專利名稱：一種抗體保護劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體保護劑及其應(yīng)用，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
離子液體是指在室溫范圍內(nèi)(一般為100°C下)呈現(xiàn)液態(tài)的完全由離子構(gòu)成的物 質(zhì)體系。一般由有機陽離子和無機陰離子、有機陰離子組成，其性能主要由組成的陽離子和 陰離子共同決定。離子液體具有很多獨特的理化性能，經(jīng)測定，許多咪唑陽離子構(gòu)成的離子 液體的熱分解溫度高達400°C。由于離子液體的熔點一般低于100°C，因此其穩(wěn)定的液態(tài)范 圍可達300°C -400°C，這是普通溶劑無法比擬的。與傳統(tǒng)的有機溶劑不同，由于離子液體內(nèi) 部的庫侖引力較大，相當于水的10倍，其蒸汽壓幾乎察覺不到。離子液體隨其陰離子和陽 離子的不同呈現(xiàn)出一定的極性，對金屬絡(luò)合物具有很強的溶解能力，對于普通溶劑難以溶 解的氫化物(NaH、CaH 2)、碳化物、氮化物、硫化物以及各種氧化物的鹽類化合物，離子液體 也具有良好的溶解能力。由于離子液體所體現(xiàn)的優(yōu)良特性，在諸多領(lǐng)域越來越成為研究的熱點，如離子液 體在萃取分離、有機合成反應(yīng)、環(huán)境友好催化體系中的應(yīng)用，因此，被認為是一種具有廣闊 應(yīng)用前景的新型環(huán)境友好的綠色溶劑。有關(guān)離子液體與酶之間相互作用報道已有很多，例 如，酶在室溫離子液體里的活性、穩(wěn)定性、選擇性等等，但是，國內(nèi)外有關(guān)離子液體在抗體穩(wěn) 定性方面的研究卻未見報道。目前，常用小分子糖類物質(zhì)、表面活性劑等作為抗體保護劑， 但效果并不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了 一種抗體保護劑，可在室溫下保持抗體的穩(wěn)定。為解決上述技術(shù)問題，含有離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽、牛血 清蛋白、硫柳汞，pH為7. 4的PBS緩沖液；其中1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽濃度 為0. 05% _5%、牛血清蛋白含量為0. lg/L-3g/L、硫柳汞含量為0. 05g/L_lg/L。所述抗體保護劑，還包括濃度為10mmol/L-30mmol/L的CaCl2，濃度為200mmol/ L-600mmol/L的海藻糖。所述抗體保護劑，離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽(離子液體1-仲 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的微波輔助合成、晶體結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性，高等學?；瘜W學報， 2009，9，1814-1818)在抗體保護劑中其濃度為0. 05%-5% (體積比)，其優(yōu)選濃度為0.5%； 發(fā)明所用離子液體為自主合成；在裝有電動攪拌器、溫度計和高純氮氣的四口瓶中，加入等 摩爾(0.5mL)的3-甲基咪唑和重蒸過的溴代仲丁烷，水浴加熱，溶液由透明變?yōu)楦酄顣r停 止攪拌，加水溶解，棄去上層未反應(yīng)的原料，將中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至400mL燒杯中加入200mL丙 酮，攪拌，分批加入四氟硼酸鉀，加畢，繼續(xù)攪拌3h，過濾除溴化鉀，濾液減壓蒸餾除去丙酮， 得到無色離子液體，然后，采用紅外、紫外、核磁(1H-NMR)和電噴霧質(zhì)譜對離子液體進行表 征。
所述的pH緩沖液，采用PBS緩沖液，由磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉組成， 30-40°C水浴溶解后，冷卻至室溫，校正pH至7. 4。所述硫柳汞、CaCl2、海藻糖為常用防腐劑的成分。本發(fā)明提供的一種抗體保護劑，用于提高免疫學檢測的穩(wěn)定性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明應(yīng)用方法為，抗體保護劑與抗體按照1 1-3 1之 間的比例混合，混合后的復(fù)合物包被于裸金電極表面制作成為工作電極，工作電極用于免 疫學檢測。所述工作電極的制備方法為，金電極(直徑2mm)分別經(jīng)0. 3,0. 05 u m A1203懸濁 液拋光成鏡面后，依次用蒸餾水、無水乙醇、蒸餾水超聲5min，清洗后將電極置于室溫下晾 干備用；將一定量的羧基化碳納米管滴加于電極表面，于室溫下晾干備用；將上述抗體混 合液10 y L滴于電極表面，在37°C下吸附lh，蒸餾水洗凈晾干，在4°C下儲存?zhèn)溆谩Ｋ雒庖邔W檢測裝置工作原理在于，抗體包被于電極表面產(chǎn)生一定阻抗值，抗體 與檢測物中毒素結(jié)合后阻抗值發(fā)生變化，其變化與毒素濃度成正比，裝置采用CHI760C型 電化學工作站檢測阻抗值。所述CHI760C型電化學工作站，其本質(zhì)是用于控制和監(jiān)測電化學池電流和電位以 及其它電化學參數(shù)變化的儀器裝置，本發(fā)明用于檢測阻抗值的變化。所述抗體，為黃曲霉毒素抗體、金黃色葡萄球菌B型腸毒素抗體、藻毒素抗體或嘔 吐毒素抗體中任一一種，購自Sigma公司。所述毒素，為黃曲霉毒素、金黃色葡萄球菌B型腸毒素、藻毒素和嘔吐毒素中任 ——種，購自Sigma公司。所述免疫學檢測方法，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記；結(jié)合在固相 載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性， 又保留酶的活性；在測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。本發(fā)明將離子液體用于抗體保護劑的開發(fā)，研制出了一種新型、綠色、高效的抗體 保護劑，可使抗體在室溫下保藏依然保持較高的活性，抗體保護劑可與抗體混合包裹于裸 金電極表面制作成工作電極，安置于免疫學檢測裝置中，明顯提高了免疫學檢測裝置的穩(wěn) 定性和準確性。


圖1 應(yīng)用抗體保護劑后，檢測黃曲霉毒素的免疫學電化學檢測曲線。(在1X 10_2_2. 0 y g/L黃曲霉毒素濃度范圍內(nèi)，可產(chǎn)生良好線性，線性回歸方程為 Y = 1. 1649X+0. 1141，R2 = 0. 9982)圖2 應(yīng)用抗體保護劑后，檢測金黃色葡萄球菌B型腸毒素的免疫學電化學檢測曲 線。(在5X 10_3_1. 0 u g/L金黃色葡萄球菌B型腸毒素濃度范圍內(nèi)，可產(chǎn)生良好線性， 線性回歸方程為 Y = 1. 3055X+0. 0809，R2 = 0. 9989)圖3 應(yīng)用抗體保護劑后，檢測藻毒素的免疫學電化學檢測曲線。(在5X10_3-1.g/L藻毒素濃度范圍內(nèi)，可產(chǎn)生良好線性，線性回歸方程為Y =0. 9964X+0. 1063，R2 = 0. 99849)圖4 應(yīng)用抗體保護劑后，檢測嘔吐毒素的免疫電化學檢測曲線。(在5X10_3-1.Oy g/L嘔吐毒素濃度范圍內(nèi)，可產(chǎn)生良好線性，線性回歸方程為Y =1. 1309X+0. 1038，R2 = 0. 9965)
具體實施例實施例1 抗體效價的測定方法1)包被用0. 05mol/L, pH 9. 6碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋至1 4000， 100 u L/孔加到酶標板上，4°C冰箱過夜。2)封閉取出已包被好的酶標板，恢復(fù)至室溫后，用洗液洗滌2次，每次2分鐘，拍 干。加入3%的BSA-PBS溶液封閉，250 u L/孔，37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育2h。3)加入抗體將封閉好的酶標板取出，恢復(fù)至室溫，洗滌3次，依次加入用0. BSA-PBS抗體稀釋液，適當倍比稀釋濃度的抗體以及陰性血清，橫向分別加入lOOyl/孔， 37°C溫育 lh。4)加入酶標二抗取出以上酶標板，洗滌4次，將酶標羊抗兔抗體稀釋至工作濃度 1 5000，每空加入100 u L，37°C恒溫培養(yǎng)箱孵育30min。5)加入顯色液將上述酶標板取出，恢復(fù)到室溫后，洗滌4次后加入顯色液， 100 u L/ 孔，37°C溫育 15min。6)終止反應(yīng)取出酶標板，加終止液(2mol/L硫酸)，50 y L/孔。7)測定用酶標儀測定終止反應(yīng)后的各孔的0D450值。陽性血清的0D450彡陰性對照孔的2. 1倍并且0D450大于0. 1，此時的抗體稀釋倍 數(shù)即是該抗體的效價。實施例2 保護劑中離子液體濃度為0. 5%實驗組中離子液體濃度為0. 5% (體積比)，將保護劑與抗體血清(藻毒素抗體) 按照2 1體積比混合，對照組不添加保護劑，將兩組分分別在室溫下儲存12個月，其間， 每隔三個月取樣，進行效價測定。藻毒素保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽0.5%、 CaCl220mmol/L、海藻糖 500mmol/L、牛血清蛋白 lg/L、硫柳汞 0. lg/L。發(fā)現(xiàn)對照組抗體在3個月時，實驗組抗體效價未發(fā)生明顯變化，而對照組抗體效 價下降50 %，6個月時實驗組抗體依然保持活力，對照組抗體已經(jīng)腐敗變質(zhì)不能使用。12個 月后，實驗組依然保持98%的抗體活力，具體結(jié)果見表1。表1 :0. 5%離子液體時藻毒素抗體效價變化
5 實施例3 保護劑中離子液體濃度為0. 05%當離子液體濃度為0.5% (體積比)時，將抗體保護劑與抗體血清(藻毒素抗體) 按照2 1體積比混合，在室溫下儲存12個月，每隔三個月取樣，進行效價測定。藻毒素保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽0. 05%、 CaCl220mmol/L、海藻糖 500mmol/L、牛血清蛋白 lg/L、硫柳汞 0. lg/L。藻毒素抗體室溫下放置3個月后，藻毒素抗體依然保持100%的抗體活力；6個月 后，藻毒素抗體依然保持94%的抗體活力；9個月后，藻毒素抗體依然保持87. 5%的抗體活 力；12個月后，藻毒素抗體依然保持78 %的抗體活力，具體結(jié)果見表2。表2 0. 05%離子液體時藻毒素抗體效價變化 實施例4 保護劑中離子液體濃度為5%當離子液體濃度為5% (體積比)時，將抗體保護劑與抗體血清(藻毒素抗體)按 照2 1體積比混合，室溫下儲存12個月，其間，每隔三個月取樣，進行效價測定。上述藻毒素保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽5%、 CaCl220mmol/L、海藻糖 500mmol/L、牛血清蛋白 3g/L、硫柳汞 lg/L。藻毒素抗體室溫下放置3個月后，藻毒素抗體依然保持87. 5%的抗體活力；6個 月后，藻毒素抗體依然保持78 %的抗體活力；9個月后，藻毒素抗體依然保持75 %的抗體活 力；12個月后，藻毒素抗體依然保持62.5%的抗體活力，具體結(jié)果見表3。表3 離子液體時藻毒素抗體效價變化 實例5 保護劑與抗體比例1 1藻毒素保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑_六氟磷酸鹽0. 5% (體 積比)、CaCl220mmol/L、海藻糖500mmol/L、牛血清蛋白lg/L、硫柳汞0. lg/L。將藻毒素保護劑與藻毒素抗體按照1 1體積比進行混合，孵育在電極上制成修 飾電極，室溫下放置12個月，每個三個月再測定lppb藻毒素含量時，電極的阻抗響應(yīng)值。通過表4可見，室溫保存12個月，電極的阻抗響應(yīng)值下降了 50%。表4保護劑與抗體比例1 1時修飾電極阻抗響應(yīng)值的變化 實例6 保護劑與抗體比例2 1藻毒素保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑_六氟磷酸鹽0. 5% (體 積比)、CaCl220mmol/L、海藻糖500mmol/L、牛血清蛋白lg/L、硫柳汞0. lg/L。將藻毒素保護劑與藻毒素抗體按照2 1體積比進行混合，孵育在電極上制成修 飾電極，再測定lppb藻毒素含量時，電極的阻抗響應(yīng)值。通過表5可見，室溫保存12個月，電極的阻抗響應(yīng)值僅下降17%。表5保護劑與抗體比例2 1時修飾電極阻抗響應(yīng)值的變化 實例7 保護劑與抗體比例3 1
藻毒素保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑_六氟磷酸鹽0. 5% (體 積比)、CaCl220mmol/L、海藻糖500mmol/L、牛血清蛋白lg/L、硫柳汞0. lg/L。將藻毒素保護劑與藻毒素抗體按照3 1體積比進行混合，孵育在電極上制成修 飾電極，再測定lppb藻毒素含量時，電極的阻抗響應(yīng)值。通過表6可見，室溫保存12個月，電極的阻抗響應(yīng)值僅下降56%。表6保護劑與抗體比例3 1時修飾電極阻抗響應(yīng)值的變化 實施例8 免疫學檢測裝置的制備工作電極的制備金電極(直徑2mm)分別經(jīng)0. 3，0. 05 y m A1203懸濁液拋光成鏡面后，依次用蒸餾 水、無水乙醇、蒸餾水超聲5min，清洗后將電極置于室溫下晾干備用。將一定量的羧基化碳 納米管滴加于電極表面，于室溫下晾干備用。將上述抗體混合液10yL滴于電極表面，在 37°C下吸附lh，蒸餾水洗凈晾干，在4°C下儲存?zhèn)溆?。免疫學檢測裝置工作原理采用CHI760C型電化學工作站檢測阻抗值變化，三電極體系組成三電極體系組 成免疫電極為工作電極，飽和甘汞標準電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。抗體包被在 金電極表面，其存在一定阻抗值，抗體與檢測物中毒素結(jié)合后阻抗值發(fā)生變化，其變化與毒 素濃度成正比。實施例9 保護劑在黃曲霉毒素免疫學檢測裝置中的應(yīng)用抗體保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽0.5%、 CaCl220mmol/L、海藻糖 500mmol/L、牛血清蛋白 lg/L、硫柳汞 0. lg/L?？贵w保護劑與抗體按照2 1體積比混合，混合后將復(fù)合物包被于金電極表面制 作成工作電極，裝置其他部件按照實施例7中設(shè)計制作。建立黃曲霉毒素標準品與免疫學檢測阻抗值變化的關(guān)系，結(jié)果見附圖一， 在lX10_2-2.0i!g/L黃曲霉毒素濃度范圍內(nèi)，可產(chǎn)生良好線性，線性回歸方程為Y = 1. 1649X+0. 1141，R2 = 0. 9982。實施例10 保護劑在金黃色葡萄球菌B型腸毒素免疫學檢測裝置中的應(yīng)用抗體保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽0.5%、 CaCl220mmol/L、海藻糖 500mmol/L、牛血清蛋白 lg/L、硫柳汞 0. lg/L?？贵w保護劑與抗體按照2 1體積比混合，混合后將復(fù)合物包被于金電極表面制 作成工作電極，裝置其他部件按照實施例7中設(shè)計制作。金黃色葡萄球菌B型腸毒素標準品與免疫學檢測阻抗值變化的關(guān)系，結(jié)果見附圖二，在5 X 10_3-1. 0 u g/L金黃色葡萄球菌B型腸毒素濃度范圍內(nèi)，可產(chǎn)生良好線性，線性回 歸方程為 Y = 1. 3055X+0. 0809，R2 = 0. 9989。實施例11 保護劑在藻毒素免疫學檢測裝置中的應(yīng)用抗體保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽0.5%、 CaCl220mmol/L、海藻糖 500mmol/L、牛血清蛋白 lg/L、硫柳汞 0. lg/L?？贵w保護劑與抗體按照2 1體積比混合，混合后將復(fù)合物包被于金電極表面制 作成工作電極，裝置其他部件按照實施例7中設(shè)計制作。藻毒素標準品與免疫學檢測阻抗值變化的關(guān)系，結(jié)果見附圖三，在 5X 10_3-1. 0 y g/L藻毒素濃度范圍內(nèi)，可產(chǎn)生良好線性，線性回歸方程為Y =
0.9964X+0. 1063，R2 = 0. 99849。實施例12 保護劑在嘔吐毒素免疫學檢測裝置中的應(yīng)用抗體保護劑組成為離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽0.5%、 CaCl220mmol/L、海藻糖 500mmol/L、牛血清蛋白 lg/L、硫柳汞 0. lg/L?？贵w保護劑與抗體按照2 1體積比混合，混合后將復(fù)合物包被于金電極表面制 作成工作電極，裝置其他部件按照實施例7中設(shè)計制作。嘔吐毒素標準品與免疫學檢測阻抗值變化的關(guān)系，結(jié)果見附圖四，在 5X10_3-1.0i!g/L嘔吐毒素濃度范圍內(nèi)，可產(chǎn)生良好線性，線性回歸方程為Y =
1.1309X+0. 1038，R2 = 0. 9965。
權(quán)利要求
一種抗體保護劑，其特征在于，含有離子液體1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽、牛血清蛋白、硫柳汞，pH為7.4的PBS緩沖液；其中1-仲丁基-3-甲基咪唑-六氟磷酸鹽濃度為0.05％-5％、牛血清蛋白含量為0.1g/L-3g/L、硫柳汞含量為0.05g/L-1g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗體保護劑，其特征在于，還包括濃度為10mmOl/L-30mmOl/L的 CaCl2,濃度為 200mmol/L-600mmol/L 的海藻糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗體保護劑，其特征在于，抗體保護劑包括1_仲丁基-3-甲基 咪唑-六氟磷酸鹽濃度為0. 5%，牛血清蛋白濃度為lg/L，硫柳汞含量為0. lg/L，CaCl2濃 度為20mmol/L，海藻糖濃度為500mmol/L，pH為7. 4的PBS緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體保護劑，其特征在于，PBS緩沖液由磷酸一氫鈉、磷酸二 氫鈉、氯化鈉組成，30-40°C水浴溶解后，冷卻至室溫，校正pH至7. 4。
5.一種權(quán)利要求1所述抗體保護劑的應(yīng)用，其特征在于，上述抗體保護劑用于提高免 疫學檢測的穩(wěn)定性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述抗體保護劑的應(yīng)用，其特征在于，具體應(yīng)用方法為，抗體保護劑 與抗體按照體積比1 1-3 1之間的比例混合，混合后的復(fù)合物包被于裸金電極表面制 作成為工作電極，工作電極用于免疫學檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗體保護劑的應(yīng)用，其特征在于，抗體為黃曲霉毒素抗體、金黃 色葡萄球菌B型腸毒素抗體、藻毒素抗體或嘔吐毒素抗體中任一一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述抗體保護劑的應(yīng)用，其特征在于，免疫學檢測包括對黃曲霉毒 素、金黃色葡萄球菌B型腸毒素、藻毒素、嘔吐毒素的檢測。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8所述任一抗體保護劑的應(yīng)用，其特征在于，免疫學檢測裝置采用 阻抗型電化學檢測方法，抗體包被于電極表面產(chǎn)生一定阻抗值，抗體與檢測物中毒素結(jié)合 后阻抗值發(fā)生變化，其變化與毒素濃度成正比，采用CHI760C型電化學工作站檢測阻抗值。
全文摘要
本發(fā)明將離子液體用于抗體保護劑的開發(fā)，研制出了一種新型、綠色、高效的抗體保護劑，可使抗體在室溫下保藏依然保持較高的活性，抗體保護劑與抗體混合包裹于裸金電極表面制作成工作電極，安置于免疫學檢測裝置中，明顯提高了免疫學檢測裝置的穩(wěn)定性和準確性，上述免疫學檢測裝置可用于對黃曲霉毒素、金黃色葡萄球菌B型腸毒素、藻毒素、嘔吐毒素的檢測。
文檔編號G01N27/26GK101851267SQ20101015239
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者孫秀蘭, 張銀志, 李在均 申請人:江南大學