專利名稱：通過用前列腺素或前列腺素類似物補(bǔ)充培養(yǎng)基加強(qiáng)體外胚發(fā)育的方法以及組合物的制作方法
聯(lián)邦政府資助研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明全部或部分由美國兒童健康和人類發(fā)育研究所(NICHD)提供資金，資金編號(hào)HD01277。因此，美國政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物胚以及在將培養(yǎng)的胚植入合適的哺乳動(dòng)物宿主的子宮后加強(qiáng)實(shí)現(xiàn)懷孕的組合物以及方法。
現(xiàn)有技術(shù)的描述輸卵管內(nèi)的環(huán)境可以加強(qiáng)精液的受精作用潛能而且促進(jìn)裂生胚的發(fā)育。胚與輸卵管上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)已經(jīng)顯示出可以促進(jìn)發(fā)育，孵化以及植入[Xu，2001；Xu，2000]。
傳統(tǒng)認(rèn)為前列環(huán)素(PGI2)與維持血液以及血管的體內(nèi)平衡有關(guān)。然而，最近對基因敲除小鼠的觀察顯示其可能具有其它的生理功能。子宮內(nèi)膜-來源的PGI2的重要性通過對環(huán)加氧酶(COX)-2敲除小鼠的觀察得以強(qiáng)調(diào)[Lim，1997]。COX-2敲除小鼠的子宮內(nèi)膜通常不能脫落。結(jié)果，轉(zhuǎn)移的野生型胚不能植入缺乏COX-2的雌性小鼠。上述異常在某種程度上可以通過給母親施用外源PGI2類似物進(jìn)行校正[Lim，1999]。
輸卵管-來源的PGI2在胚植入前的發(fā)育中的作用尚不明確，因?yàn)镻GI2受體(IP)敲除小鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)尚未與野生型的窩產(chǎn)仔數(shù)相比較[Murata，1997]。然而，來自交配的雜合IP敲除小鼠的幼仔的遺傳型分布沒能遵循孟德爾遺傳定律具有純合IP敲除基因型的雌雄幼仔的概率分別為37％以及20％，小于所預(yù)料的[Murata，1997]。
發(fā)明概述最近，我們發(fā)現(xiàn)人類輸卵管合成大量的前列環(huán)素(PGI2)以及PGE2[Huang，2002]?；蚯贸芯勘砻髯訉m內(nèi)膜-來源的PGI2對于子宮內(nèi)膜的脫落是必不可少的，但是PGI2對胚植入前的發(fā)育的影響尚未有報(bào)道。利用胚植入前的最適發(fā)育可能需要PGI2的假說，基于完全孵化率研究PGI2對小鼠胚的影響。通過Western印跡分析以及免疫組織化學(xué)評價(jià)PGI2受體(IP)的表達(dá)。通過放射性配體結(jié)合分析證實(shí)PGI2與胚的結(jié)合。我們的結(jié)果證明小鼠胚的孵化通過添加伊洛前列素(ED506.7nM)，一種穩(wěn)定的PGI2合成類似物得以加強(qiáng)。8-細(xì)胞至桑椹胚或桑椹胚至早期胚泡階段暴露于伊洛前列素對于加強(qiáng)孵化是非常重要的。這種針對PGI2的階段-特異性應(yīng)答與IP的發(fā)育階段-特異性表達(dá)相一致。實(shí)施了進(jìn)一步的研究以求將胚的加強(qiáng)孵化與增加植入以及活產(chǎn)率相聯(lián)系，將在補(bǔ)充有伊洛前列素(Iloprost)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小鼠胚轉(zhuǎn)入受孕的載體。將懷孕胚囊以及活幼仔的數(shù)目與對照胚的數(shù)目相比較。因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的添加劑據(jù)報(bào)道可以增加胎兒體重[DeBaun，2002；Thompson，1995；Sinclair，1999]，也比較幼仔以及胎盤的重量。我們的結(jié)果顯示補(bǔ)充有伊洛前列素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚加強(qiáng)了小鼠胚的植入以及活產(chǎn)率，但不影響幼仔或者胎盤的重量。
因此，在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，提供了加強(qiáng)胚體外發(fā)育的方法，包括用前列腺素諸如PGI2或者PGE2或者其類似物補(bǔ)充培養(yǎng)基。在某些實(shí)施方案中，前列腺素為PGI2或者PGE2，并且在某些實(shí)施方案中前列腺素類似物為伊洛前列素或者PGE1。在某些實(shí)施方案中，該方法包括向培養(yǎng)基中添加足以促進(jìn)胚完全孵化量的前列腺素或者類似物。優(yōu)選地，“完全孵化”包括由透明帶釋放胚。該方法的某些實(shí)施方案中，在胚的早期發(fā)育階段補(bǔ)充培養(yǎng)基，在該階段基因組被激活并且受精卵發(fā)育成桑椹胚。在一些胚為人的實(shí)施方案中，早期發(fā)育階段開始于4-至8-細(xì)胞狀態(tài)。在某些方法實(shí)施方案中，在胚的桑椹胚至早期胚泡階段發(fā)育期間補(bǔ)充培養(yǎng)基。在某些方法實(shí)施方案中，在胚的早期發(fā)育階段至桑椹期發(fā)育期間以及胚的桑椹胚至早期胚泡階段發(fā)育期間補(bǔ)充培養(yǎng)基。在某些方法實(shí)施方案中，其中胚為小鼠來源，補(bǔ)充步驟包括在其2細(xì)胞發(fā)育階段的胚收獲以后的24至42小時(shí)之間將培養(yǎng)中的胚曝露于前列腺素或者類似物。在其中胚為小鼠的某些方法實(shí)施方案中，桑椹胚至早期胚泡階段期間的補(bǔ)充步驟包括在其2-細(xì)胞發(fā)育階段的胚收獲以后的42至72小時(shí)之間將胚曝露于前列腺素或者前列腺素類似物。
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案也提供了提高體外受精胚的體內(nèi)植入潛能的方法?！爸踩霛撃堋笔桥咧踩胱訉m的能力。該方法包括進(jìn)行上述實(shí)施方案之一以加強(qiáng)胚的體外發(fā)育，由此獲得培養(yǎng)中的胚的完全孵化或者與其它IVF方法相比加強(qiáng)孵化。根據(jù)該方法的某些實(shí)施方案，然后將完全或者幾乎孵化的胚導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主的子宮，從而獲得胚的加強(qiáng)植入。在某些實(shí)施方案中，胚的體外完全孵化與成活懷孕的建立有關(guān)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提供了提高體外受精的哺乳動(dòng)物胚的活產(chǎn)潛能的方法?！盎町a(chǎn)潛能”是胚獲得活產(chǎn)胚的能力。該方法包括如上所述通過用適量的前列腺素或者其類似物的體外培養(yǎng)加強(qiáng)胚的體外發(fā)育，從而獲得培養(yǎng)中的胚的加強(qiáng)孵化潛能或者完全孵化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種處理賦予了完全孵化的加強(qiáng)潛能，甚至是在由培養(yǎng)物取出胚后以及在體內(nèi)環(huán)境中。該特性被稱為“加強(qiáng)孵化潛能”。然后將孵化的胚，或者具有加強(qiáng)孵化潛能的胚轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物宿主的子宮；使胚植入并且體內(nèi)生長，從而相對于植入但未加強(qiáng)孵化的植入的胚使胚獲得活產(chǎn)的能力得以加強(qiáng)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了提高體外受精的哺乳動(dòng)物胚群體出生率的方法，其包括根據(jù)以上所述方法加強(qiáng)胚的體外發(fā)育，使得孵化加強(qiáng)，或者優(yōu)選地獲得培養(yǎng)的胚的完全孵化。該方法包括將胚導(dǎo)入或者轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物宿主中；然后使胚體內(nèi)生長，其中具有加強(qiáng)孵化的胚組的活產(chǎn)率大于轉(zhuǎn)入宿主子宮的胚組的活產(chǎn)率，而不必首先完全孵化或者接受孵化的加強(qiáng)。
本發(fā)明的特定實(shí)施方案進(jìn)一步提供了用于體外哺乳動(dòng)物胚發(fā)育的改良的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述改進(jìn)包括補(bǔ)充有效加強(qiáng)孵化，并且優(yōu)選地促進(jìn)胚體外完全孵化量的前列腺素或者其類似物。在某些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基含有有效加強(qiáng)胚在從體外培養(yǎng)取出并轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物宿主的子宮后完全孵化潛能量的前列腺素，或者其類似物。本發(fā)明的這些及其它實(shí)施方案，特征以及優(yōu)點(diǎn)將參考下列說明書以及附圖而變得顯而易見。


圖1是顯示前列環(huán)素(PGI2)以及小鼠胚的完全孵化的圖。用PGI2類似物培養(yǎng)2-細(xì)胞小鼠胚(伊洛前列素，1nM至10μM)。96小時(shí)后確定完全孵化率。3到5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(每個(gè)實(shí)驗(yàn)17-20個(gè)胚)表示為平均值±S.D。ED50值約為6.7nM。
圖2為顯示完全孵化的加強(qiáng)以及前列環(huán)素(PGI2)暴露期間的柱狀圖(基于胚發(fā)育階段的伊洛前列素暴露)。2-細(xì)胞小鼠胚在0.1μM伊洛前列素，PGI2類似物的存在下，顯示的周期期間培養(yǎng)(表示為收獲2-細(xì)胞胚后的小時(shí)數(shù))。完全孵化率表示為平均值±S.D。胚暴露于伊洛前列素期間的發(fā)育階段列于表中。2個(gè)階段對于伊洛前列素的完全效果似乎很關(guān)鍵24-42小時(shí)以及42-72小時(shí)，分別對應(yīng)于從8-細(xì)胞胚至桑椹胚以及桑椹胚至早期胚泡的發(fā)育。各個(gè)階段暴露于伊洛前列素確保了孵化的加強(qiáng)。獨(dú)立觀察的數(shù)目(每個(gè)有18-20個(gè)胚)為對照，12；42-72個(gè)小時(shí)，3；其它的，4。對照胚中的完全孵化率不同于圖1中的完全孵化率，可能是因?yàn)樾坌孕∈髞碓吹母淖儭?br> 圖3為顯示小鼠胚中前列環(huán)素受體(IP)表達(dá)的Western印跡。來自60個(gè)小鼠胚泡(泳道1)的總細(xì)胞裂解物以及人血小板(陽性對照，泳道2)的微粒體的Western印跡分析顯示了用抗人IP的抗體的免疫反應(yīng)。小鼠IP的遷移小于人IP，分別與約50kDa以及約46kDa的預(yù)計(jì)分子量相一致。
圖4A-E以及G為顯示桑椹胚以及胚泡中前列環(huán)素受體(IP)的表達(dá)的顯微照片。顯示了2個(gè)桑椹胚的相差(圖4A)以及IP染色(圖4B)顯影。透明帶由箭頭顯示。圖4C顯示了胚泡中核的碘化丙啶鎓染色。圖4D中胚泡的IP以及碘化丙啶鎓染色重疊。圖4E顯示了胚泡的IP染色，顯示為網(wǎng)狀模式。僅僅在滋養(yǎng)外胚層中觀察到成簇的IP染色；顯示內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的染色沒有加強(qiáng)。圖4F為顯示胚泡內(nèi)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)位置的草圖。圖4G為顯示僅僅滋養(yǎng)外胚層由IP抗體染色的胚泡的共焦點(diǎn)顯微鏡顯影。截面由面板F中的劃線顯示。陰性對照，未受精的卵母細(xì)胞或者其它發(fā)育階段(未顯示)的胚中無IP染色。圖中的線條為約20μm。
圖5為顯示結(jié)合于完整小鼠胚的伊洛前列素的柱狀圖。在5μM未標(biāo)記的伊洛前列素的存在或者缺少的條件下用0.1μM3H-伊洛前列素，PGI2類似物溫育116個(gè)小鼠胚泡。由膜濾法分離結(jié)合以及游離的3H-伊洛前列素。
圖6A-B顯示了受孕載體的子宮中的懷孕胚囊。由植入位置血管供應(yīng)的增加確定植入并由懷孕胚囊的存在進(jìn)行證實(shí)。胚移植后72個(gè)小時(shí)，經(jīng)尾部靜脈對受孕的載體施用1％的芝加哥藍(lán)并在3分鐘后實(shí)施安樂死。圖6A顯示了圍繞接受胚的子宮角的不連續(xù)的藍(lán)色條帶(由*顯示)。在圖6B中，每一藍(lán)帶對應(yīng)于懷孕胚囊，其在開放的子宮角顯示為粉紅色組織。在沒有接受胚的子宮角中(由箭頭標(biāo)明)沒有發(fā)現(xiàn)藍(lán)色條帶或者懷孕的胚囊。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本公開在研究PGI2以及PGE2對精液以及胚影響的過程中，以及隨后的調(diào)查中得以發(fā)展。我們最近的結(jié)果顯示人[Huang，2002]以及小鼠[Huang，2004]輸卵管上皮細(xì)胞表達(dá)對于PGI2的合成必需的酶，即COX-1或者COX-2以及PGI2合成酶。當(dāng)用由人[Huang，2002]或者小鼠輸卵管[Huang，2004]制備的微粒體溫育14C-花生四烯酸時(shí)產(chǎn)生大量的PGI2以及PGE2。本研究也考慮了精液移動(dòng)至遠(yuǎn)端輸卵管使卵受精并且在輸卵管中發(fā)生胚發(fā)育的最初72個(gè)小時(shí)的事實(shí)。
作為本研究的一部分，通過觀察用PGI2類似物培養(yǎng)的小鼠胚的完全孵化評價(jià)PGI2對胚的影響。為了進(jìn)一步闡明該機(jī)制，也由放射性標(biāo)記的伊洛前列素研究了IP的表達(dá)以及胚的結(jié)合。
材料以及方法試劑的來源以及制度的許可。
除非另有說明，試劑購自Sigma Co.(St.Louis，MO，USA)。由保護(hù)人受試者委員會(huì)(Committee for the Protection of Human Subjects)(相當(dāng)于制度審查委員會(huì))批準(zhǔn)人樣品的使用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理以及研究方案由動(dòng)物福利委員會(huì)(Animal Welfare Committee)批準(zhǔn)。
收獲以及培養(yǎng)小鼠胚。
在受控溫度，濕度以及光循環(huán)(12小時(shí)光/黑暗)條件下，允許自由攝取水以及食物飼養(yǎng)小鼠。由Harlan(Indianapolis，IN，USA)購買3-周齡C57B1/6雌性小鼠。最初由Harlan以后由The JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME，USA)購買8-周齡C3H雄性小鼠。通過腹膜內(nèi)注射孕馬血清促性腺激素(5IU)，隨后人絨毛膜促性腺激素(hCG，5IU)46小時(shí)后獲得雌性小鼠中的超數(shù)排卵。接受hCG后，每只雌性小鼠與一只可繁殖的雄性小鼠配對。48小時(shí)以后，由輸卵管收獲2-細(xì)胞胚到補(bǔ)充有25mM HEPES以及1％BSA(Irvine Scientific)的α-MEM培養(yǎng)基中。
在37℃，5％CO2下在每孔含有600μl的培養(yǎng)基的4-孔平皿(NalgeNunc International，Naperville，IL，USA)中培養(yǎng)胚(每組17-20)。在96-小時(shí)期間順序使用HTF以及α-MEM培養(yǎng)基以符合裂解胚的營養(yǎng)需求的改變[Gardner，1998]。在最初48小時(shí)期間使用HTF培養(yǎng)基(SAGEBiopharma)，并在第二48小時(shí)期間使用具有Earle′s鹽以及2mM谷氨酰胺的α-MEM培養(yǎng)基(Irvine Scientific)。實(shí)驗(yàn)性的胚接受水中的伊洛前列素并且對照胚接受等量的水。初步試驗(yàn)顯示超過95％的胚經(jīng)96小時(shí)變成胚泡，類似于KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的胚(Specialty Media，Cell andMolecular Technologies，Inc.Phillipsburg，NJ，USA)。96-小時(shí)培養(yǎng)后，檢查每一胚透明帶的存在。完全不含透明帶的胚被計(jì)算為完全孵化的胚。通過將完全孵化的胚除以胚的總數(shù)確定完全孵化率。將胚的完全孵化選作終點(diǎn)而不是胚泡形成或者胚孵化，因?yàn)楹?個(gè)標(biāo)記與成活懷孕的建立不相關(guān)[Lane，1997]。
Western印跡分析小鼠IP(417a.a.，Genebank BAA05144)以及人IP(386 a.a.，Genebank_BAA06110)推斷的氨基酸序列高度同源[Katsuyama，1994]。初步的研究證明親和性-純化的多克隆肽抗體(由Dr.Ke-He Ruan惠贈(zèng)，University of Texas Health Science Center)與小鼠IP交叉-反應(yīng)。如前所述進(jìn)行Western印跡分析[Huang，2002]。簡而言之，通過在10％丙烯酰胺凝膠(PAGE)上分離來自60個(gè)小鼠胚泡的總的細(xì)胞裂解物并轉(zhuǎn)入硝化纖維膜(Schleicher&Schuell，Inc.，Keene，NH，USA)。通過用抗體溫育并用加強(qiáng)的化學(xué)熒光(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA)進(jìn)行目測檢測免疫活性蛋白質(zhì)，利用STORM 860激光掃描器(Amersham Biosciences)檢測。人血小板微粒體被用作陽性對照。利用預(yù)吸收的抗體在平行實(shí)驗(yàn)中證實(shí)抗體的特異性。
免疫組織化學(xué)，熒光顯微術(shù)以及共聚焦顯微鏡術(shù)。
在4℃，在4％仲甲醛(pH7.4)中固定小鼠胚30分鐘。用PBS沖洗3次后，室溫下含有0.05％Tween-20，5％奶粉以及0.1％Triton X-100的Tris-緩沖鹽封閉胚20分鐘。用IP抗體(5ng/ml)的封閉緩沖液溫育胚2小時(shí)，然后用偶聯(lián)Alexa 488的山羊抗-兔IgG(2.5μg/ml，MolecularProbes，Eugene，OR，USA)在37℃溫育30分鐘。在室溫下用10μg/ml碘化丙啶鎓對細(xì)胞核復(fù)染20分鐘。在Fluoromount-G(SouthernBiotechnology Associates Inc.，Birmingham，AL，USA)上封固胚。對于熒光顯微術(shù)，將胚泡置于封固劑中并用蓋玻片覆蓋。對于共焦點(diǎn)顯微鏡術(shù)而言，將約50μm的間隔基置于玻片和蓋玻片之間維持胚的三維形態(tài)。對于陰性對照而言，用10ng/ml的非免疫性兔IgG溫育胚(即，初級抗體的兩倍濃度)。
利用裝備有合適的過濾器的Zeiss AxioPlan 2顯微鏡進(jìn)行熒光顯微術(shù)(Carl Zeiss，Baden-Wuerttemberg，Germany)。利用CCD照相機(jī)捕捉影像并通過AxioVision程序(3.0.6版本)處理。利用連接于OlympusBX-50顯微鏡的BioRad Radiance 2000共聚焦系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA，USA)進(jìn)行共聚焦顯微鏡術(shù)。利用Image-Pro+程序處理影像(Media-Cybernetics，Carlsbad，CA，USA)。
全胚放射性配體結(jié)合分析如前所述只進(jìn)行稍微的修飾[Arbab，2002]進(jìn)行3H-伊洛前列素與胚泡的結(jié)合分析。用結(jié)合緩沖液(10mM MnCl2的10mM HEPES溶液，pH 7.4)沖洗232個(gè)孵化的以及孵化中的胚泡然后轉(zhuǎn)入有或者沒有未標(biāo)記伊洛前列素(5μM)的100μl的結(jié)合緩沖液。通過添加含有3H-伊洛前列素(200nM，比活度11.0Ci/mmol，Amersham Biosciences)的等量結(jié)合緩沖液啟動(dòng)反應(yīng)并在室溫下溫育60分鐘。通過將胚泡轉(zhuǎn)入2ml的冰冷沖洗緩沖液(0.01％BSA的10mM HEPES溶液，pH7.4)終止反應(yīng)。通過玻璃纖維過濾器(Whatman GF/C 2.4cm)過濾緩沖液以及胚泡并用2ml的沖洗緩沖液沖洗過濾物3次。通過用5ml的閃爍液體閃爍計(jì)數(shù)確定放射性之前在烘箱中干燥過濾物。
統(tǒng)計(jì)分析適當(dāng)時(shí)，使用Student′s t-檢驗(yàn)或者單向方差分析繼之以Dunnett檢驗(yàn)。p＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的。劑量反應(yīng)曲線的構(gòu)建以及ED50值的計(jì)算(曲線斜率設(shè)置在1.0)由GraphPad Prism軟件(GraphPad PrismSoftware公司，San Diego，CA，USA)完成。
胚轉(zhuǎn)移如上所述收獲小鼠胚并培養(yǎng)隨后由本發(fā)明人公開(Huang等人，2003)。簡要地，由注射hCG后42小時(shí)的超數(shù)排卵的3-周齡C57B1/6雌性小鼠收獲2-細(xì)胞胚(C3B6F1)。在37℃，5％CO2條件下于每個(gè)包含600μl HTF培養(yǎng)基(SAGE Biopharma，Bedminster，NJ，USA)的4-微孔平皿(Nalge Nunc International，Naperville，IL，USA)中培養(yǎng)胚(每組14個(gè))。實(shí)驗(yàn)胚接受伊洛前列素(1μM，Caymen Chemical，Ann Arbor，MI，USA)的水溶液，對照胚接受等量水。兩種情況下，水的體積都小于培養(yǎng)基的0.1％。
胚供體接受hCG第二天，從可能的受孕載體(8周齡C3B6F1雌性小鼠)獲得陰道涂片確定發(fā)情周期的階段。將那些發(fā)情的動(dòng)物與切除輸精管的ICR雄性小鼠(Harlan)配對并在隨后的早晨檢查陰道拴。具有陰道拴的動(dòng)物被稱為0.5天假孕。
在解剖顯微鏡(Olympus SZ-PT)下假孕的2.5天進(jìn)行胚轉(zhuǎn)移。通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮(200mg/Kg)以及甲苯噻嗪(10mg/Kg)(兩者都獲自Burns Vet Supply Inc.TX，USA)獲得外科麻醉。經(jīng)2-厘米的側(cè)翼切口進(jìn)入每個(gè)子宮角。鄰近的輸卵管由一對鉗子固定，在子宮角的遠(yuǎn)端用30規(guī)格針在反腸系膜側(cè)產(chǎn)生開口。該開口允許具有135μm內(nèi)徑的移液吸管的進(jìn)入(MidAtlantic Diagnostics，Inc.NJ，USA)。將0.8μl的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(具有25mM HEPES以及1％BSA的αMEM)中高達(dá)7個(gè)胚轉(zhuǎn)入每個(gè)角中。每次轉(zhuǎn)移后，在立體顯微鏡下檢驗(yàn)移液管的內(nèi)容物以鑒定保留的胚。側(cè)翼切口用9mm金屬夾子(Clay Adams，Parsippany，NJ，USA)封閉。由于胚從一個(gè)角遷移到另一個(gè)角(與Dr.Andreas Zimmer，University of Bonn，Germany的私人聯(lián)絡(luò))，為了避免對照和實(shí)驗(yàn)胚的混合，每一受孕載體接受對照或者實(shí)驗(yàn)胚。為了保持一致的轉(zhuǎn)移技術(shù)，根據(jù)相同的方案以及由同一個(gè)個(gè)體進(jìn)行胚轉(zhuǎn)移，所述同一個(gè)個(gè)體對于被安排接受的處理不知情。為了保證兩個(gè)組同樣由研究過程(約6個(gè)月)獲得的經(jīng)驗(yàn)受益，在4個(gè)區(qū)塊對胚安排處理(對照或者伊洛前列素)。
確定植入率胚轉(zhuǎn)移后72個(gè)小時(shí)，根據(jù)如前所述進(jìn)行某些修改的方法(Paria等人，1993)確定植入。簡要地，安樂死之前3分鐘，經(jīng)受孕載體的尾部靜脈注射0.1ml的芝加哥藍(lán)(1％)。對載體處死以后，除去子宮角。對圍繞子宮角的離散的藍(lán)色條帶(顯示為*)計(jì)數(shù)(圖6A)。這些條帶的存在反映了植入位點(diǎn)血管的維管供應(yīng)的加強(qiáng)。然后打開子宮角并對懷孕的胚囊計(jì)數(shù)(圖6B)。植入率表示為每個(gè)轉(zhuǎn)移的胚懷孕胚囊的數(shù)目。
確定出生率以及幼仔和胎盤的重量初步研究顯示一些受孕的載體在其一窩產(chǎn)仔數(shù)較少時(shí)吃它們的幼仔。為了對幼仔精確計(jì)數(shù)以及稱重，我們在胚轉(zhuǎn)移后14天(懷孕的第16.5或者自然生產(chǎn)前2天)處死受孕的載體。實(shí)施安樂死后，對活幼仔進(jìn)行計(jì)數(shù)并確定個(gè)體幼仔以及胎盤的重量。檢查所有幼仔的大體異常情況。也對空懷孕胚囊的數(shù)目計(jì)數(shù)以便確定植入率。出生率表示為每轉(zhuǎn)移胚活幼仔的數(shù)目；植入率表示為每轉(zhuǎn)移胚有或者沒有活幼仔的胚囊的數(shù)目。
統(tǒng)計(jì)分析Fisher’s精確檢驗(yàn)用來比較比率；Student′s t檢驗(yàn)用來比較重量。p＜0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的。GraphPad Instal軟件(GraphPadSoftware Inc.，San Diego，CA，USA)用于統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果PGI2提高了小鼠胚的完全孵化。
小鼠胚的完全孵化由伊洛前列素以濃度依賴的方式得以提高。在0.1μM或者更高的濃度，效果在統(tǒng)計(jì)上是顯著的(圖1)。完全胚孵化的最大加強(qiáng)發(fā)生在1μM，其中81±7％(平均值±S.D.n＝3)的實(shí)驗(yàn)胚完全孵化。相比之下，只有49±14％(平均值±S.D.n＝5)的對照胚完全孵化。來源于劑量反應(yīng)曲線的ED50值為6.7nM(圖1)。飽和濃度依賴的應(yīng)答以及6.7nM的ED50值顯示伊洛前列素的效果由受體介導(dǎo)。
對于加強(qiáng)孵化很關(guān)鍵的PGI2暴露時(shí)間以及胚的發(fā)育階段。
因?yàn)榕咴谶M(jìn)入子宮之前經(jīng)歷了幾個(gè)發(fā)育階段，我們研究了針對伊洛前列素的發(fā)育階段特異性應(yīng)答。我們的結(jié)果顯示96-小時(shí)培養(yǎng)期間的一些時(shí)間比其它時(shí)間更重要。在最初的24小時(shí)培養(yǎng)期間(在這期間大多數(shù)2-細(xì)胞胚發(fā)育成8-細(xì)胞胚)暴露于伊洛前列素并不加強(qiáng)孵化(圖2)。另一方面，收獲以后0-72小時(shí)或者24-72小時(shí)之間暴露于伊洛前列素與0-96小時(shí)暴露產(chǎn)生相同的完全孵化比率(圖2)。
確保伊洛前列素的全部效果的暴露于伊洛前列素的2個(gè)關(guān)鍵時(shí)間是在收獲后24至42小時(shí)以及42至72小時(shí)之間，分別對應(yīng)于從8-細(xì)胞胚向桑椹胚以及由桑椹胚向早期胚泡的轉(zhuǎn)化(圖2底部的表)。我們的數(shù)據(jù)顯示將胚簡短暴露于PGI2加強(qiáng)了完全孵化的潛能，甚至在胚離開輸卵管后。
小鼠胚表達(dá)IP。
為了研究小鼠胚中發(fā)育階段-特異性表達(dá)IP，在不同的發(fā)育階段我們在胚泡上進(jìn)行了Western印跡分析并在胚上進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。Western印跡分析顯示由親合性-純化的抗IP抗體檢測到期望分子量的蛋白(圖3)。熒光顯微術(shù)顯示IP染色存在于桑椹胚以及胚泡(圖4A-E)而不是在未受精卵中，或者在單細(xì)胞，2-細(xì)胞，4-細(xì)胞以及8-細(xì)胞胚中(未顯示)。桑椹胚以及胚泡中IP染色均具有相同的精細(xì)網(wǎng)狀模式。共聚焦顯微鏡術(shù)顯影顯示IP在滋養(yǎng)外胚層中優(yōu)選表達(dá)(圖4G)。因此，由小鼠胚階段-特異性表達(dá)IP與對伊洛前列素的反應(yīng)一致。
放射性標(biāo)記的伊洛前列素與小鼠胚結(jié)合。
由伊洛前列素濃度依賴性加強(qiáng)的完全胚孵化顯示所述效果是由受體介導(dǎo)的。我們進(jìn)行了放射性配體結(jié)合分析以進(jìn)一步證實(shí)小鼠胚由伊洛前列素結(jié)合。我們選擇在0.1μM的配體水平對伊洛前列素結(jié)合進(jìn)行定量，其中首先觀察到孵化加強(qiáng)并發(fā)現(xiàn)大約3.04fmol的3H-伊洛前列素與116個(gè)胚泡特異性結(jié)合(圖5)。
討論我們的數(shù)據(jù)首次顯示PGI2加強(qiáng)胚的完全孵化。這與先前報(bào)道小鼠胚與人輸卵管的上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)提高了胚的細(xì)胞數(shù)目，降低了細(xì)胞程序性死亡，并改進(jìn)胚孵化相一致[Piekos，1995；Xu，2000；Xu，2001]。因此，輸卵管-來源的PGI2以及血管內(nèi)皮來源的PGI2以類似旁泌性方式發(fā)揮效果。前者加強(qiáng)胚孵化；后者阻止血小板凝聚。濃度-依賴的應(yīng)答與受體-介導(dǎo)的事件相一致而6.7nM的ED50值類似于報(bào)道的來自人血小板的溶解的IP(8nM)的Kd值[Tsai，1989]。
胚對伊洛前列素的應(yīng)答是發(fā)育階段特異性的并與IP的表達(dá)相一致(圖2)。應(yīng)答的這些關(guān)鍵時(shí)間與小鼠胚在輸卵管中的逗留相一致，在此期間受精卵發(fā)育成桑椹胚。相關(guān)的發(fā)育階段也與人和小鼠胚中基因組的活化相一致，其分別發(fā)生在4-和8-細(xì)胞階段之間以及二細(xì)胞階段后[Tesarik，1986；Tesarik，1988；Braude，1988]。
不希望限于IP如何發(fā)揮其效果的特定理論，我們提出發(fā)育早期暴露于輸卵管-來源的PGI2或者PGE2的胚當(dāng)他們達(dá)到子宮時(shí)維持加強(qiáng)的孵化潛能。通過輸卵管-來源的PGI2，胚主動(dòng)準(zhǔn)備其自身的植入，雖然他們尚在輸卵管中。從胚的角度，輸卵管-來源的PGI2補(bǔ)充子宮內(nèi)膜-來源的PGI2，其介導(dǎo)子宮內(nèi)膜的脫落確保接收性[Lim，1999]。
不希望限于特定的理論，我們提出由PGI2或者PGE2介導(dǎo)的加強(qiáng)孵化可歸于胚細(xì)胞數(shù)目的增加。不同的機(jī)制涉及小鼠胚體外以及體內(nèi)的孵化。體外孵化包括胚泡膨脹，帶破裂之前引起總帶變細(xì)，而體內(nèi)孵化包括由子宮或者滋養(yǎng)外胚層溶胞素全面的帶溶解[Montag，2000]。因此，足夠高數(shù)量的胚細(xì)胞是完成體外孵化所需的。在這方面，我們的結(jié)果與胚與輸卵管上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)具有更多細(xì)胞，更少細(xì)胞死亡，以及提高孵化的發(fā)現(xiàn)相一致[Yeung，1992；Xu，2000]。此外，PGI2可以提高由滋養(yǎng)外胚層產(chǎn)生胰蛋白酶類蛋白酶從而溶解帶[Sawada，1990；Perona，1986]。
試管受精胚的低植入潛能(每胚10-20％)[CDC，2001]部分歸因于次最佳的培養(yǎng)條件[De Vos，2000]。已經(jīng)改進(jìn)了培養(yǎng)基以便提高體外胚發(fā)育[Gardner，1998]。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，補(bǔ)充有PGI2和/或PGE2類似物諸如伊洛前列素，PGE1的培養(yǎng)基可以為胚發(fā)育提供改良的環(huán)境并提高其植入潛能。
最后，PGI2加強(qiáng)培養(yǎng)的小鼠胚的完全孵化。由小鼠胚階段-特異性表達(dá)IP與其對PGI2的反應(yīng)一致。最后，根據(jù)我們的初始數(shù)據(jù)，PGE2也加強(qiáng)培養(yǎng)的小鼠胚的完全孵化。
在更進(jìn)一步的研究中，我們證明了補(bǔ)充有PGI2的培養(yǎng)基加強(qiáng)小鼠胚的植入以及潛在的活產(chǎn)。這些結(jié)果證實(shí)了我們最初觀察到的PGI2加強(qiáng)培養(yǎng)中的小鼠胚的完全孵化[Huang，2003]；他們同時(shí)支持了我們假設(shè)的輸卵管-來源的PGI2可以提供生理功能[Huang，2002]。
表1顯示PGI2加強(qiáng)了小鼠胚的植入潛能。將84個(gè)對照胚以及81個(gè)伊洛前列素-處理的胚轉(zhuǎn)入12個(gè)受孕的載體。72小時(shí)后，在伊洛前列素-處理組中發(fā)現(xiàn)比對照組更多的懷孕胚囊(76％對比42％，相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)1.84，95％置信區(qū)間1.38-2.43，p＜0.0001)。在轉(zhuǎn)移時(shí)，可比較胚的發(fā)育階段。
表2顯示PGI2伊洛前列素加強(qiáng)了小鼠胚的活產(chǎn)潛能。分別將406個(gè)對照胚以及415個(gè)伊洛前列素-處理的胚轉(zhuǎn)入30以及31只受孕的載體。對照以及實(shí)驗(yàn)組的出生率分別是28％以及36％(p＝0.0017，相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)1.28，95％置信區(qū)間1.044-1.560)。幼仔以及胎盤的重量是可比較的。因此，PGI2提高了小鼠胚的活產(chǎn)潛能而不影響幼仔或者胎盤的重量。此外，記錄沒有大體的異常情況。
如上所述，大約70％的實(shí)驗(yàn)以及對照胚在轉(zhuǎn)移時(shí)為桑椹期(表1)，然而轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)胚產(chǎn)生更多的懷孕胚囊。這些結(jié)果證實(shí)了我們先前觀察的在8-細(xì)胞和桑椹期之間暴露于PGI2足以加強(qiáng)小鼠的完全孵化[Huang，2003]。它們也與輸卵管-來源的PGI2作為胚營養(yǎng)素因子相一致，因?yàn)槭芫男∈舐言谳斅压軆?nèi)發(fā)育成桑椹胚[Snell，1966]。
以上現(xiàn)象顯示PGI2引發(fā)一連串的事件最終加強(qiáng)孵化，植入并提高活產(chǎn)率。在這點(diǎn)上，PGI2使人想起血小板活化因子(PAF)，其中短時(shí)間暴露于PAF提高小鼠[O′Neill，1998]以及人胚[O′Neill，1989]的植入。由PGI2引發(fā)的分子以及細(xì)胞事件對孵化非常重要。它們可以包括提高胚細(xì)胞數(shù)目[Montag，2000]，加強(qiáng)由滋養(yǎng)外胚層胰蛋白酶類蛋白酶的產(chǎn)生[Sawada，1990；Perona，1986]，加強(qiáng)應(yīng)歸于加強(qiáng)滋養(yǎng)外胚層的Na+-K+-ATP酶系統(tǒng)的囊胚腔膨脹[Biggers，1988]或者還有待于發(fā)現(xiàn)的機(jī)制。
當(dāng)轉(zhuǎn)移后分別在72小時(shí)或者14天檢查時(shí)可比較對照胚的植入率(42％以及46％)。另一方面，轉(zhuǎn)移后14天檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)胚的植入率(59％)比轉(zhuǎn)移后72小時(shí)檢驗(yàn)的植入率顯著低(p＝0.038)(76％)。在實(shí)驗(yàn)組中由于植入位點(diǎn)的聚集更多胚囊被完全再吸收是合理的?；蛘?，伊洛前列素“拯救”一些可能不會(huì)植入的胚并且只有一小部分那些“拯救的”胚發(fā)育成活幼仔。本研究的結(jié)果以及由人[Huang，2002]以及小鼠[Huang，2004]輸卵管產(chǎn)生大量的PGI2顯示PGI2是由輸卵管分泌的一種胚營養(yǎng)素因子，并且因此用PGI2類似物補(bǔ)充胚培養(yǎng)基應(yīng)該改進(jìn)IVF的結(jié)果。
用加強(qiáng)胚發(fā)育或者植入的物質(zhì)補(bǔ)充IVF培養(yǎng)基已經(jīng)由大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室以及小心翼翼的培養(yǎng)基廠商采用。可以關(guān)注包括關(guān)于再生毒物學(xué)，致畸性，以及這種操作的可能外生效應(yīng)的問題。來自培養(yǎng)在補(bǔ)充有人血清的培養(yǎng)基中的綿羊胚的羊羔更重并具有更長的懷孕期[Thompson，1995；Holm，1996；Sinclair，1999]。包括過度生長以及腫瘤形成，Beckwith-Wiedermann綜合癥的先天紊亂與輔助的再生技術(shù)有關(guān)[DeBaun，2002；Maher，2003]。
對伊洛前列素的再生毒理學(xué)研究[Battenfeld，1995]顯示胚以及胎兒發(fā)育不影響兔以及猴，但是在大鼠中觀察到足趾減少。足趾異?？赡軕?yīng)歸于引起受影響結(jié)構(gòu)的氧不足的子宮胎盤流動(dòng)性的降低而非伊洛前列素的先天致畸性，因?yàn)橐谅迩傲兴厥茄軘U(kuò)張劑并在整個(gè)懷孕期中研究的動(dòng)物接受伊洛前列素。類似缺陷可以由具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的血管擴(kuò)張劑諸如肼苯噠嗪以及二氫吡啶誘導(dǎo)。在當(dāng)前的研究中，暴露于伊洛前列素發(fā)生在胚植入前期間。在246只檢驗(yàn)的活幼仔中，沒有足趾減少或者其它的異常并且2組之間幼仔以及胎盤的重量相仿。盡管如此，用PGI2類似物補(bǔ)充IVF培養(yǎng)基應(yīng)該被認(rèn)為是一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案。
在這些示范性研究中，我們證明PGI2加強(qiáng)了小鼠胚的植入以及活產(chǎn)潛能不影響胎兒或者胎盤的重量，即前列環(huán)素不加重胎盤或者嬰兒。這是獨(dú)立于植入以及活產(chǎn)加強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，并且顯示前列環(huán)素不同于加強(qiáng)植入以及活產(chǎn)的其它試劑。先前報(bào)道加強(qiáng)植入以及活產(chǎn)的試劑也加重嬰兒，使那些試劑不適合于人的體外受精(IVF)應(yīng)用。而且，因?yàn)樵隗w內(nèi)小鼠模型中前列環(huán)素不影響胎盤以及嬰兒的重量，其可以考慮用于人IVF胚中。
上述小鼠胚的體內(nèi)試驗(yàn)獲得的結(jié)果被認(rèn)為是在包括人的其它哺乳動(dòng)物胚可能獲得的類似有利的體內(nèi)結(jié)果的代表或者預(yù)言，即當(dāng)那些胚在轉(zhuǎn)入子宮之前被類似地用前列腺素或者前列腺素體外處理時(shí)。當(dāng)前人IVF包括向患者的子宮轉(zhuǎn)移8-細(xì)胞階段或者胚泡階段的胚。在這方面，人IVF類似于包括向受孕的載體轉(zhuǎn)移對照或者前列環(huán)素類似物處理的胚的我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。我們的數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)入受孕的載體時(shí)，8-細(xì)胞和桑椹期之間暴露于前列環(huán)素類似物的實(shí)驗(yàn)胚具有比對照胚顯著高的植入率以及活產(chǎn)率(分別如表1以及2所示)。
表1

n.s.不顯著*Fisher’s精確檢驗(yàn)，相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)1.84(95％置信區(qū)間1.39-2.43)+早期和晚期胚泡表示囊胚腔分別占據(jù)＜49％和≥50％的胚。
表2

n.s.不顯著*Fisher’s精確檢驗(yàn)，相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)1.28(95％置信區(qū)間1.04-1.56)**表示為平均值±S.D。
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不經(jīng)更進(jìn)一步的描述，可以相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本發(fā)明的描述最大程度利用本發(fā)明。上述實(shí)施方案是說明性的，而非以任何方式限制其余的公開。雖然本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案已經(jīng)顯示并描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的精神和教導(dǎo)的條件下可以對其進(jìn)行修改。在這里描述的實(shí)施方案只是示范性的，而非限制性的?？梢詫@里公開的本發(fā)明進(jìn)行許多改變以及修改并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的發(fā)明背景中論述的參考文獻(xiàn)不是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)，尤其
公開日在本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)日以前的文獻(xiàn)。所有的專利，專利申請以及在這里引用的公開在此處引入?yún)⒖迹瑢υ谶@里列舉的文獻(xiàn)提供示范性，程序上或者其它的詳細(xì)補(bǔ)充。
權(quán)利要求
1.加強(qiáng)哺乳動(dòng)物胚體外發(fā)育的方法，包括用有效促進(jìn)胚完全孵化量的前列腺素或者其類似物補(bǔ)充培養(yǎng)基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述前列腺素為前列環(huán)素(PGI2)或者前列腺素E2(PGE2)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述前列腺素類似物為伊洛前列素或者前列腺素E1(PGE1)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基的補(bǔ)充是在胚早期發(fā)育階段期間進(jìn)行，在該期間基因組被活化，受精卵發(fā)育成桑椹胚。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述胚為人并且所述早期發(fā)育階段開始于4-至8-細(xì)胞階段。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基的補(bǔ)充在胚的桑椹胚至早期胚泡發(fā)育階段期間進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基的補(bǔ)充在胚的早期發(fā)育階段至桑椹期發(fā)育期間以及桑椹胚至早期胚泡發(fā)育階段期間進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述胚為小鼠并且所述補(bǔ)充包括將培養(yǎng)的胚在收獲2-細(xì)胞發(fā)育階段的胚后24至42小時(shí)之間暴露于前列腺素或者類似物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述胚為小鼠并且所述補(bǔ)充包括將胚在收獲2-細(xì)胞發(fā)育階段的胚后42至72小時(shí)之間暴露于所述前列腺素或者其類似物。
10.提高體外受精胚體內(nèi)植入潛能的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求1的方法加強(qiáng)胚的體外發(fā)育，由此加強(qiáng)胚的孵化潛能并提高體內(nèi)植入潛能。
11.權(quán)利要求9的方法，包括使所述胚完全孵化，其中完全孵化包括從透明帶釋放所述胚。
12.權(quán)利要求10的方法，包括將所述胚植入哺乳動(dòng)物宿主的子宮以及使所述完全孵化與成活懷孕的建立相關(guān)。
13.提高體外受精的哺乳動(dòng)物胚活產(chǎn)潛能的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求1的方法加強(qiáng)胚的體外發(fā)育，從而實(shí)現(xiàn)胚的加強(qiáng)孵化或者加強(qiáng)孵化潛能；將具有加強(qiáng)孵化潛能的胚引入哺乳動(dòng)物宿主的子宮；以及使引入的胚植入所述子宮，其中胚植入宿主子宮的能力相對于植入類似宿主的子宮但沒有這種加強(qiáng)的胚加強(qiáng)。
14.提高體外受精的哺乳動(dòng)物胚群體出生率的方法，包括根據(jù)權(quán)利要求1的方法加強(qiáng)所述胚的體外發(fā)育，從而實(shí)現(xiàn)胚的加強(qiáng)孵化或者加強(qiáng)孵化潛能；將具有加強(qiáng)孵化潛能的胚引入哺乳動(dòng)物宿主；以及使植入的胚體內(nèi)生長，使得具有加強(qiáng)孵化或者加強(qiáng)孵化潛能的活產(chǎn)率大于植入但沒有這種加強(qiáng)的胚的活產(chǎn)率。
15.用于哺乳動(dòng)物胚體外早期發(fā)育的改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中的改進(jìn)包括補(bǔ)充有效促進(jìn)所述胚體外完全孵化量的前列腺素或者其類似物。
16.權(quán)利要求15的培養(yǎng)基，其中前列腺素或者其類似物的所述量可在所述胚從體外培養(yǎng)取出并轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物宿主的子宮后有效加強(qiáng)所述胚的完全孵化潛能。
全文摘要
本發(fā)明公開了加強(qiáng)哺乳動(dòng)物胚體外發(fā)育的方法，包括用有效促進(jìn)胚完全孵化(即，從透明帶釋放胚)量的前列腺素或者前列腺素類似物補(bǔ)充培養(yǎng)基。優(yōu)選在胚的一或者多個(gè)下列發(fā)育階段進(jìn)行培養(yǎng)基的補(bǔ)充(a)當(dāng)基因組活化以及受精卵發(fā)育成桑椹胚時(shí)；以及(b)在胚發(fā)育的桑椹胚至早期胚泡階段期間。由此加強(qiáng)體外受精胚的體內(nèi)植入潛能以及活產(chǎn)潛能并促進(jìn)成活懷孕的建立。
文檔編號(hào)A61K31/557GK1863905SQ200480029052
公開日2006年11月15日 申請日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月8日
發(fā)明者黃照晨, 珍妮弗·S·戈?duì)柶澅? 翁旺崧 申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)董事會(huì)