專利名稱：：一種在放療和/或化療治療之前預敏化癌癥的方法和一種新型細胞因子混合物的制作方法相關申請的交叉引用本申請要求于2003年7月3日提交的美國專利申請系列號10/611,914的優(yōu)先權。引言本發(fā)明涉及一種在治療處理，例如，化療、放療或免疫治療之前預敏化癌癥的突破性方法和一種用于該方法的新型細胞因子混合物。所述細胞因子混合物是無血清的和無促細胞分裂劑的混合物，由細胞因子，例如IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF，與白細胞介素2(IL-2)按特定比例組成，其有效的誘導癌細胞進入增殖性細胞周期階段，從而提高它們對化療、放療和免疫治療的易感性。一種這樣的新型細胞因子混合物是Multikine，其可單獨或與其他藥物組合用于癌癥的治療，從而提高癌癥治療和癌癥病人的無病生存的成功率。
背景技術：
：當前的癌癥、特別是實體腫瘤的治療，主要包括外科手術和隨后的放療和/或化療。Dunne-DalyCF，″Principlesofradiotherapyandradiobiology″，SeminOncolNurs.1999Nov；15(4)250-9；HensleyML等人，″AmericanSocietyofClinicalOncologyclinicalpracticeguidelinesfortheuseofchemotherapyandradiotherapyprotectants.″，JClinOncol.1999Oct；17(10)3333-55。與這樣的療法一同，使用有毒的化學治療劑，例如吉西他濱(Gemcidabin)、長春花堿、順式鉑氨、氟尿嘧啶、甲磺酸伊馬替尼、氨甲蝶呤，它們不能區(qū)分正常細胞和癌細胞。當生效時，這些及其他有毒的化學治療劑對于增加病人的整體生存率作用很小。此外，盡管協(xié)同的組合化療和放療，當前的治療一般也未能改善癌癥病人的5年存活率。即使是抗表皮生長因子受體藥劑、抗血管生成藥物以及使用例如利妥西單抗、Erbitux和曲妥西單抗藥物的免疫和免疫佐劑療法，未能顯著地提高癌癥病人的5年存活率。此外，通過任何上述的療法或其協(xié)同的組合，都沒有改善癌癥類型的癌癥病人的完全的癥狀緩解或無病的生存。進行研究來提高無病存活率或引起完全癥狀緩解的一種治療形式是對癌細胞的細胞分裂周期進行操縱。特別地，周期中的腫瘤細胞一般比非周期中腫瘤細胞對放化療更為易感，因為在細胞周期中需要復雜的生物化學和生物分子的過程，例如依賴于酶的DNA復制、依賴于酶的磷酸化作用、信號級聯(lián)、轉錄活化分子復合物的締合和解離、細胞結構元件的高分子裝配物的形成和解離。通過誘導腫瘤細胞進入細胞周期階段，可以使用抑制任何所述復雜生物化學過程的抗代謝藥劑，例如核糖核苷酸還原酶(RNR)抑制物、二氫葉酸還原酶抑制物或DNA聚合酶抑制物，來終止細胞周期，從而防止腫瘤增殖。然而，利用細胞周期的已知方法限于用化學治療劑的連續(xù)應用來同步延滯細胞周期。例如，一種已知的方法用嘧啶類似物和隨后暴露到高濃度的抗代謝物中，來將惡性細胞延滯在細胞周期的S階段。B.Bhutan等人，CancerRes.33888-894(1973)。在應用了抗代謝物之后，在群體中的少數(shù)或沒有細胞能夠行進超過這個阻滯點。WVogel等人，Hum.Genet.45193-8(1978)。其他努力包括通過改變細胞群體內的細胞周期分布來操縱細胞分裂周期的方法。這些方案刺激惡性細胞從靜止階段進入細胞周期階段，從而提高它們對在易感的DNA復制階段起作用的抗代謝藥物的易感性。HHEuler等人，Ann.Med.Interne.(Paris)145296-302(1994)；BCLampkin等人，JClin.Invest.502204-14(1971)；Alama等人，AnticancerRes.10853-8(1990)。相反地，其他已知的方法禁止正常細胞進入S階段從而保護正常細胞免受趨化性藥物影響。使化學治療與細胞周期階段同步的又一個已知方法是REMoran等，CancerTreat.Rep.6481-6(1980)描述的所謂脈沖劑量化療。在這種方法中，通過輸注羥基脲，小鼠中的白血病腫瘤細胞被滯留在細胞周期的S階段。在輸注之后，細胞被“釋放”以繼續(xù)細胞周期，在細胞周期中給予小鼠第二藥劑(Ara-C)的“脈沖”。意圖是在細胞經過易感的細胞周期S階段時，使第二藥劑的影響最大化。然而，結果表明，盡管在羥基脲輸注后立刻用Ara-C治療的小鼠顯示了提高的生存率，在羥基脲輸注后較晚時間用Ara-C治療的小鼠沒有顯示提高的生存率。明顯地，簡單地用非同時起作用的第二藥劑使細胞周期同步不能改善這兩種藥劑的作用。然而，利用細胞周期的已知方法繼續(xù)尋找在劑量、藥物動力學、順序和安排之間的最佳的、但又是被動的協(xié)同作用?？梢灶A期的是，將細胞群體限制在易感的細胞周期階段，在所述階段細胞對損傷特別易感，可以通過減少對毒性藥物的暴露來使細胞殺傷的動力學向更高效的方向發(fā)展，具有副作用方面的更大降低。然而，利用細胞周期延滯或靜態(tài)同步的實際實驗是令人失望的，因為已知方法不能實際地將細胞誘導入細胞周期。更確切地說，所有已知方法只是使目標細胞群體的細胞周期延滯或靜態(tài)同步的協(xié)同性組合合拍。此外，用來影響細胞周期的藥劑例如嘧啶和羥基脲可對普通細胞造成損害。與延滯細胞周期或使細胞周期同步相反，另一種方法自然是誘導細胞進入細胞周期階段。然而，正如從現(xiàn)有技術從另一方面預示的，誘導細胞進入細胞周期增加了腫瘤的快速生長和復發(fā)的風險。但是已知的組合物提高無病存活率或引起完全癥狀緩解的不斷的失敗表明，需要以一種方式誘導惡性細胞進入細胞周期，所述方式不使腫瘤增殖，但是增加殘余的腫瘤對隨后的放療和/或化療治療的敏感性。因此，需要將腫瘤細胞誘導進入選自G1、S、G2和M(細胞周期的不同階段)的組的細胞周期的方法，這種新方法能與化療、免疫治療和放療協(xié)同地應用。還需要預敏化癌癥腫瘤，一般同時需要一種新型無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物，所述細胞因子混合物包含特定比例的IL-1β比IL-2、TNF-α比IL-2、IFN-γ比IL-2、以及GM-CSF比IL-2，其出人意料地在誘導腫瘤細胞進入細胞周期階段或用于預敏化癌癥方面表現(xiàn)了比已知組合物好得多的效力。發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于一般的預敏化癌癥的方法，和新型無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物，所述混合物具有特定比例的IL-1β比IL-2、TNF-α比IL-2、IFN-γ比IL-2、以及GM-CSF比IL-2。因此，本發(fā)明可使可用于開發(fā)作為藥物或作為佐劑的組合物與，諸如化療、免疫治療和放療的癌癥治療療法一同使用。在本發(fā)明的實施方式中，公開了一種用無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物改善對贅生物或免疫系統(tǒng)疾病的常規(guī)化療或放療的方法。該方法提供了與放療或細胞殺傷的其他物理形式同時使用的用于癌癥治療的預敏化步驟。還預期一種將腫瘤細胞誘導進入選自G1、S、G2和M(細胞周期的不同階段)的組的易感細胞周期階段的方法。本發(fā)明不局限于任何一種特定類型的癌癥，可以包括任何類型的癌癥。具體的應用包括在兩周時間內每周三次在腫瘤周圍，在約20IU到1600IU、或特別地以400IU或以800IU或更高的范圍施用無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物，或更進一步的每周五次，在約20IU到1600IU、或以400IU、或以800IU的范圍內施用，其中IU表示在世界衛(wèi)生組織關于人類IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。另一個實施方式包括新的和不明顯濃度的無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子制劑，例如Multikine。所述細胞因子制劑進一步的可以是藥物組合物的一部分。在特定的應用中，所述新的無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子制劑具有如下特定比例的細胞因子比白細胞介素2(IL-2)比例范圍0.4-1.5的IL-1β比IL-2，優(yōu)選的為0.7±0.1(IL-1β/IL-2)，比例范圍3.2-11.3的TNF-α比IL-2，優(yōu)選的為9.5±1.8(TNF-α/IL-2)，比例范圍1.5-10.9的IFN-γ比IL-2，優(yōu)選的為6.0±1.1(IFN-γ/IL-2)，和比例范圍2.2-4.8的GM-CSF比IL-2，優(yōu)選的為4.0±0.5(GM-CSF/IL-2)。在另一個特定的應用中，所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子制劑或藥物組合物具有進一步不同的細胞因子和Multikine中的其他生物活性小分子，其中每種生物活性小分子與IL-2的比例如下比例范圍0.38-0.68的IL-3比IL-2，優(yōu)選的為0.53±0.15，比例范圍37.2-53.8的IL-6比IL-2，優(yōu)選的為46±5.9，比例范圍261-561.5的IL-8比IL-2，優(yōu)選的為411±10.6，比例范圍0.56-0.94的IL-1α比IL-2，優(yōu)選的為0.75±0.19，比例范圍2.82-3.22的IL-10比IL-2，優(yōu)選的為3.0±0.18，比例范圍1.16-2.84的IL-16比IL-2，優(yōu)選的為1.84±0.68，比例范圍2.16-3.78的G-CSF比IL-2，優(yōu)選的為2.97±0.81，比例范圍1.17-2.43的TNF-β比IL-2，優(yōu)選的為1.8±0.63，比例范圍15.7-37.16的MIP-1α比IL-2，優(yōu)選的為22.7±7.0，比例范圍17.1-28.5的MIP-1β比IL-2，優(yōu)選的為22.8±5.7，比例范圍2.3-2.7的RANTES比IL-2，優(yōu)選的為2.5±0.13，比例范圍0.267-0.283的EGF比IL-2，優(yōu)選的為0.275±0.008，比例范圍3.63-5.42的PGE2比IL-2，優(yōu)選的為4.5±0.87，和比例范圍23.47-25.13的TxB2比IL-2，優(yōu)選的為24.3±0.83。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)勢在以下的說明中闡明。附圖和表格均構成公開內容的一部分，與說明書一同說明和解釋本發(fā)明的原理。本領域的普通技術人員將了解，通過參考附圖和隨后的詳細說明，本發(fā)明的其他方面將更為顯而易見。附圖的簡要說明本專利或申請含有至少一個以彩色制作的附圖。帶有彩色附圖的本申請或專利申請出版物的拷貝將在請求和支付了必要的費用的情況下由官方提供?，F(xiàn)在將通過以下的說明和具體實施方式借助于附圖更詳細地說明本發(fā)明。附圖1，說明Multikine的作用方式。附圖2說明用特定細胞周期標記Ki-67對頭頸癌鱗狀細胞癌變中的腫瘤的免疫組織化學著色。附圖3說明對腫瘤基質和腫瘤上皮的Ki-67免疫組織化學著色的形態(tài)學分析，其中“*”標出了統(tǒng)計學上顯著的差異，p＜0.05[α＝0.05]。發(fā)明和優(yōu)選實施方式的詳細說明本發(fā)明涉及一般而言的預敏化癌癥的方法，和新型無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物，所述混合物由特定比例的IL-1β比IL-2、TNF-α比IL-2、IFN-γ比IL-2，以及GM-CSF比IL-2組成。一種這樣的新型細胞因子混合物是Multikine，其表現(xiàn)了免疫調節(jié)能力。在癌癥病人中進行免疫抑制的臨床意義出人意料地影響了在治療性處理和特別是腫瘤細胞進入細胞周期階段之前的預敏化癌癥的方法。伴隨著輸注細胞因子，例如IL-2、IFNα-γ或IL-12，出現(xiàn)頭頸癌癥病人的免疫恢復。Whiteside，″Immunobiologyandimmunotherapyofheadandneckcancer″，CurrOncolRep2001；346-55。在頭頸癌癥中，基于白細胞介素的細胞因子療法引起了免疫增強。CortesinaG等人，″Interleukin-2injectedaroundtumor-draininglymphnodesinheadandneckcancer″，HeadNeck1991；13125-31；DeStefani等人，″Treatmentoforalcavityandoropharynxsquamouscellcarcinomawithperilymphaticinterleukin-2clinicalandpathologiccorrelations″，JImmunother1996；19125-33；Valente等人，″InfiltratingleukocytepopulationsandT-lymphocytesubsetsinheadandnecksquamouscellcarcinomasfrompatientsreceiyingperilymphaticinjectionsofrecombinantinterleukin2″，ModPathol1990；3702-8；WhitesideTL等人，″Evidenceforlocalandsystemicactivationofimmunecellsbyperitumoralinjectionsofinterleukin2inpatientswithadvancedsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck″，CancerRes1990；535654-62；Barrera等人，″Combinationimmunotherapyofsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck″，ArchOtolaryngolHeadNeckSurg2000；126345-51；Verastegui等人，″Anaturalcytokinemixture(IRX-2)andinterferencewithimmunesuppressioninduceimmunemobilizationandregressionofheadandneckcancer″，IntJImmunopharmacol1997；19619-27；Hadden等人，″Interleukinsandcontrasuppressioninduceimmuneregressionofheadandneckcancer″，ArchOtolaryngolHeadNeckSurg1994；120395-403。例如，已經成功地使用人(r)hIL-2來提高頭頸癌癥病人的免疫功能，所述免疫功能是由細胞毒T淋巴細胞[CTL]和遲發(fā)型超敏反應[DTH]反應來測定的。通過降低T細胞受體(TCR)，其關鍵信號成分是ζ鏈和zap-70的表達、IL-2產生的缺乏和升高的T細胞凋亡，顯示出T細胞反應的降低。WhitesideTL.，″Immunobiologyandimmunotherapyofheadandneckcancer″，CurrOncolRep2001；346-55。對頭頸癌癥中削弱的T細胞功能的原因的研究顯示了Fas-FasL系統(tǒng)、TGF-β和PGE2以高水平表達。然而，rIL-2的體內施用增加了CD25+細胞以及天然殺傷細胞(NK)、人白細胞抗原(HLA)-DR+淋巴細胞和T細胞的密度。在另一個系列的研究中，當淋巴外地或腫瘤周地施用細胞因子混合物時現(xiàn)察到陽性臨床反應。然而，這些研究都沒有將升高的免疫反應與確定的后繼治療，例如手術、放療和/或化療相聯(lián)系。技術Multikine，一種白細胞-白細胞介素注射劑，是從包括T細胞、B細胞和巨噬細胞在內的人外周血單核細胞產生的、無血清、無促細胞分裂劑、無抗生素的制劑。在Multikine中有三個細胞因子“家族”，一同賦予Multikine獨特的生物學活性。它們包括直接的細胞毒的/抑制細胞的和殺病毒/抑制病毒的細胞因子，例如TNF-α和IFN-γ，淋巴增殖細胞因子，例如IL-1和IL-2，和趨化性細胞因子例如IL-6、IL-8和MIP-1α。此外，構成Multikine的不同的細胞因子和生物小分子都來自于體外凝集素(PHA)刺激包括T細胞、B細胞和巨噬細胞在內的人外周血單核細胞。在Ficoll-Paque梯度上離心由供體全血分離的白細胞(包括T細胞、B細胞和巨噬細胞)，進行系列的洗滌(在生理緩沖介質中)促進淋巴細胞的分離，從分離的完全供體血液的白細胞成分中除去紅細胞、細胞碎屑及其他不需要的細胞組分。Multikine含有不同的細胞因子，每種細胞因子與白細胞介素2(IL-2)按以下特定比例存在比例范圍0.4-1.5的IL-1β比IL-2，優(yōu)選的為0.7±0.1(IL-1β/IL-2)，比例范圍3.2-11.3的TNF-α比IL-2，優(yōu)選的為9.5±1.8(TNF-α/IL-2)，比例范圍1.5-10.9的IFN-γ比IL-2，優(yōu)選的為6.0±1.1(IFN-γ/IL-2)，和比例范圍2.2-4.8的GM-CSF比IL-2，優(yōu)選的為4.0±0.5(GM-CSF/IL-2)。在Multikine中還存在不同細胞因子的殘余及其他生物活性小分子，所述生物活性小分子與IL-2比例如下比例范圍0.38-0.68的IL-3比IL-2，優(yōu)選的為0.53±0.15，比例范圍37.2-53.8的IL-6比IL-2，優(yōu)選的為46±5.9，比例范圍261-561.5的IL-8比IL-2，優(yōu)選的為411±10.6，比例范圍0.56-0.94的IL-1α比IL-2，優(yōu)選的為0.75±0.19，比例范圍2.82-3.22的IL-10比IL-2，優(yōu)選的為3.0±0.18，比例范圍1.16-2.84的IL-16比IL-2，優(yōu)選的為1.84±0.68，比例范圍2.16-3.78的G-CSF比IL-2，優(yōu)選的為2.97±0.81，比例范圍1.17-2.43的TNF-β比IL-2，優(yōu)選的為1.8±0.63，比例范圍15.7-37.16的MIP-1α比IL-2，優(yōu)選的為22.7±7.0，比例范圍17.1-28.5的MIP-1β比IL-2，優(yōu)選的為22.8±5.7，比例范圍2.3-2.7的RANTES比IL-2，優(yōu)選的為2.5±0.13，比例范圍0.267-0.283的EGF比IL-2，優(yōu)選的為0.275±0.008，比例范圍3.63-5.42的PGE2比IL-2，優(yōu)選的為4.5±0.87，和比例范圍23.47-25.13的TxB2比IL-2，優(yōu)選的為24.3±0.83。使用特性鑒定方案測定Multikine，Multikine不合有以下細胞因子及其他生物活性小分子IL-4、IL-7、和IL-15、TfR、sICAM，、PDGF-AB、IFN-α、EPO、LTC4、TGF-β2、FGFbasic、血管生成素、sE-選凝素、SCF和LIF。Multikine僅含有痕量(僅僅高于分析的檢測水平)的IL-12和LTB-4。在制造過程中，通過分步梯度離心從人供體“白細胞層”分離單核細胞，用PHA培養(yǎng)以增加培養(yǎng)物中來自供體白細胞的IL-2和其它細胞因子的產生和分泌，如在美國專利5,093,479、4,390,623、4,388,309、4,406,830、4,661,447、4,681,844和4,464,355中公開的，上述文獻通過引用合并在本文中。隨后，無菌地收獲培養(yǎng)物上清液，澄清和進行批量的病毒排阻過程。然后通過超濾作用和微濾將上清液進一步濃縮約10倍。此時，添加人血清白蛋白注射劑USP，然后對濃縮物進行生理pH緩沖，產生每種標示量的目標IL-2濃度(例如400IU/mL)。然后對濃縮物進行第二次微濾(0.22微米級過慮袋)，無菌地分配到無菌血清型小瓶中，按其IL-2含量進行標記。通過用細胞毒T淋巴細胞系(CTLL-2)對放射性標記的胸腺嘧啶核苷的結合來測定產物的效力。通過ELSA進一步測試最終的可注射藥劑中五種標記細胞因子的存在IL-2、IL-1β、GSM-CSF、IFN-γ和TNF-α。提供冷凍在含2.2mL藥物的硅酸硼玻璃血清小瓶中的Multikine，以標示量IL-2(400IU/ml)，用于腫瘤周、腫瘤內、淋巴外或皮下施用。對Multikine進行關于同一性、無菌性、細菌內毒素、pH和總蛋白濃度的質量控制測試。檢查每個小瓶的微粒污染和外觀。制劑具有3mg/mL的總蛋白質含量，其中提供的材料無菌的和無熱原。當藥物保藏在-20℃時，Multikine具有指定的從制造日起的24個月有效期。定義IL-2-白細胞介素2(IL-2)一種由CD4+輔助T淋巴細胞合成的15.5kD糖蛋白(正式地被稱為T細胞生長因子)。IL-2具有作用于生產IL-2的CD4+T淋巴細胞和免疫系統(tǒng)的其它細胞(包括B淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、NK[天然殺傷]細胞及其他細胞)的自分泌效果。IL-1β-白細胞介素1β(IL-1β)一種由活化的單核吞噬細胞合成的17kD細胞因子，在循環(huán)中以游離形式存在，介導炎癥反應。它作用于CD4+T淋巴細胞，幫助促進它們的增殖，并作為生長和分化因子作用于B-淋巴細胞。它還通過單核吞噬細胞誘導IL-6的合成。TNF-α-腫瘤壞死因子α(TNF-α)一種由受刺激的單核細胞、巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、NK細胞合成的157個氨基酸(aa)殘基的蛋白，在循環(huán)中以三聚體形式存在。TNF介導直接的抗腫瘤作用，引起腫瘤細胞溶解、促進白細胞補充、誘導血管生成和促進成纖維細胞增殖。IFN-γ-干擾素γ(IFN-γ)一種由活化的T淋巴細胞和NK細胞合成的21-24kD糖蛋白同源二聚體，是提高單核細胞破壞細胞內微生物和腫瘤細胞的能力的、強大的單核細胞激活物。其具有直接的抗病毒和抗增殖活性，使得許多細胞類型表達II類MHC(主要組織相容性復合體)細胞表面分子復合物，以及提高I類MHC的表達。GM-CSF-粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)在循環(huán)中作為單體存在的127aa蛋白，由巨噬細胞和T淋巴細胞，成纖維細胞和內皮細胞產生。它是造血細胞的生長因子，刺激髓單核細胞譜系的生長和分化。IL-3-白細胞介素-3(IL-3)一種由活化的CD4+T輔助淋巴細胞合成的20kD淋巴因子，通過促使某些造血細胞的增殖和促進T淋巴細胞增殖和分化作為集落刺激因子起作用。IL-6-白細胞介素-6(IL-6)一種由活化的T淋巴細胞、單核吞噬細胞、內皮細胞和成纖維細胞產生的26kD細胞因子。它作用于許多細胞，但在允許活化的B淋巴細胞分化成分泌抗體的漿細胞方面有特殊的功能，并誘導肝細胞形成急性期蛋白(與炎癥反應有關)以及纖維蛋白原。IL-8-白細胞介素-8(IL-8)一種由巨噬細胞和內皮細胞產生的8kD蛋白。它是嗜中性白細胞和T淋巴細胞的強大趨化因子，促進嗜中性白細胞附著到內皮細胞。IL-1α-白細胞介素1α(IL-1α)一種17KD細胞因子(類似于IL-1β)，從33kD的前體分子裂解而來，由活化的單核吞噬細胞合成，在循環(huán)中很少以游離形式存在，作為膜相關物質起作用。它幫助IL-1β調節(jié)炎癥反應。IL-10-白細胞介素-10(IL-10)一種由CD4+和CD8+T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、活化的B淋巴細胞和角質形成細胞產生的18kD的多肽。它抑制巨噬細胞呈遞抗原，特別是向TH1型細胞呈遞抗原，以及分泌IL-6和TNF的能力。IL-16-白細胞介素-16(IL-16)一種由CD8+T淋巴細胞、嗜曙紅細胞、肥大細胞和呼吸上皮細胞產生的14kD四聚體蛋白。它對CD4+T淋巴細胞和單核細胞有強烈的化學吸引性質。G-CSF-粒細胞集落刺激因子(G-CSF)一種由巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞和基質細胞產生的22-25kD的同源二聚體糖蛋白。它增加骨髓中的粒細胞祖細胞，和持續(xù)增加血液中的嗜中性白細胞。它還增強嗜中性白細胞展現(xiàn)增強的超氧化物生產能力，在破壞微生物感染的細胞和腫瘤細胞方面被認為是重要的。TNF-β-腫瘤壞死因子β(TNF-β)一種由活化的淋巴細胞產生的25kD蛋白。它可以殺死培養(yǎng)物中的腫瘤細胞，刺激成纖維細胞的增殖。此外，它模擬TNF-α的大多數(shù)其它作用。MIP-1α-巨噬細胞炎癥蛋白-1α(MIP-1α)一種由巨噬細胞及其他細胞產生的66aa的單體蛋白。它是對單核細胞、T淋巴細胞和嗜曙紅細胞的化學引誘劑。RANTES-一種由T淋巴細胞產生的8kD蛋白，是對單核細胞、T淋巴細胞和嗜曙紅細胞的化學引誘劑，促進炎癥。EGF-表皮生長因子(EGF)一種53aa殘基的三硫酸多肽。EGF是酪氨酸激酶家族的成員，具有多種功能包括刺激促有絲分裂反應和參與傷口愈合。PGE2-前列腺素E2(PGE2)PGE2屬于經由環(huán)加氧酶酶促反應來源于花生四烯酸的生物學活性脂家族。它由活化的單核細胞釋放，阻斷T淋巴細胞和巨噬細胞上的H類MHC表達。TxB2-凝血烷B2(TxB2)TxB2是通過由凝血惡烷合成酶對前列腺素和內過氧化酶PGH2的異構化、來源于多不飽和脂肪酸的生物學活性化合物的成員。TxB2在血栓栓塞性疾病和過敏反應方面具有生理學上的作用。CD25+細胞CD25是單鏈糖蛋白，常常稱為白細胞介素-2受體(IL-2R)的α鏈或Tac抗原，具有55kDa的分子量，位于活化的T和B細胞和活化的巨噬細胞上。它起到IL2受體的作用。與IL-2R的β鏈一同，CD25抗原形成IL-2的高親合性受體復合物。CTLL-2(細胞系)-從C57B1/6小鼠獲得的鼠細胞毒T淋巴細胞系。這個T細胞系的生長和增殖依賴于外源的IL-2。Fas-FasL-Fas/Fas配體系統(tǒng)。在嗜中性粒細胞上的Fas抗原、介導細胞凋亡的細胞表面跨膜蛋白和互補Fas-活化的細胞因子的組合，將凋亡信號轉導入細胞。Fas是屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的I型膜蛋白，F(xiàn)asL是TNF家族的成員。FAS配體是31kDa[千道爾頓](278個氨基酸)的膜結合蛋白。Fas-Fas配體系統(tǒng)在許多生物進程，包括自動反應的淋巴樣細胞的消除方面起到重要的作用。Fas配體在活化的T淋巴細胞中顯著地表達，是細胞毒T淋巴細胞和天然殺傷細胞的主要效應物之一。HLA-DR+淋巴細胞-含有人類白細胞抗原(HLA)-DR抗原的淋巴細胞，由glue序列確定的一組多態(tài)性糖蛋白，glue序列存在于位于染色體6的白細胞基因座中，白細胞基因座是人類中的主要組織相容性座位。IU(國際單位)與特定重量和強度的國際參考標準相比較的生物制品效力的度量單位，例如WHO關于人IL-2的1st國際標準86/504。國際單位是報告生物活性單位的唯一公認和標準化的方法，是公開的和來自國際協(xié)作研究成果的。U(生物活性的度量單位)-“單位”的變體的縮寫，是各個實驗室作為參考而派生的，對進行工作的實驗室是獨特的。各“單位”在一個實驗室和另一個實驗室之間不同，不象國際單位(IU)一樣是全球公認的標準。單核浸潤-單核細胞、漿細胞和淋巴細胞在它們“通?！辈粫嬖诘慕M織中存在；或這些細胞以大的數(shù)量或豐度在簇群中的存在，正常情況下在所述簇群中它們一般僅以少量存在。TCRζ鏈-T細胞受體ζ鏈。ζ亞基是TCR復合物的部分，靶向TCR細胞表面受體與其配體(抗原)的相互作用。擴展到細胞的細胞質(胞質液)中的ζ亞基在T細胞活化時在其酪氨酸殘基上被磷酸化，與TCR連接后的信號轉導有關。TIL(腫瘤浸潤淋巴細胞)-分離自腫瘤的T淋巴細胞，所述腫瘤被T淋巴細胞浸潤。腫瘤浸潤淋巴細胞具有很小的，或沒有細胞毒性。TIL包括CD4+CD8+優(yōu)勢T細胞，可以通過在存在IL-2的情況下培養(yǎng)在體外擴展。通過IL-2處理來活化這些細胞，與正常的淋巴因子活化的細胞相比，通常對分離出它們的腫瘤具有更大的侵略性?？梢酝ㄟ^IFN-γ增強TIL的細胞毒活性。TEL的體內抗腫瘤活性可被TGF-β阻斷。ZAP70-與TCRζ鏈締合的70kD的ζ締合蛋白，TCRζ鏈是胞質液中存在的酪氨酸激酶。ZAP70被認為參與了維持T淋巴細胞受體信號、調節(jié)信號轉導，最終產生IL-2。ZAP70基因在T細胞和天然殺傷細胞中表達，位于人類染色體2q12上。ζ(Zeta)鏈-參見TCRζ鏈ζ鏈基因位于人的染色體1上。這個蛋白的細胞外區(qū)為九個氨基酸長度，而橫跨膜區(qū)含有帶負電的天冬氨酸殘基，以及細胞質區(qū)長度是113個氨基酸。細胞質尾部含有存在于CD3鏈的尾部中的三個抗原識別基序。ζ鏈也與其他受體，例如NK細胞的Fc(片段、晶體)-γ受體締合。USP-美國藥典專論。P-“p＜0.01”數(shù)理統(tǒng)計學中的術語，表示在預設條件下發(fā)生事件的概率水平。ANOVA(差異分析)-如在統(tǒng)計學和數(shù)學教科書中描述的單因素分析，例如“HandbookofStatisticalMethodsforEngineersandScientists″，HarrisonM.Wadsworth，Jr.，Ed，McGrawHill1990和“StatisticalOperationsAnalysisofHealthResearchData”，RobertP.Hirch和RichardK.Riegelman，Eds.BlackwellScienceInc.，1996。Multikine的作用模式和特征Multikine是在此所述的設定條件下產生的天然衍生的和天然發(fā)生的人類細胞因子的、生物活性的、最低度毒性的、免疫調節(jié)混合物。Multikine可被用于抗癌和抗病毒治療，或作為對于癌癥、感染疾病和其他與免疫調節(jié)有關的疾病狀況具有廣譜應用的新型輔助治療。Multikine可以通過本領域內已知的方法制造。參見Mizeletal.，″PurificationtoApparentHomogeneityofMurineInterleukin1″，J.Immunol.126834(1981)；Togawaetal.，″CharacterizationofLymphocyte-ActivatingFactor(LAF)ProducedbyHumanMononuclearCellsBiochemicalRelationshipofHighandLowMolecularWeightFormsofLAF″，J.Immunol.1222112(1979)；Lachmanetal.，″PurificationofHumanInterleukin1″，Chem.Abstr.94137539t(1981)ofJ.Supramolec.Struct.13457(1980)；Lachmanetal.，“PartialPurificationofHumanLymphocyteActivatingFactor″，Chem.Abstr.93165824e(1980)ofPrep.Biochem.10387(1980)；Mizeletal.，″CharacterizationofLymphocyteActivatingFactorObtainedfromtheMurineMicrophageCellLineP388DI″，Chem.Abstr.9393346a(1980)，ofBiochem.Charact.Lymphokines，Proc.Int.LymphokineWorkshop2nd(1979)pp.411-418；Economouetal.，″Purification，PhyaicochemicalCharacterizationandaBiologicalRoleofLymphocyteActivatingFactor(LAF)″，Chem.Abstr.9393347b(1980)ofBiochem.Charact.Lymphokines，Proc.Int.LymphokineWorkshop，2nd(1979)pp.419-421；Simonetal.，″TheRoleofSubcellularFactorsinPulmonaryImmuneFunctionPhysicochemicalCharacterizationofTwoDistinctSpeciesofLymphocyte-ActivatingFactorProducedbyRabbitAlveolarMacrophages″，J.Immunol.1261534(1981)。動物研究也表明，“混合的白細胞介素”可能具有體外免疫調節(jié)和免疫刺激活性。Hadden等人，″MixedInterleukinsandThymosinFractionVSynergisticallyInduceTLymphocyteDevelopmentinHydrocortisone-TreatedAgedMice″，Cell.Immunol.144228-236(1992)。不限于任何一個本發(fā)明的理論，一個可能的假設是，“混合的白細胞介素”例如Multikine的局部/區(qū)域注射克服了局部免疫抑制。隨后，打破對腫瘤抗原的間斷耐受性，容許發(fā)生有效的局部抗腫瘤免疫反應。已經表明，在腫瘤區(qū)域中白細胞介素的局部滴注或將白細胞介素基因實際轉染入腫瘤，顯著地增加引起腫瘤衰退的抗腫瘤免疫反應，如Golumbek等人，″TreatmentofEstablishedRenalCancerbyTumorCellsEngineeredtoSecreteInterleukin-4″，Science254713-716(1991)所報道的。然而，這些研究都沒有發(fā)現(xiàn)將惡性細胞誘導入細胞周期階段而不引起腫瘤活躍增生的極度意外的效果。相當出人意料地，手術前施用Multikine引起細胞周期階段中的腫瘤細胞數(shù)目的增加，同根據現(xiàn)有技術所推定的相反，不增加腫瘤更加快速生長或更快速復發(fā)的風險。將腫瘤細胞誘導入細胞周期的能力似乎是Multikine獨特的，可能是由于存在于這種研究性藥物中的不同細胞因子的協(xié)同效應和這些細胞因子對宿主免疫系統(tǒng)和腫瘤細胞的不同影響。關于手術前用Multikine治療的病人的復發(fā)率的數(shù)據顯示了在用Multikine治療后24個月沒有癌癥復發(fā)。顯著地，8人小群體的連續(xù)治療的病人在后續(xù)的24個月期間沒有一個復發(fā)的病人。在空白對比中，文獻教導了在手術后18-24個月類似病人的復發(fā)率約50％。特別地，Multikine治療似乎不會誘導腫瘤殘余淋巴樣細胞的活躍增生。相應地，在Multikine治療后基質Ki-67+細胞減少了，而Ki-67+癌細胞的頻率提高了。因而，Multikine治療誘導了周期性腫瘤細胞數(shù)目的增加，引起殘余腫瘤對隨后用輻射和/或化療的改進型治療的提高的敏感性。盡管用天然的和重組的細胞因子進行的其他研究已經顯示了在癌癥療法的治療方面的效力，這些研究沒有教導誘導進入細胞周期階段或將Multikine與化療、免疫治療和放射療法協(xié)同組合的新方法。例如，對天然和重組人IL-2及其他細胞因子在局部-區(qū)域治療中的用途的研究表現(xiàn)了在各種位點的免疫增強和抗癌活性。特別地，IL-2表現(xiàn)了在胸膜腔、肝臟和膀胱中的活性，IFN-α表現(xiàn)了在卵巢中的活性，IFN-β表現(xiàn)了在腦中的活性，參見Yasumotoetal.，″Inductionoflymphokine-activatedkillercellsbyintrapleuralinstillationsofrecombinantintetleukin-2inpatientswith，malignantpleurisyduetolungcancer″，CancerRes1987；472184-7；Mavilgitetal.，″Splenicversushepaticarteryinfusionofinterleukin-2inpatientswithlivermetastases″，JClinOncol1990；8319-24；Pizzaetal.，″Tumorregressionafterintralesionalinjectionofinterleukin-2(IL-2)inbladdercancer.Preliminaryreport″，IntJCancer1984；34359-67；Bereketal.，″Intraperitonealrecombinantα-interferonfor″salvage″immunotherapyinstageIIIepithelialovariancanceragynecologiconcologygroupstudy″，CancerRes1985；454447-53；andFetteletal.，″Intratumoradministrationofbeta-interferoninrecurrentmalignantgliomas-AphaseIclinicalandlaboratorystudy″，Cancer1990；6578-83。更進一步的，已經顯示出IFN-γ表現(xiàn)了在皮膚中的活性，TNF-α表現(xiàn)了在生殖器中的活性，各種細胞因子的混合物表現(xiàn)了在頭和頸中的活性，如Edwards等人，″Theeffectofintralesionalinterferongammaonbasalcellcarcinomas″，JAmAcadDermatol1990；22496-500；Irie等人，″Acaseofvulvacancerrespondingtotherecombinanthumantumornecrosisfactor(PT-950)localinjectiontherapy″，GanNoRinsho1988；34946-50；和Pulley等人，“Intravenous，intralesionalandendolymphaticadministrationoflymphokinesinhumancancer”，LymphRes1986；5S157-63所報道的。此外，手術前在頸部淋巴周或頸部淋巴周及顎下施用重組IL-210天的研究顯示了壞死和淋巴浸潤參見下述文獻Valenteetal.，″InfiltrationleukocytepolulationsandT-lymphocytesubsetsinheadandnecksquamouscellcaroinomasfrompatientsreceivingPerilymphaticinjectionsofrecombinantinterleukin-2″，ModPathol1990；3702-8andDeStefanietal.，″Treatmentoforalcavityandoropharynxsquamouscellcarcinomawithperilymphaticinterleukin-2clinicalandpathologiccorrelations″，JImmunother1996；19125-33。所報導的。此外，切除的腫瘤的微觀檢驗表明了與IL-2的臨床觀察相關的淋巴浸潤方面的提高，如Saito等人，″Immunohistologyoftumortissueinlocaladministrationofrecombinantinterleukin-2inheadandneckcancer″，NipJibiGakkaiKaiho1989；921271-6。盡管如此，上述的研究都沒有顯示在切除的腫瘤的大體尺寸方面的任何變化，盡管在20位頭頸癌癥病人中在推定的高劑量重組IL-2(800,000U四周[U＝單位])有兩個癥狀緩解，如Saito等人，″ClinicalevaluationoflocaladministrationofrIL-2inheadandneckcancer″，NipJibiGakkaiKaiho.1989；921271-6所報道的。此外，上述研究受到小數(shù)目的病人的限制和受到缺乏與對照組的病理比較的妨礙。盡管DeStefani等人最新對202位OSCC病人的隨機的多中心階段III研究表明，在手術前向同側頸部淋巴結鏈低劑量(5000U/天[U＝單位])淋巴周施用重組人IL-210天，引起無病生存的顯著增加(P＜0.01)，依次引起更長的整體生存(p＜0.03)，DeStefani等人沒有評定這種治療方式對細胞周期的作用和它對改進輻射和化療的效果。DeStefani等人，″ImprovedSurvivalWithPerilymphaticInterleukin2inPatientsWithResectableSquamousCellCarcinomaoftheOralCavityandOropharynx″，Cancer2002；9590-97。此外，盡管教導了5000U/天，關于DeStefani等人教導的“高”和“低”劑量的施用生物學，由于藥物的效力是通過不確定的U(單位)來度量的，在本發(fā)明和DeStefani等之間無法進行比較。與此相反，對于按IU(國際單位)測定Multikine的生物學活性，本發(fā)明驗證和完成了完整的USP分析方法批準程序。方法用免疫組織化學Ki-67標記，或其他等同的手段例如通過使用PCNA標記、p53標記來測定的腫瘤細胞增殖用作預后的參數(shù)。參見deVicenteetal.，“ExpressionofcyclinD1andKi-67insquamouscellcarcinomaoftheoralcavityclinicopathologicalandprognosticsignificance″，OralOncol2002；38301-8；Bettendorfetal.，“PrognosticrelevanceofKi-67antigenexpressionin329casessoforalsquamouscellcarcinoma″，ORLJOtorhinolarymgsolRelatSpec2002；64200-5。結合地，流式細胞計數(shù)法或常規(guī)的染色法，和臨床的、組織病理學的和腫瘤分階段和分類鏡檢術(TNM、腫瘤、結、轉移)，與其他方法一同來表明疾病進程的侵略性。Kerdpon等人，″Expressionofp53inoralmucosalhyperplasia，dysplasiaandsquamouscellcarcinoma″，OralDisease386-92，1997。特別地，Ki-67細胞增殖標記是有區(qū)別的，僅特異于處于細胞周期階段的細胞。G1是第一個生長階段；S是第二階段，以細胞的DNA合成起始為記號，在細胞中細胞DNA復制，G2是第二個生長階段，DNA復制后的細胞在大小上加倍。M是細胞周期中的最后一個階段，發(fā)生有絲分裂，其中細胞從原始的母細胞分裂成為子細胞。產生的每個細胞含有原始母細胞的DNA的完整復制物。特異于細胞周期中的細胞的Ki-67細胞標記不存在于處在G0期的細胞中，G0期是細胞的休止期。在G0期間，細胞不經歷細胞復制、增殖或DNA復制。顯著地，細胞周期階段現(xiàn)象對于所有活的真核細胞，包括腫瘤細胞，是性質上共同的。確定在外科切除之后殘余腫瘤細胞巢中Ki-67的存在以檢測腫瘤細胞增殖。參見Raybaudetal.，“NuclearDNAcontent，anadjuncttop53andKi-67asamarkerofresistancetoradiationtherapyinoralcavityandpharyngealsquamouscellcarcinoma”，IntJ.OralMaxillofacSurg2000；2936-41；Koelbletal.，“p53andKi-67aspredictivemarkersforradiosensitiveityinsquamouscellcarcinomaoftheoralcavity？Animmunohistochemicalandclinicopathologicstudy”，IntJRadiatOncolBiolPhys2001；49147-54。一般地，可以在經歷著細胞周期G1、S、G2和M的細胞中發(fā)現(xiàn)Ki-67，但不能在“靜止”的腫瘤細胞(G0)中發(fā)現(xiàn)。因為周期性腫瘤細胞對于放療和化療是更為敏感的，非周期性腫瘤細胞對放療和化療是局外的和高抗性的。因此，設計一項研究，通過免疫組織病理學分析來自頭頸癌癥病人的腫瘤，所述病人在外科切除殘余腫瘤之前用Multikine治療，然后進行放療。參見Timáretal.，“TheeffectofLeukocyteInterleukin，Injectionontheperi-andintratumoralsubpopulationofmononuclearcellsandontumorepithelia-Apossiblenewapprcachtoaugmentionsensitivitytoradiationandchemotherapyinoralcancet.Amulti-centerPhaseI/IIclinicaltrial”，TheLaryngoscope，Vol，113December2003。以盲目的方式實施該研究，由第三個獨立的、有資格的、不了解治療和病人群體的病理學家執(zhí)行，所述病人群體是被治療的或對照。在此報告我們的臨床研究結果并引入作為參考，通過引用，即作為I-II期臨床試驗的部分分析了一組54位口腔扁平細胞癌癥病人(H&NC)。對這些病人進行治療方式的安全性、腫瘤和臨床反應，和單核浸潤與細胞周期速率的組合的研究。一組54位病人群體中的27位病人按劑量逐步升高的方式接受了Multikine的腫瘤周施用。這項研究表明，用Multikine預處理頭頸癌癥病人，腫瘤被誘導進入細胞周期階段G1、S、G2和M，而不是G0。這引起復發(fā)率的下降，和Multikine治療的病人的無病生存的提高。在我們的研究中，按以下方式進行Multikine施用對于每個測試的劑量組，按照以下劑量在兩周(每周3次)期間腫瘤周地注射日劑量低劑量，每天400IU(IL-2的國際單位)[IL-2當量](8位病人)，中等劑量，每天800IU(IL-2當量)(12位病人)，以及每周5次的高劑量，每天800IU(IL-2當量)(7位病人)。所有Multikine注射劑都被皮膚內地施用在可見的/明顯的腫瘤塊的周圍。在最初施用Multikine后的21天和28天進行針對殘余腫瘤塊的切除手術。在傷口愈合后，在術后不同的時間，對手術后的病人進行局部/區(qū)域放射治療，取決于各個病人的外科手術恢復情況。一般在術后兩到四周間開始放療。Multikine施用前進行單次環(huán)磷酰胺的靜脈內輸注，在第一次Multikine施用前三天輸注300mg/m2。自己口服施用(與食物一同)吲哚氯甲酰(25mg)，每天三次，在環(huán)磷酰胺施用后3天開始，直到手術前24小時。在環(huán)磷酰胺施用后3天直到手術前24小時，自己施用硫酸鋅(50mg)和多種維生素補充物，每天一次。建議并鼓勵病人手術后繼續(xù)自我施用多種維生素和鋅的服用。這些藥劑對腫瘤細胞周期沒有任何影響，以低于這些藥物的正常癌癥治療3-5倍的劑量給藥。結果通過Ki-67表達檢測周期中的細胞來鑒定如附圖1所示的癌細胞和基質細胞(宿主細胞單核細胞、成纖維細胞、內皮細胞等)。對Ki-67+癌細胞的密度的形態(tài)學分析表明，除了最高Multikine劑量的施用之外，Multikine治療誘導了處于周期中的腫瘤細胞的顯著的增加(p＜0.05)，如附圖2所示。另一方面，圖2還顯示出主要在腫瘤的基質區(qū)域存在的處于周期中的宿主細胞的發(fā)生率，隨著Multikine劑量的提高而減少。對于最低和最高劑量，效果被證明是顯著的(p＜0.05)。這些發(fā)現(xiàn)支持了這樣的結論，運用Multikine治療的處理引起癌細胞進入細胞周期階段，但不使宿主免疫細胞或基質細胞進入細胞周期。因此，本發(fā)明預期，根據Ki-67抗原的表達，Multikine治療誘導高比例的腫瘤細胞進入細胞周期。如在此表述的，關于手術前用Multikine治療的病人的復發(fā)率的初步數(shù)據，在用Multikine治療后24個月沒有出現(xiàn)復發(fā)率的升高，所述病人隨后進行放射治療或觀察等待。顯著地，連續(xù)Multikine治療的8人小組在后續(xù)的24個月期間沒有一個復發(fā)的病人。與此相反，文獻教導了在手術后18-24個月類這些病人的復發(fā)率約50％。此外，Multikine治療似乎不誘導腫瘤殘留淋巴樣細胞的活躍增生，相應地基質Ki-67+細胞減少了，而在Multikine治療后Ki-67+癌細胞的頻率提高了。因而，Multikine治療誘導了周期腫瘤細胞數(shù)目的增加，引起殘余腫瘤對用輻射和/或化療的改進型治療的提高的敏感性。Multiline對癌癥的治療方式用Multikine進行癌癥的預敏化的治療方式是以為頭頸癌癥病人開發(fā)的治療方案為基礎的，其已經以統(tǒng)計學上顯著的方式被證明顯著地提高腫瘤細胞進入周期，使得這些腫瘤細胞對隨后的放射和化學治療更加敏感。治療包括在下頜下的頸部淋巴結鏈的區(qū)域中皮下地施用Multikine。2周期間，以按照IL-2約20IU到1600IU范圍的日劑量，十次皮下的/真皮下的Multikine日注射，在腫瘤塊邊緣的周圍腫瘤周地施用1/2，在腫瘤塊同側下頜下的淋巴鏈施用1/2。另一個療程優(yōu)選的在40IU到800IU的范圍內。再另一個范圍可以是35IU到75IU的范圍。建議的治療的一個具體的非限制性的實施例預期以按照IL-255IU的日劑量，在兩周時間內施用Multikine十次(10次)皮下的/真皮下的日注射。藥物安全、試驗性效力和組合物已經在超過190例癌癥、HIV和HIV/HPV感染的病人中測試了Multikine，沒有與Multikine施用相關的嚴重的有害事件，參見Harrisetal.，″Immunologicapproachestothetreatmentofprostatecancer″，SeminOncol.1999Aug；26(4)439-7；Timáretal.，″TheeffectofLeukocyteInterleukin，Injectionontheperi-andintratumoralsubpopulationofmononuclearcellsandontumorepithelia-Apossiblenewapproachtoaugmentingsensitivitytoradiationandchemotherapyinoralcancer，Amulti-centerPhaseI/IIclinicaltrial″，TheLaryngoscope，Vol.113December2003；Brownetal.，″APhaseIOpen-LabelStudyofLeukocyte.Interleukin，InjectioninHIV-1infectedindividualspreliminaryevidenceforimproveddelayed-typehypersensitivityresponsestorecallantigens″，AntiviralTherapy5(supplement)18，2000；Tayloretal.，″ImmunotherapywithLeukocyteInterleukin，Injectionforhumanpapillomavirus(HPV)inducedcervicaldysplasiainHIVpatients″，AnnualMeetingoftheInternationalSocietyforInterferonandCytokineResearch，Cleveland，OH，October2001；Tayloretal.，″ImmunotherapywithLeukocyteInterleukin，Injectionforhumanpapillomavirus(HPV)inducedcervicaldysplasiainHIVpatients″，33rdSGOConference，Miami，F(xiàn)L，March2002所報道的。在小鼠、鼠、豚鼠和犬的動物毒理學研究中，Multikine也被證明是安全的。此外，在頭頸癌癥和子宮頸發(fā)育異常中測試和證明了Multikine的試驗性效力。Multikine可被進一步與一個或多個藥學上可接受的載體或佐劑一同，預防性地或治療性地用作免疫調節(jié)組合物的成分。當預防性地使用時，在任何明顯的感染或疾病之前提供該免疫調節(jié)組合物。有可能以純的或基本上純的形式施用Multikine，也可同時使用藥物組合物、制劑或制備物。用于臨床的和用于人的本發(fā)明的制劑，包含如上所述的Multikine以及一個或多個藥學上可接受的載體，和選擇性地包括其他治療成分，特別是治療性的免疫佐劑。載體必須是“可接受的”，意思是與制劑的其他成分相容，不為其接受者帶來傷害。一般地，均一地和細密地制備制劑，使活性成分與液體載體或細碎的固體載體、或這兩者相連，然后，如果有必要，使產物形成期望的劑型。在此使用的術語“藥學上可接受的載體”是指任何載體、稀釋劑、賦形劑、懸浮劑、潤滑劑、位劑、載體、輸送系統(tǒng)、乳化劑、崩解劑、吸收劑、防腐劑、表面活性物質、著色劑、香味劑或甜味劑。制劑可以方便地以單位劑量形式存在，可以通過藥學領域任何公知的方法來制備。適合于靜脈內、肌肉內、皮下或腹膜內、鼻部等施用的制劑為便于施用可包含活性成分的無菌水溶液，溶劑優(yōu)選的及溶劑是與接受者的血液等滲的。本發(fā)明的化合物也可以口服地、胃腸外地施用，通過吸入噴霧、表面地、直腸地、口腔地、或通過植入的儲存器，以含有常規(guī)的無毒藥學上可接受的載體、佐劑和賦形劑的劑量制劑的形式施用。在此使用的術語胃腸外的包括皮下的、靜脈內、肌肉內、腹膜內、鞘內、心室內、胸骨內的和顱內的注射或輸注技術。這種制劑可以通過將固體活性成分溶解在水中產生水溶液，并使該溶液無菌化來方便地制備，所述水含有生理學相容的物質，例如氯化鈉(例如，0.1-2.0M)、甘氨酸等，并具有與生理條件相容的緩沖的pH。這些可以置于單位劑量或多劑量的容器中，例如密封的安瓿瓶或小瓶。本發(fā)明的化合物也可以以無菌的可注射制劑的形式施用，例如，作為無菌的可注射水性的或油質的懸浮液。這些懸浮液可以根據本領域已知的技術使用適合的分散劑或潤濕劑和懸浮劑來配制。無菌可注射制劑也可以是處于無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑，例如，1，3-丁二醇溶液中的無菌可注射溶液或懸浮液。在可接受的載體和溶劑之中，可以使用的有水、Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油通常用作溶劑或懸浮介質。為此，可以使用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。脂肪酸例如油酸和其甘油酯衍生物，包括橄欖油和蓖麻油，特別是它們的的聚氧乙撐化的變體，在可注射制劑中是有用的。這些油劑或懸浮液也可含有長鏈醇類稀釋劑或分散劑。本發(fā)明的化合物也可以表面地施用，特別是當需治療的條件涉及通過表面施用易達到的區(qū)域或器官時，包括眼睛、皮膚、或較低的腸道的失調。適合的表面制劑對于這些區(qū)域的每一個都是易于制備的。對于針對眼睛或眼科用途的表面應用，化合物可以被配制為等滲的、調整了pH的無菌鹽水中的微?；瘧腋∫海騼?yōu)選的，配制為等滲的、調整了pH的無菌鹽水中的溶液，可以具有或沒有防腐劑，例如benzylalkonium氯化物。做為選擇，Multikine的眼科用途可以是配置在軟膏，例如礦脂中的。對于皮膚的表面施用，化合物可以被配制在適合的軟膏中，所述軟膏含有懸浮于或溶于例如以下一種或多種的混合物中的化合物礦物油、液體石蠟、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。做為選擇，活性化合物可以被配制在適合的洗液或乳膏劑中，所述洗液或乳膏劑含有懸浮于或溶于例如以下一種或多種的混合物中的活性化合物礦物油、脂酸山梨糖醇酐酯、聚山梨酸酯60、十六烷基酯蠟、cetearylalcohol、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。與載體物質組合產生單個劑量形式的活性成分的數(shù)量可以取決于治療的宿主和施用的特定模式而變化。這些因素包括具體使用的化合物的活性，病人的年齡、體重、總體健康狀態(tài)、性別和飲食，施用的時間，排出的比率，藥物組合，和待治療的特定疾病的嚴重度以及施用的形式。可以應用藥學方法來控制作用的持續(xù)時間。可以通過使用聚合物來復合或吸收肽來實現(xiàn)控制釋放制劑。受控的給藥可以通過選擇合適的高分子(例如，聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白)和高分子的濃度，以及用于控制釋放的摻合方法來實行。例如，Multikine可被摻合入疏水的聚合物基質來在數(shù)天期間控制釋放。這種控制釋放膜劑是本領域公知的。特別優(yōu)選的的是經皮給藥系統(tǒng)?？捎糜诒景l(fā)明的、通常為此目的使用的聚合物的其他實例包括非降解的乙烯-醋酸乙烯酯共聚物和可在外表和內部使用的可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物。某些水凝膠例如聚(羥基乙烷基異丁烯酸酯)或聚(乙烯基乙醇)也是有用的，但與其他聚合物釋放系統(tǒng)，例如上述那些相比有更短的釋放周期。做為選擇，不將這些藥劑摻合入聚合物粒子，有可能將這些材料捕集在制備的微囊中，例如通過凝聚技術或通過界面聚合作用制備的微囊，例如，分別為羥甲基纖維素或明膠微囊、和聚(異丁烯酸甲酯)微囊，或捕集在膠體藥物遞送系統(tǒng)中，例如脂質體、白蛋白微球、微乳劑、毫微粒子和毫微囊劑，或捕集到大乳劑中。為了有效的治療例如中樞神經系統(tǒng)的目標，當外圍地施用時，Multikine還應當易于穿透血腦屏障。通過心室內的途徑或其他適合于向腦部施用的適當遞送系統(tǒng)，可以有效地施用不能穿透血腦屏障的化合物。Multikine也可以以單獨的試劑盒的形式，或以如上所述的藥物組合物的形式提供。Multikine的施用可以通過常規(guī)方法進行。例如，Multikine可以用于適合的稀釋劑，例如鹽水或水，或完全或不完全佐劑中?？梢酝ㄟ^適合于免疫系統(tǒng)刺激的任何途徑，例如靜脈內、腹膜內、肌肉內的、皮下的、鼻部、口服、直腸、陰道等等，施用Multikine。如上所述，Multikine可以用于預防目的或治療目的。當為預防性時，在有任何跡象之前，或在有由疾病導致的任何癥狀之前提供Multikine。當為治療性時，在疾病發(fā)作之時(或之后)，或疾病的任何癥狀發(fā)作之時提供Multikine。Multikine的治療性施用足以衰減疾病和提高常規(guī)治療的成果。因而已經描述了本發(fā)明，顯而易見的是可以在許多方面進行變化。這樣的變化不被認為是偏離了本發(fā)明的精神范圍，所有這樣的修改都被包括在以下的權利要求的范圍之中。權利要求1.一種在治療性處理之前預敏化癌癥的方法，包括步驟向癌癥施用治療有效量的無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物。2.權利要求1的方法，其中所述治療法選自化療、免疫治療和放療。3.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以約20IU到1600IU的范圍，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。4.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以約40IU到800IU的范圍，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。5.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以約35IU到75IU的范圍，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。6.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以55IU，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。7.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以400IU，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。8.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以800IU，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。9.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以800IU，在兩周時間中每周五次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。10.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑細胞因子混合物由如下特定比例的選自IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的細胞因子比白細胞介素-2比例范圍0.4-1.5的IL-1β比IL-2；比例范圍3.2-10.9的TNF-α比IL-2；比例范圍1.5-10.9的IFN-γ比IL-2；和比例范圍2.2-4.8的GM-CSF比IL-2。11.權利要求10的方法，其中所述細胞因子的特定比例如下比例范圍0.6到0.8的IL-1β比IL-2；比例范圍7.7到11.3的TNF-α比IL-2；比例范圍4.9到7.1的IFN-γ比IL-2；和比例范圍3.5到4.5的GM-CSF比IL-2。12.權利要求1的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑細胞因子混合物是Multikine。13.一種誘導腫瘤細胞進入選自G1、S、G2和M的細胞周期的方法，包括步驟向癌細胞施用治療有效量的無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物。14.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以約20IU到1600IU的范圍，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。15.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以約40IU到800IU的范圍，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。16.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以約35IU到75IU的范圍，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。17.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以55IU，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。18.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以400IU，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。19.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以800IU，在兩周時間中每周三次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。20.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物以800IU，在兩周時間中每周五次地腫瘤周施用，其中IU代表在世界衛(wèi)生組織關于人IL-2的1st國際標準中給出的白細胞介素-2的國際單位，86/504。21.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑細胞因子混合物由如下特定比例的選自IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的細胞因子比白細胞介素-2(IL-2)組成比例范圍0.4-1.5的IL-1β比IL-2；比例范圍3.2-10.9的TNF-α比IL-2；比例范圍1.5-10.9的IFN-γ比IL-2；和比例范圍2.2-4.8的GM-CSF比IL-2。22.權利要求21的方法，其中所述細胞因子的特定比例如下比例范圍0.6到0.8的IL-1β比IL-2；比例范圍7.7到11.3的TNF-α比IL-2；比例范圍4.9到7.1的IFN-γ比IL-2；和比例范圍3.5到4.5的GM-CSF比IL-2。23.權利要求13的方法，其中所述無血清和無促細胞分裂劑細胞因子混合物是Multikine。24.一種無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物，包括如下特定比例的選自IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的細胞因子比白細胞介素-2(IL-2)比例范圍0.4-1.5的IL-1β比IL-2；比例范圍3.2-10.9的TNF-α比IL-2；比例范圍1.5-10.9的IFN-γ比IL-2；和比例范圍2.2-4.8的GM-CSF比IL-2。25.權利要求24的無血清和無促細胞分裂劑的細胞因子混合物，其中所述細胞因子的特定比例如下比例范圍0.6到0.8的IL-1β比IL-2；比例范圍7.7到11.3的TNF-α比IL-2；比例范圍4.9到7.1的IFN-γ比IL-2；和比例范圍3.5到4.5的GM-CSF比IL-2。26.一種用于治療癌癥的藥物組合物，包括如下特定比例的選自IL-1β、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的細胞因子比白細胞介素-2(IL-2)比例范圍0.4-1.5的IL-1β比IL-2；比例范圍3.2-10.9的TNF-α比IL-2；比例范圍1.5-10.9的IFN-γ比IL-2；和比例范圍2.2-4.8的GM-CSF比IL-2，和選擇性地與藥學上可接受的賦形劑、載體或添加劑組合。27.權利要求26的藥物組合物，其中所述細胞因子的特定比例如下比例范圍0.6到0.8的IL-1β比IL-2；比例范圍7.7到11.3的TNF-α比IL-2；比例范圍4.9到7.1的IFN-γ比IL-2；和比例范圍3.5到4.5的GM-CSF比IL-2。28.權利要求27的藥物組合物，進一步包括IL-3比IL-2比例在0.38-0.68中，優(yōu)選的0.53±0.15的范圍。29.權利要求27的藥物組合物，進一步包括IL-6比IL-2的比例在46±5.9，優(yōu)選在37.2-53.8的范圍內。30.權利要求27的藥物組合物，進一步包括IL-8比IL-2比例在261-561.5，優(yōu)選的411±10.6的范圍。31.權利要求27的藥物組合物，進一步包括IL-1α比IL-2的比例在0.56到0.94，優(yōu)選的0.75±0.19的范圍內。32.權利要求27的藥物組合物，進一步包括IL-10比IL-2的比例在2.82-3.22，優(yōu)選的3.0±0.18的范圍內。33.權利要求27的藥物組合物，進一步包括IL-16比IL-2的比例在1.16-2.84，優(yōu)選1.84±0.68的范圍內。34.權利要求27的藥物組合物，進一步包括G-CSF比IL-2的比例在2.16-3.78，優(yōu)選2.97±0.81的范圍。35.權利要求27的藥物組合物，進一步包括TNF-β比IL-2的比例在1.17-2.43，優(yōu)選1.8±0.63的范圍內。36.權利要求27的藥物組合物，進一步包括MIP-1α比IL-2的比例在15.7-37.16，優(yōu)選22.7±7.0的范圍內。37.權利要求27的藥物組合物，進一步包括MIP-1β比IL-2的比例在17.1-28.5，優(yōu)選22.8±5.7的范圍內。38.權利要求27的藥物組合物，進一步包括RANTES比IL-2的比例在2.3-2.7，優(yōu)選2.5±0.13的范圍內。39.權利要求27的藥物組合物，進一步包括EGF比IL-2的比例在0.267-0.283，優(yōu)選0.275±0.008的范圍內。40.權利要求27的藥物組合物，進一步包括PGE2比IL-2的比例在3.63-5.42，優(yōu)選4.5±0.87的范圍內。41.權利要求27的藥物組合物，進一步包括TxB2比IL-2的比例在23.47-25.13，優(yōu)選24.3±0.83的范圍內。全文摘要本發(fā)明涉及一種在治療處理，例如，化療、放療或免疫治療之前預敏化癌癥的突破性方法和一種用于該方法的新型細胞因子混合物。所述細胞因子混合物是無血清和無促細胞分裂劑的混合物，由特定比例的細胞因子例如IL－1β、TNF－α、IFN－γ和GM－CSF比白細胞介素2(IL－2)構成，在誘導腫瘤細胞進入增殖的細胞周期階段、從而提高它們對化療、放療和免疫治療的易感性方面是有效的。一種這樣的新型細胞因子混合物是Multikine，其可被單獨使用或與其他藥物組合使用，用于癌癥的治療，從而提高癌癥治療和癌癥病人的無病生存的成功率。文檔編號A61K38/21GK1845757SQ200480025403公開日2006年10月11日申請日期2004年7月1日優(yōu)先權日2003年7月3日發(fā)明者E·塔羅爾申請人:塞爾-賽公司