專利名稱：抗cd40抗體的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗CD40抗體在治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥中的新應用。本 發(fā)明特別可用于治療先前曾給予過(i)CHOP，(ii)嵌合抗-CD20單克隆抗體利妥昔單抗，或 (iii)CHOP與利妥昔單抗聯(lián)用治療過的患者。
背景技術：
⑶40是存在于人正常B細胞和腫瘤B細胞表面的一種50_55kDa細胞表面抗原。 B-細胞系的腫瘤惡性B細胞表達⑶40，其存活和增殖看來依賴于⑶40信號傳導。低級和 高級B細胞淋巴瘤、急性B細胞淋巴母細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病 和霍奇金病患者的轉化細胞均表達⑶40。在急性髓母細胞性白血病和50% AIDS相關性淋 巴瘤中也檢測到⑶40表達?？笴D40抗體及其應用已有描述，例如，已公開的WO 2005/044294、 W02005/044304、WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044307、W02005/044854、 WO 2005/044855, WO 2006/073443, WO 2006/125117、W02006/125143、WO 2007/053661 和 WO 2007/053767共有國際專利申請。這些申請?zhí)貏e公開了人抗⑶40單克隆IgG1抗體， 其中稱為CHIR-12. 12 (但現(xiàn)在稱為HCD122)的單克隆抗體系通過免疫接種攜帶人IgG1重 鏈基因座和人κ輕鏈基因座的轉基因小鼠而產生(捷諾小鼠技術公司(XenoMouse technology)；加州阿布吉尼克斯(Abgenix，California))。這些申請還披露了抗CD40抗 體如HCD122在治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥中的應用。盡管任何一種現(xiàn)有治療劑對患者可能有益，但還需要降低毒性以及改善治療結果 的方法。此外，由于原始耐藥性或治療過程產生的耐藥性，許多疾病或病癥單用一種藥物治 療常常變得難治。因此，能改善單用一種藥物治療療效的任何聯(lián)合療法的發(fā)現(xiàn)都是最令人 感興趣的。附圖簡述

圖1顯示了 RL DLBCL異種移植模型中不同處理提供的抗腫瘤活性的研究結果(見 實施例1)。圖2顯示了⑶40L和HCD122對SU-DHL-4細胞的CHOP細胞毒性影響的研究結果。圖3顯示了 CD40L和HCD122對RL和SU-DHL-4細胞系NFkB信號傳導影響的研究結果。圖4顯示了⑶40L和HCD122對RL細胞中某些細胞表面粘附分子表達影響的研究結果。圖5顯示了⑶40L和HCD122對SU-DHL-4細胞中某些細胞表面粘附分子表達影響 的研究結果。圖6顯示了⑶40L和HCD122對SU-DHL-4細胞體外聚集影響的研究結果。發(fā)明詳述本發(fā)明提供治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的方法。所述方法包括 用(i)抗-CD40抗體和(ii)環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松(CHOP)聯(lián)合治療。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，體內聯(lián)合給予這兩種已知的治療藥物獲得了出乎預料強的治療效果。發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)，這兩種療法聯(lián)用的效果高于每種療法各自效果之和，即抗-CD40抗體(如HCD122)和 CHOP聯(lián)用能提供協(xié)同療效。不想受理論的束縛，發(fā)明人認為這種出乎預料強的療效是由于 抗⑶40抗體能通過下調NF-kB活性和/或抑制⑶40L-誘導的粘附分子表達，從而使B細 胞對CHOP細胞毒性敏感所致。本發(fā)明提供了一種治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的方法，所述方 法包括給予所述患者環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松(CHOP)并聯(lián)用抗-⑶40抗體。在一些實施方式中，同時給予患者抗-⑶40抗體(本文稱為“抗體療法”)和環(huán)磷 酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松(CHOP;本文稱為“化學療法”)。在這些實施方式中，抗 體療法可以與化學療法準確地同時給予(同時給予即兩種療法)。或者，可以與化學療法大 致相同的時間給予抗體療法(即兩種療法不是精確地同時給予)，例如，在同一次訪問醫(yī)生 或其他健康護理專家時。在其他實施方式中，不同時給予患者抗體療法和化學療法，而是以任何順序依次 (連續(xù))給予。在這些實施方式中，本發(fā)明方法包括給予患者第一輪化學療法，然后給予患 者第一劑抗-⑶40抗體。或者，所述方法包括給予患者第一劑抗-⑶40抗體后，再給予患者 第一輪化學療法。在依次給予抗體療法和化學療法的實施方式中，給予兩種療法的方式可 使兩種療法同時對患者產生療效(即每種療法效果重疊期間)，雖然不一定如此。因此，本發(fā)明提供了一種治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的方法， 所述方法包括在給予環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種之前、期間或 之后給予患者抗-CD40抗體。本文中提及使用環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的 一種或多種時表示使用環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或一種以上、兩種 或兩種以上、三種或三種以上、或全部四種。在給予患者第一輪化學療法然后給予第一劑抗-CD40抗體的實施方式中，在第一 輪化學療法給藥約1周至約1年、約1周至約10個月、約1周至約8個月、約1周至約6個 月、約1周至約4個月、約1周至約2個月、約1周至約1個月、約1周至約3周、約1周至 約2周、或約1周時，給予患者第一劑抗-CD40抗體。換句話說，在第一輪化學療法后約1 周至約1年、約1周至約10個月、約1周至約8個月、約1周至約6個月、約1周至約4個 月、約1周至約2個月、或約1周至約1個月、約1周至約3周、約1周至約2周、或約1周 時，給予抗體療法。在第一劑抗-CD40抗體后給予患者第一輪化學療法的實施方式中，在給予患者第 一劑抗-⑶40抗體后約1周至約1年、約1周至約10個月、約1周至約8個月、約1周至約 6個月、約1周至約4個月、約1周至約2個月、約1周至約1個月、約1周至約3周、約1周 至約2周、或約1周時，給予第一輪化學療法。換句話說，在第一輪化學療法之前約1周至 約1年、約1周至約10個月、約1周至約8個月、約1周至約6個月、約1周至約4個月、約 1周至約2個月、或約1周至約1個月、約1周至約3周、約1周至約2周、或約1周時，給予 抗體療法。當同時給予二種療法時，它們可作為一種藥物制劑或作為兩種或多種藥物制劑分 開給予。當不是同時給予二種療法時，它們是作為兩種或多種藥物制劑分開給予。當采用兩種或多種藥物制劑分開時，可采用抗體療法和化學療法的任何合適聯(lián)合。例如，一種藥物制劑可含有抗體藥物，而其他藥物制劑含有化療劑環(huán)磷酰胺、多柔比星、 長春新堿和強的松?；蛘撸环N藥物制劑可含有抗體藥物和一種或多種化療劑，而其他藥物 制劑含有其他化療劑。在藥物制劑含有抗體藥物和一種或多種化療劑的實施方式中，這種 藥物制劑可通過包括以下步驟的方法獲得(i)獲得凍干的抗-CD40抗體組合物，(ii)獲得 包含一種或多種用無菌稀釋劑稀釋的化療劑的組合物，和(iii)用包含一種或多種化療劑 的組合物重建該凍干的抗體組合物。因此，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含(i)環(huán)磷酰胺、多柔 比星、長春新堿和強的松中的一種或多種，( )抗-CD40抗體，和(iii)藥學上可接受的運 載體或賦形劑。本發(fā)明還提供了(i)環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種和 (ii)抗-CD40抗體在制造用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的藥物中的應 用。在其他實施方式中，本發(fā)明提供了(i)環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一 種或多種和(ii)抗-CD40抗體在制造通過聯(lián)合療法治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥 人類患者的至少兩種不同藥物(兩種、三種、四種或五種藥物)中的應用。環(huán)磷酰胺、長春 新堿、強的松、多柔比星以及抗-CD40抗體可用于制造至少三種、至少四種、或至少五種不 同藥物。本發(fā)明還提供了治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的藥盒，所述藥盒 中裝有⑴環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種，和(ii)抗-CD40抗 體。所述藥盒還裝有一種或多種給予人類患者這種聯(lián)合治療的裝置，例如(i)無菌針頭和 注射器，( )無菌容器(例如，玻璃瓶，塑料瓶或塑料袋)和滴注器，(iii)帶有調節(jié)夾的無 菌管，和(iv)導管的一種或多種。本發(fā)明提供一種治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的方法，所述方法 包括給予患者環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種，其中所述患者先前 曾用抗-CD40抗體治療過。本發(fā)明還提供一種治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患 者的方法，所述方法包括給予患者抗-⑶40抗體，其中所述患者先前曾用環(huán)磷酰胺、多柔比 星、長春新堿和強的松中的一種或多種治療過。本發(fā)明進一步提供抗-CD40抗體在制造用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥 人類患者的藥物中的應用，其中所述人類患者先前曾用環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強 的松中的一種或多種治療過。本發(fā)明還提供環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一 種或多種在制造用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的藥物中的應用，其中 所述人類患者先前曾用抗-CD40抗體治療過?！跋惹霸委熯^”或“曾治療過”表示對象在第二療法之前已經(jīng)接受過一劑或多劑 第一療法藥物。“先前曾治療過”或“曾治療過”包括在用第二療法治療開始前的2年、18個 月、1年、6個月、2個月、6周、1個月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天， 曾采用第一療法治療過的患者。在本發(fā)明的聯(lián)合方法中，因此“先前曾治療過”或“曾治 療過”包括在用化學療法治療開始前的2年、18個月、1年、6個月、2個月、6周、1個月、4周、 3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，曾采用抗⑶40抗體治療過的患者。在本 發(fā)明的聯(lián)合方法中，“先前曾治療過”或“曾治療過”還包括在用抗CD40抗體治療開始前的 2年、18個月、1年、6個月、2個月、6周、1個月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天，曾采用化學療法治療過的患者。例如，可通過詢問患者的醫(yī)療記錄或進行合適的體外試驗將曾用抗-⑶40抗體治 療過的患者與其他患者區(qū)分開。例如，可通過詢問患者的醫(yī)療記錄或進行合適的體外試驗 將先前曾用環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種治療過的患者與其他 患者區(qū)分開。本發(fā)明還提供抗-CD40抗體在制造用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類 患者的藥物中的應用，其中在環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松之前給予所述藥物。 在其他實施方式中，本發(fā)明提供抗-CD40抗體在制造用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或 病癥人類患者的藥物中的應用，其中在環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松之后給予所 述藥物。本發(fā)明還提供環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種在制造用于 治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的藥物中的應用，其中在抗-CD40抗體之前 給予所述藥物。在另一實施方式中，本發(fā)明提供環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中 的一種或多種在制造用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的藥物中的應用， 其中在抗-CD40抗體之后給予所述藥物。本發(fā)明還提供抗-CD40抗體與環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種 或多種進行聯(lián)合治療，同時、分別或依次用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥的人類 患者。本發(fā)明還提供抗-CD40抗體在藥物制造中的應用，用所述藥物同時或依次與磷酰胺、 多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種聯(lián)合治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥的 人類患者。本發(fā)明還提供磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種在藥物制造 中的應用，用所述藥物同時或依次與抗-CD40抗體聯(lián)合治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病 癥的人類患者。本發(fā)明的方法包括在第一輪或隨后輪次化療期間的任何時刻，給予一劑抗-CD40 抗體?；蛘?，本發(fā)明的方法包括在各輪化療之間給予一劑抗-CD40抗體。如上所述，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗-CD40抗體與CHOP的聯(lián)合治療能提供協(xié)同療效。因此， 在本文所述方法、應用、組合物和藥盒的一些實施方式中，相對于單獨給予各自治療劑，這 種聯(lián)合治療提供了更好的協(xié)同療效。術語“協(xié)同”用于描述兩種或多種活性藥物聯(lián)用的效 力大于各活性藥物單用之和。因此，當兩種或多種藥物聯(lián)用導致對某種活性或過程(如腫 瘤生長)的“協(xié)同抑制”時，意味著對該活性或過程的抑制作用大于各活性藥物抑制作用之 和。因此，術語“協(xié)同療效”指兩種或多種治療聯(lián)用時觀察到的療效(通過任何一種參數(shù)測 定，如本文實施例1的腫瘤生長延遲)大于用各自治療觀察到的各自療效之和。如上所述，發(fā)明人認為本發(fā)明聯(lián)合治療提供的這種出乎預料的療效是由于抗CD40 抗體能通過下調NF-kB活化和/或抑制⑶40L-誘導的粘附分子表達，從而使腫瘤B細胞對 CHOP細胞毒性敏感(見本文的實施例2-4)所致。本文的實施例證明，CD40的信號傳導有 助于B細胞對CHOP細胞毒性產生耐藥，用拮抗性-CD40抗體(如HCD122)降低CD40信號 傳導能防止或降低這種耐藥性。本文的實施例還證明，CD40信號傳導誘導B細胞表達細胞 表面粘附分子，使B細胞聚集與它們的微環(huán)境相互作用，從而使B細胞對CHOP細胞毒性產 生耐藥。該實施例說明，可用拮抗性抗-CD40抗體(如HCD122)來防止或降低B細胞表面 粘附分子的表達。因此，本發(fā)明提供抗-⑶40抗體在防止或降低人腫瘤B細胞對CHOP細胞毒產生耐藥(即使腫瘤B細胞對CHOP細胞毒性敏感)的應用。本發(fā)明還提供一種防止或降低人腫 瘤B細胞對CHOP細胞毒產生耐藥(即使瘤性B細胞對CHOP細胞毒性敏感)的方法，所述 方法包括使一個或多個人腫瘤B細胞體外接觸抗-CD40抗體的步驟。本發(fā)明還提供防止或降低人患者B細胞對CHOP細胞毒產生耐藥的方法，所述方法 包括給予患者抗-CD40抗體的步驟。本發(fā)明還提供一種治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病 癥人類患者的方法，所述方法包括給予患者抗-CD40抗體以降低患者B細胞對CHOP細胞毒 產生耐藥(即使患者的腫瘤B細胞對CHOP細胞毒性敏感)的步驟。本發(fā)明也提供用抗-CD40抗體，在體外(即，使腫瘤B細胞對CHOP細胞毒性敏感) 或人類患者體內(即，使患者的腫瘤B細胞對CHOP細胞毒性敏感)防止或降低人腫瘤B細 胞對CHOP細胞毒性產生耐藥。本發(fā)明還提供抗-CD40抗體在藥物制造中的應用，所述藥物 用于防止或降低人類患者體內B細胞對CHOP細胞毒產生耐藥(即使患者的腫瘤B細胞對 CHOP細胞毒性敏感)。用于這些實施方式的抗-⑶40抗體優(yōu)選能下調NF-kB活化。具體說，所述抗體能 下調B細胞通過⑶40信號傳導所誘導的NF-kB活化，而這種活化使B細胞對CHOP細胞毒 性產生耐藥。用于這些實施方式的抗-CD40抗體優(yōu)選能抑制B細胞的一種或多種細胞表面粘附 分子表達。具體說，所述抗體能抑制B細胞通過CD40信號傳導所誘導的一種或多種細胞 表面粘附分子表達，這種表達使B細胞對CHOP細胞毒產生耐藥。在一些實施方式中，所述 抗-⑶40抗體抑制⑶40-L誘導的⑶54、⑶80、⑶86和⑶95中的一種或多種(或者⑶54， ⑶80，⑶86and⑶95中的兩種或兩種以上、三種或三種以上、或全部四種)表達。因此，本發(fā)明的組合物、應用和藥盒采用抗-⑶40抗體來下調NF-kB活化和/或抑 制B細胞的一種或多種細胞表面粘附分子表達。本發(fā)明所用標準技術和方法的小結見下文。應理解，本發(fā)明不限于所述的具體方 法、方案、細胞系、載體和試劑。還應理解，本文所用術語只是為了描述具體實施方式
，這些 術語不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍僅受所附權利要求書的術語的限制。本說明書中采用了核苷酸和氨基酸的標準縮寫。除非另有說明，本發(fā)明的實施將 采用分子生物學、微生物學、重組DNA技術和免疫學的常規(guī)技術，這些技術屬于本領域技術 人員的知識范圍。文獻中充分描述了這些技術。本發(fā)明涉及抗CD40抗體在治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者中的應 用?！阿?0”、“⑶40抗原”或“⑶40受體”指腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的50_55kDa跨膜 糖蛋白(參見例如，美國專利號 5，674，492 和 4，708，871 ;Stamenkovic 等(1989)EMBO 8 1403 ；Clark (1990) Tissue Antigens (組織抗原)36 33 ；Barclay 等(1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (白細胞抗原文獻)(第2版；學術出版社，圣地亞哥))。已經(jīng)鑒定到 人CD40基因旁路剪接轉錄變體編碼的兩種人CD40同種型。、第一種同種型(也稱為“長 同種型”或“同種型1”)表達產生長277個氨基酸的前體多肽(SEQ ID NO :9 ；首先報道 為GenBank登錄號CAA43045，和鑒定為GenBank登錄號NP_001241的同種型1)，它由SEQ IDNO :8(見GenBank登錄號X60592和NM_001250)編碼，含有前19個殘基代表的信號序列。 第二種同種型(也稱為“短同種型”或“同種型2”)表達產生長203個氨基酸的前體多肽 (SEQ ID NO :7 ;GenBank 登錄號 NP_690593)，它由 SEQ IDNO :6 (GenBank登錄號 NM_152854)編碼，也含有前19個殘基代表的信號序列。人CD40的這兩種同種型的前體多肽中前165個 殘基相同(即SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 9的殘基1-165)。所述短同種型前體多肽(SEQ ID NO 7所示)由缺少一編碼區(qū)段(導致翻譯框移位)的轉錄變體(SEQ ID NO 6)編碼； 與⑶40的長同種型所含的C末端(SEQ ID NO 9的殘基166-277中所示的C末端)相比， 產生的這種CD40同種型所含的C-末端(SEQ ID NO 7的殘基166-203)較短且不相同。對 于本發(fā)明目的，術語“⑶40”或“⑶40抗原”、“⑶40細胞表面抗原”或“⑶40受體”包括⑶40 的長同種型和短同種型二者。本文中“⑶40表達細胞”指表達可檢測水平⑶40抗原的任何正?；驉盒约毎?。本 領域熟知檢測細胞中⑶40抗原表達的方法，包括但不限于PCR技術、免疫組化、流式細胞 術、Western印跡、ELISA等。這些方法能夠檢測⑶40mRNA、⑶40抗原和細胞表面⑶40抗 原。優(yōu)選CD40表達細胞是表達可檢測水平細胞表面CD40抗原的細胞。“⑶40配體”或“⑶40L”指該32_33kDa跨膜蛋白分別存在的兩種較小生物學活性 可溶形式 18kDa 和 31kDa(Graf 等(1995) Eur. J. Immunol. 25 1749-1754 ；Mazzei 等(1995) J Biol.Chem. 270 :7025_7028 ；Pietravalle 等(1996)J BiolChem. 271 :5965_5967)。人 CD40L 也稱為 CD154 或 gp39?！叭祟惢颊摺敝赣邪l(fā)生或復發(fā)B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥風險的人?！癇細胞腫瘤生長相關疾病或病癥”表示與B細胞系細胞生長不受控制相關的任何 疾病或病癥(包括惡化前疾病)。這種疾病和病癥包括但不限于急性淋巴母細胞白血病 (ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、幼淋巴 細胞白血病(PLL)、小淋巴細胞白血病(SLL)、彌散性小淋巴細胞白血病(DSLL)、彌散性大B 細胞淋巴瘤(DLBCL)、毛細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、EB病毒(EBV)誘導的淋巴 瘤、骨髓瘤如多發(fā)性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、重鏈病、粘膜相關淋巴樣組織淋 巴瘤、單核細胞樣B細胞淋巴瘤、脾臟淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、血管內淋巴瘤病、免疫母 細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤等?？捎帽景l(fā)明方法治療B細胞增殖或聚集異常相關的非霍奇金淋巴瘤的對象。對 于本發(fā)明目的，按照工作分類法(Working Formulation classification)將這類淋巴 瘤分類為B細胞淋巴瘤，再分為低級、中級和高級(參見“TheNon-Hodgkin’ s Lymphoma Pathologic Classification Project”(非霍奇金淋巴瘤病理分類方案)，Cancer 49(1982) 2112-2135)。因此，低級B細胞淋巴瘤包括小淋巴細胞、濾泡小分裂細胞和濾泡 混合性小分裂細胞和大細胞淋巴瘤；中級淋巴瘤包括濾泡大細胞、彌散性小分裂細胞、彌散 混合性小細胞和大細胞以及彌散性大細胞淋巴瘤；高級淋巴瘤包括大細胞免疫母細胞、淋 巴母細胞以及伯基特和非伯基特類型的非分裂小細胞淋巴瘤?？捎帽景l(fā)明的方法治療低 級、中級和高級B細胞淋巴瘤。可用本發(fā)明方法治療性處理按照修訂的歐洲和美國淋巴瘤分類(REAL)系統(tǒng)分類 的B細胞淋巴瘤。這類B細胞淋巴瘤包括但不限于以下分類的淋巴瘤前體B細胞瘤，如B 淋巴母細胞白血病/淋巴瘤；外周B細胞瘤，包括慢性B細胞淋巴細胞性白血病/小淋巴細 胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤/免疫細胞瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡中心淋巴瘤(濾泡 性)(包括彌散性小細胞、彌散混合性小細胞和大細胞以及彌散性大細胞淋巴瘤)、邊緣區(qū)B 細胞淋巴瘤(包括結外、結內和脾內類型，例如粘膜相關淋巴組織的結外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤)、漿細胞瘤/骨髓瘤、原發(fā)性縱隔(胸腺)亞型彌散性大細胞B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴 瘤和伯基特樣高級B細胞淋巴瘤；不可分類的低級或高級B細胞淋巴瘤。在本發(fā)明的方法中，用聯(lián)合治療來提供對疾病或病癥的陽性治療反應。“陽性治療 反應”表示聯(lián)合冶療的治療活性導致疾病或病癥改善，和/或疾病或病癥相關癥狀改善。即， 可觀察到抗增殖作用、防止腫瘤進一步生長、腫瘤體積減小、瘤細胞數(shù)量減少和/或CD40表 達細胞相關的一種或多種癥狀減輕。因此，例如，陽性治療反應指該疾病有以下一種或多種 改善(1)腫瘤體積減??；(2)瘤細胞數(shù)量減少；(3)瘤細胞死亡增加；(4)抑制了瘤細胞存 活；(4)抑制了(即減緩至某種程度，優(yōu)選停止)腫瘤生長；(5)抑制(即減緩至某種程度， 優(yōu)選停止)了瘤細胞浸潤周圍器官；(6)抑制(即減緩至某種程度，優(yōu)選停止)了腫瘤轉移； (7)防止了腫瘤進一步生長；(8)患者存活率提高；和(9) 一定程度緩解了所述疾病或病癥 的一種或多種相關癥狀。可采用針對所述疾病或病癥的標準化反應標準來確定任何給定疾病或病癥的陽 性治療應答反應?？梢圆捎靡韵潞Y檢技術確定腫瘤形態(tài)(即腫瘤總負荷、腫瘤大小等)的改 變來評估腫瘤的反應，這些技術有磁共振成像(MRI)掃描、χ-射線成像、計算機斷層(CT)掃 描、骨掃描成像、內窺鏡檢查和腫瘤取樣活檢，包括抽吸骨髓(BMA)和計數(shù)循環(huán)系統(tǒng)中的腫 瘤細胞。除了這些陽性治療反應外，接受治療的對象可能顯示疾病相關癥狀改善的有益效 果。因此對B細胞腫瘤而言，對象可以有所謂的B癥狀減輕，即盜汗、發(fā)熱、體重降低和/或 蕁麻疹減輕。對于癌前疾病而言，用抗CD40治療劑治療可阻斷和/或推遲相關性惡性疾病 的發(fā)生，例如，推遲顯著性不確定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)患者發(fā)生多發(fā)性骨髓瘤。疾病改善的特征是恢復完全反應?！巴耆磻敝腹撬枇霾±惹胺派溲芯?、骨髓 和腦脊液(CSF)異?；騿慰寺〉鞍桩惓Ｒ鸦謴驼?，沒有臨床上可檢測的疾病。按照本發(fā) 明方法治療后，這種反應可持續(xù)至少4-8周，或者有時持續(xù)6-8周?；蛘撸膊「纳瓶煞诸?為部分反應?！安糠址磻敝笡]有出現(xiàn)新病灶，而所有可測定的腫瘤負荷(即對象中存在的 惡性細胞數(shù)量，或檢測的瘤塊大小或異常單克隆蛋白含量)降低至少約50%，這種現(xiàn)象可 持續(xù)4-8周或6-8周。本發(fā)明的方法和產品涉及采用治療或預防有效量的抗-CD40抗體以及四種CHOP 組分中的每一種?！坝行Я俊被颉爸委熁蝾A防有效量”表示當作為聯(lián)合治療的一部分給予時， 對患者治療帶來陽性治療反應的抗體用量或化療藥物用量。本文在其它地方更詳細地描述 了合適的用量。本文所用“腫瘤”(或“腫塊”)指所有的腫瘤細胞生長和增殖(無論惡性或良性)， 以及所有的癌前細胞、癌細胞和癌組織。本文所用“腫瘤”指導致異常生長的任何形式的細 胞生長調節(jié)異?；蛘{節(jié)失常(無論惡性或良性)。因此，“腫瘤細胞”包括調節(jié)異?；蛘{節(jié) 失常的惡性和良性細胞生長。術語“癌癥”和“癌”指或描述哺乳動物的特征一般為細胞生 長失調的生理疾病。在本文中，“治療”定義為施加或給予患者聯(lián)合治療，施加或給予患者的分離組織 聯(lián)合治療，其中所述患者患有疾病、有疾病癥狀或對疾病易感，目的是為了治愈、治療、緩 解、減輕、改變、補救、改善、消除，或影響患者的疾病、疾病癥狀或對疾病的易感性。本發(fā)明的方法對于治療之前曾給予過其他抗腫瘤治療藥物的患者特別有效。其中 包括在開始本發(fā)明所述聯(lián)合治療之前任何時候，例如在開始本發(fā)明聯(lián)合治療之前15年內、14年內、13年內、12年內、11年內、10年內、9年內、8年內、7年內、6年內、5年內、4年內、 3年內、2年內、18個月內、1年內、6個月內、2個月內、6周內、1個月內、4周內、3周內、2周 內、1周內、6天內、5天內、4天內、3天內、2天內或1天內，曾給予過其他抗腫瘤治療藥物的
^^ ο具體說，本發(fā)明的聯(lián)合治療可用于治療先前曾用過以下療法的人類患者(i)單 用CHOP，(ii)單用抗-CD40抗體(如HCD122)，(iii)單用抗-⑶20抗體(如嵌合型抗-⑶20 抗體利妥昔單抗)，或(iv)用CHOP與抗-CD20抗體聯(lián)合治療(如利妥昔單抗，此種聯(lián)合治 療通常稱為R-CH0P)。本發(fā)明對用其他抗腫瘤治療方法難治的疾病或病癥特別有用。因此，可用本發(fā)明 來治療用以下療法難治的疾病或病癥(i)單用CHOP，(ii)單用抗-CD40抗體(如HCD122)， (iii)單用抗-CD20抗體(如嵌合抗-CD20抗體利妥昔單抗)，或(iv)用CHOP與抗-CD20 抗體聯(lián)合治療(R-CHOP)?！半y治”指對用特定抗癌治療藥物治療有耐藥性或無反應的具體疾 病或病癥。這種疾病或病癥可能是在用特定治療劑開始治療時即為該特定治療劑難治(即 對初次接觸該治療劑無反應)，或者曾用該治療劑治療一段時間或在該治療劑后續(xù)治療期 間對該治療劑產生耐藥。因此，本發(fā)明提供了用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人 類患者的方法、組合物、應用和藥盒，其中所述疾病或病癥為除本發(fā)明聯(lián)合治療外的癌癥治 療方法難治疾病。術語“抗癌癥治療”指對疾病或病癥的任何治療，如化療、抗體療法、手術、 放療和它們的聯(lián)合。本發(fā)明對于治療用其他抗腫瘤治療方法治療后復發(fā)的患者也特別有用。因此，可 用本發(fā)明來治療用以下療法治療后復發(fā)的患者(i)單用CHOP，(ii)單用抗-CD40抗體(如 HCD122)，(iii)單用抗-CD20抗體(如嵌合抗-CD20抗體利妥昔單抗)，或(iv)用CHOP與 抗-CD20抗體聯(lián)合治療(R-CHOP)?！皬桶l(fā)”表示患者對先前的癌癥治療方法有部分或有完 全反應，但隨后又發(fā)生了此疾病或病癥。因此，本發(fā)明提供用于治療B細胞腫瘤生長相關疾 病或病癥人類患者的方法、組合物、應用和藥盒，其中所述患者用除本發(fā)明聯(lián)合治療外的癌 癥治療方法治療后疾病復發(fā)。本發(fā)明的聯(lián)合治療可解決用利妥昔單抗(以商品名Rituxan 出售的IDEC-C2B8 單克隆抗體(Bi公司(Biogen Idec)或基因技術公司(Genentech)))治療帶來的問題。利 妥昔單抗是含有人IgGl和κ恒定區(qū)以及分離自鼠抗-CD20單克隆抗體可變區(qū)的一種嵌合 型抗-CD20單克隆抗體(Reff等(1994)Blood83 :435_445)。本發(fā)明的方法能治療表達CD40 的B細胞相關疾病或病癥的患者，所述患者可能已經(jīng)用利妥昔單抗或者用利妥昔單抗和化 療劑(例如，CHOP)聯(lián)合治療治療過。因此，本發(fā)明還提供通過聯(lián)合治療治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患 者的方法、組合物、應用和藥盒，其中所述患者先前曾給予過嵌合型抗-CD20抗體利妥昔 單抗?？捎帽景l(fā)明治療(i)單用利妥昔單抗，或(ii)用CHOP與利妥昔單抗聯(lián)合治療 (R-CHOP)難治的疾病或病癥。還可用本發(fā)明治療(i)單用利妥昔單抗，或(ii)用CHOP與 利妥昔單抗聯(lián)合治療(R-CHOP)后復發(fā)的患者。例如，可通過詢問患者的醫(yī)療記錄或進行合適的體外試驗將先前曾用利妥昔 單抗治療過的患者與其他患者區(qū)分開。例如，可用合適的方法，如FACS，監(jiān)測用利妥昔 單抗治療的患者體內被去除的循環(huán)性CD19+B細胞數(shù)目，以及現(xiàn)存循環(huán)性CD19+B細胞數(shù)目(McLaughlin 等，(1998) J. Clin. Oncol. 16(8) 2825-2833 ；Maloney 等，(1997)Blood 90(6) :2188-2195)。本發(fā)明方法包括采用抗⑶40抗體。天然抗體通常是約150，000道爾頓的異質四 聚體糖蛋白，由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價 二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數(shù)目視不同同種型的重鏈而不同。每條重鏈和輕鏈也含有 規(guī)律性隔開的鏈內二硫橋。每條重鏈的一端為可變區(qū)(Vh)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈 的一端為可變區(qū)(VJ，另一端為恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)相對，輕鏈可變 區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。認為由特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變區(qū)之間形成界面。術 語“可變”指抗體中可變區(qū)某些部分的序列差異很大?？勺儏^(qū)賦予抗原結合特異性。恒定 區(qū)不直接參與抗體與抗原的結合，但具有各種效應器功能，如Fc受體(FcR)結合、參與抗體 依賴性細胞毒性、啟動補體依賴性細胞毒性和肥大細胞脫顆粒?？筛鶕?jù)抗體恒定區(qū)的氨基酸序列將任何一種脊椎動物的抗體“輕鏈”分為明顯不 同的稱為κ和λ輕鏈的兩種類型。根據(jù)“重鏈”恒定區(qū)的氨基酸序列，可將抗體分為不同類型。人抗體主要有五類 IgA, IgD, IgE, IgG和IgM，其中幾類可進一步分為亞類(同種型)，如IgGU IgG2、IgG3、 IgG4、IgAl和IgA2。不同抗體類型對應的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。已知 不同抗體類型的亞基結構和三維構型。不同同種型具有不同的效應器功能。例如，人IgGl 和IgG3同種型具有ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)活性。IgGl抗體，具體是人 IgGl抗體，特別可用于本發(fā)明方法。“人效應細胞”是表達一種或多種FcR并具有效應功能的白細胞。該細胞優(yōu)選至少 表達Fc γ RIII，并具有抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)效應器功能。介導ADCC的 人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、巨噬細胞、 嗜酸性白細胞和中性粒細胞，優(yōu)選PBMC和NK細胞。具有ADCC活性的抗體通常是IgGl或 IgG3同種型。需要注意，除分離的IgGl和IgG3抗體以外，可通過將非ADCC抗體的可變區(qū) 與IgGl或IgG3同種型恒定區(qū)組合來制備這類ADCC介導抗體。使用術語“Fe受體”或“FcR”來描述能結合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天 然序列的人FcR。此外，優(yōu)選的FcR可結合IgG抗體(γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII和 FcyRIII亞類受體，包括這些受體的等位基因變體或者旁路剪接形式。FcyRII受體包括 Fc y RIIA ( “活化受體”)和FcyRIIB( “抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，主要差 別在于其胞質結構域不同。活化性受體Fc γ RIIA在其胞質結構域中含有免疫受體酪氨酸 激活基序(ITAM)。抑制性受體Fc γ RIIB在其細胞質結構域中含有免疫受體酪氨酸抑制基 序(ITIM)(參見 Daeron(1997)Annu. Rev. Immunol. 15 :203_234)。FcR 綜述見 Ravetch 和 Kinet(1991)Annu. Rev. Immunol. 9 457-492 (1991) ；Capel 等，(1994)Immunomethods 4 25-34 和 de Haas 等，(1995) J. Lab. Clin. Med. 126 :330_341。本文所用術語 “FcR” 還涵蓋 其他FcR，包括那些將來鑒定的FcR。該術語也包括負責將成熟IgG轉移給胎兒的新生受體 FcRn (Guyer 等，(1976) J. Immunol. 117 587 和 Kim 等，(1994) J. Immunol. 24 :249(1994))。本文所用術語“抗體”廣義包括能特異性結合CD40抗原的全裝配抗體、抗體片段 (如Fab、F' (ab)2、Fv和其它片段)、單鏈抗體(scFv)、雙抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、 人源化抗體、全人抗體等)和含有上述物質的重組肽。術語“抗體”涵蓋多克隆和單克隆抗體。本文所用“抗⑶40抗體”包括能特異性識別⑶40抗原的任何抗體。在一些實施 方式中，用于本發(fā)明方法的抗CD40抗體，特別是單克隆抗CD40抗體對CD40抗原具有強烈 的單位點結合親和力。用標準試驗如Biacore 測定時，這類單克隆抗體與CD40的親和力 (Kd)為至少IO-5M,優(yōu)選至少IO-6M,至少IO-7M,至少ΙΟ、，至少1(Γ9Μ，至少10_1QM，至少IiT11M 或至少10_12M。本領域知道Biacore分析，在“ΒΙΑ應用手冊”中提供了詳細內容?！疤禺愋宰R別”或“特異性結合于”表示所述抗CD40抗體結合人B細胞表面的CD40 抗原，但不以顯著程度結合人B細胞表面的其他抗原，如CD20抗原?？梢圆捎帽绢I域技術人員已知的合適抗體生產方法來產生用于本發(fā)明方法的 抗-⑶40抗體。用于本發(fā)明方法的抗CD40抗體可以是單克隆抗體。本文所用術語“單克隆抗 體”(和“mAb”)指獲自基本均一抗體群的抗體，即，該群中的各個抗體相同，除了可能存在 少量天然產生的突變外。該術語不限制產生抗體的動物種類，并且不需要通過任何具體方 法產生抗體。與一般包含針對多個不同抗原決定簇(表位)的不同抗體群的多克隆抗體制 劑相反，各種單克隆抗體只針對抗原上的一個決定簇(表位)。術語“單克隆”最初用來指由單克隆免疫細胞系所產生的抗體，盡管都識別相同的 靶蛋白，但與“多克隆”抗體不同，后者是由不同B細胞產生的針對蛋白質的不同表位。本 文中，術語“單克隆”不暗示任何特定的細胞來源，而指具有相同氨基酸序列并識別同一靶 蛋白上相同表位的任何抗體群。因此，可采用任何合適的蛋白質合成系統(tǒng)，包括免疫細胞、 非免疫細胞、無細胞系統(tǒng)等來制造單克隆抗體。這種用法在本領域是常見的，例如，用小鼠 骨髓瘤NSO細胞系表達的⑶R-移植人源化抗體Synagis ，CHO細胞系表達的人源化抗體 Herceptin ,以及CHO細胞系表達的噬菌體展示抗體Humira 都可稱為單克隆抗體?！氨砦弧敝缚乖肿又心苷T導產生抗體和結合抗體的那個部分。表位可包含線性氨 基酸殘基(即表位中的殘基以線性方式依次排列)、非線性氨基酸殘基(本文中稱為“非線 性表位”；這些表位不是依次排列的)、或包含線性和非線性氨基酸殘基?？衫肒ohler等，(1975)Nature，256 :495所描述的雜交瘤方法或重組DNA方 法(參見，例如，美國專利號4，816，567)制備單克隆抗體。也可從例如McCafferty等 (1990)Nature 348 =552-554(1990)和美國專利號5，514，548所述技術產生的抗體噬菌體 文庫分離單克隆抗體。Clackson 等(1991) Nature352 :624_628 和 Marks 等(1991) J Mol. Biol. 222 581-597分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)發(fā)表物描述了通過鏈 改組(Marks等(1992)Bio/Technology 10 =779-783)，以及組合感染和體內重組產生高親 和力(nM級)人抗體，作為構建極大噬菌體文庫的方法(Waterhouse等(1993) Nucleic. Acids Res. 21 =2265-2266) 21:2265-2266).因此，這些技術是分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單 克隆抗體雜交瘤技術的可行替代方法。當采用重組DNA法制備用于本發(fā)明方法的抗CD40抗體時，采用常規(guī)方法不難分離 單克隆抗體的編碼DNA和測序。一旦分離后，可將該DNA放入表達載體中，然后轉染入本身 不產生免疫球蛋白的宿主細胞如大腸桿菌(E. coli)細胞、猿COS細胞、中華倉鼠卵巢(CHO) 細胞或骨髓瘤細胞中，在該重組宿主細胞中合成獲得單克隆抗體。有關在含有編碼抗體DNA 的細菌中重組表達的綜述文獻包括Skerra等(1993) Curr. Opinion in Immunol. 5 256和Phickthun(1992) Immunol. Revs. 130 :151?；蛘?，可以在細胞系如CHO細胞系中產生抗體， 如美國專利號5，545，403 ；5, 545，405 ；和5，998，144所述。簡言之，用能夠表達輕鏈和重鏈 的載體分別轉染該細胞系?？蓪煞N蛋白質轉染不同載體而產生嵌合抗體。另一優(yōu)點是抗 體在哺乳動物CHO細胞內可糖基化。用于本發(fā)明聯(lián)合治療的重組抗體的優(yōu)選來源是CHO細 胞。本文所用“宿主細胞”指培養(yǎng)成單細胞實體的微生物或者真核細胞或細胞系，它們 可能是、或已經(jīng)用作重組載體或其它轉運多核苷酸的接受體，包括已被轉染的原始細胞的 后代。應理解，由于存在天然、偶發(fā)性或有意的突變，單個細胞的后代與其初始親代細胞的 形態(tài)或者基因組或總DNA組成不一定完全相同。本領域已知CD40的單克隆抗體。參見例如，McMichael編(1987 ； 1989) Leukocyte Typing III and IV(白細胞分型III和IV)(牛津大學出版社，紐約)中關于B細胞抗 原的章節(jié)；美國專利號 5, 674, 492 ；5，874，082 ；5, 677, 165 ；6，056，959 ；WO 00/63395 ；國 際公開號 WO 02/28905 和 WO 02/28904 ；Gordon 等(1988) J. Immunol. 140 1425 ；Valle 等(1989)Eur. J. Immunol. 19 1463 ;Clark 等(1986)PNAS 83 4494 ；Paulie 等(1989) J. Immunol. 142 590 ；Gordon 等(1987)Eur. J. Immunol. 17 1535 Jabara 等(1990) J. Exp. Med. 172 1861 ；Zhang 等(1991) J. Immunol. 146 1836 ；Gascan 等(1991) J. Immunol. 147 8 ；Banchereau 等(1991)Clin. Immunol. Spectrum 3 ；禾口 Banchereau 等(1991)Science 251 :70ο如上所述，本文所用術語“抗體”包括嵌合抗體?！扒逗稀笨贵w指最優(yōu)選用重組DNA 技術產生的包含人(包括免疫“相關”動物，如黑猩猩)和非人組分的抗體。因此，嵌合抗體 的恒定區(qū)最優(yōu)選與天然人抗體恒定區(qū)基本相同；嵌合抗體的可變區(qū)最優(yōu)選衍生自對CD40 具有所需抗原特異性的非人來源的抗體。非人來源可以是可用來產生抗CD40抗原的抗體 的任何脊椎動物來源。這種非人來源包括但不限于嚙齒類(例如，家兔、大鼠、小鼠等；參 見，例如，美國專利號4，816，567)和非人靈長類(例如，古猴(Old World Monkey)、類人猿 等；參見例如美國專利號5，750，105和5，756，096)。短語“恒定區(qū)”指抗體分子中賦予效應 器功能的那部分。在以前制備用于治療人類疾病的無免疫原性抗體的研究中，小鼠恒定區(qū) 被人恒定區(qū)取代。這些人源化抗體的恒定區(qū)衍生自人抗體。然而，這些抗體仍能在人中引 發(fā)不良的可能有潛在危險的免疫應答并且喪失親和力。如上所述，本文所用術語“抗體”包括人源化抗體?！叭嗽椿敝负凶钌俜侨丝贵w 序列的抗體形式。人源化抗體的大部分序列是人抗體(受者抗體)，但該受者抗體的超變區(qū) (也稱為互補決定區(qū)或CDR)殘基被具有所需特異性、親和力或活性的非人動物，例如小鼠、 大鼠、家兔或非人靈長類的(供者抗體)超變區(qū)殘基取代。短語“互補決定區(qū)”指共同確定了 含天然抗體結合位點的天然Fv區(qū)結合親和力和特異性的氨基酸序列。參見例如，Chothia 等，(1987) J. Mol. Biol. 196 901-917 ；Kabat 等，(1991)美國健康與人類服務部(U. S. Dept. of Health and 人 Services)，NIH 公布號 91-3242)。人源化可根據(jù)Winter 及其同事(Jones 等，(1986)Nature 321 :522_525 ； Riechmann 等，(1988)Nature 332 323-327 ；Verhoeyen 等，(1988)Science 239 1534-1536)的方法用嚙齒類CDR或突變型嚙齒類CDR序列取代人抗體的相應序列。也可 見美國專利號 5，225，539 ；5，585，089 ；5，693，761 ；5，693，762 ；5，859，205。在一些例子中，人抗體一個或多個可變區(qū)的框架區(qū)內的殘基為對應的非人殘基所取代(參見，例如美國專 利號5，585，089 ；5, 693，761 ；5, 693，762和6，180，370)。此外，人源化抗體可含有在受者 抗體或供者抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。制備這些修飾可進一步精制抗體的性能(例如，獲得 所需的親和力)?？傊?，人源化抗體所含的所有可變區(qū)、至少一個通常兩個可變區(qū)中所有或 基本上所有的超變區(qū)對應于非人抗體序列的超變區(qū)，所有或基本上所有的框架區(qū)對應于人 抗體的框架區(qū)。人源化抗體也任選包含抗體的恒定區(qū)(Fe)，通常是人抗體恒定區(qū)的至少一 部分。更多的細節(jié)見 Jones 等，(1986)Nature 331 :522_525 ;Riechmann 等，(1988)Nature 332 323-329 ；禾口 Presta(1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596。因此，這種“人源化”抗 體可包括基本上不是完整的人可變區(qū)而是被非人動物的相應序列取代的抗體。實際上，人 源化抗體通常是其中一些⑶R殘基和可能的一些框架殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘 基取代的人抗體。參見，例如，美國專利號5，225，539 ；5, 585,089 ；5，693，761 ；5，693，762 ； 5，859，205。也參見美國專利號6，180，370，和國際公布號WO 01/27160，其中公開了人源化 抗體和如何產生對預定抗原具有改進親和力的人源化抗體的制備方法。也可采用Human Engineering 技術(加州伯克利愛克索馬有限公司(Xoma Ltd.， Berkeley, California))來制造人源化抗⑶40抗體，用其描述的方法來降低抗體分子的 免疫原性同時維持其結合活性(例如，見Studnicka等，(1994)Protein Engineering 7 805-814和美國專利號5，766，886)。人源化抗CD40單克隆抗體包括抗體例如有SGN-40 (Tai等(2004) Cancer Res. 64 2846-52 ；美國專利號6，838，261)，它是鼠抗CD40抗體SGN-14的人源化形式(Francisco等 (2000)Cancer Res. 60 :3225_31)，和美國專利申請公開號2004/0120948所述的抗體。也可采用非人哺乳動物宿主，更具體說是用滅活了內源性免疫球蛋白(Ig)基因 座為特征的轉基因小鼠所產生的異種或修飾的抗-CD40抗體來實施本發(fā)明。這種轉基因動 物原先表達宿主免疫球蛋白輕鏈和重鏈的內源活性基因失去功能而被同類人免疫球蛋白 基因座取代。這些轉基因動物可產生基本上沒有宿主(動物)免疫球蛋白輕鏈或重鏈亞基 的人抗體。例如參見美國專利第5，877，397號和第5，939，598號。因此，在一些實施方式中，通過(例如)免疫轉基因小鼠獲得抗⑶40的完全人 抗體。用捷諾小鼠(XenoMouse )技術(阿布吉尼克斯公司(Abgenix)；加州弗里蒙特 (Fremont, California))獲得一只這類小鼠，參見美國專利號6,075, 181,6,091,001和 6，114，598。例如，用表達人⑶40的Sf9細胞免疫含有人IgG1重鏈基因座和人κ輕鏈基 因座的轉基因小鼠產生了 HCD122抗體，。小鼠也可以是其它同種型的轉基因小鼠。在一些實施方式中，所述抗⑶40抗體的輕鏈可變區(qū)包含HCD122的輕鏈⑶R 序列。因此，在一些實施方式中，抗-⑶40抗體的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID Ν0:10所示的 CDR-Ll氨基酸序列，SEQ ID NO 11所示的CDR-L2氨基酸序列，以及SEQ ID NO 12所示的 ⑶R-L3氨基酸序列。在其他實施方式中，所述抗⑶40抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)包含HCD122 的重鏈⑶R序列。因此，在一些實施方式中，抗-⑶40抗體的重鏈可變區(qū)包含SEQ ID Ν0: 13所示的CDR-Hl氨基酸序列，SEQ ID NO 14所示的CDR-H2氨基酸序列以及SEQID NO 15 所示的⑶R-H3氨基酸序列。在進一步的實施方式中，所述抗⑶40抗體的輕鏈可變區(qū)(VJ包含HCD122的輕鏈 CDR序列，重鏈可變區(qū)(Vh)包含HCD122的重鏈CDR序列。因此，在一些實施方式中，抗-CD40抗體的輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 10所示的⑶R-Ll氨基酸序列，SEQ ID NO 11所 示的⑶R-L2氨基酸序列以及SEQ IDNO 12所示的⑶R-L3氨基酸序列，其重鏈可變區(qū)(Vh) 包含SEQ ID NO 13所示的⑶R-Hl氨基酸序列，SEQ ID NO 14所示的⑶R-H2氨基酸序列 以及SEQID NO 15所示的⑶R-H3氨基酸序列。定義給定抗體可變區(qū)中CDR殘基的方法有許多(例如，參見以下萬維網(wǎng)(www) 地址“bioinf.org.uk/abs”)。最常使用的是Kabat編號體系(Kabat等，1991，免疫學 感興趣的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版， 馬里蘭州貝塞斯達國立衛(wèi)生研究院公共衛(wèi)生署(Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD))。根據(jù)Kabat編號體系，輕鏈可變區(qū)內的CDR是 氨基酸24-34 (CDR-Ll)、50-56 (CDR-L2)和89-97 (CDR-L3)，重鏈可變區(qū)內的CDR是氨基酸 31-35 (CDR-Hl) ,50-65 (CDR-H2)和 95-102 (CDR-H3)。另一種熟知體系是 Chothia 編號體系 (Chothia 和 Lesk(1987)MoI. Biol. 196 901-917)。根據(jù) Chothia 編號體系，輕鏈可變區(qū)內 的 CDR 是氨基酸 26-32 (CDR-Ll)、50-52 (CDR-L2)和 91-96 (CDR-L3)，重鏈可變區(qū)內的 CDR 是 氨基酸26-32 (OTR-Hl)、53_55 (⑶R-H2)和96-101 (⑶R-H3)。采用一種或多種已知體系，技 術人員不難確定某給定抗體是否符合上述輕鏈和重鏈CDR序列的要求?！翱贵w片段”指完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片 段的例子包括Fab、F(ab' )2和Fv片段。“Fab”指包含抗體的輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(ChI)的單價抗原結合片段。用 木瓜蛋白酶消化抗體產生了兩個相同的Fab片段和殘留的“Fe”片段，后一名稱反映了其易 于結晶的能力。F(ab' )2指含有抗體兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分并保留了交聯(lián)抗原能 力的二價抗原結合片段。胃蛋白酶處理產生了 F(ab' )2片段?！癋v”是含有完整的抗原識 別和結合位點的最小抗體片段。該區(qū)由非共價緊密結合的一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變 區(qū)的二聚體組成。在這種構型中，每個可變區(qū)的3個⑶R相互作用從而確定了 二聚體 表面上的抗原結合位點。6個CDR共同賦予了該抗體的抗原結合特異性。然而，即使一個可 變區(qū)(或僅含有3個抗原特異性CDR的半個Fv)也能識別并結合抗原，雖然親和力低于完 整的結合位點。本發(fā)明也可采用單鏈Fv(SCFV)，這是一種含有抗體Vh和\結構域的多肽，其 中這些結構域以一條多肽鏈的形式存在(參見，例如，美國專利4，946，778,5, 260，203、 5，455，030和5，856，456)。scFv多肽通常在Vh與\結構域之間含有一多肽接頭使scFv能 形成與抗原結合的所需結構。scFv的綜述見Pluckthun，刊于Rosenburg和Moore編的《單 克隆抗體的藥理學》(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)，第113卷，斯普林格 韋格出版社(Springer-Verlag)，紐約，第 269-315 頁，1994?？笴D40抗體的片段適合用于本發(fā)明方法，只要它們保留了結合人B細胞表面CD40 抗原的能力。在本文中將這類片段稱為“抗原結合”片段。這類片段的優(yōu)選特征是功能特 性類似于對應的全長抗體。因此，例如，全長抗CD40抗體的片段優(yōu)選能夠特異性結合人細 胞表面表達的人⑶40抗原，并且沒有本文其他地方所述的顯著激動活性。在某些情況下， 用于本發(fā)明方法的抗CD40抗體片段保留了結合相關FcR的能力。已經(jīng)開發(fā)了產生抗體片段的各種技術。傳統(tǒng)上，通過蛋白酶水解消化完整抗體產 生這些片段(參見例如，Morimoto 等(1992) Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107—117(1992)和 Brennan 等(1985) Science 229:81)。然而，現(xiàn)在可通過重 組宿主細胞直接產生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體文庫分離得到這種抗體片段。 或者，可從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，并化學偶聯(lián)形成F(ab' )2片段(Carter等 (1992)Bio/Technology 10 :163_167)。按照另一種方法，可從重組宿主細胞培養(yǎng)物直接分 離得到F(ab' )2片段。本領域技術人員明白產生抗體片段的其它技術。用于本發(fā)明聯(lián)合治療的抗-CD40抗體當與人B細胞表面CD40抗原結合時沒有顯 著的激動活性。在一些實施方式中，它們與人細胞表面CD40結合可導致抑制B細胞的增殖 和分化。適合用于本發(fā)明方法的抗CD40抗體包括那些可顯示“激動”活性的抗體，“激動劑” 可與細胞上的受體結合，并啟動相似或相同于受體天然配體所啟動的反應或活性。CD40激 動劑能誘導以下任何一種反應(但不限于)或所有反應B細胞增殖和/或分化；通過諸如 ICAM-U E-選擇素、VCAM等分子上調細胞間粘附；分泌促炎細胞因子如IL_1、IL_6、IL-8、 IL-12、TNF 等；通過 CD40 受體經(jīng)由 TRAF (如 TRAF2 和 / 或 TRAF3) ,MAP 激酶如 NIK (NF- κ B 誘導激酶)、I- κ B激酶(ΙΚΚ α/β)、轉錄因子NF- κ B、Ras和MEK/ERK途徑、ΡΙ3Κ/ΑΚΤ途 徑、Ρ38ΜΑΡΚ途徑等進行信號轉導；通過諸如XIAP、mcl-1、bcl-χ等分子轉導抗凋亡信號； 產生B和/或T記憶細胞；B細胞產生抗體；B細胞同種型轉換，上調細胞表面II類MHC和 CD80/86表達等。“顯著”激動活性指經(jīng)過B細胞應答試驗測定，比陰性對照誘導的激動活性高至少 30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%^； 100%?！帮@著”激 動活性優(yōu)選經(jīng)過B細胞應答試驗測定，比陰性對照誘導的激動活性高至少2倍或至少3倍。 因此，例如，當感興趣的B細胞應答是B細胞增殖時，“顯著”激動活性所誘導的B細胞增殖 水平比陰性對照誘導的B細胞增殖水平高至少2倍或至少3倍。在一個實施方式中，不結 合CD40的抗體用作陰性對照。經(jīng)B細胞應答試驗測定，“無顯著激動活性”抗體所顯示的激 動活性不高于陰性對照誘導的激動活性約25%，優(yōu)選不高于約20%、15%、10%、5%、1 %、 0. 5%，或者甚至不高于陰性對照誘導的激動活性約0. 1%。⑶40的“拮抗劑”防止或降低了⑶40受體與激動劑配體(具體是⑶40L)結合所 誘導的任何反應。這種拮抗劑可降低對⑶40L結合所誘導的應答5 %、10%、15 %、20 %、 25%,30%,35%,優(yōu)選 40%、45%、50%、55%、60%，更優(yōu)選降低 70%、80%、85%，最優(yōu)選 降低 90%、95%、99%或 100%。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選抗體和片段是當與人B細胞CD40抗原結合時沒有顯著激 動活性，以及當與人B細胞⑶40抗原結合時顯示有拮抗活性的抗⑶40抗體。在一些實施 方式中，所述抗CD40抗體在一種B細胞應答中沒有顯著的激動活性。在其他實施方式中， 所述抗CD40抗體在一種以上B細胞應答(如增殖和分化，或者增殖、分化和抗體生產)的 試驗中沒有顯著的激動活性。測定抗CD40治療劑(如抗CD40抗體)拮抗活性的方法是本領域已知的，包括但 不限于標準的競爭性結合試驗、監(jiān)測B細胞分泌抗體的試驗、B細胞增殖試驗、Banchereau 樣-B細胞增殖試驗、抗體產生的T輔助細胞試驗、共同刺激B細胞增殖試驗和上調B細胞激 活標記的試驗。相關試驗的描述可參見，例如，美國專利號6，087，329和作為WO 00/75348、 WO 2005/044294、W02005/044304, WO 2005/044305、WO 2005/044306、WO 2005/044307、 W02005/044854, WO 2005/044855、WO 2006/073443、WO 2006/125117、W02006/125143、WO2007/053661和WO 2007/053767公布的國際專利申請?？刹捎帽绢I域已知的任何試驗確定抗CD40抗體是否可用作一種或多種B細胞應 答的拮抗劑。在一些實施方式中，抗CD40抗體用作選自以下至少一種B細胞應答的拮抗 劑B細胞增殖、B細胞分化、抗體生產、細胞間粘附、產生記憶B細胞、同種型轉換、上調II 類MHC和⑶80/86的細胞表面表達和分泌促炎細胞因子如IL-8、IL-12和TNF。特別感興 趣的是結合于人B細胞表面CD40抗原時對B細胞增殖無顯著激動活性的拮抗性抗CD40抗 體。如用B細胞增殖試驗測定的那樣，抗CD40抗體可以是可溶性或細胞表面CD40L誘 導B細胞增殖的拮抗劑。本領域知道合適的B細胞增殖試驗。下文也描述了合適的B細胞 增殖試驗。在一些實施方式中，拮耐性抗CD40抗體刺激B細胞增殖的水平不高于陰性對照 誘導B細胞增殖的約25% (即至少75%抑制)，優(yōu)選不高于約20%、15%、10%、5%、1%、 0. 5%，或者甚至不高于陰性對照誘導B細胞增殖高的約0. 1%。在其它實施方式中，如用B細胞增殖試驗測定的那樣，所述抗CD40抗體是另一種 抗 CD40 抗體(如 S2C6 抗 CD40 抗體；Kwekkeboom 等(1993) Immunology 79 :439_444)誘導 B細胞增殖的拮抗劑，在該拮抗性抗CD40抗體存在時其它抗CD40抗體刺激的B細胞增殖水 平不高于沒有拮抗性抗CD40抗體時其它抗CD40抗體誘導B細胞增殖的約25 % (即至少抑 制75 % )，優(yōu)選不高于約20%、15%、10 %、5 %、1 %、0. 5 %，或者甚至不高于沒有拮抗性抗 ⑶40抗體時其它抗⑶40抗體誘導的B細胞增殖的約0. 1 %。在其它實施方式中，如用B細胞活化試驗測定的那樣，抗CD40抗體是細胞系EL4B5(Kwekkeboom 等(1993) Immunology 79 :439_444)誘導 B 細胞增殖的拮抗劑，在拮 抗性抗CD40抗體存在時EL4B5細胞系刺激的B細胞增殖水平不高于沒有拮抗性抗CD40抗 體時此細胞系誘導B細胞增殖的約25 % (即至少抑制75 % )，優(yōu)選不高于約20 %、15 %、 10%,5%U%>0.5%,或者甚至不高于沒有拮抗性抗⑶40抗體時該細胞系誘導B細胞增殖 的約0. 1%。在其它實施方式中，如用人T細胞輔助B細胞產生抗體試驗測定的那樣，所述抗 CD40抗體是人T細胞誘導B細胞產生抗體的拮抗劑。以此方式，存在拮抗性抗CD40抗體 時，T細胞刺激B細胞產生IgG抗體、產生IgM抗體或者產生IgG和IgM 二種抗體的水平不 高于缺乏該拮抗性抗⑶40抗體時T細胞刺激B細胞產生各種抗體的約50% (即至少抑制 了 75% )，優(yōu)選不高于約25%、20%、15%、10%、5%、1%、0. 5%，或者甚至更優(yōu)選不高于缺 乏該拮抗性抗⑶40抗體時T細胞刺激B細胞產生各種抗體的約0. 1 %。例如，可采用以下試驗評估抗⑶40抗體的拮抗活性?；旧先鏒e Groot等(1990) Lymphokine Research (1990) 9 :321所述，可從(例如)獲自扁桃腺切除術個體的扁桃腺分 離獲得這些試驗用的人B細胞。簡要說，用手術刀切割分散扁桃腺組織，用5mM L-亮氨酸甲 酯處理以消除吞噬細胞和NK細胞，通過一輪2-氨基乙基異硫脲溴處理綿羊紅細胞(SRBC) 形成花結去除T細胞。用間接免疫熒光標記法和FACS分析核查所得到的B淋巴細胞制品 的純度，間接免疫熒光標記法采用抗_(⑶20)mAb Bl (康特克隆公司(Coulter Clone)，佛羅 里達州海爾勒阿(Hialeah, FA))或抗_(CD3)mAb 0KT3(奧索公司(Ortho)，新澤西州拉里 坦(Raritan,NJ))和FITC偶聯(lián)的兔抗-(小鼠Ig)的F(ab' )2片段(甾麥公司(Zymed), 加州舊金山(San Francisco，CA))。
B-細胞增殖試驗在平底96孔微量滴定板中，用補充有10%胎牛血清的200 μ 1 IMDM培養(yǎng)B細胞 (每孔4χ104個)。加入固定的抗-(IgM)抗體(免疫珠5 μ g/ml ；伯樂公司(BioRad)，加州 里士滿(Richmond, California))刺激B細胞。需要時，加入100U/ml重組IL-2。在開始 微量培養(yǎng)時加入不同濃度的測試單克隆抗體(mAb)，第3天測定18小時脈沖后(3H)-胸苷 的摻入評估細胞增殖。在固定的抗-IgM存在下或者固定的抗-IgM和IL-2存在下拮抗性 抗CD40抗體不會顯著地共同刺激人B-細胞增殖。Banchereau-樣B-細胞增殖試驗為了在類似于Banchereau等(1991) Science (1991) 251 :70所述的培養(yǎng)系統(tǒng)中測 定抗CD40單克隆抗體刺激B-細胞增殖的能力，采用了表達人Fc γ RII的HR等位基因形式 的小鼠3T6轉染細胞。在平底微孔板中存在IxlO4個轉染細胞(用5000鐳輻射過)時用 補充有10%胎牛血清和100U/ml重組IL-4的200 μ IIMDM培養(yǎng)B細胞(每孔2χ104個)。 加入B細胞之前，使3Τ6細胞貼附于塑料培養(yǎng)板至少5小時。加入的抗⑶40mAb的濃度為 15ng/ml至2000ng/ml，測定第7天用[3H]胸苷脈沖處理18小時后的胸苷摻入評估B細胞 的增殖。用拮抗件抗CD40mAb抑制S2C6-刺激的B細胞增殖也可采用上述B-細胞增殖試驗，通過抑制抗⑶40抗體如S2C6(也稱為SGN-14， 據(jù)報道它是CD40刺激正常B細胞增殖的激動劑；Francisco等(2000)Cancer Res. 60 3225-3231)刺激B-細胞增殖的能力，鑒定拮抗性抗CD40單克隆抗體(mAb)。在偶聯(lián) 抗-IgM(5y g/ml)和抗CD40mAb S2C6(1. 25 μ g/ml)的瓊脂糖珠存在下，在200 μ 1微孔中培 養(yǎng)人扁桃腺B細胞(每孔4χ104個)。加入不同濃度的感興趣抗CD40mAb，3天后評估[3H]-胸 苷摻入。作為對照，可加入相似濃度的抗_(葡糖腦苷脂酶)mAb 8E4。Barneveld等(1983) Eur. J. Biochem. 134 :585。拮抗性抗CD40抗體可抑制抗-IgM和mAb S2C6共同刺激誘導的 人B-細胞增殖(例如)至少75%或更多(即拮抗性抗CD40抗體存在下S2C6-刺激的增殖 不高于沒有拮抗性抗CD40抗體時觀察到的25%)。相反，用等量無關mAb8E4(抗β -葡糖 腦苷脂酶抗體)沒有觀察到顯著抑制。Bameveld等，同上。這一結果表明，抗⑶40mAb不能 為人B細胞增殖遞送刺激信號，但相反，可抑制用另一種mAb觸發(fā)CD40產生的刺激信號。用EL4B5細胞激活B-細胞的試驗Zubler 等(1985) J. Immunol. (1985) 134 :3662 觀察到，小鼠胸腺瘤 EL-4 細胞系 (稱為EL4B5)的突變亞克隆能強烈刺激小鼠和人來源的B細胞體外增殖和分化成免疫球 蛋白-分泌性漿細胞。發(fā)現(xiàn)這種激活為抗原非依賴性，不受MHC限制。為了最優(yōu)地刺激人 B細胞，需要存在活化人T細胞的培養(yǎng)上清液，但用佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA) 或IL-I預先激活EL4B5細胞時也能發(fā)生B-細胞應答。Zubler等(1987) Immunological Reviews 99 281 ；和 Zhang 等(1990) J. Immunol. 144 :2955。此培養(yǎng)系統(tǒng)能有效激活 B 細 胞-有限稀釋實驗證明可激活大多數(shù)人B細胞增殖和分化成抗體-分泌細胞。Wen等(1987) Eur.J. Immunol17:887。在平底微量滴定板中用補充有10%熱滅活胎牛血清、5ng/ml佛波醇_12_肉豆蔻 酸13-乙酸酯和5%人T細胞培養(yǎng)上清液的200 μ 1 IMDM培養(yǎng)B細胞(每孔1000個)與經(jīng) 過輻射(5000鐳)的EL4B5細胞(每孔5χ104個)。在開始培養(yǎng)時加入不同濃度的mAb，第6天用3 [H]-胸苷脈沖處理18小時后評估胸苷摻入。為了制備T-細胞上清液，在1 μ g/ml PHA 和10ng/ml PMA存在下以IO6個/ml的密度培養(yǎng)純化的T細胞36小時。Wen等(1987)Eur. J. Immunol (1987) 17 :887。離心細胞獲得T-細胞上清液，儲存于_20°C。檢測了 T細胞上清 液提高EL4B5-B細胞培養(yǎng)物中人B細胞增殖的效率，合并最有效的上清液用于實驗。評估 抗⑶40抗體對EL4B5誘導人B-細胞增殖的影響時，可加入單克隆抗體如MOPC-141 (IgG2b) 作為對照。人T細胞輔助B細胞產?？贵w的試驗拮抗性抗CD40抗體可用作B細胞產生抗體的拮抗劑?？稍赥細胞輔助試驗中 評估抗體抑制活化T細胞以接觸依賴性方式刺激B細胞產生抗體的能力，來檢測抗CD40 抗體的這種類型拮抗活性。在此方式中，用1 500稀釋的抗-⑶3mAb CLB-T3/3腹水 (CLB，荷蘭阿姆斯特丹)包被96孔組織培養(yǎng)板。加入如下所示的共刺激mAb 抗⑶2mAb CLB-T11. 1/1和CLB-T11.2/1(CLB，荷蘭阿姆斯特丹)，兩種為1 1000稀釋的腹水和抗 ⑶28mAb CLB-28/1 (CLB,荷蘭阿姆斯特丹)。隨后，加入扁桃腺T細胞(經(jīng)3000拉德輻射； 每孔IO5個)、扁桃腺B細胞(每孔IO4個)和rIL-2(20U/ml)。各孔細胞培養(yǎng)物的最終體 積為200μ1。8天后，離心細胞，收獲無細胞上清液。如下所述用ELISA評估(稀釋)樣品 中的人IgM和IgG濃度。在一個實施方式中，在包被有抗-⑶3mAb和含或不含用于共刺激T細胞的不同mAb 的96孔板中一起培養(yǎng)人扁桃腺B細胞(IO4個/孔)與經(jīng)輻射的純化T細胞(3000拉德， IO5個/孔)。培養(yǎng)8天后，收獲上清液測定B細胞產生的抗體。通過下述ELISA試驗評估 B細胞產生的抗體。從培養(yǎng)開始時，加入不同濃度的感興趣抗CD40抗體。作為對照可加入 mAb M0PC-141。拮抗性抗⑶40抗體可抑制人T細胞刺激B細胞產生IgG和IgM抗體至少50%或 更多(即在拮抗性抗CD40抗體存在下T細胞誘導B細胞產生的抗體量不高于沒有拮抗性 抗⑶40抗體時觀察到的50% )。相反，對照抗體如M0PC-141對T細胞誘導的B細胞產生 抗體沒有顯著影響。用于抗體定量的ELISA試驗用ELISA評估人IgM和IgG的濃度。用0. 05M碳酸鹽緩沖液(pH = 9. 6)配制 的4 μ g/ml小鼠抗人IgGmAb MH 16-01 (CLB,荷蘭阿姆斯特丹)或1. 2 μ g/ml小鼠抗-人 IgMmAb 4102 (太勾公司(Tago)，加州伯林蓋姆(Burlingame, CA))包被96孔ELISA平板， 4°C培育16小時。用PBS-0. 05%吐溫-20 (PBS-吐溫)洗滌平板3次，用BSA飽和1小時。 洗滌2次后，用不同稀釋度的測試樣品37°C培育該平板1小時。洗滌3次后，與1 μ g/ml過氧 化物酶標記的小鼠抗-人IgGmAb MH 16-01 (CLB)或小鼠抗-人IgMmAb MH 15-01 (CLB) 37°C 培育1小時以檢測結合的Ig。洗滌平板4次，加入底物鄰苯二胺顯示結合的過氧化物酶的 活性。用人標準血清(H00，CLB)建立各次試驗的標準曲線。本領域知道拮抗性抗⑶40抗體。參見例如，美國專利申請公開號20020142358和 20030059427公開的稱為F4-465的雜交瘤產生的人抗CD40抗體。F4-465獲自HAC小鼠 (Kuroiwa 等(2000) Nature Biotech 10 1086 (2000))，因此表達人 λ 輕鏈。除拮抗活性外，用于本發(fā)明方法的抗CD40抗體優(yōu)選具有另一種作用于靶細胞的 機制?？耿?0抗體優(yōu)選具有ADCC活性。
本發(fā)明特別感興趣的抗⑶40抗體具有HCD122(用2003年9月17號保藏于 ATCC(美國模式培養(yǎng)物保藏所；大學大道10801號(10801 UniversityBlvd.)，馬納薩斯 (Manassas)，弗吉尼亞州(Virginia) 20110-2209 (USA))的專利保藏物編號PTA-5543的雜 交瘤細胞系產生)的結合特征。這些抗體包括但不限于a)單克隆抗體HCD122，由ATCC保藏的專利保藏物編號PTA-5543的雜交瘤細胞系
產生；b)包含選自以下氨基酸序列的抗體SEQ ID NO 2所示序列、SEQ ID NO :4所示序 列、SEQ ID NO :5 所示序列、SEQ ID NO 2 禾口 SEQ ID NO :4 所示的二序列以及 SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO 5所示的二序列；c)包含選自以下氨基酸序列的抗體=SEQ ID NO 17所示序列、SEQ IDNO 19所示 序列、SEQ ID NO :20所示序列、SEQ ID N0:17禾口 SEQ ID NO 19所示的二序列以及SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 20所示的二序列；d)包含選自以下氨基酸序列的抗體=SEQ ID NO 16所示序列、SEQ IDNO 18所示 序列以及SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 18所示的二序列；e)含有選自由以下核苷酸序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的抗體SEQID NO 1所示序列、SEQ ID NO 3所示序列以及SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示的二序列；f)含有包含SEQ ID NO 10所示的CDR-Ll氨基酸序列、SEQ ID NO :11所示的 ⑶R-L2氨基酸序列以及SEQ ID NO 12所示的⑶R-L3氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(Vj的抗體。g)含有包含SEQ ID NO: 13所示的CDR-Hl氨基酸序列、SEQ ID N0:14所示的 ⑶R-H2氨基酸序列以及SEQ ID NO 15所示的⑶R-H3氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(Vh)的抗 體；h)含有包含 SEQ ID NO 10 所示 CDR-Ll 氨基酸序列、SEQ ID NO 11 所示 CDR-L2 氨基酸序列和SEQ ID NO 12所示⑶R-L3氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，以及含有包含SEQ ID NO 13所示CDR-Hl氨基酸序列、SEQ ID NO 14所示CDR-H2氨基酸序列和SEQ ID NO 15所示CDR-H3氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(Vh)的抗體；i)結合人⑶40抗原結構域2的抗體；j)結合能夠與單克隆抗體HCD122結合的⑶40表位的抗體；k)結合含有SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9所示人CD40序列殘基82-87表位的抗 體；和1)在競爭性結合試驗中能與單克隆抗體HCD122競爭的抗體。從含有一種或多種編碼⑶40抗體的表達載體的CHO細胞獲得的抗-⑶40抗體可 用于本發(fā)明的方法。尤其優(yōu)選保藏于ATCC的專利保藏物編號PTA-5543的雜交瘤細胞系產生的單克隆 抗體HCD122用于本發(fā)明的方法。單克隆抗體HCD122能結合人CD40抗原的結構域2，而發(fā)現(xiàn)具有拮抗特性的早期 抗-CD40抗體能結合人CD40的其他結構域。如流式細胞術試驗測定的那樣，在ELISA類型試驗中能結合可溶性CD40的HCD122單克隆抗體可防止⑶40-配體與細胞表面⑶40結合，并取代先前已結合的CD40-配體。體外檢測對正常人B細胞增殖的影響時，HCD122的作用是拮抗性抗CD40 抗體。而且，HCD122不誘導正常人淋巴細胞強烈增殖。該抗體能夠通過抗體依賴的細胞毒 作用(ADCC)殺傷表達⑶40的靶細胞。經(jīng)Biacore 試驗測定，HCD122對人⑶40的結合親 和力為5xlO_1QM。已知HCD122抗體的核苷酸和氨基酸序列(例如，參見WO 2005/044854)。此 外，已于2003年9月13日將表達HCD122抗體的小鼠雜交瘤細胞系153. 8E2. D10. D6. 12. 12 (CMCC# 12056)保藏到美國典型培養(yǎng)物保藏中心[ATCC ；大學大道10801號，弗吉尼 亞州馬納薩斯20110-2209 (USA)]，專利保藏物編號為PTA-5543。HCD122輕鏈的完整序列見SEQ ID NO :2，其中包括前導序列(SEQ IDNO 2的殘基 1-20)、可變區(qū)(SEQ ID NO :2的殘基21-132)以及恒定區(qū)(SEQ IDNO :2的殘基133-239)。 HCD122重鏈的完整序列見SEQ ID NO :4，其中包括前導序列(SEQ ID NO :4的殘基1_19)、可 變區(qū)(SEQ ID NO 4 的殘基 20-139)以及恒定區(qū)(SEQ ID NO 4 的殘基 140-469)。HCD122 一種變體的完整序列見SEQ IDNO :5，其中包括前導序列(SEQ ID NO 5的殘基1_19)、可變 區(qū)(SEQ ID NO :5的殘基20-139)以及恒定區(qū)(SEQ ID NO :5的殘基140-469)。該變體與 HCD122不同之處在于SEQ ID NO 4中位于恒定區(qū)內的第153位丙氨酸殘基被絲氨酸殘基 取代。編碼HCD122輕鏈和重鏈的核苷酸序列見SEQ ID NO :1(HCD122輕鏈的編碼序列)和 SEQ ID NO :3(HCD122重鏈的編碼序列)。不含前導序列的HCD122輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列見SEQ ID N0:16(即SEQ ID NO 2的殘基21-132)。不含前導序列的HCD122輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列見SEQ ID NO :17(即SEQ ID NO 2的殘基21-239)。不含前導序列的HCD122重鏈可變區(qū)的氨基酸 序列見SEQ ID N0:18(S卩SEQ ID NO :4的殘基20-139)。不含前導序列的HCD122重鏈可 變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列見SEQID NO :19(即SEQ ID NO 4的殘基20-469)。HCD122重 鏈變體可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列見SEQ ID NO :20(即SEQ ID NO 5的殘基20-469)。用于本發(fā)明方法的抗CD40抗體包括與HCD122單克隆抗體不同但保留了其CDR的 抗體，和含有一個或多個氨基酸加入、缺失或取代的抗體。HCD122是完全的人抗體，但如果 需要可進一步去免疫原性(de-immunized)?？捎靡阎椒ㄖ苽淙ッ庖咴缘目笴D40抗體， 例如WO 98/52976和WO 00/34317所述。用這種方式可修飾抗CD40抗體內的殘基以降低 該抗體對人的免疫原性同時保留其治療活性。可用例如，EP 0983303 AUffO 00/34317和WO 98/52976所述方法，產生任何已知 抗體的具有感興趣結合特異性的變體序列。例如，已證明CDR內的序列在某些患者中可導 致抗體結合II類MHC觸發(fā)不良T輔助細胞應答。保守性取代可能使抗體保留結合活性但 除去觸發(fā)不良T細胞應答的能力。可以用本領域公知的方法進行這類保守或非保守取代， 如本文其它地方所述，得到的抗體也可用于本發(fā)明方法?？捎帽疚乃龇椒ǔＲ?guī)檢測變異 抗體有無特定活性，例如，拮抗活性、親和力和特異性。例如，可通過突變編碼感興趣抗體的克隆DNA序列制備拮抗性抗CD40抗體，如 HCD122單克隆抗體的氨基酸序列變體。本領域熟知誘變和改變核苷酸序列的方法。參見 例如，Walker 和 Gaastra 編(1983) Techniques in Molecular Biology (分子生物學技術) (麥克米蘭出版公司(MacMillan Publishing Company)，紐約)；Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488-492 ；Kunkel 等(1987)Methods Enzymol. 154367-382 ；Sambrook等(1989)Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆試驗室手冊)(冷泉港，紐 約)；美國專利號4，873，192 ；和其中引用的參考文獻。不影響感興趣多肽生物學活性的合 適氨基酸取代的指南可參見Dayhoff等，(1978)《蛋白質序列和結構圖》(Atlas of Protein Sequence and Structure), (Natl. Biomed. Res. Found.，華盛頓特區(qū))中的模型。優(yōu)選保 守性取代，例如用特性相似的另一氨基酸取代一個氨基酸。保守性取代的例子包括，但不限 于，Gly<=>Ala、ValoIle<=>Levi、Asp々Glu、Lys<=>Arg、Asn<=>Gln禾nPheoTrpoTyr。在構建感興趣抗體，如感興趣的拮抗性抗-CD40抗體多肽的變體時，所作的修飾 應使變體繼續(xù)具有所需活性，即結合親和力相似并且拮抗性抗CD40抗體仍能特異性結合 人細胞表面表達的CD40抗原，當與人CD40表達細胞的CD40抗原結合時無顯著激動活性而 顯示拮抗活性。顯然，制作編碼這種變體多肽DNA中的任何突變都必須不將其序列置于讀 碼框外并且優(yōu)選不產生可能導致二級mRNA結構的互補區(qū)(例如，參見，EP 0075444)。此外，可用許多方法突變拮抗性抗-CD40抗體的恒定區(qū)從而改變其效應器功能。 例如，參見美國專利6，737，056B1和美國專利申請公布號2004/0132101A1所述的Fc突變 從而優(yōu)化抗體與Fc受體的結合。參比抗體如拮抗性抗CD40抗體變體的氨基酸序列與參比抗體如拮抗性抗CD40 抗體分子，如本文所述HCD122單克隆抗體的序列相同性，優(yōu)選至少70%或75%，優(yōu)選至少 80%或85%，更優(yōu)選至少90%、91%、92%、93%、94%或95%。更優(yōu)選這些分子共享至少 96%、97%、98%或99%的序列相同性。對于本發(fā)明的目的，可用Smith-Waterman的同源性 檢索算法以仿射空格(affine gap)檢索，確定序列相同性百分比，所用參數(shù)為空格開放罰 分12、空格延伸罰分2和BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman同源性檢索算法的說明見Smith 和 Waterman，(1981)，Adv. Appl. Math. 2 :482_489。例如，變體與參比抗體如拮抗性抗-CD40 抗體有少至1-15個氨基酸殘基、少至1-10個氨基酸殘基，如6-10，少至5個、少至4個、3 個、2個、甚至1個氨基酸殘基不相同。就兩條氨基酸序列的最佳比對而言，與參比氨基酸序列相比，氨基酸序列變體的 毗連區(qū)段可含有添加的氨基酸殘基或刪除的氨基酸殘基。用于與參比氨基酸序列比較的毗 連區(qū)段包括至少20個毗連氨基酸殘基，可以是30、40、50或更多個氨基酸殘基。可校正與 保守殘基取代或空格相關的序列相同性(參見Smith-Waterman同源性檢索算法)。能特異性結合CD40，尤其是結合惡性B細胞的CD40抗原時，保留拮抗活性的抗體 的精確化學結構取決于眾多因素。由于抗體分子中存在可電離的氨基和羧基，獲得的特定 多肽可以是酸性鹽或堿性鹽，或中性鹽形式。能在合適的環(huán)境中保留其生物活性的所有這 種制劑都包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗體的定義中。此外，可通過用糖組分衍生(糖 基化)或用其它補充分子，例如脂質、磷酸、乙?；燃訌娫摱嚯牡囊患壈被嵝蛄?。也可 通過與糖偶聯(lián)來加強。這種加強的某些方面內容可通過生產宿主的翻譯后加工系統(tǒng)來實 現(xiàn)；可在體外引入其它這種修飾。在任何情況下，本文所用的抗⑶40抗體的定義包括這種 修飾。在各種試驗中，期望這種修飾可提高或降低該多肽的活性而定量或定性地影響其活 性。此外，可通過氧化、還原或其它衍生方式修飾鏈中各氨基酸殘基，可切割該多肽得到保 留活性的片段。本領域提供了關于制備和使用抗體變體的基本指南。在制備抗-CD40抗體變體過 程中，本領域技術人員不難確定對天然蛋白核苷酸或氨基酸序列的哪種修飾導致產生的變體將適合用作本發(fā)明方法藥物組合物中的治療活性組分。用于本發(fā)明方法的抗CD40抗體在體外和/或體內優(yōu)選具有至少一種以下生物學 活性抑制T細胞刺激的正常人外周B細胞分泌抗體；抑制CD40L表達細胞或可溶性CD40 配體(s⑶40L)刺激正常人外周B細胞存活和/或增殖；抑制Jurkat T細胞刺激正常人外周 B細胞存活和/或增殖；抑制SCD40L或固相CD40L刺激任何細胞產生“存活”抗-凋亡胞內 信號；抑制與SCD40L或固相CD40L連接、缺失、無反應(anergy)和/或誘導攜帶CD40的靶 細胞或攜帶CD40相關配體的細胞(包括但不限于T細胞和B細胞)耐受時任何細胞中的 CD40信號轉導，誘導CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的擴增和激活(參見例如，供者同種抗原通過 CD40-CD40L 干擾的-特異性組織排斥，van Maurik 等(2002) J. Immunol. 169 :5401_5404)， 通過任何機制(包括但不限于對靶細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、補體 依賴性細胞毒性(CDC)、下調增殖和/或凋亡)產生的細胞毒性、調節(jié)靶細胞的細胞因子分 泌和/或細胞表面分子的表達和它們的組合?？砂凑毡疚牡拿枋鲞M行這種生物學活性試 驗。也參見 Schultze 等(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :8200_8204 ；Denton 等(1998) Pediatr. Transplant. 2 :6_15 ；Evans 等(2000)J. Immunol. 164 :688_697 ；Noelle (1998) Agents Actions Supp 1. 49 17-22 ；Lederman 等(1996)Curr. Opin. Hematol. 3 :77_86 ； Coligan 等(1991)Current Protocols in Immunology 13 12 ；Kwekkeboom 等(1993) Immunology 79 :439_444 ；和美國專利號 5，674，492 和 5，847，082 所述的試驗?？晒こ谈脑炜贵w提高其ADCC活性。具體說，CH2結構域的羧基端一半對FcRlII 受體介導的ADCC至關重要。由于CH2和絞鏈區(qū)對效應器功能有重要作用，故可制備含 有額外CH2和/或絞鏈區(qū)的一系列多結構域抗體，以研究其效應器功能的改變(參見 Greenwood等(1994) Ther. Immunol. 1 (5) :247_55)。另一種方法是平行工程改造額外結構 域，例如，工程改造將半胱氨酸加入到嵌合性Ig的H鏈中產生二聚體(參見Shopes (1992) J. Immunol. 148(9) =2918-2922) 0而且，可經(jīng)工程改造將突變引入Fc區(qū)(參見例如，美國 專利號6，737，056B1)、在巖藻糖基轉移酶缺陷細胞系的細胞中表達(參見例如，美國專 利申請公布號US2003/0115614)，或對抗體糖基化實施其它改變(參見例如，美國專利號 6，602，684)而提高ADCC活性。檢測本文鑒定的CD40-抗原表位的特異性拮抗性抗CD40抗體的代表性試驗是“競 爭性結合試驗”。競爭性結合試驗是通過未知物質抑制已知的標記配體與其特異性抗體結 合的能力來檢測和定量未知物質的血清學試驗。也稱為競爭性抑制試驗。在代表性的競爭 性結合試驗中，標記的CD40多肽被樣品中的候選抗體沉淀，例如與制備的針對抗CD40單克 隆抗體的一個或多個表位的單克隆抗體結合而沉淀?？赏ㄟ^篩選針對CD40蛋白或含有感 興趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而制備的一系列抗體來鑒定能與某感興趣表位發(fā)生特 異性反應的抗-CD40抗體。例如，就人CD40而言，感興趣表位包括含有以下同種型的線性 和/或非線性氨基酸殘基的表位人CD40的短同種型(SEQ ID NO 7所示，參見GenBank登 錄號NP_690593，由SEQ ID NO 6所示序列編碼；也參見GenBank登錄號NM_152854)，或人 CD40 的長同種型(SEQ ID NO 9 所示，參見 GenBank 登錄號 CAA43045 和 NP_001241,由 SEQ ID NO 8所示序列編碼；參見GenBank登錄號X60592和NM_001250)。或者，可用以前鑒定 的合適的拮抗性抗-CD40抗體進行競爭性結合試驗來選擇與以前鑒定抗體相當?shù)膯慰寺?抗體。
這種免疫試驗采用的抗體可以是標記或未標記的抗體。未標記抗體可用于凝結試 驗；采用各種各樣標記物的標記抗體可用于各種試驗。使可檢測物質與抗體結合有助于檢 測抗-CD40抗體與感興趣表位之間形成的抗體_抗原復合物。合適的檢測方式包括采用例 如放射性核素、酶、輔酶、熒光劑、化學發(fā)光劑、色原、酶底物或輔助因子、酶抑制劑、輔基復 合物、自由基、顆粒、染料等標記。酶的合適例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β _半 乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物例子包括鏈霉親和素/生物素和親和素/ 生物素；合適的熒光物質例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒 光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質的例子是魯米諾；生物發(fā)光物質的例子包括螢光素 酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質的例子包括125i、131I、35S或3Η。這種標記的試劑 可用于各種熟知的試驗，例如放射性免疫試驗，酶免疫試驗如ELISA、熒光免疫試驗等。參 見，例如美國專利號 3，766，162 ；3，791，932 ；3，817，837 和 4，233，402。如上所述，本發(fā)明的聯(lián)合治療能解決與B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥的已知療 法，包括用利妥昔單抗(以商品名Rituxan⑧市售)治療相關的問題。利妥昔單抗已經(jīng)顯 示能有效治療低級、中級和高級非霍奇金淋巴瘤(NHL)，并且在其它B細胞惡性腫瘤中具有 活性(參見例如，Maloney 等(1994)Blood84 :2457_2466)，McLaughlin 等(1998) J Clin. Oncol 16 :2825-2833， Maloney 等(1997)Blood 90 :2188_2195， Hainsworth 等(2000) Blood 95:3052-3056，Colombat 等(2001)Blood 97 101-106，Coiffer 等(1998)Blood 92 1927-1932),Foran 等(2000)J. Clin. Oncol. 18 :317_324，Anderson 等(1997)Biochem. Soc. Trans. 25 :705_708，或 Vose 等(1999) Ann. Oncol. 10 :58a)。利妥昔單抗被批準用于治 療復發(fā)性低級B細胞瘤或濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)。然而，一些患者逐漸對利妥昔《治 療產生耐藥性(參見 Witzig 等(2002) J Clin. Oncol. 20 3262, Grillo-Lopez 等(1998) J Clin. Oncol. 16 :2825，或 Jazirehi 等(2003)Mol. CancerTher. 2 1183-1193) 例如，經(jīng) 抗-CD20抗體治療后，一些患者的惡性B細胞不表達CD20 (Davis等(1999)Clin. Cancer Res. 5 611)。而且，30% -50%低級NHL患者對此單克隆抗體沒有臨床反應(Hainsworth 等(2000)Blood 95 3052-3056 ；CoIombat 等(2001)Blood97 101-106)。對此種單克隆抗 體產生耐藥性的患者，或對此抗體初次治療即有耐藥性的B-細胞淋巴瘤患者需要采用其 它形式的治療干預。用利妥昔單抗治療后復發(fā)的患者也需要其他療法。發(fā)現(xiàn)與利妥昔單抗 相比，治療活性、特別是抗腫瘤活性優(yōu)異的抗體可顯著改善B細胞腫瘤生長相關的疾病或 病癥，如B細胞淋巴瘤，尤其是B細胞非霍奇金淋巴瘤的治療方法。在一些實施方式中，例如，當在人淋巴瘤或骨髓瘤細胞系的裸小鼠異種移植瘤模 型中用等量的抗體測定抗腫瘤活性時，本發(fā)明聯(lián)合治療提供的治療效果遠高于利妥昔單 抗。在其他實施方式中，例如，當在人淋巴瘤或骨髓瘤細胞系的裸小鼠異種移植瘤模型中用 等量的抗體測定抗腫瘤活性時，本發(fā)明聯(lián)合治療提供的治療效果遠高于利妥昔單抗和CHOP 聯(lián)合治療(通常稱為R-CH0P)。合適的裸小鼠異種移植腫瘤模型包括采用人伯基特淋巴瘤細胞系(稱為納瑪 (Namalwa)和道迪)模型。優(yōu)選的實施方式在用人道迪淋巴瘤細胞系產生各種階段的裸小 鼠異種移植腫瘤模型中檢測抗腫瘤活性。與不分階段的模型相比，采用道迪淋巴瘤細胞系 產生的各種階段裸小鼠異種移植腫瘤模型能更有效地區(qū)分給定抗體的療效，因為在分階段 模型中，只在腫瘤達到可測定大小后開始給予抗體。在不分階段的模型中，通常約在腫瘤接種1天內至出現(xiàn)可觸知腫瘤之前開始給予抗體。在分階段模型中某抗體效力若優(yōu)于利妥昔 單抗或R-CHOP (即治療活性提高)則強烈表明該抗體比利妥昔單抗療效更好。而且，在道 迪模型中，利妥昔單抗靶向的抗-⑶20在細胞表面的表達水平高于⑶40。在本文的實施例中，發(fā)明人采用了 RL(ATCC ；CRL-2261)和SU-DHL-4(DSMZ ；ACC 495)人B細胞淋巴瘤細胞系。據(jù)報道，這些細胞系為EB病毒基因組陰性，不同于本領域所 用的許多常見淋巴瘤細胞系。當解釋實驗數(shù)據(jù)時，由于對這些細胞系中的致癌性EBV信號 傳導的影響，采用EB病毒陽性細胞系可能產生問題。發(fā)明人專門選擇了 EBV陰性的RL和 SU-DHL-4淋巴瘤細胞系，這樣可更好地保證結果，即對人類治療效果預測的真實性。因此，在一些實施方式中，例如，當在對EB病毒基因組陰性的人淋巴瘤細胞系的 裸小鼠異種移植腫瘤模型中用等量的抗體測定抗腫瘤活性時，本發(fā)明聯(lián)合治療提供的治療 效果遠高于利妥昔單抗。在進一步的實施方式中，例如，當在對EB病毒基因組陰性的人淋 巴瘤細胞系的裸小鼠異種移植腫瘤模型中用等量的抗體測定抗腫瘤活性時，本發(fā)明聯(lián)合 治療提供的治療效果遠高于利妥昔單抗和CHOP聯(lián)合治療。在這些實施方式中可用RL或 SU-DHL-4淋巴瘤細胞系?！暗攘俊钡目笴D40抗體和利妥昔單抗指每單位體重或每單位體積給予相同的毫克 劑量。因此，當腫瘤模型小鼠每kg體重給予0. Olmg該抗CD40抗體時，也可給予小鼠每kg 體重0.0 Img的利妥昔單抗?？贵w效力的另一種差異是在體外測定NK細胞存在時獲得腫瘤細胞最大裂解所需 的抗體濃度。例如，抗CD40抗體最大裂解道迪細胞的EC50低于利妥昔單抗?jié)舛鹊?/2，優(yōu) 選低于1/4，最優(yōu)選低于1/10。因此，在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)試驗中，抗CD40抗體 或其抗原結合片段的效力遠高于等量利妥昔單抗，如WO 2007/053767所述，試驗包括在相 關抗體存在下培育CD40表達細胞和CD20表達細胞與分離的人自然殺傷(NK)細胞的試驗。本發(fā)明采用抗CD40抗體治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥。給予治療有效濃度的本發(fā)明抗CD40抗體來治療表達CD40的腫瘤B細胞相關疾病 或病癥。為了實現(xiàn)這一目標，可用本領域已知的各種可接受的運載體和/或賦形劑配制該 抗體。通過胃腸道外給藥途徑給予抗CD40抗體。一般通過靜脈內或皮下注射給予該抗體。 本領域普通技術人員知道進行這種給藥的方法。優(yōu)選靜脈內輸注給藥一段時間，此時間約少于1小時至10小時(更優(yōu)選少于1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10小時)?？稍谝欢螘r間，即約少于1小時至6小時，包括例如，約1-4
小時，約1-3小時，或者約1-2小時后繼續(xù)輸注給藥。或者，可皮下給藥。配制本發(fā)明藥物組合物使其與預計的給藥途徑相容。用于胃腸道外給藥的溶液或 懸液可包含以下組分無菌稀釋液如注射用水、鹽水溶液；抗菌劑如芐基醇或對羥基苯甲 酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸 檬酸鹽或磷酸鹽以及調節(jié)張力的物質如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A如鹽酸或氫氧化鈉調 節(jié)PH。可將胃腸道外制劑裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小藥瓶中。一般用標準技術提供用藥學上可接受的緩沖液，如無菌鹽水、無菌緩沖液或其組 合等配制的抗CD40抗體。制備胃腸外給藥藥劑的方法描述見《雷明頓藥物科學與實踐》 (Remington :The Science and Practice of Pharmacy)(第 21 版，Lffff 出版社(Lippincott Williams & Wilkins)，2005年5月)。也參見例如W098/56418，它描述了適合用于本發(fā)明方法的穩(wěn)定抗體藥物制劑。本領域普通技術人員不難確定至少一種抗CD40抗體的給藥劑量。影響給藥方式 和至少一種抗⑶40抗體的給藥劑量的因素包括但不限于疾病嚴重程度、所治療個體的病 史、年齡、身高、體重、健康狀況、疾病類型和身體狀況對抗體輸注的反應。相似地，抗CD40 抗體的給藥量將取決于給藥方式和給予此種抗腫瘤藥物是單劑量還是多劑量。通常，隨著 所治療對象的體重增加，優(yōu)選給予更高劑量的抗CD40抗體。給予抗CD40抗體的單劑量范圍是從約0. lmg/kg至約35mg/kg、從約0. 5mg/kg至 約 30mg/kg、從約 lmg/kg 至約 30mg/kg、從約 3mg/kg 至約 30mg/kg、從約 3mg/kg 至約 25mg/ kg、從約3mg/kg至約20mg/kg、或從約5mg/kg至約15mg/kg。因此，例如，該劑量可以是 0. 3mg/kg、0. 5mg/kg、lmg/kg、1. 5mg/kg、2mg/kg、2. 5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、IOmg/ kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg 或 35mg/kg,或者屬于約 0. 3mg/kg_50mg/kg 范圍內 的其它劑量。用治療有效量的抗體治療對象，包括一次治療，或者優(yōu)選包括一系列治療。因此， 本發(fā)明所述方法可包括給予多次劑量的抗⑶40抗體。該方法包括給予1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治療有效的分開給藥的含抗CD40抗體的藥物組合物。 本領域技術人員無需過多試驗即可容易地確定給予多劑量含抗CD40抗體的藥物組合物的 頻率和持續(xù)時間。在治療過程中可給予相同治療有效量的抗CD40抗體。或者，在治療過程 中可給予不同治療有效量的抗CD40抗體。在一個實施例中，用抗⑶40抗體治療對象，劑量范圍是約0. l_20mg/kg體重，在約 1-10周，優(yōu)選約2-8周，更優(yōu)選約3-7周，更優(yōu)選約4、5或6周中每周給藥一次?？梢悦块g 隔2-12個月進行治療以防止復發(fā)，或者一旦有復發(fā)跡象立即給藥。應理解，在具體治療過 程中可能提高或降低用于治療的抗體有效劑量?？筛鶕?jù)診斷試驗結果而改變劑量。因此，在一個實施方式中，給藥方案包括先在治療期間的第1、8、15和22天給予治 療有效劑量的至少一種抗⑶40抗體。在另一實施方式中，給藥方案包括先在治療期間每天，或一周的第1、3、5和7天給 予治療有效劑量的至少一種抗⑶40抗體；包括先在治療期間一周的第1和3-4天給予治療 有效劑量的至少一種抗CD40抗體的給藥方案；和先在治療期間一周的第1天給予治療有 效劑量的至少一種抗CD40抗體的優(yōu)選給藥方案。治療時間包括至少1周、至少2周、至少 3周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少6個月或至少1年。治療時間可以是連續(xù) 的，或者互相間隔至少1周、至少2周、至少1個月、至少3個月、至少6個月或至少1年。在其它實施方式中，如本文所述抗CD40抗體的初始治療有效劑量可以是較低劑 量范圍(即約0. 3mg/kg-20mg/kg)，后續(xù)劑量為較高劑量范圍(即約20mg/kg-50mg/kg)。在其它實施方式中，如本文所述抗CD40抗體的初始治療有效劑量可以是較高劑 量范圍(即約20mg/kg-50mg/kg)，后續(xù)劑量為較低劑量范圍(即0. 3mg/kg-約20mg/kg)。 因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，可通過將“加載劑量”的抗體給予需要治療的對象啟動 抗CD40抗體治療?！凹虞d劑量”指給予對象的抗CD40抗體的初始劑量，其所給抗體的劑量 屬于較高劑量范圍(即約20mg/kg-50mg/kg)?？赏ㄟ^一次給藥(例如IV —次輸注給予該 抗體)或多次給藥(例如IV多次輸注給予該抗體)給予“加載劑量”，只要在約24小時內 給予所有“加載劑量”。給予“加載劑量”后，再給予該對象一次或多次治療有效劑量的抗CD40抗體?？砂凑彰恐芙o藥方案，或者每兩周一次、每三周一次、每四周一次給予后續(xù)治療 有效劑量。在這類實施方式中，后續(xù)治療有效劑量通常屬于較低劑量范圍(即0. 3mg/kg-約 20mg/kg)?；蛘撸谝恍嵤┓绞街?，在給予“加載劑量”后按照“維持方案”給予后續(xù)治療有 效劑量的抗CD40抗體，所述治療有效劑量的抗體每月給予一次、每6周給予一次、每兩個月 給予一次、每10周給予一次、每三個月給予一次、每14周給予一次、每4個月給予一次、每 18周給予一次、每5個月給予一次、每22周給予一次、每六個月給予一次、每7個月給予一 次、每8個月給予一次、每9個月給予一次、每10個月給予一次、每11個月給予一次或者每 12個月給予一次。在這類實施方式中，抗CD40抗體的治療有效劑量為較低劑量范圍(即 0. 3mg/kg-約20mg/kg)，特別是以較高頻率間隔(如每2周一次至每月一次)，或者屬于較 高劑量范圍(即約20mg/kg-約50mg/kg)給予后續(xù)劑量；特別是以較低頻率間隔(如給藥 間隔約為1個月-12個月)給予后續(xù)劑量。用于本發(fā)明方法的本文所述藥物組合物中存在的抗CD40抗體可以是天然抗體， 或重組技術獲得的抗體，也可來自任何來源，包括哺乳動物來源，如，小鼠、大鼠、兔、靈長動 物、豬和人。這類多肽優(yōu)選衍生自人來源，更優(yōu)選雜交瘤細胞系產生的重組人蛋白。本發(fā)明方法可采用含有作為治療活性組分的具有本文所述結合特性的抗CD40抗 體的任何藥物組合物。因此，可將含有一種或多種抗CD40抗體的液體、凍干或噴霧干燥的 組合物制備成水性或非水性溶液或懸液，便于隨后按照本發(fā)明方法給予對象。這些組合物 各自包含至少一種抗⑶40抗體，作為治療或預防活性組分?！爸委熁蝾A防活性組分”指將抗 ⑶40抗體特地摻入組合物中以產生所需的治療或預防反應，將該藥物組合物給予對象，治 療、預防或診斷該對象的疾病或病癥。所述藥物組合物優(yōu)選包含合適的穩(wěn)定劑、填充劑或二 者，以最大程度減少制備和儲存期間與蛋白質穩(wěn)定性和生物學活性損失有關的問題?？蓪⑴浞街苿?formulant)加入到含有抗⑶40抗體的藥物組合物中。這些配方 制劑可包括但不限于油、聚合物、維生素、糖、氨基酸、鹽、緩沖劑、白蛋白、表面活性劑或填 充劑。糖優(yōu)選包括糖或糖醇，如單糖、二糖或多糖，或者水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括 果糖、葡萄糖、海藻糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、右旋糖苷、支鏈淀粉、糊精、α和 β環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素，或它們的混合物?！疤谴肌倍x為含有 羥基的C4-C8烴，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。這 些糖或糖醇可單獨或聯(lián)合使用。糖或糖醇濃度為1. 0% -7% w/v，更優(yōu)選2. 0% -6. 0% w/ V0氨基酸優(yōu)選包括肉毒堿、精氨酸和甜菜堿的左旋(L)形式；然而，可加入其它氨基酸。 優(yōu)選的聚合物包括平均分子量為2，000-3，000的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或平均分子量為 3，000-5，000的聚乙二醇(PEG)?？杉尤朐撝苿┑谋砻婊钚詣┮奅P號270，799和268，110。摻入藥物組合物的配方制劑應為抗CD40抗體提供穩(wěn)定作用。即抗CD40抗體應保 留其物理和/或化學穩(wěn)定性并具有所需生物學活性，即一種或多種本文所定義的拮抗劑活 性。本領域熟知監(jiān)測蛋白質穩(wěn)定性的方法。參見例如，Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10 :29_90 ;Lee 編(1991)Peptide and Protein Drug Delivery (月太禾口蛋白 質藥物遞送)(馬賽代克公司(Marcel Dekker，Inc.)，紐約州紐約)；以及下文所述的穩(wěn)定 性試驗。通常，測定蛋白質在所選溫度下特定時間內的穩(wěn)定性。在優(yōu)選實施方式中，穩(wěn)定的抗體藥物制劑室溫(約25°C)儲存可提供穩(wěn)定的抗CD40抗體至少1個月、至少3個月或 至少6個月，和/或約2-8°C儲存可穩(wěn)定至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少18個 月、至少24個月。配制在藥物組合物中時，如果在給定時間點該藥物組合物不出現(xiàn)可見的沉淀、聚 集和/或變性現(xiàn)象(如褪色或不澄清)或可檢測跡象(例如，用分子大小排阻層析(SEC) 或UV光散射檢測)，則認為該蛋白質如抗體保持了其物理穩(wěn)定性。就化學穩(wěn)定性而言，如果 配制在藥物組合物中時，在給定時間點化學穩(wěn)定性的測定表明該蛋白質(即抗體)在藥物 組合物中保持了感興趣的生物學活性，則認為該蛋白質如抗體保持了其化學穩(wěn)定性。監(jiān)測 化學穩(wěn)定性改變的方法是本領域眾所周知的，包括但不限于檢測蛋白質化學形式改變的 方法，例如采用(如)SDS-PAGE、SEC和/或基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜檢測蛋 白質剪切的結果；和采用(如)離子交換色譜檢測與分子電荷改變有關(例如，與脫酰胺有 關)的降解。參見例如，下文所述方法。當配制在藥物組合物中時，如果經(jīng)過所需生物學活性的合適試驗測定，在給定時 間點所需生物學活性是制備該藥物組合物時所需生物學活性的約30%、優(yōu)選約20%以內， 則認為抗CD40抗體保持了所需的生物學活性?？梢匀绫疚膶嵤├鰷y定抗CD40抗體 的所需生物學活性。也參見 Schultze 等(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 8200-8204 ； Denton 等(1998) Pediatr. Transplant. 2 6-15 ；Evans 等(2000)J. Immunol. 164 688-697 ；Noelle (1998)Agents Actions Suppl. 49 17-22 ;Lederman 等(1996)Curr. Opin. Hematol. 3 :77_86 ;Coligan 等(1991)Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom 等(1993) Immunology 79 :439_444 ；和美國專利號 5，674，492 和 5，847，082 所 述的試驗。在本發(fā)明的一些實施方式中，將抗CD40抗體配制成液體藥物制劑?？刹捎帽绢I域 已知方法，包括上文公開的方法制備抗⑶40抗體。可在CHO細胞系中重組產生抗⑶40抗 體。在配制成制劑之前儲存抗⑶40抗體期間，可凍存(如< 20°C )該抗體，然后室溫 融化進一步配制成制劑。所述液體藥物制劑包含治療有效量的抗CD40抗體。此制劑中的 抗體含量需要考慮給藥途徑和所需的劑量體積。以此方式，該液體藥物組合物包含濃度為約0. lmg/ml-50. Omg/ml、約0. 5mg/ ml-40. 0mg/ml、約 1. 0mg/ml-30. 0mg/ml、約 5. Omg/ml-25. 0mg/ml、約 5. 0mg/ml-20. Omg/ml 或約15. Omg/ml-25. Omg/ml的抗⑶40抗體。在一些實施方式中，該液體藥物組合物包含濃 度為約 0. lmg/ml-5. Omg/ml、約 5. Omg/ml-lO. Omg/ml、約 10. Omg/ml-15. Omg/ml、約 15. Omg/ ml-20. Omg/ml、約 20. Omg/ml-25. Omg/ml、約 25. 0mg/ml-30. Omg/ml、約 30. Omg/ml-35. Omg/ ml、約 35. 0mg/ml-40. Omg/ml、約 40. Omg/ml-45. Omg/ml 或約 45. 0mg/ml-50. Omg/ml 的抗 ⑶40抗體。在其它實施方式中，該液體藥物組合物包含濃度為約15. Omg/ml、約16. Omg/ml、 約 17. Omg/ml、約 18. Omg/ml、約 19. Omg/ml、約 20. Omg/ml、約 21. Omg/ml、約 22. Omg/ml、約 23. Omg/ml、約24. Omg/ml或約25. Omg/ml的抗CD40抗體。該液體藥物組合物包含抗CD40 抗體和緩沖液，將該制劑的PH維持在約pH 5. 0-pH 7. O的范圍，包括約pH 5. 0,5. 1,5. 2、 5. 3、5· 4、5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9、7· O。在一 些實施方式中，所述緩沖液將該制劑的PH保持在約pH 5. 0-pH 6. 5、約pH 5. 0-pH 6. O、約pH 5. 0-ρΗ 5. 5、約 pH 5. 5-7. 0、約 pH 5. 5-pH 6. 5 或約 pH 5. 5-pH 6. 0 的范圍內。該制劑中可采用將液體抗⑶40抗體制劑的pH維持在約pH 5. 0-ρΗ 7. 0范圍內的 任何合適緩沖劑，只要如上所述保持該抗體的理化穩(wěn)定性和所需生物學活性。合適的緩沖 劑包括但不限于常用酸和其鹽，其中抗衡離子可以是(例如)鈉、鉀、銨、鈣或鎂?？捎糜?緩沖該藥物液體制劑的常用酸和其鹽的例子包括但不限于琥珀酸或琥珀酸鹽、檸檬酸或 檸檬酸鹽、乙酸或乙酸鹽、酒石酸或酒石酸鹽、磷酸或磷酸鹽、葡糖酸或葡糖酸鹽、谷氨酸或 谷氨酸鹽、天冬氨酸或天冬氨酸鹽、馬來酸或馬來酸鹽以及蘋果酸或蘋果酸鹽緩沖劑。該制 劑內的緩沖液濃度可以是約lmM-50mM，包括約lmM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、 30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或者約lmM-50mM范圍內的其它值。在一些實施方式中，該制 劑內的緩沖液濃度為約 5mM-15mM，包括約 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、llmM、12mM、13mM、 14mM、15mM,或者約5mM-15mM范圍內的其它值。在本發(fā)明的一些實施方式中，該液體藥物制劑包含治療有效量的抗CD40抗體和 濃度能使制劑PH維持在約pH 5. 0-ρΗ 7. 0，優(yōu)選約pH 5. 0-ρΗ 6. 5范圍內的琥珀酸鹽緩沖 劑或檸檬酸鹽緩沖劑?！扮晁猁}緩沖液”或“檸檬酸鹽緩沖液”分別指含有琥珀酸鹽或檸 檬酸鹽的緩沖液。在一優(yōu)選實施方式中，琥珀酸或檸檬酸鹽抗衡離子是鈉陽離子，因此該 緩沖液分別是琥珀酸鈉或檸檬酸鈉。然而，預計任何陽離子均有效。其它可能的琥珀酸鹽 或檸檬酸鹽陽離子包括但不限于鉀、銨、鈣和鎂。如上所述，該制劑內琥珀酸鹽或檸檬酸 鹽緩沖液濃度可以為約 lmM-50mM，包括約 lmM、2mM、5mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、 35mM、40mM、45mM、50mM或約lmM-50mM范圍內的其它值。在一些實施方式中，該制劑內的緩 沖液濃度為約 5mM-15mM，包括約 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、llmM、12mM、13mM、14mM 或約 15mM。在其它實施方式中，該液體藥物制劑包含濃度為約0. lmg/ml-50. Omg/ml或約5. Omg/ ml-25. Omg/ml的抗CD40抗體，和濃度為約lmM-20mM、約5mM-15mM，優(yōu)選約IOmM的琥珀酸鹽 或檸檬酸鹽緩沖液，如琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖液。理想地該液體藥物制劑接近等滲，含有抗CD40抗體和緩沖液的液體藥物制劑還 可包含可使該制劑接近等滲的足量等滲劑。“接近等滲”指水性制劑的摩爾滲透壓為約 240mmol/kg-360mmol/kg,優(yōu)選約 240-340mmol/kg，更優(yōu)選約 250-330mmol/kg，甚至更優(yōu)選 約260-320mmol/kg，還要優(yōu)選約270-310mmol/kg。本領域技術人員了解測定溶液等滲的方法。本領域技術人員熟悉用于向藥物組合物提供等滲性的各種藥學上可接受的溶質。 等滲劑可以是能調節(jié)本發(fā)明液體藥物制劑的滲透壓至接近體液相同值的任何試劑。需要使 用生理上可接受的等滲劑。因此，含有治療有效量的抗CD40抗體和緩沖液的液體藥物制劑 還可包含可用于提供等滲性的組分，如氯化鈉；氨基酸如丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸；糖和糖 醇(多元醇)，包括但不限于葡萄糖、右旋糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、海藻糖、甘油、山 梨糖醇和木糖醇；乙酸、其它有機酸或其鹽，以及相對少量的檸檬酸鹽或磷酸鹽。本領域普 通技術人員知道適合提供液體制劑的最優(yōu)等滲強度的其它試劑。在一些優(yōu)選實施方式中，含有抗CD40抗體和緩沖液的液體藥物制劑還含有氯 化鈉作為等滲劑。該制劑中的氯化鈉濃度取決于其它組分對滲透性的貢獻。在一些實 施方式中，氯化鈉濃度為約 50mM-300mM、約 50mM-250mM、約 50mM-200mM、約 50mM-175mM、 約 50mM-150mM、約 75mM-175mM、約 75mM-150mM、約 100mM-175mM、約 100mM-200mM、約100mM-150mM、約 125mM-175mM、約 125mM-150mM、約 130mM-170mM、約 130mM-160mM、約 135mM-155mM、約140mM-155mM或約145mM-155mM。在一個這類實施方式中，氯化鈉濃度為 約150mM。在其它這類實施方式中，氯化鈉濃度為約150mM，緩沖液是濃度約為5mM-15mM的 琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖液，該液體藥物制劑含有治療有效量的抗CD40抗體，該制劑的pH 為約pH 5. 0-ρΗ 7. Oj^JpH 5. 0-ρΗ 6. 0或約pH 5. 5-pH 6.5。在其它實施方式中，該液體 藥物制劑含有濃度為約0. lmg/ml-50. Omg/ml或約5. Omg/ml-25. Omg/ml的抗CD40抗體、約 150mM氯化鈉和約IOmM琥珀酸鈉或檸檬酸鈉，pH為約pH 5. 5?？蓪⒈砻婊钚詣饺氡景l(fā)明液體藥物制劑中，以降低溶液_空氣界面上的表面張 力，從而抑制加工該制劑期間凍融或機械剪切引起的蛋白質降解。因此，在一些實施方式 中，該液體藥物制劑含有治療有效量的抗CD40抗體、緩沖液，還包含表面活性劑。在其它實 施方式中，該液體藥物制劑含有抗CD40抗體、緩沖液、等滲劑，還含有表面活性劑。所用的表面活性劑一般是非離子型表面活性劑，包括聚氧乙烯山梨糖醇酯，如 聚山梨酯80 (吐溫80)和聚山梨酯20 (吐溫20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯如普朗尼克 F68 ；聚氧乙烯醇如Bri j35 ；硒甲硅油；聚乙二醇如PEG400 ；溶血磷脂酰膽堿；和聚氧乙 烯-對-叔-辛基酚如Triton X-100。用表面活性劑或乳化劑使藥物穩(wěn)定的經(jīng)典方法參 見例如，Levine 等(1991) J Parenteral Sci. Technol. 45(3) :160_165。用于實施本發(fā)明 的優(yōu)選表面活性劑是聚山梨酯80。當包含表面活性劑時，加入量一般為約0. 001% -1. 0% (w/v)、約 0. 001% -0.5%、約 0. 001% -0. 4%、約 0. 001% _0.3%、約0· 001% -0.2%、約 0. 005%-0. 5%、約0. 005%-0. 2%、約0. 01%-0. 5%、約0. 01%-0. 2%、約0. 03%-0. 5%, 約 0. 03% -0. 3%、約 0. 05% -0. 5%或約 0. 05% -0. 2% 0因此，在一些實施方式中，該液體藥物制劑含有治療有效量的抗CD40抗體，和濃 度為約lmM-50mM、約5mM-25mM或約5mM-15mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉緩沖液；該制劑的 PH為約pH 5. 0-ρΗ 7. 0、約pH 5. 0-ρΗ 6. 0或約pH 5. 5-pH 6. 5 ；該制劑還包含含量為約 0.001% -1.0%或約0.001% -0.5%的表面活性劑，如聚山梨酯80。這類制劑可任選地 含有等滲劑，如濃度為約50mM-300mM、約50mM-200mM或約50mM-150mM的氯化鈉。在其它 實施方式中，該液體藥物制劑含有濃度為約0. lmg/ml-50. Omg/ml或約5. Omg/ml-25. Omg/ ml的抗⑶40抗體，包括約20. Omg/ml的抗⑶40抗體；約50mM-200mM的氯化鈉，包括約 150mM氯化鈉；約5mM-20mM的琥珀酸鈉或檸檬酸鈉，包括約IOmM琥珀酸鈉或檸檬酸鈉； 濃度為約50mM-200mM的氯化鈉，包括約150mM氯化鈉；和任選的表面活性劑，如含量為約 0. 001% -1.0%的聚山梨酯80，包括約0. 001% -0.5%聚山梨酯80 ；該液體藥物制劑的 pH 為約 pH 5. 0-ρΗ 7. 0、約 pH 5. 0-ρΗ 6. 0、約 pH 5. 0-ρΗ 5. 5、約 pH 5. 5-pH 6. 5 或約 pH 5. 5-pH 6. 0。該液體藥物制劑可基本不含如上所述的任何防腐劑和其它運載體、賦形劑或穩(wěn)定 劑?；蛘撸撝苿┛珊幸环N或多種防腐劑，例如，上文所述的抗菌劑、藥學上可接受的運載 體、賦形劑或穩(wěn)定劑，只要它們不會對抗CD40抗體的理化穩(wěn)定性造成不良影響。可接受的 運載體、賦形劑和穩(wěn)定劑的例子包括但不限于其它緩沖劑、助溶劑、表面活性劑、抗氧化劑 (包括抗壞血酸和甲硫氨酸)、螯合劑如EDTA、金屬絡合物(如鋅_蛋白質絡合物)和可生物 降解的聚合物如聚酯。關于藥學上可接受的運載體、穩(wěn)定劑和等滲劑(isomolyte)的配方 和選擇的充分討論可參見《雷明頓藥物科學與實踐》(第21版，Lffff (Lippincott ffilliams&Wilkins)出版社，2005 年 5 月)。本文所用的“運載體”包括在所用劑量和濃度對接觸的細胞或哺乳動物無毒性的 藥學上可接受的運載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。生理上可接受的運載體常常是PH緩沖水溶液。 生理上可接受的運載體的例子包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和其它有機酸；抗 氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或 免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、精 氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA ；糖醇如甘 露醇或山梨糖醇；形成鹽的抗衡離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑如吐溫、聚乙二醇 (PEG)和普朗尼克。制備本文所述的液體藥物制劑或其它藥物組合物后，可將其凍干以防止降解。本 領域普通技術人員知道凍干液體組合物的方法。臨用前，可用無菌稀釋液(如林格氏溶液、 蒸餾水或無菌鹽水)重建該組合物，所述無菌稀釋液可含有其它成分。重建后，優(yōu)選用本領 域技術人員已知的方法將該組合物給予對象。含有抗⑶40抗體的藥物組合物可以是如以WO 2007/124299公開的共有國際專利 申請?zhí)朠CT/US2007/066757中所述的組合物。具體說，用于本發(fā)明聯(lián)合治療的藥物組合物 可包含⑴抗-⑶40抗體，(ii)將組合物的pH維持在約pH 5. 0和pH 7. 0之間的緩沖劑， 和(iii)含量足以使液體組合物接近等滲的精氨酸-HC1。這些組合物中的緩沖劑可以是檸 檬酸鹽/檸檬酸緩沖劑。所述組合物可進一步包含非離子表面活性劑和/或L-甲硫氨酸 作為進一步的穩(wěn)定劑。該組合物的摩爾滲透壓約為240-360mmol/kg。緩沖劑的濃度可以為 約5mM至約IOOmM,約5mM至約20mM，或約5mM至約15mM(例如，IOmM)。該組合物的pH為 pH 5. 0—pH 6. 0 (例如，約pH 5. 5)。該組合物可含有濃度約50mM至約200mM或從IOOmM 至約175mM(例如，約150mM)的精氨酸-HC1。該組合物還可包含表面活性劑，例如，濃度為 約0.001%至約1.0% (w/v)，或者約0.025%至約0. (w/v)的聚山梨酯。該組合物可進 一步含有濃度約0. 5mM至約20. OmM或約1. OmM至約20. OmM(例如，約5. OmM)的甲硫氨酸。 所述抗-⑶40抗體在組合物中的含量為約0. lmg/ml至約50. Omg/ml，或約1. Omg/ml至約 35. Omg/ml，或約 10. Omg/ml 至約 35. Omg/ml。本發(fā)明還涉及采用化療劑環(huán)磷酰胺(商品名Cytoxan)、多柔比星(商品名 Adriamycin)，長春新堿(商品名Oncovin)和強的松(商品名Deltasone) 0這四種化療劑 聯(lián)用稱為CHOP。通常用CHOP方案治療非霍奇金淋巴瘤患者，將CHOP作為彌散性大B細胞 淋巴瘤(DLBCL)患者的標準療法已有25年以上(Feugier等(2005) J. Clin. Oncol. 23(18) 4117-4126 ；Habermann 等(2006) J. Clin. Oncol. 24(19) :3121_3127)。已聯(lián)用 CHOP 與利妥 昔單抗來治療 DLBCL(Feugier 等(2005) J. Clin. Oncol. 23(18) :4117_4126 ；Habermann 等 (2006)J. Clin. Oncol. 24(19) :3121_3127)。CHOP是三種化療藥物(環(huán)磷酰胺、多柔比星和長春新堿)與一種類固醇(強的松) 聯(lián)用。CHOP化學療法伴有許多副作用，最常見的是疲勞、血細胞計數(shù)減少(由于影響骨髓)、 惡心、脫發(fā)、不孕、口瘡和潰瘍、食欲喪失和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(例如，發(fā)麻和針刺感或腹痛)。本 發(fā)明方法采用較低劑量的CHOP方案從而能減輕或消除這些副作用中的一種或多種。因此， 在一些實施方式中，本發(fā)明的方法、應用、組合物和藥盒可用于治療人類患者的B細胞腫瘤 生長相關疾病或病癥，同時可避免或減輕與CHOP給藥通常相關的一種或多種副作用。
本發(fā)明的聯(lián)合治療采用較低劑量的抗CD40抗體從而能減輕或消除與抗CD40抗體 給藥相關的一種或多種副作用。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明的方法、應用、組合物和藥 盒可用于治療人類患者的B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥，同時避免或減輕與抗CD40抗體 給藥通常相關的一種或多種副作用。本發(fā)明方法可采用含有CHOP組分作為治療活性組分的任何藥物組合物。這些組 合物將含有一種或多種CHOP組分以及藥學上可接受的運載體或賦形劑，例如，本文其他地 方所述的藥學上可接受的運載體或賦形劑。合適的藥物組合物是本領域眾所周知的。“治 療活性組分”指將相關治療劑特地摻入該組合物中以產生所需的治療反應，從而將該藥物 組合物給予對象時可治療該對象的疾病或病癥?？山o予“治療有效”濃度的CHOP組分以治 療腫瘤B細胞生長相關的疾病或病癥?？赏ㄟ^任何合適的給藥途徑給予CHOP組分。通常靜脈內給予環(huán)磷酰胺、多柔比星 和長春新堿藥，而強的松通?？诜o藥。本領域普通技術人員知道這種給藥的方法。通常循環(huán)治療給予CHOP，每輪循環(huán)包括第1天給予750mg/m2環(huán)磷酰胺，第1天給 予50mg/m2多柔比星，第1天給予1. 4mg/m2長春新堿，以及第1_5天給予100mg/m2強的松。 通常每3周(21天)重復一次這種循環(huán)。常規(guī)療程總共包括6-8輪循環(huán)。在本發(fā)明的方法、應用、組合物和藥盒中，環(huán)磷酰胺的用量為75-1000mg/m2，或 185-1000mg/m2,或 500-1000mg/m2，或 700-800mg/m2 (例如，750mg/m2)。多柔比星的用量為 5-70mg/m2,或 12_70mg/m2，或 35_70mg/m2，或 45_55mg/m2 (例如，50mg/m2)。長春新堿的用量 為 0. 1-2. Omg/m2，或 0. 7-2. Omg/m2，或 1. 0-2. Omg/m2，或 1. 0-1. 6mg/m2 (例如，1. 4mg/m2)。強 的松的用量為 10-130mg/m2，或 50_130mg/m2，或 65_130mg/m2，或 85_125mg/m2 (例如，IOOmg/ m2)。本領域技術人員能夠容易地選擇本發(fā)明聯(lián)合治療所用的合適的CHOP方案。在本發(fā)明的方法、應用、組合物和藥盒中，優(yōu)選每3周重復一次CHOP方案，但如果 需要也可每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、甚至每10周重復一次。本發(fā)明 的聯(lián)合治療可降低所用的CHOP劑量同時保持療效，從而能夠更加頻繁地重復該CHOP方案， 如每周或者每兩周重復一次?？山o予任何所需輪次的CHOP，例如1-20輪，優(yōu)選3-15輪，更 優(yōu)選5-10輪。術語“包括”包括“含有”以及“由...構成”。例如，“含有” X的組合物可僅由X 組成或可包含其它物質，例如X+Y。詞語“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。必要 時，可從本發(fā)明定義中刪去詞語"基本上"。與數(shù)值χ相關的術語“約”表示，例如，x± 10%?，F(xiàn)在只通過實施例方式更詳細地描述本發(fā)明的各個方面和實施方式。應理解，可 修改細節(jié)，但不背離本發(fā)明的范圍。實驗以下實施例所用的抗-⑶40抗體是單克隆抗體HCD122(以前稱為CHIR-12. 12)。 已經(jīng)描述過HCD122的制造、測序和特征。實施例1 :HCD122聯(lián)用CH0P(H_CH0P)的抗腫瘤活性人單克隆抗體HCD122和CHOP當單獨使用時已在RL和SU-DHL-4淋巴瘤模型中各 自顯示出有抗腫瘤效力。RL細胞系(ATCC ;CRL-2261)是從一名52歲白種男性NHL患者建立的一種人B細胞淋巴瘤細胞系。SU-DHL-4細胞系(DSMZ;ACC 495)是從一名38歲男性 B-NHL(彌散性大細胞、核裂細胞型)患者建立的一種人B細胞淋巴瘤細胞系。據(jù)報道，這些 細胞系為EB病毒基因組陰性，不同于本領域使用的許多常見淋巴瘤細胞系。當解釋實驗數(shù) 據(jù)時，由于對這些細胞系中致癌性EBV信號傳導的影響，采用EB病毒陽性細胞系可能會帶 來問題。發(fā)明人專門選擇了 EBV陰性的RL和SU-DHL-4淋巴瘤細胞系，這樣可更好地保證 結果的真實性。在RL彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)異種移植模型中評價了 HCD122與CHOP聯(lián)用 的活性，并與單用HCD122或單用CHOP的活性比較。HCD122和CHOP聯(lián)用下文稱為H-CH0P。 還將H-CHOP的療效與通常稱為R-CHOP的已知CHOP和嵌合型抗-⑶20單克隆抗體利妥昔 單抗聯(lián)用的療效進行了比較。材料和方法在CB17/SCID小鼠RL DLBCL異種移植模型中檢測了 HCD122與CHOP聯(lián)用的抗腫 瘤活性。將IOxIO6個RL細胞與等體積Matrigel 植入動物胸椎中線區(qū)域皮下，植入體積 為200 μ 1。當平均腫瘤體積達到150-200mm3時開始給予抗體(在圖1中表示為第1天)。 腹膜內注射分別給予HCD122、利妥昔單抗和陰性對照人IgGl抗體。所有單克隆抗體一周 給予一次，治療時間長度為4周。CHOP方案給藥的劑量和時間如下強的松0. 2mg/kg 口服 (ρ·ο·)第1-5天；環(huán)磷酰胺40mg/kg靜脈內(i.v.)第1天；多柔比星3. 3mg/kg，i. v.第 1天；長春新堿0.5mg/kg，i.v.第1天。各組η = 12。用數(shù)字卡尺測量腫瘤體積，先長度 后寬度。一旦看見腫瘤每周測量記錄兩次。用以下公式計算腫瘤體積和倍增時間，體積= LxW2/2。記錄動物體重計算每組的平均值。結果這些實驗的結果顯示于圖1和下表1和2。表1 第25天時的腫瘤生長抑制
權利要求
一種治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的方法，所述方法包括給予所述患者環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松(CHOP)并聯(lián)用抗 CD40抗體，其中所述抗 CD40抗體當與人B細胞表面CD40抗原結合時沒有顯著的激動活性，所述患者先前曾給予(i)CHOP，(ii)嵌合型抗 CD20單克隆抗體利妥昔單抗，或(iii)CHOP與利妥昔單抗聯(lián)合治療。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述疾病或病癥是用(i)CH0P，(ii)嵌合型 抗-CD20單克隆抗體利妥昔單抗，或(iii)CHOP與利妥昔單抗聯(lián)合治療難治的疾病。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者用(i)CHOP，(ii)嵌合型抗-CD20 單克隆抗體利妥昔單抗治療，或(iii)CHOP與利妥昔單抗聯(lián)合治療后疾病復發(fā)。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，同時給予患者CHOP和抗-CD40抗體。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，依次給予患者CHOP和抗-⑶40抗體。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，給予患者第一輪CHOP，然后給予患者第一劑 抗-⑶40抗體。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，給予患者第一劑抗-⑶40抗體，然后給予患 者第一輪CHOP。
8.—種藥物組合物，其包含(i)環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多 種，(ii)抗-CD40抗體，和(iii)藥學上可接受的運載體或賦形劑，其中所述抗-CD40抗體 當與人B細胞表面CD40抗原結合時沒有顯著的激動活性。
9.⑴環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種和(ii)抗-CD40抗 體在制造用于治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的藥物中的應用，其中所述 抗-CD40抗體當與人B細胞表面CD40抗原結合時沒有顯著的激動活性，所述患者先前曾給 予(i)CH0P，(ii)嵌合型抗-CD20單克隆抗體利妥昔單抗，或(iii) CHOP與利妥昔單抗聯(lián)合 治療。
10.⑴環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種和(ii)抗-CD40抗體 在制造用于B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者聯(lián)合治療的至少兩種單獨藥物中的 應用，其中所述抗-CD40抗體當與人B細胞表面CD40抗原結合時沒有顯著的激動活性，所 述患者先前曾給予(i)CH0P，(ii)嵌合型抗-CD20單克隆抗體利妥昔單抗，或(iii) CHOP與 利妥昔單抗聯(lián)合治療。
11.一種治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥人類患者的藥盒，所述藥盒裝有⑴環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松中的一種或多種；和( )抗-CD40抗體， 其中所述抗-CD40抗體當與人B細胞表面CD40抗原結合時沒有顯著的激動活性
12.如上述權利要求中任一項所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述疾 病或病癥選自急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病 (CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、幼淋巴細胞白血病(PLL)、小淋巴細胞白血病(SLL)、彌 散性小淋巴細胞白血病(DSLL)、彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、毛細胞白血病、非霍奇金 淋巴瘤、霍奇金病、EB病毒(EBV)誘導的淋巴瘤、骨髓瘤如多發(fā)性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨 球蛋白血癥、重鏈病、粘膜相關淋巴樣組織淋巴瘤、單核細胞樣B細胞淋巴瘤、脾臟淋巴瘤、 淋巴瘤樣肉芽腫病、血管內淋巴瘤病、免疫母細胞淋巴瘤和AIDS相關淋巴瘤。
13.如權利要求12所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述疾病或病癥是非霍奇金淋巴瘤。
14.如權利要求13所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述非霍奇金淋巴 瘤是彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
15.如上述權利要求中任一項所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述 抗-CD40抗體是結合人CD40抗原結構域2的單克隆抗體。
16.如上述權利要求中任一項所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述 抗-CD40抗體是結合含有SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9所示人CD40序列殘基82-87表位 的單克隆抗體。
17.如上述權利要求中任一項所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述 抗-CD40抗體選自a)保藏于ATCC的專利保藏物編號PTA-5543的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體 HCD122,；b)包含選自以下氨基酸序列SEQID NO :2所示序列、SEQ ID NO :4所示序列、SEQ ID NO :5 所示序列、SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :4 所示二序列以及 SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO: 5所示二序列的抗體；c)包含選自以下氨基酸序列SEQID NO 17所示序列、SEQ ID NO 19所示序列、SEQ ID NO :20 所示序列、SEQ ID N0:17 禾口 SEQ ID NO 19 所示二序列以及 SEQ ID N0:17 禾口 SEQ ID NO 20所示二序列的抗體；d)包含選自以下氨基酸序列SEQID NO :16所示序列、SEQ ID N0:18所示序列以及 SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 18所示二序列的抗體；e)含有選自以下核苷酸序列SEQID NO :1所示序列、SEQ ID NO :3所示序列以及SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示二序列的核酸分子編碼的氨基酸序列的抗體；f)含有包含SEQID NO 10所示的CDR-Ll氨基酸序列、SEQ ID NO 11所示的CDR-L2 氨基酸序列以及SEQ ID N0:12所示的⑶R-L3氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(Vj的抗體。g)含有包含SEQID NO 13所示的CDR-Hl氨基酸序列、SEQ ID NO 14所示的CDR-H2 氨基酸序列以及SEQ ID N0:15所示的CDR-H3氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(Vh)的抗體；和h)含有包含SEQID NO 10所示CDR-Ll氨基酸序列、SEQ ID NO 11所示CDR-L2氨基 酸序列和SEQ ID NO 12所示⑶R-L3氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(Vj，和包含SEQ ID NO: 13所示CDR-Hl氨基酸序列、SEQ ID NO 14所示CDR-H2氨基酸序列和SEQ ID NO 15所示 CDR-H3氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(Vh)的抗體。
18.如權利要求1-17中任一項所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述 抗-CD40抗體獲自含有一種或多種編碼該抗體的表達載體的CHO細胞。
19.如上述權利要求中任一項所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述 抗-CD40抗體是保藏于ATCC的專利保藏物編號PTA-5543的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗 體 HCD122(CHIR-12. 12)。
20.如權利要求1-18中任一項所述的方法、組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述 抗-CD40抗體是選自以下的抗原結合抗體片段Fab片段、F(ab' )2片段和Fv片段，其中 所述片段當與人B細胞表面CD40抗原結合時沒有顯著的激動活性。
21.一種防止或降低人B腫瘤細胞對CHOP細胞毒性產生耐藥方法，所述方法包括使一種或多種人B腫瘤細胞接觸抗-CD40抗體的步驟，其中所述抗-CD40抗體當與人B細胞表 面CD40抗原結合時沒有顯著的激動活性。
22.一種防止或降低人類患者B細胞對CHOP細胞毒性產生耐藥方法，所述方法包括給 予所述患者抗-CD40抗體的步驟，其中所述抗-CD40抗體當與人B細胞表面CD40抗原結合 時沒有顯著的激動活性。
23.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗體能下調B細胞 中CD40信號傳導所誘導的有助于B細胞對CHOP細胞毒性產生耐藥的NF-kB活化。
24.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗體能抑制B細胞 中CD40信號傳導誘導的有助于B細胞對CHOP細胞毒性產生耐藥的一種或多種細胞表面粘 附分子的表達。
25.如上述權利要求中任一項所述的組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述抗CD40抗 體是能夠下調B細胞中CD40信號傳導誘導的有助于B細胞對CHOP細胞毒性產生耐藥的 NF-kB活化的抗CD40抗體。
26.如上述權利要求中任一項所述的組合物、應用或藥盒，其特征在于，所述抗CD40抗 體是能夠抑制B細胞中CD40信號傳導誘導的有助于B細胞對CHOP細胞毒性產生耐藥的一 種或多種細胞表面粘附分子表達的抗CD40抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗CD40抗體在治療B細胞腫瘤生長相關疾病或病癥中的新應用。本發(fā)明特別可用于治療先前曾給予過(i)CHOP，(ii)嵌合型抗-CD20單克隆抗體利妥昔單抗，或(iii)CHOP與利妥昔單抗聯(lián)合治療的患者。
文檔編號A61P35/00GK101970003SQ200880124614
公開日2011年2月9日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權日2007年11月9日
發(fā)明者A·M·莫扎, M·盧克曼, S·J·徐, S·坎塔克, Y·王 申請人:諾華有限公司;愛克索馬技術有限公司