專(zhuān)利名稱(chēng)：Dna適體修飾的生物電化學(xué)傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型生物電化學(xué)傳感器及其制備方法，特別是一種DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥，是當(dāng)今社會(huì)中存在的嚴(yán)重威脅人類(lèi)身體健康的疾病之一。其中，急性淋巴細(xì) 胞白血病對(duì)于孩子們身體健康的威脅尤其明顯。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在患急性淋巴細(xì)胞白血病病 人中有接近三分之二是兒童。并且，在現(xiàn)有的治療手段中，低治愈率以及高復(fù)發(fā)率也是癌癥 治療過(guò)程中存在的問(wèn)題。然而，若在癌癥早期即能被診斷出來(lái)的話(huà)，則將大大提高病人的存 活率，并且也有研究證明，早期診斷和及時(shí)治療是提高病人存活率的有效方法之一。因此， 針對(duì)癌癥的分子水平特征，進(jìn)行癌癥早期診斷的研究就顯得極為重要。電化學(xué)生物傳感器是一類(lèi)以電極作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器，以電位或電流加以測(cè)量的生物 傳感器。電化學(xué)體系借助電極實(shí)現(xiàn)電能的輸入或輸出，從而獲得電極表面修飾物質(zhì)的電信 號(hào)，常用的為三電極體系。三電極體系包括工作電極、輔助電極(也稱(chēng)對(duì)電極)和參比電極， 電流流經(jīng)工作電極和對(duì)電極。工作電極所測(cè)得的電位是相對(duì)于參比電極而言。電化學(xué)作為 一種分析檢測(cè)方法，具有設(shè)備低廉、靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)。具體包括以下幾種方法1.循環(huán)伏安法是最常用的一種方法，它在解釋電子傳遞機(jī)理方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)；2.示差脈沖法則擁有更高的靈敏度，因此常用作檢測(cè)；交流阻抗法在表面表征方 面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因而常用來(lái)輔助表征電極的表面狀態(tài)。3.在表面表征方面，顯微鏡技術(shù)具有直觀可靠的優(yōu)點(diǎn)。近來(lái)，研究人員報(bào)道了一種稱(chēng)作適體的分子探針。適體為單鏈DNA、RNA或是經(jīng) 過(guò)修飾的核酸，是通過(guò)一種體外選擇過(guò)程SELEX(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)產(chǎn)生的。在 SELEX技術(shù)中，能從大量的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選出能與靶物質(zhì)高特異性、高親和力 結(jié)合的核酸配基，即為適體。在已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)中，適體可以結(jié)合小分子物質(zhì)諸如三磷酸腺 苷(ATP)，或是大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)，甚至可以與細(xì)胞特異性結(jié)合。由于具有高特異性識(shí)別 靶物質(zhì)、低分子量、合成簡(jiǎn)便、易于修飾、低毒性、高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，適體越來(lái)越多被應(yīng)用于 各項(xiàng)研究以及生物傳感器的設(shè)計(jì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器。用以癌 細(xì)胞的早期診斷。本發(fā)明的目的之二在于提供該傳感器的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器，為三電極體系傳感器，其特征在于 所述的三電極中的對(duì)電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金 電極上修飾有DNA適體鏈。上述的DNA適體鏈為帶有巰基的CCRF-CEM急性白血病細(xì)胞的DNA適體鏈。
上述的帶有巰基的CCRF-CEM急性白血病細(xì)胞的DNA適體鏈為 5， -HS-(CH2)6-ATCTA ACTGCTGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACG GTTAG A-3，。一種制備上述的DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器的方法，其特征在于該方 法的具體步驟為將處理過(guò)的金電極置于IM H2SO4中，在0-1. 5V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安 掃峰，掃速設(shè)置為lOOmv/s，至達(dá)到穩(wěn)定；然后在氮?dú)庵写蹈稍摻痣姌O后，將該金電極置于 含有巰基DNA適體鏈的溶液的Eppendorf管中，該溶液含有濃度為0. 05pM 50pM的HS-DNA 適體，IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, IM NaCl 和 0. 5 μ M 的 pH 為 8. O 的 TCEP，倒置 16 小時(shí)，再 浸入ImM MCH水溶液中2小時(shí)，用超純水沖洗，并用氮?dú)獯蹈?，即得到DNA適體修飾的金電 極，該金電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的生物電化學(xué)傳感器；所述的 HS-DNA適體為5，-HS-(CH2)6-ATCTA ACTGC TGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACGGTTAG A-3，。本發(fā)明第一次在金電極表面修飾上帶有巰基的CCRF-CEM急性白血病細(xì)胞的DNA 適體鏈，用于特異性識(shí)別和檢測(cè)靶細(xì)胞，在檢測(cè)過(guò)程中，K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]作為具有 電活性的探針，來(lái)表征信號(hào)。當(dāng)樣品中存在靶細(xì)胞的時(shí)候，適體鏈與靶細(xì)胞特異結(jié)合，使電 極表面與K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6]之間的電子傳遞受到阻礙，因此檢測(cè)到的電信號(hào)較低； 而當(dāng)樣品中沒(méi)有靶細(xì)胞或是存在其他參照細(xì)胞(如HL-60原髓白血病細(xì)胞)的時(shí)候，適體 鏈不會(huì)與其特異性結(jié)合，因MK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的電信號(hào)較高。這一檢測(cè)體系結(jié) 合了 DNA適體高特異性以及電化學(xué)檢測(cè)方法高靈敏度的特點(diǎn)，使癌細(xì)胞的早期診斷成為可 能。


圖1 為在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6] (pH 7. 0)的緩沖液中，修 飾了不同濃度的DNA適體的金電極的循環(huán)伏安圖。圖2 為在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6] (pH 7.0)的緩沖液中， CCRF-CEM細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量250，000)與DNA適體不同反應(yīng)時(shí)間的示差脈沖圖。圖3 為在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6] (pH 7.0)的緩沖液中， HL-60細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量250，000)與DNA適體不同反應(yīng)時(shí)間的示差脈沖圖。圖4 為在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6] (pH 7.0)的緩沖液中， CCRF-CEM細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量250，000)與DNA適體不同反應(yīng)時(shí)間的交流阻抗圖。圖5 為在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3[Fe (CN)6]/K4[Fe (CN)6] (pH 7.0)的緩沖液中， HL-60細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量250，000)與DNA適體不同反應(yīng)時(shí)間的交流阻抗圖。圖6為CCRF-CEM細(xì)胞(a)與HL-60細(xì)胞(b)在修飾了 DNA適體的鍍金云母片上 的顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一金電極的修飾在進(jìn)行適體修飾之前，先在細(xì)砂紙上打磨金電極，然后再在Al2O3粉末上打磨，之 后分別在無(wú)水乙醇以及超純水中超聲5分鐘。為了更好地除去殘留在金電極表面的雜質(zhì)， 將電極置于IM H2SO4中，在0-1. 5V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃峰，掃速設(shè)置為IOOmv/ s，約20圈達(dá)到穩(wěn)定。然后在氮?dú)庵写蹈呻姌O，進(jìn)行適體修飾。將金電極分別置于含有巰基DNA 適體鏈(5，-HS-(CH2)6-ATCTA ACTGC TGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACG GTTAG A-3，) 的Eppendorf管中，其中含有濃度范圍為0. 05pM、0. 5pM、5pM以及50pM的HS-DNA適體， IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，IM NaCl 禾口 0. 5 μ M TCEP (ρΗ 8.0)，倒置 16 小時(shí)。之后，再浸入 ImM MCH水溶液中2小時(shí)。電極修飾完畢后，用超純水沖洗，并用氮?dú)獯蹈?，得到編?hào)分別為 Α、B、C、D的經(jīng)修飾的金電極。實(shí)施例二 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理CCRF-CEM細(xì)胞(人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞)和HL-60細(xì)胞(人原髓細(xì)胞 白血病細(xì)胞)都購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。這兩種細(xì)胞均在37攝氏度，5% CO2的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末端時(shí)收集，進(jìn) 行細(xì)胞檢測(cè)研究。檢測(cè)前用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每次使用細(xì)胞濃度一般在IO5左右。實(shí)施例三修飾到金電極上的適體濃度的優(yōu)化循環(huán)伏安法，采用的電化學(xué)探針是5mM K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]。對(duì)上述編號(hào)為 A、B、C、D的金電極做電化學(xué)探針檢測(cè)，結(jié)果如圖1。從循環(huán)伏安圖的結(jié)果中可以觀察到，隨 著適體濃度的不斷降低，K3[Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]與金電極表面的電化學(xué)傳遞變得更加容 易，從而信號(hào)也在不斷地增大，其中B號(hào)金電極表面與K3[Fe (CN) 6] /K4[Fe (CN) 6]的電化學(xué)傳 遞最佳，得到了較好的峰形，之后當(dāng)適體濃度進(jìn)一步降低時(shí)，信號(hào)沒(méi)有明顯的增大。實(shí)施例四適體應(yīng)用于癌細(xì)胞檢測(cè)的生物傳感器的構(gòu)建將編號(hào)為B的金電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的生物電化 學(xué)傳感器，進(jìn)行靶細(xì)胞的檢測(cè)，使用的參照細(xì)胞為HL-60細(xì)胞(人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞)。采用示差脈沖法對(duì)含有靶細(xì)胞的樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，圖2為檢測(cè)結(jié)果。從圖中可 以觀察到，隨著靶細(xì)胞和DNA適體反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)信號(hào)不斷降低，尤其是從0小時(shí)至2 小時(shí)之間，信號(hào)降低明顯。之后，隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)增加，雖然信號(hào)仍有所降低，但差值并 不顯著，因此，鑒于2小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間便能達(dá)到比較好的檢測(cè)信號(hào)，在之后的相關(guān)研究中， 使用的適體與細(xì)胞反應(yīng)時(shí)間固定在2小時(shí)。為了進(jìn)一步證明此信號(hào)的變化是由于修飾在金電極上的DNA適體特異性結(jié)合靶 細(xì)胞所引起的，因而進(jìn)行了之后的參照實(shí)驗(yàn)。圖3即為使用此檢測(cè)體系檢測(cè)HL-60細(xì)胞的 結(jié)果圖，從圖中可以觀察到，即使將工作電極浸入HL-60細(xì)胞懸浮液長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)，檢測(cè)峰值 幾乎沒(méi)有發(fā)生明顯的降低，說(shuō)明DNA適體并沒(méi)有特異性結(jié)合HL-60細(xì)胞，電信號(hào)的微小降低 可能是由于HL-60細(xì)胞少量、非特異性地吸附到金電極表面。該對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，利用這一體 系可以特異性識(shí)別靶細(xì)胞并將之與其它非靶標(biāo)細(xì)胞有效區(qū)分開(kāi)來(lái)，實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜體系中檢測(cè) 靶細(xì)胞的目的，為癌癥早期診斷提供了可能性。圖4和5分別展示的是CCRF-CEM以及HL-60細(xì)胞懸浮液的交流阻抗檢測(cè)結(jié)果圖。 DNA適體在特異性識(shí)別了靶細(xì)胞(CCRF-CEM)并與之結(jié)合以后，便會(huì)引起金電極表面阻抗值 的變化，使得阻抗值變大。圖4是含有靶細(xì)胞CCRF-CEM的樣品液的檢測(cè)圖，從圖中可以觀 察到，隨著細(xì)胞與適體反應(yīng)時(shí)間的增加，電極表面的阻抗值增大，在兩者反應(yīng)2小時(shí)后的阻 抗值變化明顯；同樣，圖5顯示，工作電極浸入HL-60細(xì)胞懸浮液2小時(shí)后的阻抗值增大并 不明顯，阻抗值的微小增大可能是由細(xì)胞非特異性吸附至電極表面所引起的。這個(gè)結(jié)果與 示差脈沖結(jié)果一致，從阻抗變化的角度支持了這一體系可以用于癌細(xì)胞的檢測(cè)。實(shí)施例五修飾于金電極上的適體特異性結(jié)合靶細(xì)胞的直觀證明
為了更加直觀地證明靶細(xì)胞CCRF-CEM確實(shí)被特異性結(jié)合在經(jīng)適體修飾過(guò)的金電 極表面，本發(fā)明借助顯微鏡拍照來(lái)進(jìn)一步觀察細(xì)胞是否被適體鏈特異性識(shí)別并結(jié)合至金電 極上。首先要對(duì)云母片進(jìn)行鍍金處理，來(lái)模擬金電極表面的情況。之后，按照修飾金電極 的方法對(duì)鍍金云母片進(jìn)行DNA適體的修飾。接著，將修飾好了的鍍金云母片分別浸入含有 靶細(xì)胞CCRF-CEM的樣品液以及含有HL-60細(xì)胞的懸浮液，培育2小時(shí)后，輕輕沖洗干凈，放 到顯微鏡下觀察、拍照，結(jié)果如圖6。在圖6(a)中，靶細(xì)胞CCRF-CEM特異性地被DNA適體所 識(shí)別，從而結(jié)合到鍍金云母片上，在顯微鏡下可以明顯觀察到有很多細(xì)胞結(jié)合到鍍金云母 片表面；相反，在圖6(b)中幾乎看不到細(xì)胞，說(shuō)明HL-60細(xì)胞由于無(wú)法被適體特異性識(shí)別， 所以并沒(méi)有結(jié)合到鍍金云母片表面?？梢?jiàn)，修飾到金基底上的DNA適體確實(shí)能夠特異性識(shí) 別靶細(xì)胞并與之結(jié)合，從而使適體應(yīng)用于構(gòu)建電化學(xué)傳感器成為可能。
上述結(jié)果證明了基于適體特性及電化學(xué)方法所設(shè)計(jì)的這一檢測(cè)方案，可以針對(duì)癌 細(xì)胞分子水平上的差異性，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行有效檢測(cè)，從而達(dá)到早期檢測(cè)癌癥的目的。
權(quán)利要求
一種DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器，為三電極體系傳感器，其特征在于所述的三電極中的對(duì)電極是鉑電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金電極上修飾有DNA適體鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器，其特征在于所述的 DNA適體鏈為帶有巰基的CCRF-CEM急性白血病細(xì)胞的DNA適體鏈。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器，其特征在于所述的 帶有巰基的CCRF-CEM急性白血病細(xì)胞的DNA適體鏈為5，-HS-(CH2) 6_ATCTA ACTGC TGCGC CGCCGGGAAA ATACT GTACG GTTAG A-3，。
4.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器的方法，其 特征在于該方法的具體步驟為將處理過(guò)的金電極置于IM H2SO4中，在0-1. 5V電壓范圍內(nèi) 進(jìn)行循環(huán)伏安掃峰，掃速設(shè)置為lOOmv/s，至達(dá)到穩(wěn)定；然后在氮?dú)庵写蹈稍摻痣姌O后，將 該金電極置于含有巰基DNA適體鏈的溶液的Eppendorf管中，該溶液含有濃度為0. 05pM 50pM 的 HS-DNA 適體，IOmM Tris-HCl，ImM EDTA, IM NaCl 禾口 0. 5 μ M 的 pH 為 8. O 的 TCEP，侄!J 置16小時(shí)，再浸入ImM MCH水溶液中2小時(shí)，用超純水沖洗，并用氮?dú)獯蹈桑吹玫紻NA適 體修飾的金電極，該金電極與鉬電極和飽和甘汞電極一起組成三電極體系的生物電化學(xué)傳 感器；所述的 HS-DNA 適體為5，-HS-(CH2)6-ATCTA ACTGC TGCGCCGCCG GGAAAATACT GTACG GTTAG A-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器及其制備方法。該新型生物電化學(xué)傳感器，為三電極體系傳感器，其特征在于所述的三電極中的對(duì)電極是鉑電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為金電極，在該金電極上修飾有DNA適體鏈。本發(fā)明的DNA適體修飾的新型生物電化學(xué)傳感器結(jié)合了DNA適體高特異性以及電化學(xué)檢測(cè)方法高靈敏度的特點(diǎn)，使癌細(xì)胞的早期診斷成為可能。
文檔編號(hào)G01N27/327GK101825597SQ20101015232
公開(kāi)日2010年9月8日 申請(qǐng)日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者劉月星, 李婷, 李根喜, 陳桂芳, 陳琳, 陳震宇 申請(qǐng)人:上海大學(xué)