)有影響；圖7B所示的圖表明將F72抗體的亞類轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2可提高增強(qiáng)Ramos細(xì)胞CD95表達(dá)的活性；圖8A所示的圖表明將4D11抗體的亞類從IgG1轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG4對(duì)其與Ramos細(xì)胞的結(jié)合沒(méi)有影響；圖8B所示的圖表明將4D11抗體的亞類從IgG1轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG4將以相同或不同程度抑制由CD40配體引起的Ramos細(xì)胞CD95表達(dá)的增強(qiáng)；圖9所示的圖表明將4D11抗體的亞類從IgG1轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG4或IgG4PE可降低ADCC活性；圖10所示的圖表明將4D11抗體的亞類從IgG1轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG4P可降低CDC活性；圖11所示的是對(duì)人CD40轉(zhuǎn)基因鼠施用4D11G1、4D11G4P或4D11G4PE后，血中的B細(xì)胞(外周血淋巴細(xì)胞中的B220-陽(yáng)性細(xì)胞)的數(shù)目隨時(shí)間的變化；圖12A所示的是將抗CD40抗體施用于人CD40轉(zhuǎn)基因鼠后，脾B細(xì)胞(脾B細(xì)胞中CD23-陽(yáng)性細(xì)胞)CD23的表達(dá)更高；圖12B所示的是將抗CD40抗體施用于人CD40轉(zhuǎn)基因鼠后，脾B細(xì)胞(脾B細(xì)胞中CD86-陽(yáng)性細(xì)胞)CD86的表達(dá)更高；圖12C所示的是將抗CD40抗體施用于人CD40轉(zhuǎn)基因鼠后，脾B細(xì)胞(脾B細(xì)胞中CD95-陽(yáng)性細(xì)胞)CD95的表達(dá)更高；圖13A所示的是4D11和281-1-10在人CD40轉(zhuǎn)基因鼠中對(duì)抗原特異的抗體(IgG1)產(chǎn)生的抑制活性；圖13B所示的是4D11和281-1-10在人CD40轉(zhuǎn)基因鼠中對(duì)抗原特異的抗體(IgM)產(chǎn)生的抑制活性；圖14A所示的是在抑制抗原特異的抗體產(chǎn)生活性的檢測(cè)中B細(xì)胞(外周血淋巴細(xì)胞中的B220-陽(yáng)性細(xì)胞)在血中的數(shù)目，
圖14B所示的是在抑制抗原特異的抗體產(chǎn)生活性的檢測(cè)中脾B細(xì)胞(脾淋巴細(xì)胞中的B220-陽(yáng)性細(xì)胞)的數(shù)目，圖15所示的是以30mg/kg的劑量對(duì)獼猴(cynomolgus)施用4D11G4P或4D11G4PE后，血中的B細(xì)胞(外周血淋巴細(xì)胞中的B220-陽(yáng)性細(xì)胞)的數(shù)目隨時(shí)間的變化；圖16所示的是圖15所示的檢測(cè)中的血IL-12水平；圖17所示的是4D11G4PE對(duì)猿的DTH(雄性獼猴中的延遲型超敏性)的抑制作用；圖18所示的是圖17的結(jié)果檢測(cè)中抗破傷風(fēng)毒素IgG的效價(jià)；圖19所示的是圖17的結(jié)果檢測(cè)中抗破傷風(fēng)毒素IgM的效價(jià)；圖20A所示的是4D11G4PE和5C8(抗CD40配體的抗體)對(duì)血小板凝聚的影響；圖20B所示的是4D11G4PE和5C8(抗CD40配體的抗體)對(duì)血小板凝聚的影響；圖21所示的是4D11G4P、4D11G4PE、4D11G2Ser或4D11G4/2/4在pH2.7，37℃溫育后，其寡聚體含量隨時(shí)間的變化；圖22所示的是抗CD40拮抗型抗體對(duì)皮膚移植排斥的抑制作用；圖23所示的是將341G2Ser施用于具有Ramos細(xì)胞植入的荷瘤鼠，腫瘤體積在細(xì)胞植入后隨時(shí)間的變化；圖24所示的是將341G2Ser施用于具有T24細(xì)胞植入的荷瘤鼠，腫瘤體積在細(xì)胞植入后隨時(shí)間的變化；圖25所示的是將341G2Ser施用于具有Hs 766T細(xì)胞植入的荷瘤鼠，腫瘤體積在細(xì)胞植入后隨時(shí)間的變化；及圖26所示的是將341G2Ser施用于具有Capan-2細(xì)胞植入的荷瘤鼠，腫瘤體積在細(xì)胞植入后隨時(shí)間的變化。
最佳實(shí)施方式1.激動(dòng)型抗體的修飾抗體本質(zhì)上是一類保護(hù)機(jī)體抵抗外來(lái)物，例如微生物、病毒及癌細(xì)胞的分子，因此抗體可殺死并清除掉那些可與其結(jié)合的細(xì)胞。致死活性包括兩種不同的活性，所謂抗體依賴的細(xì)胞毒性(以下縮寫為ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(以下縮寫為CDC)的活性組成。
ADCC是指一類由在其表面表達(dá)的Fc受體與抗體的恒定區(qū)結(jié)合而識(shí)別靶細(xì)胞的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等激活而誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。相反，CDC是指一類由通過(guò)抗體抗原結(jié)合引發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)激活而誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。已知這些活性因抗體的不同亞類而改變，已發(fā)現(xiàn)這是由于抗體的恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)差異而造成的(Charles A.Janeway等，Immunology，1997，Current Biology Ltd./GarlandPublishing Inc.)。
如果抗CD40激動(dòng)型抗體沒(méi)有可誘導(dǎo)表達(dá)CD40的細(xì)胞死亡的ADCC和/或CDC活性，即免疫激活作用機(jī)制，則該抗體作為藥物是更優(yōu)選的。如果表達(dá)CD40的細(xì)胞被ADCC和/或CDC活性損傷，則可能發(fā)生免疫抑制而不是所需的免疫激活，從而導(dǎo)致疾病的惡化。另外，患有感染性疾病的病人可能具有更高的ADCC和/或CDC活性。因此，當(dāng)將這種抗體應(yīng)用于感染性疾病時(shí)，需要用比在這種情況下不能有效檢測(cè)上述活性的健康人血清或外周血中的補(bǔ)體更具活性的，例如兔補(bǔ)體對(duì)其安全性進(jìn)行更仔細(xì)地評(píng)估。由此，構(gòu)建沒(méi)有ADCC或CDC活性的突變體和重組體，并檢測(cè)其活性。
由于已知ADCC和/或CDC活性隨目標(biāo)抗體的亞類而改變，因此改變亞類可能降低ADCC和/或CDC活性。例如，對(duì)人IgG亞類，通常IgG4是一個(gè)具有較低ADCC和CDC活性的亞類，而且已報(bào)道IgG2具有CDC活性，但ADCC活性較差，而IgG1的ADCC和CDC活性都較高(Charles A.Janeway等，Immunology，1997，Current BiologyLtd./Garland Publishing Inc.)。利用上述特征選擇特定的亞類可以構(gòu)建比原始抗體的細(xì)胞毒性作用更小的抗體。如下所述的抗體的特定亞類與點(diǎn)突變的關(guān)聯(lián)性可用于構(gòu)建具有所需活性的抗體。另外，已報(bào)道抗體ADCC和/或CDC活性的降低可通過(guò)在其恒定區(qū)引入突變而獲得。例如，L235、D265、D270、K322、P331和P329(字母表示單字母注釋的氨基酸，數(shù)字表示由Kabat等人提出的EU索引(Kabat等人，Sequences of proteins of Immunological Interest，1991 Fifthedition)，以下將使用這些符號(hào))在人IgG的補(bǔ)體激活中起重要作用，用其它氨基酸取代這些位點(diǎn)的其中一個(gè)有可能降低CDC活性(Esohe E.Idusogie等人J.Immunol.2000，1644178-4184，Yuanyuan Xu等人J.Biol.Chem.1994，2693469-3474，Brekke，O.H.等人Eur.J.Immunol.1994，242542，Morgan，A.，等人，Immunology 1995，86319，Lund，J.等人，J.Immunol.，1996，1574963，Tao，M.H.，等人，J.Exp.Med.1993，178661)。具體地，用A取代D270、K322、P329或P331可降低CDC活性。用S或G取代P331也可得到同樣的結(jié)果。
我們認(rèn)為Glu233-Ser239、Gly316-Lys338、Lys274-Arg301、Tyr407-Arg416、Asn297、Glu318、Leu234-Ser239、Asp265-Glu269、Asn297-Thr299和Ala327-Ile332參與IgG與FcR的結(jié)合(Duncan，A.R.，Woof，J.M.，Partridge，L.J.，Burton，D.R.，and Winter，G.(1988)Nature 332，563-564，Gessner，J.E.，Heiken，H.，Tamm，A.，and Schmidt，R.E.(1998)Ann.Hematol.76，231-248，Gavin，A.，Hulett，M，andHogarth，P.M.(1998)in The Immunoglobulin Receptors and TheirPhysiological and Pathological Roles in Immunity(van de Winkel，J.G.J.，and Hogarth，P.M.，eds)，11-35頁(yè)，Kluwer Academic PublishersGroup，Dordrecht，The Netherlands，Sautes，C.(1997)in Cell-mediatedEffects of Immunoglobulins(Fridman，W.H.，and Sautes，C.，eds)，29-66頁(yè)，R.G.Landes Co.，Austin，TX，Da′ron，M.(1997)Annu.Rev.Immunol.15，203-234，Canfield，S.M.，and Morrison，S.L.(1991)J.Exp.Med.173，1483-1491，Chappel，M.S.，Isenman，D.E.，Everett，M.，Xu，Y.-Y.，Dorrington，K.J.，and Klein，M.H.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88，9036-9040，Woof，J.M.，Partridge，L.J.，Jefferis，R.，andBurton，D.R.(1986)Mol.Immunol.23，319-330，Wines，B.D.，Powell，M.S.，Parren，P.W.H.I.，Barnes，N.，and Hogarth，P.M.(2000)J.Imunol.164，5313-5318)，因此在這些區(qū)域引入突變有可能降低ADCC活性。具體地，用E取代L235，或A取代G237可降低IgG與FcR的結(jié)合。
本發(fā)明的抗體至少具有一個(gè)氨基酸突變，以降低ADCC和/或CDC活性，優(yōu)選地具有1-20、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1或2個(gè)突變。
本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)在一些抗CD40抗體中，IgG2的鉸鏈區(qū)在表達(dá)較強(qiáng)的激動(dòng)活性時(shí)是非常重要的。用任何不同亞類取代除鉸鏈區(qū)外的可變區(qū)或恒定區(qū)，或引入點(diǎn)突變不僅可調(diào)節(jié)ADCC和/或CDC活性，而且可增加抗體的產(chǎn)生，提高純化和儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性及其血液動(dòng)力學(xué)。
為了生產(chǎn)抗體藥物，抗體在純化和儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性是非常重要的。由于至今開發(fā)的抗體主要屬于IgG1亞類，因此將除鉸鏈區(qū)外的可變區(qū)或恒定區(qū)轉(zhuǎn)化為來(lái)源于IgG1亞類的序列，可有效改善上述抗CD40激動(dòng)型抗體的物理性質(zhì)。
本發(fā)明提供如下激動(dòng)型抗CD40抗體的突變體和其它突變體[1]具有激動(dòng)活性、可與CD40結(jié)合的單克隆抗體的重鏈，其中所述重鏈包括來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈，及至少具有一個(gè)氨基酸缺失或取代，或至少添加一個(gè)氨基酸的恒定區(qū)，所述的缺失、取代或添加可增加或降低ADCC和/或CDC活性。
[1]中的重鏈，其中恒定區(qū)來(lái)源于人IgG。
[2]中的重鏈，其中人IgG是人IgG1。
[2]中的重鏈，其中人IgG是人IgG2。
[2]中的重鏈，其中人IgG是人IgG3。
[2]中的重鏈，其中人IgG是人IgG4。
[3]到[5]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中所述的恒定區(qū)中氨基酸取代是用絲氨酸取代如Kabat等人的EU索引所示331位的脯氨酸。
包含[1]到[7]任何一項(xiàng)中的重鏈的單克隆抗體。
[1]到[7]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中重鏈包括由雜交瘤KM341-1-19(保藏號(hào)FERM BP-7759)產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈的可變區(qū)。
包括來(lái)自由[9]中所述重鏈和來(lái)自由雜交瘤KM341-1-19(保藏號(hào)FERM BP-7759)產(chǎn)生的單克隆抗體的輕鏈的可變區(qū)的輕鏈組成的單克隆抗體。
[1]到[7]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中重鏈包括由SEQ ID NO38所示的多肽的可變區(qū)。
由[11]中所述的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO40所示的多肽的可變區(qū)。
[1]中的重鏈，其中重鏈由從SEQ ID NO132所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
由[13]中的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中輕鏈由從SEQ ID NO134所示的多肽中除去信號(hào)膚序列后所余部分組成。
[1]中的重鏈，其中所述重鏈?zhǔn)怯砂哂蠸EQ ID NO131所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生的。
[8]中的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是由包含具有SEQID NO131所示的多核苷酸和SEQ ID NO133所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生的。
[1]到[7]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中重鏈包含來(lái)自由雜交瘤2105(保藏號(hào)FERM BP-8024)產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈的可變區(qū)。
由[17]中的重鏈和輕鏈構(gòu)成的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含來(lái)自雜交瘤2105(保藏號(hào)FERM BP-8024)產(chǎn)生的單克隆抗體的輕鏈的可變區(qū)。
[1]到[7]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中所述重鏈包含SEQ ID NO42所示的多肽的可變區(qū)。
由[19]中的重鏈和下述輕鏈組成的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO44所示的多肽的可變區(qū)。
[1]中的重鏈，其中所述重鏈由從SEQ ID NO136所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
由[21]中的重鏈和下述的輕鏈組成的單克隆抗體，其中所述輕鏈由從SEQ ID NO44所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
[1]中的重鏈，其中所述重鏈?zhǔn)怯砂哂蠸EQ ID NO135所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生的。
[8]中的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是由包含具有SEQID NO135所示的多核苷酸和SEQ ID NO137所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生的。
由SEQ ID NO131所示的多核苷酸。
由SEQ ID NO133所示的多核苷酸。
具有[25]中多核苷酸的表達(dá)載體。
具有[26]中多核苷酸的表達(dá)載體。
具有[25]和[26]中多核苷酸的表達(dá)載體。
包含[27]中表達(dá)載體的宿主。
包含[28]中表達(dá)載體的宿主。
包含[29]中表達(dá)載體的宿主。
生產(chǎn)單克隆抗體重鏈的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)[30]中所述的宿主；及從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體的重鏈。
生產(chǎn)單克隆抗體的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)[32]中所述的宿主；及從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體。
由SEQ ID NO135所示的多核苷酸。
由SEQ ID NO137所示的多核苷酸。
具有[35]中多核苷酸的表達(dá)載體。
具有[36]中多核苷酸的表達(dá)載體。
具有[35]和[36]中多核苷酸的表達(dá)載體。
包含[37]中表達(dá)載體的宿主。
包含[38]中表達(dá)載體的宿主。
包含[39]中表達(dá)載體的宿主。
生產(chǎn)單克隆抗體重鏈的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)[40]中的宿主；及從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體的重鏈。
生產(chǎn)單克隆抗體的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)[42]中的宿主；及從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體。
生產(chǎn)具有激動(dòng)活性、能與CD40結(jié)合的單克隆抗體重鏈的方法，其包括用來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈分別取代不是來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈的抗體的上部鉸鏈和中部鉸鏈的步驟。
生產(chǎn)包含可變區(qū)和來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈的單克隆抗體重鏈的方法，其包括鑒定來(lái)源于可與CD40結(jié)合的單克隆抗體重鏈的形成可變區(qū)的多肽的步驟。
生產(chǎn)與CD40結(jié)合、具有激動(dòng)活性的單克隆抗體的方法，其包括用來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈分別取代不是來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈的抗體的上部鉸鏈和中部鉸鏈的步驟。
生產(chǎn)包含可變區(qū)及來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈的單克隆抗體的方法，其包括鑒定來(lái)源于可與CD40結(jié)合的單克隆抗體重鏈的形成可變區(qū)的多肽的步驟。
包括[8]、[10]、[12]、[14]、[16]、[18]、[20]、[22]或[24]中的單克隆抗體為活性成分的藥物組合物。
[49]中的藥物組合物，其用于預(yù)防或治療惡性腫瘤、病原體或自免疫疾病。
預(yù)防或治療惡性腫瘤、病原體或自免疫疾病的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用[49]中的藥物組合物。
上述[8]、[10]、[12]、[14]、[16]、[18]、[20]、[22]或[24]中的單克隆抗體在生產(chǎn)用于預(yù)防或治療惡性腫瘤、病原體或自免疫疾病的藥物組合物中的用途。
從SEQ ID NO131所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列的部分后的多核苷酸。
通過(guò)從SEQ ID NO133所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列的部分后的多核苷酸。
通過(guò)從SEQ ID NO135所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列的部分后的多核苷酸。
通過(guò)從SEQ ID NO137所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)肽序列部分后的多核苷酸。
本發(fā)明提供一種通過(guò)修飾屬于人IgG2的激動(dòng)型抗CD40抗體而產(chǎn)生的抗體，其中修飾抗體是用來(lái)源于不同亞類的序列取代除上部和中部鉸鏈外的恒定區(qū)而得到的突變體。優(yōu)選IgG1亞類。本發(fā)明提供一種通過(guò)修飾屬于人IgG2的激動(dòng)型抗CD40抗體而產(chǎn)生的抗體，其中修飾抗體是用來(lái)源于不同亞類的序列取代除鉸鏈區(qū)外的恒定區(qū)而得到的突變體。優(yōu)選IgG1亞類。
此處ADCC和CDC活性的降低是指與相應(yīng)的抗CD40單克隆抗體，而不是上述突變體的活性相比較，其活性降低，例如，與由雜交瘤KM341-1-19(保藏號(hào)FERM BP-7759)或2105(保藏號(hào)FERMBP-8024)產(chǎn)生的單克隆抗體的相應(yīng)活性相比較?？赏ㄟ^(guò)任何已知方法，例如實(shí)施例中所述的方法測(cè)定ADCC和CDC活性。由雜交瘤KM341-1-19(保藏號(hào)FERM BP-7759)或2105(保藏號(hào)FERM BP-8024)產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列將在下面進(jìn)行描述。
編碼KM341-1-19抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA及重鏈和輕鏈的氨基酸序列將在下面進(jìn)行描述。
在KM341-1-19抗體的重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO37)中，信號(hào)肽序列從50位的腺嘌呤(A)起始。信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于109位的″腺嘌呤″([A])和110位的胞嘧啶(C)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于493位的腺嘌呤(A)和494位的鳥嘌呤(G)之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在KM341-1-19抗體的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO38)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于20位的絲氨酸(S)和21位的谷氨酰胺(Q)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于148位的絲氨酸(S)和149位的丙氨酸(A)之間。
因此，KM341-1-19抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列從110位的胞嘧啶(C)到493位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO37。另外，KM341-1-19抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列從21位的谷氨酰胺(Q)到148位的絲氨酸(S)之間，參見SEQ ID NO38。
在KM341-1-19抗體的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO39)中，信號(hào)肽序列從29位的腺嘌呤(A)起始。信號(hào)肽序列與可變區(qū)的界線在88位的“腺嘌呤”([A])和89位的鳥嘌呤(G)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于400位的腺嘌呤(A)和401位的“胞嘧啶”([C])之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在KM341-1-19抗體的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO40)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于20位的甘氨酸(G)和21位的谷氨酸(E)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于124位的賴氨酸(K)和125位的“精氨酸”([R])之間。
因此，KM341-1-19抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列從89位的鳥嘌呤(G)到400位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO39。另外，KM341-1-19抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列從21位的谷氨酸(E)到124位的賴氨酸(K)之間，參見SEQ ID NO40。
KM341-1-19抗體的重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO37)
GTCGACGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGCCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGGATCCKM341-1-19抗體的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO38)MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
KM341-1-19抗體的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO39)ACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGKM341-1-19抗體的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO40)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT編碼2105抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA及重鏈和輕鏈的氨基酸序列將在下面進(jìn)行描述。
在2105抗體重鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO41)中，信號(hào)肽序列從70位的腺嘌呤(A)起始。信號(hào)肽序列與可變區(qū)的界線位于126位的“胸腺嘧啶”([T])和127位的鳥嘌呤(G)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于495位的腺嘌呤(A)和496位的鳥嘌呤(G)之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在2105抗體的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO42)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于19位的半胱氨酸(C)和20位的谷氨酸(E)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于142位的絲氨酸(S)和143位的丙氨酸(A)之間。
因此，2105抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列從127位的鳥嘌呤(G)到495位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO41。另外，2105抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列從20位的谷氨酸(E)到142位的絲氨酸(S)之間，參見SEQ ID NO42。
在2105抗體的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO43)中，信號(hào)肽序列從28位的腺嘌呤(A)起始。信號(hào)肽序列與可變區(qū)的界線位于87位的“腺嘌呤”([A])和88位的鳥嘌呤(G)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于405位的腺嘌呤(A)和406位的“胞嘧啶”([C])之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在2105抗體的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO44)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于20位的甘氨酸(G)和21位的谷氨酸(E)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于126位的賴氨酸(K)和127位的“精氨酸”([R])之間。
因此，2105抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列從88位的鳥嘌呤(G)到405位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO43。另外，2105抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列從21位的谷氨酸(E)到位126的賴氨酸(K)之間，參見SEQ ID NO44。
2105抗體重鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO41)CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG2105抗體重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO42)MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK2105抗體輕鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO43)
CTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTG2105抗體輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO44)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV在341G2Ser的重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO131)中，信號(hào)肽序列與可變區(qū)的界線位于60位的“腺嘌呤”([A])和61位的胞嘧啶(C)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于444位的腺嘌呤(A)和445位的鳥嘌呤(G)之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在341G2Ser的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO132)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于20位的絲氨酸(S)和21位的谷氨酰胺(Q)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于148位的絲氨酸(S)和149位的丙氨酸(A)之間。
因此，341G2Ser的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列從61位的胞嘧啶(C)到444位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO131。另外，341G2Ser重鏈可變區(qū)的氨基酸序列從21位的谷氨酰胺(Q)到148位的絲氨酸(S)之間，參見SEQ ID NO132。
341G2Ser完整重鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO131)
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA341G2Ser完整重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO132)MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在341G2Ser的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO133)中，信號(hào)肽序列與可變區(qū)的界線位于60位的“腺嘌呤”([A])和61位的鳥嘌呤(G)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于372位的腺嘌呤(A)和373位的“胞嘧啶”([C])之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在341G2Ser的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO134)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于20位的甘氨酸(G)和21位的谷氨酸(E)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于124位的賴氨酸(K)和125位的“精氨酸”([R])之間。因此，341G2Ser的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列從61位的鳥嘌呤(G)到372位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO133。另外，341G2Ser輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列從21位的谷氨酸(E)到124位的賴氨酸(K)之間，參見SEQ ID NO134。
341G2Ser完整輕鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO133)ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA341G2Ser完整輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO134)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在2105G2Ser的重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO135)中，信號(hào)肽序列與可變區(qū)的界線位于57位的“胸腺嘧啶”([T])和58位的鳥嘌呤(G)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于426位的腺嘌呤(A)和427位的鳥嘌呤(G)之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在2105G2Ser的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO136)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于19位的半胱氨酸(C)和20位的谷氨酸(E)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于142位的絲氨酸(S)和143位的丙氨酸(A)之間。
因此，2105G2Ser的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列從58位的鳥嘌呤(G)到426位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO135。另外，2105G2Ser重鏈可變區(qū)的氨基酸序列從20位的谷氨酸(E)到142位的絲氨酸(S)之間，參見SEQ ID NO136。
2105G2Ser完整重鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO135)ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAAC
GGCAAGGAGTAGAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA2105G2Ser完整重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO136)MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK在2105G2Ser的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO137)中，信號(hào)肽序列與可變區(qū)的界線位于60位的“腺嘌呤”([A])和61位的鳥嘌呤(G)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于378位的腺嘌呤(A)和379位的“胞嘧啶”([C])之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在2105G2Ser的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO138)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于20位的甘氨酸(G)和21位的谷氨酸(E)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于126位的賴氨酸(K)和127位的“精氨酸”([R])之間。因此，2105G2Ser輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列從61位的鳥嘌呤(G)到378位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO137。另外，2105G2Ser輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列從21位的谷氨酸(E)到126位的賴氨酸(K)之間，參見SEQ ID NO138。
2105G2Ser完整輕鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO137)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA2105G2Ser完整輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO138)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC2.拮抗型抗體的修飾和激動(dòng)型抗體一樣，如果抗CD40拮抗型抗體在作用機(jī)制方面沒(méi)有ADCC和/或CDC活性，則其作為治療性藥物是更優(yōu)選的。另外，即使檢測(cè)不到ADCC活性，但抗CD40拮抗型抗體的沒(méi)有通過(guò)其體內(nèi)經(jīng)Fc受體交聯(lián)而誘導(dǎo)信號(hào)的活性也是非常重要的。換句話說(shuō)，必須確保它們不激活免疫，這樣的活性抗體可作為藥物。抗CD40拮抗型抗體作為治療自免疫疾病或抑制器官移植中排斥反應(yīng)的藥物是非常有潛力的。但如果由于給患者施用后的某些作用而誘導(dǎo)即使可能很弱的拮抗活性，那么癥狀可能會(huì)惡化，與所需的治療效果相背離。因此，沒(méi)有任何拮抗活性的抗體是更優(yōu)選的藥物。在本發(fā)明中，用猴子的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已表明，在IgG4中引入一個(gè)點(diǎn)突變L235E(表示在235位用E取代L；下文使用相同的符號(hào))可在體內(nèi)有效降低拮抗活性。雖然IgG4是一個(gè)具有較低ADCC和CDC活性的亞類，但已報(bào)道當(dāng)在細(xì)胞例如CHO中表達(dá)作為重組蛋白的IgG4時(shí)，其半個(gè)分子由于重鏈間的弱S-S鍵而分泌出來(lái)(Rob C.Aalberse等，Immunology，105，9-19，2002)。為了克服這個(gè)問(wèn)題，已報(bào)道在抗體恒定區(qū)引入一個(gè)突變可成功地促進(jìn)S-S鍵的形成。因此，也對(duì)這種突變的有用性進(jìn)行了評(píng)估。具體地，在228位引入P取代S(S.Angal等，Molecular Immunology，vol.30，no.1，105-108，1993)。
對(duì)拮抗型抗體和激動(dòng)型抗體而言，抗體在純化和儲(chǔ)存過(guò)程的穩(wěn)定性是非常重要的。有一些方法可構(gòu)建這種既具有較好的物理性質(zhì)又保持拮抗活性的抗體。迄今為止商品化的抗體藥物主要屬于IgG1亞類，而且也沒(méi)有報(bào)道它們?cè)谒幬锱浞椒矫娲嬖趩?wèn)題。根據(jù)這些事實(shí)，從物理性質(zhì)的角度考慮，由IgG1衍生抗體的恒定區(qū)是非常有利的。但對(duì)抗CD40抗體而言，需要降低其ADCC和CDC活性。因此，可能需要用某些點(diǎn)突變修飾具有IgG1型恒定區(qū)的抗體。上述突變可用于構(gòu)建這種抗體。通過(guò)在其中引入點(diǎn)突變P331G，則IgG1型恒定區(qū)的ADCC和CDC活性會(huì)降低。而且也發(fā)現(xiàn)在IgG4中引入點(diǎn)突變L235E可除去其體內(nèi)微弱的拮抗活性，使其在治療上更有效，但使其在低pH下穩(wěn)定性降低。因此，用E以外的其它氨基酸取代L235可能使其物理上更具有功能。對(duì)于4D11抗體，它的可變區(qū)結(jié)構(gòu)與2B11抗體非常相似。與4D11抗體相比較，2B11抗體具有較低的拮抗活性，但在低pH下具有更高的穩(wěn)定性。基于以上特性，如果將來(lái)源于2B11恒定區(qū)的某些氨基酸引入到4D11抗體中，那么4D11可能會(huì)變得更穩(wěn)定。具體地，重鏈中的點(diǎn)突變L38V、P58R、G62W、I79M、K81Y、H87Y、S98A、K109R、V120M或T124A，或輕鏈中的N75S，或二者聯(lián)合可達(dá)到這個(gè)目的。具體地，通過(guò)用V取代4D11抗體重鏈可變區(qū)38位的L的突變體(縮寫為L(zhǎng)38V；以下使用同樣的符號(hào))、P58R突變體、G62W突變體、I79M突變體、K81Y突變體、H87Y突變體、S98A突變體、K109R突變體、V120M突變體或T124A突變體，或輕鏈中的N75S突變體，或二者聯(lián)合可達(dá)到這個(gè)目的。
根據(jù)本發(fā)明的抗體至少有一個(gè)氨基酸突變以降低ADCC和/或CDC活性，優(yōu)選地具有1-15、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、或1或2個(gè)突變。
本發(fā)明提供如下拮抗型抗CD40抗體的突變體和其它突變體 一種具有拮抗活性、能與CD40結(jié)合的單克隆抗體的重鏈，其中所述重鏈包括至少具有一個(gè)氨基酸缺失或取代，或至少添加一個(gè)氨基酸的恒定區(qū)，所述缺失、取代或添加可增加或降低ADCC和/CDC。
[53]中的重鏈，其中恒定區(qū)來(lái)源于人IgG。
[54]中的重鏈，其中人IgG是IgG1。
[54]中的重鏈，其中人IgG是IgG2。
[54]中的重鏈，其中人IgG是IgG3。
[54]中的重鏈，其中人IgG是IgG4。
[55]、[57]或[58]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中所述的恒定區(qū)中的氨基酸取代是用谷氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的235位的亮氨酸。
[53]到[58]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中所述重鏈包括至少具有一個(gè)氨基酸缺失或取代，或至少添加一個(gè)氨基酸的恒定區(qū)，所述缺失、取代或添加可促進(jìn)重鏈間S-S鍵的形成。
[60]中的抗體重鏈，其中所述的恒定區(qū)中的氨基酸取代是用脯氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的228位的絲氨酸。
一種包含[53]到[61]任何一項(xiàng)中的重鏈的單克隆抗體。
[53]到[61]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中重鏈包含由雜交瘤4D11(保藏號(hào)FERM BP-7758)產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈的可變區(qū)。
一種包含[63]中的重鏈和下述輕鏈的單克隆抗體，所述輕鏈包含由雜交瘤4D11(保藏號(hào)FERM BP-7758)產(chǎn)生的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)。
[53]到[61]任何一項(xiàng)中的重鏈，其中所述重鏈包含SEQ ID NO46所示的多肽的可變區(qū)。
一種由[65]中的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO48所示的多肽的可變區(qū)組成。
[53]中的重鏈，其中重鏈由從SEQ ID NO140所示的多肽中除去信號(hào)肽序列的所余部分組成。
一種由[67]中的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中所述輕鏈由從SEQ ID NO142所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
[53]中的重鏈，其中重鏈?zhǔn)怯砂哂蠸EQ ID NO139所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生的。
[62]中的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體是由包含具有SEQ ID NO139所示的多核苷酸和SEQ ID NO141所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生的。
一種由SEQ ID NO139所示的多核苷酸。
一種由SEQ ID NO141所示的多核苷酸。
一種具有[71]中多核苷酸的表達(dá)載體。
一種具有[72]中多核苷酸的表達(dá)載體。
一種具有[71]和[72]中多核苷酸的表達(dá)載體。
一種包含[73]中表達(dá)載體的宿主。
一種包含[74]中表達(dá)載體的宿主。
一種包含[75]申表達(dá)載體的宿主。
一種產(chǎn)生單克隆抗體重鏈的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)[76]中的宿主；及從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體的重鏈。
一種產(chǎn)生單克隆抗體的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)[78]中的宿主；及從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體。
一種包含[62]、[64]、[66]、[68]或[70]中的單克隆抗體為活性成分的藥物組合物。
[81]中的藥物組合物用于預(yù)防或治療移植排斥、自免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)或凝血因子VIII抑制。
一種預(yù)防或治療移植排斥、自免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)或凝血因子VIII抑制的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用[81]中的藥物組合物。
[62]、[64]、[66]、[68]或[70]中的單克隆抗體在制備用于預(yù)防或治療移植排斥、自免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)或凝血因子VIII抑制的藥物組合物中的應(yīng)用。
一種產(chǎn)生與CD40結(jié)合、具有拮抗活性且激動(dòng)活性降低的單克隆抗體的重鏈的方法，其包括在人抗體的重鏈恒定區(qū)缺失或取代至少一個(gè)氨基酸，或添加至少一個(gè)氨基酸的步驟。
[85]中的方法，其中恒定區(qū)來(lái)源于人IgG。
[86]中的方法，其中人IgG是人IgG4。
[85]到[87]任何一項(xiàng)中的方法，其中所述恒定區(qū)氨基酸的取代是用谷氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的235位的亮氨酸。
一種由從SEQ ID NO139所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)肽序列的其余部分所得的多核苷酸。
一種由從SEQ ID NO141所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)肽序列的其余部分所得的多核苷酸。
另外，本發(fā)明提供以下材料。
一種拮抗型抗CD40抗體的突變體，包括至少一個(gè)在由雜交瘤4D11(保藏號(hào)FERM BP-7758)產(chǎn)生的單克隆抗體重鏈可變區(qū)進(jìn)行的取代，以及包含用S取代4D11抗體輕鏈可變區(qū)75位的N的拮抗型抗CD40抗體的突變體，所述取代選自用V取代38位的L、用R取代58位的P、用W取代62位的G、用M取代79位的I、用Y取代81位的K、用Y取代87位的H、用A取代98位的S、用R取代109位的K、用M取代120位的V、和用A取代124位的T的組。
此處，ADCC和CDC活性的降低是指這些活性與相應(yīng)的抗CD40單克隆抗體的活性相比而不是上述突變體的活性相比較是降低的，例如，與由雜交瘤4D11(保藏號(hào)FERM BP-7758)產(chǎn)生的單克隆抗體的相應(yīng)活性相比較。可通過(guò)任何已知方法，例如實(shí)施例中所述的方法測(cè)定ADCC和CDC的活性。由雜交瘤4D11(保藏號(hào)FERM BP-7758)產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列將在下面進(jìn)行描述。
編碼4D11抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA及重鏈和輕鏈的氨基酸序列將在下面分別進(jìn)行描述。
在4D11抗體的重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO45)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于93位的″胞嘧啶″([C])和94位的胞嘧啶(C)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于456位的腺嘌呤(A)和457位的鳥嘌呤(G)之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在4D11抗體的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO46)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于26位的絲氨酸(S)和27位的谷氨酰胺(Q)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于147位的絲氨酸(S)和148位的丙氨酸(A)之間。
因此，4D11抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列從94位的胞嘧啶(C)到456位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO45。另外，4D11抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列從27位的谷氨酰胺(Q)到147位的絲氨酸(S)之間，參見SEQ ID NO46。
在4D11抗體的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO47)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于124位的″胸腺嘧啶″([T])和125位的鳥嘌呤(G)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于442位的腺嘌呤(A)和443位的“胞嘧啶”([C])之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在4D11抗體的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO48)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于22位的半胱氨酸(C)和23位的丙氨酸(A)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于128位的賴氨酸(K)和129位的“精氨酸”([R])之間。
因此，4D11抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列從125位的鳥嘌呤(G)到442位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO47。另外，4D11抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列從23位的丙氨酸(A)到128位的賴氨酸(K)之間，參見SEQ ID NO48。
4D11抗體的重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO45)ATATGTCGACGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC4D11抗體的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO46)MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSAS4D11抗體的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO47)
AGATCTTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTACGCGGGGAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG4D11抗體的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO48)MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT在4D11抗體G4PE的重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO139)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于78位的″胞嘧啶″([C])和79位的胞嘧啶(C)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于441位的腺嘌呤(A)和442位的鳥嘌呤(G)之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在4D11抗體的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO140)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于26位的絲氨酸(S)和27位的谷氨酰胺(Q)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于147位的絲氨酸(S)和148位的丙氨酸(A)之間。
因此，4D11抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列從79位的胞嘧啶(C)到441位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO139。另外，4D11抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列從27位的谷氨酰胺(Q)到147位的絲氨酸(S)之間，參見SEQ ID NO140。
4D11G4PE完整重鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO139)
ATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA4D11G4PE完整重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO140)MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
在4D11G4PE的輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO141)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于66位的″胸腺嘧啶″([T])和67位的鳥嘌呤(G)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于384位的腺嘌呤(A)和385位的“胞嘧啶”([C])之間(使用了基因預(yù)測(cè)軟件(Signal P ver.2))。
在4D11G4PE的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO142)中，信號(hào)肽序列和可變區(qū)的界線位于22位的半胱氨酸(C)和23位的丙氨酸(A)之間，可變區(qū)和恒定區(qū)的界線位于128位的賴氨酸(K)和129位的“精氨酸”([R])之間。
因此，4D11G4PE的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列從67位的鳥嘌呤(G)到384位的腺嘌呤(A)之間，參見SEQ ID NO141。另外，4D11抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列從23位的丙氨酸(A)到128位的賴氨酸(K)之間，參見SEQ ID NO142。
4D11G4PE完整輕鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO141)ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA4D11G4PE完整輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO142)MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
3.定義此處所用術(shù)語(yǔ)定義如下。
本發(fā)明中所述的“CD40”是指具有E.A.Clark等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494，1986，或I.Stamenkovic等人在EMBO J.81403，1989中所述的氨基酸序列的多肽，具體來(lái)說(shuō)，是指在B細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞或來(lái)源于這些細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的抗原多肽。
“抗CD40抗體”是指任何針對(duì)細(xì)胞表達(dá)的CD40、全長(zhǎng)CD40或部分長(zhǎng)度的CD40的單克隆抗體。
另外，本發(fā)明中的“抗體”是來(lái)源于編碼構(gòu)成免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)，及輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的基因(統(tǒng)稱為抗體基因)。人免疫球蛋白分為5個(gè)不同的類別，包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。另外，IgG由4個(gè)不同的亞類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4組成，而IgA由2個(gè)不同的亞類IgA1和IgA2組成。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4位于人染色體14q32，33上。免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)同源的L鏈(輕鏈)和兩個(gè)同源的H鏈(重鏈)組成。免疫球蛋白的類別和亞類由其H鏈決定。本發(fā)明中的抗體可包括免疫球蛋白的任何類別，任何亞類或任何同種型。發(fā)明抗體的“功能片段”是指上述定義的抗體中單獨(dú)或多個(gè)對(duì)相應(yīng)于所述抗體的抗原有活性的部分(部分片段)，例如包括F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、二硫鍵穩(wěn)定的FV、單鏈FV(scFV)及其多聚體(D.J.King，Applications and Engineering ofMonoclonal Antibodies，1998，T.J.International Ltd.)。
迄今為止，已知IgG1包括J00228、Z17370和Y14737，IgG2包括J00230、AJ250170、AF449616、AF449617、AF449618、Z49802和Z49801，IgG3包括M12958、K01313、X16110、X99549、AJ390236、AJ390237、AJ390238、AJ390241、AJ390242、AJ390246、AJ390247、AJ390252、AJ390244、AJ390254、AJ390260、AJ390262、AJ390272、AJ390276和AJ390279，IgG4包括K01316、AJ001563和AJ001564(以上列出的符號(hào)表示基因的登錄號(hào))。
在本發(fā)明中，CH1、鉸鏈、CH2和CH3表示的是基于Kabat等人的EU索引(Kabat等，Sequences of proteins of immunological interest，1991 Fifth edition)中的任何抗體重鏈恒定區(qū)的一部分。通過(guò)定義，CH1是EU索引中從118到215之間，鉸鏈?zhǔn)荅U索引中從216到230之間，CH2是EU索引中從231到340之間，CH3是EU索引中從341到446之間。
本發(fā)明中的“人抗體”是指抗體是來(lái)源于人的抗體基因的表達(dá)產(chǎn)物。
“激動(dòng)性”是指增強(qiáng)配體與細(xì)胞例如B細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)的CD40結(jié)合的作用，或賦予表達(dá)CD40的細(xì)胞至少一種CD40配體對(duì)表達(dá)CD40的細(xì)胞的作用?！凹?dòng)型抗體”是指具有激動(dòng)作用的抗體。賦予表達(dá)CD40的細(xì)胞作用的一個(gè)例子是促進(jìn)CD95的表達(dá)。
“拮抗性”是指抑制配體與細(xì)胞例如B細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)的CD40結(jié)合的作用，或中和至少一種CD40配體對(duì)表達(dá)CD40的細(xì)胞的作用。“拮抗型抗體”是指具有拮抗作用的抗體。賦予表達(dá)CD40的細(xì)胞作用的一個(gè)例子是抑制B細(xì)胞增殖或抗體的產(chǎn)生。
本申請(qǐng)通過(guò)氨基酸序列清楚地闡述了抗體、重鏈或輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明也包括具有至少一個(gè)氨基酸，優(yōu)選地是1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1或2個(gè)氨基酸缺失或取代、或添加的氨基酸序列。
本申請(qǐng)通過(guò)核苷酸序列清楚地闡述了編碼抗體、重鏈或輕鏈可變區(qū)的基因。本發(fā)明也包括具有至少一個(gè)核苷酸，優(yōu)選地是1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1或2個(gè)核苷酸缺失或取代、或添加的核苷酸序列。
本發(fā)明中的抗CD40抗體可通過(guò)將抗體基因插入到表達(dá)載體，將載體轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)細(xì)胞或上清收獲抗體及純化抗體而提供。
載體可以是能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制，并能整合到宿主染色體上的噬菌體或質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA可來(lái)源于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或酵母，而噬菌體DNA可以來(lái)自λ噬菌體。
用于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并無(wú)特別限定，只要其可以表達(dá)靶基因即可。宿主細(xì)胞的例子包括細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等)、酵母、動(dòng)物細(xì)胞(COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞等)和昆蟲細(xì)胞。
已知有各種方法將基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，包括各種方式，例如有鈣離子介導(dǎo)，電穿孔、原生質(zhì)體融合、醋酸鋰介導(dǎo)、磷酸鈣轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。為了將基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物中的方法包括微注射、對(duì)ES細(xì)胞使用的電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；及核移植，如下所述。
在本發(fā)明中，“培養(yǎng)”是指(a)培養(yǎng)液上清，(b)培養(yǎng)的細(xì)胞、培養(yǎng)的生物量或其分解物質(zhì)，或(c)轉(zhuǎn)化子的分泌物。為了培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，要使用適于宿主的培養(yǎng)基及靜態(tài)培養(yǎng)，有時(shí)可能使用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或其它培養(yǎng)方式。
培養(yǎng)后，如果所需抗體蛋白在菌體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，則通過(guò)破碎菌體或細(xì)胞來(lái)收獲抗體。如果所需抗體在菌體或細(xì)胞外產(chǎn)生，則通過(guò)離心或其它方式從菌體或細(xì)胞中分離培養(yǎng)液。然后，單獨(dú)或聯(lián)合使用任何適于分離/純化蛋白的層析方法將所需抗體從培養(yǎng)液中分離出來(lái)。
另外，可使用構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)產(chǎn)生將基因整合為內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因山羊、轉(zhuǎn)基因綿羊或轉(zhuǎn)基因豬(Wright，G.，等，(1991)Bio/Technology 9，830-834)，從而從這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳汁中獲得大量來(lái)源于抗體基因的單克隆抗體。根據(jù)待培養(yǎng)雜交瘤的性質(zhì)、研究目的和培養(yǎng)方法，可用已知的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或任何從已知基本培養(yǎng)基制備的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤進(jìn)行體外培養(yǎng)，使雜交瘤生長(zhǎng)、維持、儲(chǔ)存并在其上清中產(chǎn)生單克隆抗體。
4.抗體特性(1)激動(dòng)型抗體由于如本發(fā)明所述的激動(dòng)型抗體突變體的ADCC和/或CDC活性等于或低于原始抗體，但保持激動(dòng)活性，因此它可激活免疫系統(tǒng)，但不損傷免疫活性細(xì)胞。因此期望該突變體具有等于或高于原始抗體的免疫激活作用，而對(duì)表達(dá)CD40的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用等于或低于原始抗體。
(2)拮抗型抗體如本發(fā)明所述的拮抗型抗CD40抗體突變體與未修飾的抗體相比較，其ADCC和/或CDC活性降低，但保持對(duì)CD40L誘導(dǎo)的免疫激活信號(hào)有抑制活性。而且也期望它可以降低通過(guò)Fc受體引發(fā)的體內(nèi)信號(hào)誘導(dǎo)活性。
5.藥物組合物一種包含如本發(fā)明的純化抗體制劑的藥物組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除抗體外，藥物組合物優(yōu)選地可包含生理上可接受的稀釋液或載體，而且可以是與不同抗體或不同藥物例如抗生素混合的混合物。合適的載體包括但不限定于，生理鹽水、磷酸緩沖鹽、磷酸緩沖鹽葡萄糖溶液和緩沖生理鹽水。選擇性地，抗體可進(jìn)行冷凍干燥以進(jìn)行儲(chǔ)存，在使用時(shí)，重新將其溶解在上述水溶性緩沖液中。藥物組合物可通過(guò)口服途徑、腸胃外注射途徑例如靜脈內(nèi)、肌肉、皮下或腹膜內(nèi)注射或定量施用。
包括如本發(fā)明所述的抗體和合適的稀釋液及生理上可接受的載體的組合物的單次有效劑量是每千克體重0.0001毫克到100毫克，施用的時(shí)間間隔可以是2天到8周。
當(dāng)藥物組合物中的抗體是激動(dòng)型抗體時(shí)，可用作免疫刺激劑(抗病毒或抗感染藥物)用于病原體包括例如甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、HIV、流感病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒、衣原體、支原體、弓形體、瘧疾、錐體蟲和結(jié)核桿菌；抗腫瘤藥物用于具有CD40表達(dá)的癌細(xì)胞的惡性腫瘤，包括例如胰腺癌、膀胱癌，淋巴瘤(例如Hodgkin′s淋巴瘤)、白血病、惡性黑素瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和頭頸癌；及自免疫疾病例如風(fēng)濕病的治療藥物。藥物組合物可用于上述疾病的聯(lián)合治療。也可以作為癌癥特異的多肽的佐劑聯(lián)合使用。另一方面，當(dāng)藥物組合物是拮抗型抗體時(shí)，則可用作器官移植中的免疫抑制劑(用于胰島、腎或其它，或GVHD移植中排斥反應(yīng)的預(yù)防或治療性藥物)，自免疫疾病(例如，風(fēng)濕病、牛皮癬、慢性潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn′s病、全身性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、肌無(wú)力癥、硬皮病、抗磷脂抗體綜合癥、自身免疫性肝炎、原發(fā)性血小板減少性紫癜、Behcet′s綜合癥、動(dòng)脈硬化、腎炎及呼吸窘迫綜合癥)的治療藥物，變態(tài)反應(yīng)(例如哮喘)的治療藥物，及凝血因子VIII抑制的治療藥物。藥物組合物可用于以上疾病的聯(lián)合治療。
6.表位分別確定了具有超級(jí)激動(dòng)活性的KM341-1-19和2105抗體和具有超級(jí)拮抗活性的4D11抗體對(duì)CD40的結(jié)合表位(實(shí)施例2)。本發(fā)明提供具有激動(dòng)或拮抗活性的抗體，這些抗體具有不同于上述抗體的可變區(qū)序列，但與上述抗體識(shí)別相同的表位。這些抗體可通過(guò)如下所述的步驟獲得。
例如，當(dāng)要獲得與KM341-1-19抗體識(shí)別相同表位的激動(dòng)型抗CD40抗體時(shí)，用CD40免疫鼠及類似動(dòng)物，得到單克隆抗體，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從中篩選和KM341-1-19抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40的單克隆抗體。根據(jù)實(shí)施例2中所述方法從篩選到的抗體中選擇與KM341-1-19抗體具有相同的結(jié)合肽的模式的抗體。
參照以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但本發(fā)明并不局限于實(shí)施例所述的具體實(shí)施方式
。
實(shí)施例1抗體和抗原蛋白的表達(dá)和純化將含抗體可變區(qū)的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞(ATCC)中，用G418篩選表達(dá)抗體的細(xì)胞，以制備穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
通過(guò)將載體瞬時(shí)引入HEK細(xì)胞(ATCC)來(lái)表達(dá)突變抗原。
通過(guò)以下方法將抗CD40抗體從上述培養(yǎng)液上清中純化。含抗CD40抗體的培養(yǎng)液上清用Hyper D蛋白質(zhì)A柱(由NGK Insulators，Ltd.生產(chǎn))，對(duì)鼠IgG1純化時(shí)用蛋白質(zhì)G柱(Amersham PharmaciaBiotech)，根據(jù)所附說(shuō)明，以PBS(-)為吸附緩沖液，0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH3)為洗脫緩沖液進(jìn)行親和純化。通過(guò)加入1M Tris-HCl(pH 8.0)或Na2HPO4溶液將洗脫組分調(diào)整到pH約7.2。制備的抗體溶液用PBS(-)通過(guò)滲透膜(10,000分子截留，由Spectrum Laboratories，Inc.生產(chǎn))或SP柱(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行透析，并用孔徑為0.22μm的濾膜MiuEX-GV(由Millipore Corp.生產(chǎn))進(jìn)行過(guò)濾和除菌。通過(guò)測(cè)定280nm吸收值計(jì)算純化抗體的濃度，以1.450D為1mg/ml。
實(shí)施例2表位的測(cè)定將CD40胞外區(qū)含氨基酸175的13-mer肽段(SEQ ID NO1)每?jī)蓚€(gè)氨基酸“步移”(shift)，共合成82種肽段(SEQ ID NOS49到130)，從C末端在纖維素膜上形成點(diǎn)，并對(duì)其N末端進(jìn)行乙?；?JeriniAG，Germany)。然后進(jìn)行常規(guī)的Western分析(參見Reineke，U.等，(2001)，″Epitope mapping with synthetic peptides prepared by SPOTsynthesis.″Antibody Engineering(Springer Lab Manual)Eds.Kontermann/Dubel，433-459)。在分析中，點(diǎn)的色彩密度用LumiImagerTM(Boehringer-Mannheim Corp.)進(jìn)行定量(圖1A-1、A-2、B-1和B-2)。
結(jié)果表明4D11抗體強(qiáng)烈地識(shí)別第20個(gè)到第24個(gè)和第41個(gè)肽段，2105抗體強(qiáng)烈地識(shí)別第12個(gè)到第23個(gè)和第64個(gè)肽段，KM341-1-19抗體強(qiáng)烈地識(shí)別第41個(gè)和第42個(gè)肽段，KM643-4-11強(qiáng)烈地識(shí)別第43個(gè)肽段，F(xiàn)72強(qiáng)烈地識(shí)別第75個(gè)肽段，110強(qiáng)烈地識(shí)別第64個(gè)肽段，F(xiàn)4-465強(qiáng)烈地識(shí)別第34、35、54、55、65、66和75個(gè)肽段，KM281-1-10強(qiáng)烈地識(shí)別第21、24、64和75個(gè)肽段，2B11(新型抗體)強(qiáng)烈地識(shí)別第21、24和64個(gè)肽段，F(xiàn)76(新型抗體)強(qiáng)烈地識(shí)別第21、35、51和52個(gè)肽段。
為了確定抗CD40抗體的結(jié)合位點(diǎn)，制備了含引入突變的CD40-FC融合蛋白，并通過(guò)ELISA檢測(cè)其結(jié)合能力。由于抗CD40抗體并不與鼠B細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)，因此通過(guò)將部分氨基酸序列轉(zhuǎn)變?yōu)槭驝D40的氨基酸序列而制備了5個(gè)融合蛋白。對(duì)抗體與抗原的結(jié)合性進(jìn)行了檢測(cè)。制備突變CD40-FC融合蛋白的方法如下所述。通過(guò)將鼠CD40序列引入到可與抗體強(qiáng)烈結(jié)合的肽序列部分而制備突變位點(diǎn)。CD40mut1將第15個(gè)肽段的EFTE轉(zhuǎn)變?yōu)锳LEK，CD40mut2將第21個(gè)肽段的LDT轉(zhuǎn)變?yōu)镾AQ，CD40mut3將第24個(gè)肽段的TH轉(zhuǎn)變?yōu)镮R，CD40mut4將第42個(gè)肽段的EEGW轉(zhuǎn)變?yōu)镵EGQ，CD40mut5將的64個(gè)肽段的VSSA轉(zhuǎn)變?yōu)镼SSL。通過(guò)基因工程技術(shù)制備這些抗體(圖2A、B和C)。分析結(jié)果表明，2105抗體極大地降低了與CD40mut1的結(jié)合能力。結(jié)果也表明，4D11抗體和2B11降低了與CD40mut2的結(jié)合能力。
實(shí)施例3抗CD40激動(dòng)型抗體與Ramos細(xì)胞的結(jié)合活性將Ramos細(xì)胞系以濃度2×106/ml懸浮在含0.1％NaN3和2％FCS的PBS染色緩沖液(SB)中。將細(xì)胞懸浮液(100μl/孔)分配到96孔圓底平板(Becton，Dickinson and Company生產(chǎn))中。加入雜交瘤培養(yǎng)上清(50μl)，并在冰上溫孵30分鐘。以針對(duì)人血清白蛋白的人IgG1抗體為陰性對(duì)照，將其在雜交瘤培養(yǎng)基中調(diào)整到濃度為2μg/ml，加樣量為50μl，然后在冰上溫孵15分鐘。平板用SB洗滌后，加入50μl 250倍稀釋的R-PE熒光標(biāo)記抗人抗體(由SouthernBiotechnology Associates，Inc.生產(chǎn))，然后在冰上溫孵15分鐘。平板用SB洗滌兩次后，將其懸浮到300到500μl FACS緩沖液中，通過(guò)FACS(FACSort，F(xiàn)ACScan，由Becton，Dickinson and Company生產(chǎn))測(cè)定每種細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例4抗CD40激動(dòng)型抗體對(duì)Ramos細(xì)胞激動(dòng)活性的評(píng)估將5.0×105cells/ml Ramos細(xì)胞懸浮液以100μl/孔接種到96孔板中。將雜交瘤培養(yǎng)上清或純化的抗體在培養(yǎng)基中稀釋到20μg/ml，然后將稀釋液以100μl/孔的濃度加到96孔板中。過(guò)夜培養(yǎng)后，收獲細(xì)胞，然后對(duì)細(xì)胞使用R-PE標(biāo)記的抗CD95抗體(Pharmingen NJ)。通過(guò)FACScan或FACSsort(Becton，Dickinson and Company)進(jìn)行分析。
實(shí)施例5抗CD40拮抗型抗體在Ramos細(xì)胞中對(duì)CD95表達(dá)的抑制將1.0×106cells/ml Ramos細(xì)胞懸浮液以50μl/孔接種到96孔板中。將雜交瘤培養(yǎng)上清或純化的抗體在培養(yǎng)基中調(diào)整到2μg/ml，然后將培養(yǎng)基以100μl/孔加到96孔板中。向培養(yǎng)基中加入4μg/ml溶解性CD40配體(Alexis Corporation)及4μg/ml抗FLAG抗體(M2，Sigma)，然后將培養(yǎng)基以50μl/孔加到96孔板中。過(guò)夜培養(yǎng)后，收獲細(xì)胞，然后對(duì)細(xì)胞使用R-PE標(biāo)記的抗CD95抗體(Pharmingen NJ)。通過(guò)FACS進(jìn)行分析。
實(shí)施例6抗CD40抗體CDC活性的測(cè)定在CDC檢測(cè)中，相對(duì)于2,000個(gè)Cr51標(biāo)記的靶細(xì)胞用總體積200μl終濃度為5％的來(lái)源于人血清的補(bǔ)體(由Sigma Co.生產(chǎn))或來(lái)源于兔血清的補(bǔ)體(Cedarlane Laboratories Limited，Ontario，Canada)及各種濃度的抗體，于37℃，5％CO2下在圓底96孔板中培養(yǎng)2小時(shí)。
培養(yǎng)后，離心平板，使細(xì)胞沉淀，然后將50μL上清轉(zhuǎn)移到含閃爍粉(LumaplateTM-96由Packard Instrument Co.，Inc.生產(chǎn))的96孔板中，并在55℃干燥1.5小時(shí)。確定平板干燥后，在平板上覆蓋一個(gè)特定的蓋子(TopSealTM-A96孔板，由Packard Instrument Co.，Inc.生產(chǎn))，用閃爍計(jì)數(shù)器(TopCount由Packard Instrument Co.，Inc.生產(chǎn))測(cè)定γ-射線的劑量。
實(shí)施例7抗CD40抗體ADCC活性的測(cè)定對(duì)于抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，測(cè)定了存在具有殺傷活性的細(xì)胞，例如NK細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞和抗體(抗體依賴的細(xì)胞毒性作用，以下為ADCC)時(shí)針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，及存在補(bǔ)體和抗體(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用，以下為CDC)時(shí)針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。以hIgG為對(duì)照。
測(cè)定方法簡(jiǎn)單描述如下。將放射性鉻(Cr51)摻入到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，然后測(cè)定細(xì)胞死亡后釋放到培養(yǎng)液中的Cr51的量作為γ-射線的劑量。
具體地，將105個(gè)Burkitt′s淋巴瘤細(xì)胞系的靶細(xì)胞Raji(ATCCCCL-86)懸浮到15μL胎牛血清(FCS)中。向懸浮液中加入50μL(37MBq/mL)Cr51標(biāo)記的鉻酸鈉(由PerkinElmer，Inc.生產(chǎn)以下以Cr51表示)，將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。然后加入10mL培養(yǎng)基，通過(guò)離心除去培養(yǎng)基。該操作步驟重復(fù)3次以除去未整合到細(xì)胞中的Cr51。
在ADCC檢測(cè)中，將2,000個(gè)Cr51標(biāo)記的靶細(xì)胞和由實(shí)施例6中所述方法獲得的200,000個(gè)健康人外周血單核白細(xì)胞與各種濃度的抗體一起在圓底96孔板(由Falcon生產(chǎn))中培養(yǎng)，總體積200μL，37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時(shí)。
培養(yǎng)后，離心平板使細(xì)胞沉淀，然后將50μL上清轉(zhuǎn)移到含閃爍粉(LumaplateTM-96由Packard Instrument Co.，Inc.生產(chǎn))的96孔板中，并在55℃干燥1.5小時(shí)。確定平板干燥后，在平板上覆蓋一個(gè)特定的蓋子(TopSealTM-A96孔板，由Packard Instrument Co.，Inc.生產(chǎn))，用閃爍計(jì)數(shù)器(TopCount由Packard Instrument Co.，Inc.生產(chǎn))測(cè)定γ-射線的劑量。
實(shí)施例8抗CD40激動(dòng)型抗體P331S突變體的制備和活性評(píng)估抗CD40激動(dòng)型抗體KM341-1-19和2105的基因克隆如WO02/099186所述。已報(bào)道將IgG2恒定區(qū)331位的脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸可降低CDC活性。為了降低KM341-1-19抗體和2105抗體的CDC活性，在IgG2恒定區(qū)引入了P331S突變。
將抗體表達(dá)載體N5KG1-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals以下縮寫為N5KG1)的人IgG1恒定區(qū)用人IgG2取代，制備N5KG2，然后將IgG2331位的Pro轉(zhuǎn)變?yōu)镾er以制備突變體。根據(jù)說(shuō)明書通過(guò)離心收獲KM341-1-19雜交瘤，加入TRIZOL(Gibco BRL)提取總RNA，進(jìn)行IgG2恒定區(qū)的cDNA克隆。用Clontech公司的SMART RACEcDNA擴(kuò)增試劑盒根據(jù)說(shuō)明書克隆抗體cDNA可變區(qū)。cDNA的第一條鏈用5μg總RNA為模板進(jìn)行制備。以tnIgG3NheatatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC(SEQ ID NO2)G和tnIgG2BamatatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC(SEQ ID3)為引物序列，用ZtaqPCR試劑盒(Takara)進(jìn)行PCR，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98℃1秒，55℃30秒，72℃1分鐘以擴(kuò)增基因。反應(yīng)后，用QIAGEN PCR純化試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物純化，然后用NheI和BamHI消化，并整合到N5KG1中以確定其序列。該載體命名為N5KG2。
如下制備N5KG2Ser(331位Pro轉(zhuǎn)變?yōu)镾er)。以N5KG2為模板，IgG3NheatatGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG(SEQ ID NO4)和G2Ser2GTTTTCTCGATGGAGGCTGGGAGGCC(SEQ ID NO5)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。同時(shí)，以N5KG2為模板，IgG2BamatatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC(SEQ ID NO6)和G2Ser1GGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAAC(SEQ ID NO7)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。擴(kuò)增的DNA片段用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，將兩種純化DNA片段進(jìn)行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行5次反應(yīng)。向混合物中加入引物IgG3Nhe和IgG2Bam，并進(jìn)行15次同樣的反應(yīng)。然后將擴(kuò)增的DNA片段用NheI和BamHI進(jìn)行酶切，并用N5KG1載體(N5KG2Ser)中的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行取代。將含用Bg1II和NheI消化的抗體可變區(qū)序列的片段整合到N5KG2Ser中。
評(píng)估通過(guò)上述方法表達(dá)和純化的抗體對(duì)Ramos細(xì)胞的結(jié)合能力(圖3A)和激動(dòng)活性(圖3B)。未觀察到由于引入P331S突變而產(chǎn)生的活性變化。
實(shí)施例9抗CD40激動(dòng)型抗體331ser突變體的CDC活性測(cè)定根據(jù)以上方法測(cè)定CDC活性。使用來(lái)源于兔血清的補(bǔ)體，以Ramos細(xì)胞為靶細(xì)胞。結(jié)果表明，在抗體濃度為1μg/ml的KM341-1-19抗體中，與IgG2相比較，IgG2ser的CDC活性極大降低(圖4A)。另外，當(dāng)使用人補(bǔ)體時(shí)，沒(méi)有觀察到變化(圖4B)。
實(shí)施例10恒定區(qū)改變的激動(dòng)型抗CD40抗體的制備和活性測(cè)定在WO 02/088186所述的抗CD40抗體中，有兩個(gè)屬于IgG2亞類的抗體具有很強(qiáng)的激動(dòng)活性(KM341-1-19抗體和2105抗體)。為了檢測(cè)IgG2亞類是否對(duì)激活CD40是重要的，分別制備了抗體恒定區(qū)改變?yōu)镮gG1、IgG3和IgG4的重組蛋白，并根據(jù)實(shí)施例4和6測(cè)定了對(duì)抗原的結(jié)合能力及在Ramos細(xì)胞中增強(qiáng)CD95表達(dá)的活性。用N5KG1表達(dá)IgG1，用通過(guò)以IgG2和IgG3取代N5KG1恒定區(qū)而獲得的表達(dá)載體N5KG2和N5KG3表達(dá)IgG2和IgG3。用IgG3特異的引物根據(jù)部分修改的IgG2克隆方法進(jìn)行IgG3恒定區(qū)的cDNA克隆。用N5KG4PE(IDEC Pharmaceuticals)表達(dá)IgG4。
根據(jù)實(shí)施例1表達(dá)抗體蛋白。將IgG2轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG1、IgG3或IgG4并不影響KM341-1-19抗體和2105抗體對(duì)表達(dá)人CD40的Ramos細(xì)胞的結(jié)合活性(圖5A-1和5A-2)。但這些抗體在Ramos細(xì)胞中對(duì)促進(jìn)CD 95表達(dá)增強(qiáng)的活性降低了10％或更多(圖5B-1和5B-2)。這表明，不僅可變區(qū)的結(jié)構(gòu)可確定抗體的結(jié)合區(qū)，抗體恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)在2105抗體和KM341-1-19抗體的強(qiáng)激動(dòng)活性中也是重要的。因此，為了檢測(cè)IgG2恒定區(qū)的哪個(gè)區(qū)對(duì)激動(dòng)活性是重要的，制備了將IgG2結(jié)構(gòu)與IgG4結(jié)構(gòu)混合的結(jié)構(gòu)域交換突變體，并測(cè)定其活性。如下所述，通過(guò)取代鉸鏈區(qū)而制備結(jié)構(gòu)域交換的突變體。在這種情況下，“鉸鏈區(qū)”包括上部鉸鏈(從Kabat EU編碼216)、中部鉸鏈(從Kabat EU編碼226)和下部鉸鏈(Kabat EU編碼231)，如Ole H Brekke等人在ImmunologyToday 1995，16，85-90中所描述。分別制備了KM341-1-19抗體和2105抗體的4個(gè)結(jié)構(gòu)域交換突變體IgG2/4(CH1和鉸鏈區(qū)IgG2，其它區(qū)IgG4)，IgG4/2/4(鉸鏈區(qū)IgG2，其它區(qū)IgG4)，IgG2/4/4(CH1IgG2，其它區(qū)IgG4)和IgG4/2/2(CH1IgG4，其它區(qū)IgG2)。
用Ztaq PCR試劑盒(Takara)制備表達(dá)IgG2/4抗體的載體N5KG2/4。以N5KG2為模板，IgG3BamatatggatccTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC(SEQ ID NO8)和24Chi4AGGGGTCCGGGAGATCATGAGAGTGTCCTT(SEQ ID NO9)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。同時(shí)，以N5KG4(IDECPharmaceuticals)為模板，24Chi3AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCT(SEQID NO10)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO11)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。擴(kuò)增的DNA片段用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并將兩種純化DNA片段進(jìn)行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行5次反應(yīng)。向混合物中加入引物IgG3Bam和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO12)，并進(jìn)行15次同樣的反應(yīng)。擴(kuò)增的DNA片段用NheI和BamHI進(jìn)行酶切，并用N5KG1載體中的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行取代。
表達(dá)IgG4/2/4的載體N5KG4/2/4如下進(jìn)行制備。以N5KG4為模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO13)、G2Hin3TTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGG(SEQ ID NO14)、linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO15)和G2Hin4ACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCG(SEQ ID NO16)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。擴(kuò)增的DNA片段用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并將兩種純化DNA片段進(jìn)行等量混合。然后以混合物為模板，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行5次反應(yīng)。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并進(jìn)行15次同樣的反應(yīng)。擴(kuò)增的DNA片段用NheI和BamHI進(jìn)行酶切，并用N5KG1載體中的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行取代。
表達(dá)IgG2/4/4的載體N5KG2/4/4如下進(jìn)行制備。以N5KG2為模板，IinkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO17)和G4CH1-2GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG(SEQ ID NO18)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。同時(shí)，以N5KG4模板，G4CH1-1CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC(SEQ ID NO19)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO20)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。擴(kuò)增的DNA片段用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并將兩種純化DNA片段進(jìn)行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行5次反應(yīng)。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并進(jìn)行15次同樣的反應(yīng)。擴(kuò)增的DNA片段用NheI和BamHI進(jìn)行酶切，并用N5KG1載體中的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行取代。
表達(dá)IgG4/2/2的載體N5KG4/2/2如下制備。以N5KG4為模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO21)和G4CH1-2GGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAG(SEQ ID NO22)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。同時(shí)，以N5KG2為模板，G4CH1-1CTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACC(SEQ ID NO23)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO24)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。擴(kuò)增的DNA片段用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并將兩種純化DNA片段進(jìn)行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行5次反應(yīng)。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并進(jìn)行15次同樣的反應(yīng)。擴(kuò)增的DNA片段用NheI和BamHI進(jìn)行酶切，并用N5KG1載體中的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行取代。
測(cè)定KM341-1-19抗體和2105抗體4種結(jié)構(gòu)域交換突變體的結(jié)合活性。結(jié)果表明，它們與原始的IgG2之間的結(jié)合活性沒(méi)有差異(圖6A-1和6A-2)。但只有KM341-1-19抗體和2105抗體的IgG2/4/4的激動(dòng)活性極大降低(圖6B-1和6B-2)。結(jié)果表明IgG2的鉸鏈區(qū)對(duì)激動(dòng)活性是非常重要的。
進(jìn)一步檢測(cè)了鉸鏈區(qū)的哪段序列是重要的。將鉸鏈區(qū)分為3個(gè)部位，具體地為上部鉸鏈、中部鉸鏈和下部鉸鏈(Ole H Brekke等，Immunology Today 1995，16，85-90)。將這些區(qū)中IgG2特異的序列用IgG4特異的序列取代。通過(guò)在上部鉸鏈(從Kabat EU code 216)、中部鉸鏈(從Kabat EU code 226)和下部鉸鏈(從Kabat EU code 231)引入突變而得到的抗體分別命名為IgG2UH4、IgG2MH4和IgG2LH4。它們各自的表達(dá)載體命名為N5KG2UH4、N5KG2MH4和N5KG2LH4?！般q鏈”根據(jù)Kabat等人在Sequences of proteins ofimmunological interest，1991 Fifth edition中所述定義為EU索引216到230。
N5KG2UH4制備如下。以N5KG2為模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO25)和UH4-2CACAACATTTggaCTCAACTcTCTTGTCCACC(SEQ ID NO26)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。同時(shí)，以N5KG2為模板，UH4-1GGTGGACAAGAgAGTTGAGtccAAATGTTGTG(SEQ ID NO27)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO28)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。擴(kuò)增的DNA片段用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并將兩種純化DNA片段進(jìn)行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行5次反應(yīng)。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并進(jìn)行15次同樣的反應(yīng)。擴(kuò)增的DNA片段用NheI和BamHI進(jìn)行酶切，并用N5KG1載體中的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行取代。
N5KG2MH4制備如下。以N5KG2為模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO29)和UM4-2GGCACGGTGGGCAtgggggaccataTTTGCGCTC(SEQ ID NO30)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。同時(shí)，以N5KG2為模板，UM4-1GAGCGCAAAtatggtcccccaTGCCCACCGTGCC(SEQ ID NO31)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO32)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。擴(kuò)增的DNA片段用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并將兩種純化DNA片段進(jìn)行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行5次反應(yīng)。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并進(jìn)行15次同樣的反應(yīng)。擴(kuò)增的DNA片段用NheI和BamHI進(jìn)行酶切，并用N5KG1載體中的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行取代。
N5KG2LH4制備如下。以N5KG2為模板，linkHgggtacgtcctcacattcagtgatcag(SEQ ID NO33)和UL4-2GAAGACTGACGGTCCccccaggaactcTGGTGCTGGGCA(SEQ ID NO34)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。同時(shí)，以N5KG2為模板，UL4-1TGCCCAGCACCAgagttcctggggGGACCGTCAGTCTTC(SEQ ID NO35)和linkH2tgatcatacgtagatatcacggc(SEQ ID NO36)為引物進(jìn)行反應(yīng)，98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，反應(yīng)進(jìn)行15次。擴(kuò)增的DNA片段用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，并將兩種純化DNA片段進(jìn)行等量混合。然后98℃1秒，60℃30秒，72℃30秒，進(jìn)行5次反應(yīng)。向混合物中加入引物linkH和linkH2，并進(jìn)行15次同樣的反應(yīng)。擴(kuò)增的DNA片段用NheI和BamHI進(jìn)行酶切，并用N5KG1載體中的IgG1恒定區(qū)進(jìn)行取代。
其中檢測(cè)到有3個(gè)KM341-1-19抗體和2105抗體的結(jié)構(gòu)域交換突變體對(duì)抗原具有相同的結(jié)合活性(圖6A-1和6A-2)。但I(xiàn)gG2UH4和IgG2MH4對(duì)Ramos細(xì)胞的激動(dòng)活性極大降低(圖6B-1和6B-2)。從上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鉸鏈區(qū)上部和中部鉸鏈的結(jié)構(gòu)對(duì)抗CD40抗體KM341-1-19和2105的IgG2亞類依賴性激動(dòng)活性是非常重要的。
由于IgG2對(duì)激動(dòng)活性是非常重要的，因此對(duì)將除IgG2外的其它亞類的抗體轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2亞類抗體后是否可以增強(qiáng)其激動(dòng)活性進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)幾個(gè)克隆發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)76的激動(dòng)活性可通過(guò)將IgG1亞類轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG2亞類而增強(qiáng)(圖7A和B)。
實(shí)施例11抗CD40的拮抗型抗體突變體的制備將含如WO 02/088186所述的，來(lái)源于IgG1的4D11抗體重鏈和輕鏈的DNA片段用Bg1II和NheI消化、純化并整合到N5KG4PE、N5KG4P和N5KG4載體(IDEC Pharmaceuticals)中。N5KG4PE在IgG4恒定區(qū)包含點(diǎn)突變S228P和L235E，而N5KG4P在IgG4恒定區(qū)包含點(diǎn)突變S228P。根據(jù)上述方法對(duì)抗體蛋白進(jìn)行表達(dá)和純化。根據(jù)上述方法以對(duì)Ramos細(xì)胞的結(jié)合為指標(biāo)對(duì)抗體進(jìn)行純化。未觀察到IgG1、IgG4、IgG4P和IgG4PE對(duì)Ramos細(xì)胞結(jié)合活性的變化(圖8A)。根據(jù)上述方法比較IgG1與各種IgG4突變體的拮抗活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IgG1的拮抗活性與IgG4突變體的拮抗活性沒(méi)有差異(圖8B)。
實(shí)施例12抗CD40拮抗型抗體突變體ADCC活性和CDC活性的評(píng)估根據(jù)上述方法評(píng)估抗CD40突變抗體的ADCC活性和CDC活性。
當(dāng)以人MNC細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，表達(dá)CD40的Daudi細(xì)胞為靶細(xì)胞時(shí)，與作為4D11抗體原始亞類的IgG1相比較，有兩個(gè)突變體IgG4和IgG4PE的ADCC活性極大降低(圖9)。
以Daudi細(xì)胞為靶細(xì)胞，比較IgG1與IgG4P的CDC活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與IgG1相比，IgG4P的CDC活性極大降低(圖10)。
實(shí)施例13抗CD40拮抗型抗體對(duì)B細(xì)胞的作用將100μg4D11抗體的IgG1、IgG4P和IgG4PE尾靜脈施用于其遺傳背景是鼠內(nèi)源CD40破壞但具有人CD40基因的純合子轉(zhuǎn)基因鼠(Yasui.等，Int.Immunol.2002 Vol 14319)。施用24小時(shí)后，從眼窩靜脈血管叢收集血液。用0.16mol/L氯化銨溶血后，向溶血裂解物中加入FITC-標(biāo)記的抗B220抗體，并用FACS進(jìn)行分析。結(jié)果如圖11所示。在圖中，縱軸表示B細(xì)胞在總淋巴細(xì)胞中的比例。IgG1可最大程度降低B細(xì)胞的比例，IgG4P降低的比例較小，而IgG4PE降低的比例更小。施用24小時(shí)后，切除脾，用載玻片壓碎，制備細(xì)胞懸浮液。對(duì)細(xì)胞懸浮液溶血后，對(duì)溶血裂解物使用PE-標(biāo)記的抗B220抗體和FITC-標(biāo)記的抗CD23、CD86或CD95抗體，并用FACS進(jìn)行分析。結(jié)果如圖12A、B和C所示。在圖中，縱坐標(biāo)表示表達(dá)表面標(biāo)志物的B細(xì)胞在總淋巴細(xì)胞中的比例。結(jié)果表明，4D11G1可達(dá)到與商品化的鼠抗人CD40激動(dòng)型抗體5C3(Pharmingen)相同水平的增加每種標(biāo)志物表達(dá)的能力。與IgG1和IgG4P相比較，IgG4PE對(duì)激活表面標(biāo)志物表達(dá)的增加較小。
實(shí)施例14抗CD40拮抗型抗體對(duì)抑制抗原特異的抗體產(chǎn)生和B細(xì)胞數(shù)目改變方面的作用將100μg(基于NP-CGG)4-羥基-3-硝基苯乙?；?雞γ-球蛋白結(jié)合物(NP-CGG由Hitoshi KIKUTANI教授提供，Research Institute forMicrobial Diseases，Osaka University)和明礬的復(fù)合體通過(guò)腹膜內(nèi)施用于其遺傳背景是鼠內(nèi)源CD40破壞但具有人CD40基因的純合子轉(zhuǎn)基因鼠(Yasui.等，Int.Immunol.2002 Vol 14319)，使鼠致敏。在用抗原致敏前，通過(guò)尾靜脈施用50或100μg抗體。施用100μg抗人白蛋白的人IgG4PE抗體作為對(duì)照。致敏7和14天后，從眼窩靜脈血管叢收集血液。通過(guò)ELISA方法測(cè)定血清中NP特異的IgG1和IgM抗體的量。ELISA方法如下進(jìn)行。將50μl/孔結(jié)合NP的牛血清白蛋白(NP-BSA2.5μg/ml)加到用于ELISA測(cè)定的96微孔板(Maxisorp，由Nunc A/S生產(chǎn))的孔中，并在4℃溫育，以使NP-BSA吸附在其上。然后除去上清，向每個(gè)孔中加入封閉試劑(SuperBlock，由PierceBiotechnology，Inc.生產(chǎn))，在室溫下溫育，進(jìn)行封閉。然后用含0.1％Tween 20的磷酸緩沖液(PBS-T)洗滌孔3次。然后向孔中加入用含10％Block Ace(50μl/孔)的PBS-T稀釋的血清，在37℃溫育反應(yīng)2小時(shí)。將微孔板用PBS-T洗滌3次。然后向孔中加入堿性磷酸酶(CosmoBio，1070-04 or 1020-04)標(biāo)記的1,000倍稀釋的羊抗鼠IgG1抗體或IgM抗體及含10％Block Ace的PBS-T(50μg/孔)，37℃溫育2小時(shí)。然后用PBS-T洗滌微孔板，然后向孔中加入顯色底物溶液(50μl/孔，Sigma 104，磷酸酶底物)。用微孔板讀數(shù)儀測(cè)定波長(zhǎng)405nm處的吸收值。結(jié)果如圖13A和B所示。在圖中，縱坐標(biāo)表示將從C57BL/6鼠收集的10,000倍稀釋(對(duì)IgG1而言)或100倍稀釋(對(duì)IgM抗體而言)的血清轉(zhuǎn)換為注射2次1個(gè)單位NP-CGG的血清而得到的值。4D11抗體和281的IgG4P或IgG4PE抗體可同等程度抑制NP特異的IgG1和IgM抗體的產(chǎn)生。
根據(jù)與實(shí)施例1中相同的方法測(cè)定鼠外周血和脾中B細(xì)胞數(shù)目的變化，檢測(cè)對(duì)產(chǎn)生抗體的抑制作用。結(jié)果如圖14A和B所示。與IgG4PE抗體相比較，4D11抗體和281的IgG4P抗體可顯著降低外周血中B細(xì)胞的比例。在抗原致敏14天后，施用100μg IgG4PE抗體并不改變脾中B細(xì)胞的數(shù)目。但施用IgG4P可改變或傾向于改變?cè)摫壤?br> 實(shí)施例15抗CD40拮抗型抗體對(duì)獼猴的作用對(duì)獼猴前臂-頭靜脈施用30mg/kg 4D11抗體的IgG4P或IgG4PE，一定時(shí)間后從股靜脈收集血液。在外周血淋巴細(xì)胞的亞類分析中，對(duì)細(xì)胞懸浮液使用了FITC-標(biāo)記的抗CD3抗體、PE-標(biāo)記的抗CD20抗體和APC-標(biāo)記的抗CD45抗體，用FACS測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的比例，從而計(jì)算CD45陽(yáng)性細(xì)胞的比例。結(jié)果如圖15所示。在圖中，縱坐標(biāo)表示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)CD20陽(yáng)性細(xì)胞與抗體施用前CD20陽(yáng)性細(xì)胞的比例。在單獨(dú)施用IgG4P抗體1到7天后，CD20陽(yáng)性細(xì)胞在個(gè)體中降低約40％。但單獨(dú)施用IgG4PE抗體4天后，CD20陽(yáng)性細(xì)胞僅降低20％。
通過(guò)ELISA方法測(cè)定血清中IL12的濃度。從股動(dòng)脈收集血液，在室溫下放置20到60分鐘，然后3,000rpm，室溫下離心15分鐘。通過(guò)猴IL12 ELISA試劑盒(BioSource International Inc.)測(cè)定所得血清中的IL12濃度。結(jié)果如圖16所示。在任何采血時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有觀察到由IgG4PE抗體引起的IL-12產(chǎn)生的增加。但由IgG4P抗體引起的IL12在第四天產(chǎn)生最大值。
實(shí)施例16抗CD40拮抗型抗體對(duì)獼猴遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型的作用用破傷風(fēng)類毒素(TTx)(10Lf/ml；Denka Seiken Co.，Ltd.)對(duì)9只雄性獼猴進(jìn)行皮內(nèi)或肌肉內(nèi)刺激，以誘導(dǎo)對(duì)TTx的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。同時(shí)，在致敏開始前10分鐘，對(duì)每3只動(dòng)物靜脈內(nèi)施用0.1和10mg/kg 4D11G4PE抗體3次(每周一次)，以檢測(cè)4D11G4PE對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用。在肌肉內(nèi)施用氯胺酮進(jìn)行麻醉后，通過(guò)皮內(nèi)對(duì)背部施用TTx(50μL/位點(diǎn)×12位點(diǎn))，并對(duì)股骨肌肉內(nèi)施用TTx(0.6mL/身體)進(jìn)行致敏反應(yīng)，在致敏21天后，通過(guò)對(duì)胸腔皮內(nèi)施用TTx(10μL/位點(diǎn)，對(duì)每3個(gè)位點(diǎn)施用0到10Lf/ml)進(jìn)行激發(fā)。在激發(fā)24和48小時(shí)后，觀察施用部位的皮膚反應(yīng)，并根據(jù)Draize皮膚過(guò)敏評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估。每3個(gè)位點(diǎn)測(cè)定的TTx濃度結(jié)果為一個(gè)平均值。結(jié)果如圖17所示。施用4D11G4PE抗體24和48小時(shí)后，可顯著抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)。
檢測(cè)了TTx對(duì)TTx特異的IgG和IgM抗體的作用。在不同時(shí)間從股骨靜脈采血，并在室溫放置20到60分鐘，然后在室溫下3,000rpm離心15分鐘。通過(guò)ELISA方法測(cè)定所得血清的抗體效價(jià)。ELISA方法如下進(jìn)行。將100μl/孔的TTx(0.5Lf/ml)加到用于ELISA測(cè)定的96微孔板(Maxisorp，由Nunc A/S生產(chǎn))的孔中，并在4℃溫育，以使TTx吸附于其上。然后除去上清，向孔中加入封閉試劑(含0.5％BSA的磷酸緩沖液)，在室溫下溫育進(jìn)行封閉。然后用含0.05％Tween 20的磷酸緩沖液(PBS-T)洗滌孔3次。然后向孔中加入用含0.5％BSA的PBS-T稀釋的血清(100到819，200倍稀釋，稀釋放大率2；100μl/孔)，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。微孔板用PBS-T洗滌3次。然后向孔中加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的3,000倍稀釋的羊抗猴IgG抗體或IgM抗體(Nordic Immunology)和含0.5％BSA(100μg/孔)的PBS-T，室溫下溫育1小時(shí)。然后用PBS-T洗滌微孔板，然后向孔中加入顯色底物溶液(100μl/孔，o-鹽酸苯二胺+過(guò)氧化氫水溶液)。用微孔板讀數(shù)儀測(cè)定492nm波長(zhǎng)處的吸收值。抗TTx抗體效價(jià)定義為使吸收值為0.1或更高時(shí)的最大稀釋倍數(shù)。當(dāng)吸收值甚至在100倍稀釋仍不能達(dá)到0.1時(shí)，則抗體的效價(jià)為0。結(jié)果如圖18和19所示。施用1mg/kg 4D11G4PE可抑制TTx特異的IgG和IgM抗體效價(jià)約為1/10。當(dāng)施用10mg/kg4D11G4PE時(shí)，抗體效價(jià)在任何采血點(diǎn)都在檢測(cè)靈敏度之下。
實(shí)施例17抗CD40拮抗型抗體對(duì)血小板血栓形成的影響將從健康人體收集的血液分為4份(每份6ml)。向每份分別加入對(duì)照人IgG4PE、對(duì)照鼠IgG2a、人抗人CD40IgG4PE(4D11)和鼠抗人CD154 IgG2a(5C8)，使每份的血液濃度為100μg/ml。根據(jù)說(shuō)明書組裝扁平灌注室(GlycoTech Corp.)和包被膠原的Petri培養(yǎng)皿。將用各種抗體處理的血液以對(duì)血液的剪切力為1,500/s的速度經(jīng)過(guò)7分鐘流到灌注室中。然后，將4％多聚甲醛磷酸緩沖液以對(duì)緩沖液的剪切力為1,500/s的速度經(jīng)過(guò)10分鐘流到灌注室中。將在Petri培養(yǎng)皿上形成的血小板凝集固定、用血小板特異的PE-標(biāo)記的CD41a抗體染色，并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖20A和B所示。用人抗人CD40IgG4PE(4D11)處理的血液和用對(duì)照抗體處理的血液一樣可在包被膠原的Petri培養(yǎng)皿上形成血小板凝集。但用鼠抗人CD154 IgG2a處理的血液不形成血小板凝集。
實(shí)施例18抗CD40拮抗型抗體穩(wěn)定性的評(píng)估對(duì)4D11抗體恒定區(qū)修飾抗體的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較和檢測(cè)。在評(píng)估方法中，將瞬時(shí)表達(dá)G4P、G4PE、G2Ser和G4/2/4的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)液上清通過(guò)蛋白質(zhì)A柱(Amersham Pharmacia Biotech)，并用0.1M檸檬酸緩沖液(pH 2.7)進(jìn)行洗脫，然后在37℃溫育1分鐘和10分鐘。然后用50nM磷酸緩沖液(pH 7.0)進(jìn)行中和。通過(guò)凝膠過(guò)濾柱(Tosoh Corp.)測(cè)定所得抗體溶液中寡聚體的含量。結(jié)果表明，寡聚體含量隨著溫育時(shí)間的增加而增加，G4/2/4最容易產(chǎn)生寡聚體，G4PE次之，G2Ser第三，而G4P第四(圖21)。
實(shí)施例19抗CD40拮抗型抗體對(duì)抑制皮膚移植排斥的作用將DBA/2鼠尾部的皮膚移植到其遺傳背景是鼠內(nèi)源CD40破壞但具有人CD40基因的純合子轉(zhuǎn)基因鼠C57BL/6的胸腔側(cè)背面，并用石膏對(duì)移植的皮膚固定7天。在皮膚移植0、2、4、7、9、11和14天后，將100μg待測(cè)底物4D11G4PE或載體進(jìn)行尾靜脈給藥。為了抑制NK細(xì)胞的移植排斥作用，在操作前3天和操作后第1、4和9天對(duì)所有鼠腹膜內(nèi)施用100μg抗asialo GML抗體。結(jié)果如圖22所示。與施用載體的組相比較，施用4D11G4PE組的移植排斥有明顯的延遲。
實(shí)施例20CD40在人腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)的分析用341G2Ser通過(guò)FACS分析來(lái)驗(yàn)證CD40在Burkitt′s淋巴瘤細(xì)胞系Ramos、膀胱癌細(xì)胞系T24(ATCC，HTB-4)、胰腺癌細(xì)胞系Hs 766T(ATCC，HTB-134)和Capan-2(ATCC，HTB-80)中的表達(dá)。
用胰蛋白酶消化T24、Hs 766T和Capan-2并收獲細(xì)胞，Ramos同樣進(jìn)行收獲。用PBS洗滌細(xì)胞系，然后重懸到含1μg/ml 341G2Se的染色緩沖液中。染色緩沖液是通過(guò)向PBS中加入0.05mM EDTA、0.05％疊氮化鈉和5％固定化的牛血清而得到的。在4℃溫育15分鐘后，用染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后重懸到用染色緩沖液進(jìn)行1∶250稀釋的PE-結(jié)合的羊抗人IgG(γ)(Southern Biotechnology Associates，Inc)稀釋液中。在4℃溫育15分鐘后，用染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后用FACSCalibur(由BD Biosciences生產(chǎn))進(jìn)行分析。以相同量的人抗-2，4-二硝基苯酚(DNP)抗體為陰性對(duì)照。用Cellquest(由BDBiosciences生產(chǎn))數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。
結(jié)果表明，當(dāng)用341G2Ser染色時(shí)，Ramos、T24、Hs766T和Capan-2的平均熒光強(qiáng)度明顯高于陰性對(duì)照，從而驗(yàn)證了CD40的表達(dá)。
實(shí)施例21抗CD40激動(dòng)型抗體對(duì)人腫瘤細(xì)胞系的作用分別將2.5×103個(gè)Ramos細(xì)胞，2.5×102個(gè)T24細(xì)胞，5×103個(gè)Hs766T細(xì)胞和5×103個(gè)Capan-2細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，使其在圓底96孔板(由Falcon生產(chǎn))中總體積為100μL。將Ramos和Hs766T、Capan-2和T24與濃度為1ng/ml到1,000ng/ml的341G2Ser一起在37℃，5％CO2下培養(yǎng)66小時(shí)、90小時(shí)和114小時(shí)。加入10μL(3.7MBq/mL)3H-標(biāo)記的胸腺嘧啶(由Amersham Biosciences生產(chǎn))，并在37℃，5％CO2下培養(yǎng)6小時(shí)。在Printed Filtermat A(由PerkinElmer，Inc.生產(chǎn))上用96微孔板收獲器(由Skatron Instruments，Inc.生產(chǎn))收獲Ramos細(xì)胞，并用樣品袋(由PerkinElmer，Inc.生產(chǎn))覆蓋。加入12mL Betaplate Scint(由PerkinElmer，Inc.生產(chǎn))，然后用液體閃爍計(jì)數(shù)器(Pharmacia 1205 Betaplate由Pharmacia Corp.生產(chǎn))測(cè)定β-射線的劑量。用收獲器(由PerkinElmer，Inc.生產(chǎn))在過(guò)濾型微孔板(由PerkinElmer，Inc.生產(chǎn))上分別收獲Hs 766T細(xì)胞、T24細(xì)胞和Capan-2細(xì)胞。將特定的封條貼在過(guò)濾器背面，然后向其中加入20μL/孔MicroScint 20(由PerkinElmer，Inc.生產(chǎn))。用閃爍計(jì)數(shù)器(TopCount由Packard Instrument Co.，Inc.生產(chǎn))測(cè)定β-射線的劑量。數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得的三次測(cè)量的平均值除以非處理對(duì)照的值而獲得的細(xì)胞存活率(％)來(lái)表示。
結(jié)果表明，在所有細(xì)胞系中，細(xì)胞存活率都隨341G2Ser的濃度而降低(表1)。當(dāng)加入100ng/ml 341G2Ser時(shí)，Ramos細(xì)胞的存活率為58％，T24細(xì)胞的存活率為22％，Hs 766T細(xì)胞的存活率為15％，Capan-2細(xì)胞的存活率為77％。結(jié)果表明341G2Ser具有抑制Ramos細(xì)胞、T24細(xì)胞、Hs 766T細(xì)胞和Capan-2細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。
表1細(xì)胞存活率

實(shí)施例22抗CD40激動(dòng)型抗體對(duì)患癌鼠模型的作用(1)Ramos細(xì)胞用3Gy射線照射6周齡雌Balb/c裸鼠(購(gòu)自CLEA Japan，Inc.)，并將2×107cells/鼠的Ramos細(xì)胞皮下移植到其背部。移植16天后，測(cè)定該處的腫瘤體積。將腫瘤大小為50到170mm3的患癌鼠劃為一組，每組包括5只鼠。在第16天用100μg/鼠341G2Ser(溶在200μl含1％裸鼠血清的PBS中的溶液)對(duì)患癌鼠靜脈內(nèi)施用1次，并在第47天測(cè)定腫瘤大小。以人抗人血清白蛋白(HAS)抗體為陰性對(duì)照。
(2)T24細(xì)胞除去3次皮下植入裸鼠背部的T24細(xì)胞塊，并將其皮下移植到6周齡雌Balb/c裸鼠(購(gòu)自CLEA Japan，Inc。)背部。移植的腫瘤塊約為3平方毫米。移植10天后，測(cè)定移植的腫瘤的體積。將腫瘤大小為80到200mm3的患癌鼠劃分為一組，每組包括5只鼠。在第10天用100μg/鼠341G2Ser(溶在200μl含1％裸鼠血清的PBS中的溶液)對(duì)患癌鼠靜脈內(nèi)施用1次，并在第29天測(cè)定腫瘤大小。以人抗DNP抗體為陰性對(duì)照。
(3)Hs 766T細(xì)胞將7×105cells/鼠的Hs 766T細(xì)胞皮下移植到6周齡雌Balb/c裸鼠(購(gòu)自CLEA Japan，Inc.)背部。移植16天后，測(cè)定移植腫瘤的大小。將腫瘤大小為50到140mm3的患癌鼠劃分為一組，每組包括5只鼠。在第16天用100μg/鼠341G2Ser(溶在200μl含1％裸鼠血清的PBS中的溶液)對(duì)患癌鼠靜脈內(nèi)施用1次，并在第32天測(cè)定腫瘤大小。以人抗DNP抗體為陰性對(duì)照。
(4)Capan-2細(xì)胞將2×106cells/鼠的Capan-2細(xì)胞皮下移植到6周齡雌Balb/c裸鼠(購(gòu)自CLEA Japan，Inc.)背部。移植13天后，測(cè)定移植腫瘤的大小。將腫瘤大小為30到130mm3的患癌鼠劃分為一組，每組包括5只鼠。從第13天用10或100μg/鼠341G2Ser(溶在200μl含1％裸鼠血清的PBS中的溶液)對(duì)患癌鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)施用，每周兩次，并在第34天測(cè)定腫瘤大小。以人多克隆抗體(hIgG)(由Sigma Co.生產(chǎn))為陰性對(duì)照。
通過(guò)以下公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率(TGIR)。
100-[{(施用341G2Ser組在最后測(cè)量日的平均腫瘤體積-施用341G2Ser組在開始施用抗體時(shí)的平均腫瘤體積)/(施用陰性對(duì)照組在最后測(cè)量日的平均腫瘤體積-施用陰性對(duì)照組在開始施用抗體時(shí)的平均腫瘤體積)}×100]結(jié)果表明，T24、Hs766T和Capan-2患癌鼠中的TGIR超過(guò)100％，并在鼠中觀察到腫瘤體積的減小。另一方面，Ramos患癌鼠中的TGIR為73.4％，腫瘤體積在鼠中的增加受到相當(dāng)抑制(表2)。圖23到26分別表示的是在移植了Ramos細(xì)胞、T24細(xì)胞、Hs 766T細(xì)胞和Capan-2細(xì)胞的患癌鼠中腫瘤體積的變化。
表2腫瘤生長(zhǎng)抑制率

細(xì)胞系的抑制率是最后測(cè)量日的值。
工業(yè)應(yīng)用如實(shí)施例所述，本發(fā)明的抗CD40抗體在恒定區(qū)引入突變，使抗CD40抗體亞類的部分結(jié)構(gòu)被另一亞類取代，從而降低了ADCC活性和CDC活性，但保持其活性。因此，本發(fā)明的抗體在作為治療性抗體向患者施用時(shí)可降低對(duì)表達(dá)CD40的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，從而具有安全性。
本申請(qǐng)所引用的所有出版物，專利和專利申請(qǐng)均全部并入本申請(qǐng)作為參考。
序列表說(shuō)明SEQ ID NOS2到36合成的DNASEQ ID NOS49到130合成的肽序列表<110>KIRIN BEER KABUSIKI KAISHA<120>抗CD40抗體突變體<130>PH-2356-PCT<140>
<141>
<150>JP 2003-431408<151>2003-12-25<160>142<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>175<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln1 5 10 15Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr20 25 30Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu35 40 45Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp50 55 60Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp65 70 75 80Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys85 90 95Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe Gly Val Lys100 105 110Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro Cys Pro Val115 120 125Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His Pro Trp130 135 140Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln Ala Gly Thr Asn145 150 155 160Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu Arg Ala Leu165 170 175<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
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405 410 415Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe420 425 430Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn435 440 445Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr450 455 460Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys465 470<210>141<211>708<212>DNA<213>人<400>141atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggcttctgc tgctctggct cccaggtgcc 60agatgtgcca tccagttgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagcagtg ctttagcctg gtatcagcag 180aaaccaggga aagctcctaa gctcctgatc tatgatgcct ccaatttgga aagtggggtc 240ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300cagcctgaag attttgcaac ttattactgt caacagttta atagttaccc gacgttcggc 360caagggacca aggtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttga 708<210>142<211>235<212>PRT<213>人<400>142Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys50 55 60Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val65 70 75 80Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln100 105 110Phe Asn Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu130 135 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145 150 155 160Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln165 170 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser180 185 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu195 200 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser210 215 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 23權(quán)利要求
1.具有激動(dòng)活性、與CD40結(jié)合的單克隆抗體的重鏈，其中所述重鏈包括來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈，及具有至少一個(gè)氨基酸缺失或取代，或至少添加一個(gè)氨基酸的恒定區(qū)，所述的缺失、取代或添加可提高或降低ADCC和/或CDC。
2.如權(quán)利要求1所述的重鏈，其中，所述的恒定區(qū)來(lái)源于人IgG。
3.如權(quán)利要求2所述的重鏈，其中，所述的人IgG是人IgG1。
4.如權(quán)利要求2所述的重鏈，其中，所述的人IgG是人IgG2。
5.如權(quán)利要求2所述的重鏈，其中，所述的人IgG是人IgG3。
6.如權(quán)利要求2所述的重鏈，其中，所述的人IgG是人IgG4。
7.如權(quán)利要求3到5任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的恒定區(qū)中的氨基酸取代是用絲氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的331位的脯氨酸。
8.包括權(quán)利要求1到7任何一項(xiàng)中所述的重鏈的單克隆抗體。
9.如權(quán)利要求1到7任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的重鏈包括來(lái)自由保藏號(hào)為FERM BP-7759的雜交瘤KM341-1-19產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)。
10.由如權(quán)利要求9所述的重鏈和下述輕鏈組成的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含來(lái)自由保藏號(hào)為FERM BP-7759的雜交瘤KM341-1-19產(chǎn)生的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)。
11.如權(quán)利要求1到7任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的重鏈包括SEQ ID NO38所示的多肽的可變區(qū)。
12.由如權(quán)利要求11所述的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中，所述的輕鏈包括SEQ ID NO40所示的多肽的可變區(qū)。
13.如權(quán)利要求1所述的重鏈，其中，所述的重鏈由從SEQ ID NO132所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
14.由如權(quán)利要求13所述的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中，所述的輕鏈由從SEQ ID NO134所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
15.如權(quán)利要求1所述的重鏈，其中，所述的重鏈由包含具有SEQID NO131所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生。
16.如權(quán)利要求8所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體由包含具有SEQ ID NO131所示的多核苷酸和SEQ ID NO133所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生。
17.如權(quán)利要求1到7任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的重鏈包括來(lái)自由保藏號(hào)為FERM BP-8024的雜交瘤2105產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈的可變區(qū)。
18.由如權(quán)利要求17所述的重鏈和輕鏈組成的單克隆抗體，其中所述輕鏈包含來(lái)自由保藏號(hào)為FERM BP-8024的雜交瘤2105產(chǎn)生的單克隆抗體的輕鏈的可變區(qū)。
19.如權(quán)利要求1到7任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的重鏈包括SEQ ID NO42所示的多肽的可變區(qū)。
20.由如權(quán)利要求19所述的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中，所述的輕鏈包括SEQ ID NO44所示的多肽的可變區(qū)。
21.如權(quán)利要求1所述的重鏈，其中，所述的重鏈由從SEQ ID NO136所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
22.由如權(quán)利要求21所述的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中，所述的輕鏈由從SEQ ID NO138所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
23.如權(quán)利要求1所述的重鏈，其中，所述的重鏈由包含具有SEQID NO135所示多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生。
24.如權(quán)利要求8所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體由包含具有SEQ ID NO135所示的多核苷酸和SEQ ID NO137所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生。
25.由SEQ ID NO131所示的多核苷酸。
26.由SEQ ID NO133所示的多核苷酸。
27.具有如權(quán)利要求25所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
28.具有如權(quán)利要求26所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
29.具有如權(quán)利要求25和26所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
30.包含如權(quán)利要求27所述的表達(dá)載體的宿主。
31.包含如權(quán)利要求28所述的表達(dá)載體的宿主。
32.包含如權(quán)利要求29所述的表達(dá)載體的宿主。
33.產(chǎn)生單克隆抗體重鏈的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求30所述的宿主；從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體的重鏈。
34.產(chǎn)生單克隆抗體的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求32所述的宿主；從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體。
35.由SEQ ID NO135所示的多核苷酸。
36.由SEQ ID NO137所示的多核苷酸。
37.具有如權(quán)利要求35所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
38.具有如權(quán)利要求36所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
39.具有如權(quán)利要求35和36所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
40.包含如權(quán)利要求37所述的表達(dá)載體的宿主。
41.包含如權(quán)利要求38所述的表達(dá)載體的宿主。
42.包含如權(quán)利要求39所述的表達(dá)載體的宿主。
43.產(chǎn)生單克隆抗體重鏈的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求40所述的宿主；從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體的重鏈。
44.產(chǎn)生單克隆抗體的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求42所述的宿主；從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體。
45.產(chǎn)生具有激動(dòng)活性、能與CD40結(jié)合的單克隆抗體重鏈的方法，其包括用來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈分別取代上部鉸鏈和中部鉸鏈不是來(lái)源于人IgG2的抗體的上部鉸鏈和中部鉸鏈的步驟。
46.產(chǎn)生包含可變區(qū)和來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈的單克隆抗體重鏈的方法，其包括鑒定來(lái)源于能與CD40結(jié)合的單克隆抗體重鏈，并能形成可變區(qū)的多肽的步驟。
47.產(chǎn)生具有激動(dòng)活性、能與CD40結(jié)合的單克隆抗體的方法，其包括用來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈分別取代上部鉸鏈和中部鉸鏈不是來(lái)源于人IgG2的抗體的上部鉸鏈和中部鉸鏈的步驟。
48.產(chǎn)生包含可變區(qū)及來(lái)源于人IgG2的上部鉸鏈和中部鉸鏈的單克隆抗體的方法，其包括鑒定來(lái)源于能與CD40結(jié)合的單克隆抗體重鏈，并能形成可變區(qū)的多肽的步驟。
49.包括如權(quán)利要求8、10、12、14、16、18、20、22和24任何一項(xiàng)中所述的單克隆抗體為活性成分的藥物組合物。
50.如權(quán)利要求49所述的藥物組合物，其用于治療或預(yù)防惡性腫瘤、病原體或自免疫疾病。
51.治療或預(yù)防惡性腫瘤、病原體或自免疫疾病的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用如權(quán)利要求49所述的藥物組合物。
52.如權(quán)利要求8、10、12、14、16、18、20、22和24任何一項(xiàng)中所述的單克隆抗體在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防惡性腫瘤、病原體或自免疫疾病的藥物組合物中的用途。
53.具有拮抗活性、與CD40結(jié)合的單克隆抗體的重鏈，其中，所述的重鏈包括至少具有一個(gè)氨基酸缺失或取代，或至少添加一個(gè)氨基酸的恒定區(qū)，所述的缺失、取代或添加可提高或降低ADCC和/或CDC。
54.如權(quán)利要求53所述的重鏈，其中，所述的恒定區(qū)來(lái)源于人IgG。
55.如權(quán)利要求54所述的重鏈，其中，所述的人IgG是人IgG1。
56.如權(quán)利要求54所述的重鏈，其中，所述的人IgG是人IgG2。
57.如權(quán)利要求54所述的重鏈，其中，所述的人IgG是人IgG3。
58.如權(quán)利要求54所述的重鏈，其中，所述的人IgG是人IgG4。
59.如權(quán)利要求55、57和58任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的恒定區(qū)中的氨基酸取代是用谷氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的235位的亮氨酸。
60.如權(quán)利要求53到59任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的重鏈包括至少具有一個(gè)氨基酸缺失或取代，或至少添加一個(gè)氨基酸的恒定區(qū)，所述的缺失、取代或添加可促進(jìn)重鏈間S-S鍵的形成。
61.如權(quán)利要求60所述的抗體重鏈，其中，所述的恒定區(qū)中的氨基酸取代是用脯氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的228位的絲氨酸。
62.包括權(quán)利要求53到61任何一項(xiàng)中所述的重鏈的單克隆抗體。
63.如權(quán)利要求53到61任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的重鏈包括由保藏號(hào)為FERM BP-7758的雜交瘤4D11產(chǎn)生的單克隆抗體的重鏈的可變區(qū)。
64.包含如權(quán)利要求63所述的重鏈和下述輕鏈的單克隆抗體，所述輕鏈包含由保藏號(hào)為FERM BP-7758的雜交瘤4D11產(chǎn)生的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)。
65.如權(quán)利要求53到61任何一項(xiàng)中所述的重鏈，其中，所述的重鏈包括SEQ ID NO46所示的多肽的可變區(qū)。
66.由如權(quán)利要求65所述的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中，所述的輕鏈包含SEQ ID NO48所示的多肽的可變區(qū)。
67.如權(quán)利要求53所述的重鏈，其中，所述的重鏈由從SEQ ID NO140所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
68.由如權(quán)利要求67所述的重鏈和單克隆抗體輕鏈組成的單克隆抗體，其中，所述的輕鏈由從SEQ ID NO142所示的多肽中除去信號(hào)肽序列后所余部分組成。
69.如權(quán)利要求53所述的重鏈，其中，所述的重鏈由包含具有SEQID NO139所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生。
70.如權(quán)利要求62所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體由包含具有SEQ ID NO139所示的多核苷酸和SEQ ID NO141所示的多核苷酸的表達(dá)載體的宿主產(chǎn)生。
71.由SEQ ID NO139所示的多核苷酸。
72.由SEQ ID NO141所示的多核苷酸。
73.具有如權(quán)利要求71所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
74.具有如權(quán)利要求72所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
75.具有如權(quán)利要求71和72所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
76.包含如權(quán)利要求73所述的表達(dá)載體的宿主。
77.包含如權(quán)利要求74所述的表達(dá)載體的宿主。
78.包含如權(quán)利要求75所述的表達(dá)載體的宿主。
79.產(chǎn)生單克隆抗體重鏈的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求76所述的宿主；從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體的重鏈。
80.產(chǎn)生單克隆抗體的方法，其包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求78所述的宿主；從培養(yǎng)物和/或宿主中獲得單克隆抗體。
81.包括如權(quán)利要求62、64、66、68、和70任何一項(xiàng)中所述的單克隆抗體為活性成分的藥物組合物。
82.如權(quán)利要求81所述的藥物組合物，用于治療或預(yù)防移植排斥、自免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)或凝血因子VIII抑制。
83.治療或預(yù)防移植排斥、自免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)或凝血因子VIII抑制的方法，其包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用如權(quán)利要求81所述的藥物組合物。
84.如權(quán)利要求62、64、66、68、和70任何一項(xiàng)中所述的單克隆抗體在生產(chǎn)用于治療或預(yù)防移植排斥、自免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)或凝血因子VIII抑制的藥物組合物中的用途。
85.產(chǎn)生與CD40結(jié)合、具有拮抗活性但激動(dòng)活性降低的單克隆抗體重鏈的方法，其包括在人抗體重鏈恒定區(qū)進(jìn)行至少一個(gè)氨基酸的缺失或取代、或至少添加一個(gè)氨基酸的方法。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其中恒定區(qū)來(lái)源于人IgG。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其中人IgG是人IgG4。
88.如權(quán)利要求85到87任何一項(xiàng)中所述的方法，其中，所述的恒定區(qū)中的氨基酸取代是用谷氨酸取代Kabat等人的EU索引中所示的235位的亮氨酸。
89.從SEQ ID NO131所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列部分后的多核苷酸。
90.由從SEQ ID NO133所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列部分后的多核苷酸。
91.由從SEQ ID NO135所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列部分后的多核苷酸。
92.由從SEQ ID NO137所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列部分后的多核苷酸。
93.由從SEQ ID NO139所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列部分后的多核苷酸。
94.由從SEQ ID NO141所示的多核苷酸中除去編碼信號(hào)序列部分后的多核苷酸。
全文摘要
提供了一種具有治療前景的抗CD40抗體突變體，該突變體具有設(shè)計(jì)為適于作為藥物制劑的降低的ADCC和CDC活性。一種激動(dòng)型抗CD40抗體突變體，包括在恒定區(qū)至少含有一個(gè)氨基酸突變和/或取代，以降低其ADCC和/CDC活性，及一種拮抗型抗CD40抗體突變體，包括在恒定區(qū)至少含有一個(gè)突變和/或取代，以降低其ADCC和/CDC活性，這兩種抗體均具有至少一個(gè)來(lái)源于人IgG2的鉸鏈區(qū)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1922316SQ20048004210
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者高橋信明, 三浦徹, 北川義康, 平野亞樹 申請(qǐng)人:麒麟麥酒株式會(huì)社