專利名稱：人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及到對現(xiàn)有的人結(jié)締組織生長因子進(jìn)行多點(diǎn)突變及相應(yīng)篩選后得到的突變體蛋白。同時(shí)，本發(fā)明還涉及所述的突變體蛋白的藥學(xué)用途。
背景技術(shù)：
結(jié)締組織生長因子(CTGF)是一類屬于CCN家族的富含半胱氨酸(Cys)的生長因子，它具有多種生物學(xué)活性，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷徙、粘附、胞外基質(zhì)形成以及血管生成活性等功能，并且在某些特定條件下還具有促凋亡活性及抑有絲分裂活性。Bradham等人曾于1991年，在培養(yǎng)的靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中，通過用PDGF抗血清與培養(yǎng)物中一個(gè)38kDa的多肽分子交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)了人類CTGF的同源體，該蛋白由349個(gè)氨基酸組成，因其能在體外刺激成纖維細(xì)胞的有絲分裂及趨化性，故起名CTGF(Connective tissue growth factor)。本發(fā)明人曾成功地克隆到的一個(gè)CTGF基因(其5’端非編碼區(qū)具有特殊的序列，其基因庫登記號(hào)為A Y395801，中國專利號(hào)為ZL01107226.1)hCTGF基因定位于染色體6q23.1，長度大約為3kb，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成(Fig.1)。外顯子I編碼一段長度為37個(gè)氨基酸的前導(dǎo)信號(hào)肽，其中34位的Cys對于CTGF從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)到高爾基體(Golgi)的輸送是必需的。其余4個(gè)外顯子分別編碼4個(gè)執(zhí)行不同功能的結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域I為IGFBD區(qū)域(insulin-like growth factor binding domain，胰島素樣生長因子結(jié)合區(qū)域)，該區(qū)域與6個(gè)經(jīng)典的IGF結(jié)合蛋白(IGFBP1-6)N端半胱氨酸富含區(qū)有約32％的一致性，其中的GCGCCXXC基序?yàn)镮GF結(jié)合位點(diǎn)；結(jié)構(gòu)域II為VWC區(qū)域(Von Willebrand type C domain)，該區(qū)域也可見于Von Willebrand因子、粘蛋白、血小板反應(yīng)素及膠原蛋白中，可能與寡聚化反應(yīng)有關(guān)，尤其可能與介導(dǎo)CTGF二聚體復(fù)合物的形成有關(guān)；結(jié)構(gòu)域III為TSP1區(qū)域(thrombospondin type 1 repeat domain)，該區(qū)域含有一個(gè)WSXCSXXCG基序，可能是硫化糖綴合物結(jié)合位點(diǎn)，因此該區(qū)域可能與細(xì)胞粘附有關(guān)；結(jié)構(gòu)域IV為CT區(qū)域(C-rich domain)，該區(qū)域的10個(gè)半胱氨酸中的6個(gè)形成了半胱氨酸結(jié)(cystine knot)，這種結(jié)構(gòu)同樣也見于NGF、TGF-β、PDGF中，可能與受體結(jié)合活性有關(guān)，因此，結(jié)構(gòu)域IV可能同時(shí)具有二聚化和受體結(jié)合區(qū)域。
目前，已在5種哺乳動(dòng)物(人、小鼠、大鼠、豬、牛)及2種兩棲類動(dòng)物(青蛙及非洲爪蟾)中發(fā)現(xiàn)了CTGF的cDNA。編碼的CTGF蛋白長度從343-349個(gè)氨基酸不等(其中hCTGF為349個(gè)氨基酸殘基)，其中前22-27殘基為信號(hào)肽序列。CTGF蛋白序列除信號(hào)肽部份外，可達(dá)到90％的高度保守性，而在信號(hào)肽區(qū)域僅有60-65％的同源性。
CTGF可在多種細(xì)胞知成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)受創(chuàng)傷刺激或某些細(xì)胞因子如TGF-β及BMP-2(骨形態(tài)蛋白2)的信號(hào)刺激時(shí)，以即刻早期基因產(chǎn)物形式被迅速合成分泌，作用于多種細(xì)胞，以調(diào)控細(xì)胞周期并作用于胞外基質(zhì)(ECM)的方式調(diào)控細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和粘附、增強(qiáng)炎性細(xì)胞的趨化性[10-12]。此外，CTGF還可表現(xiàn)為促凋亡活性及抑有絲分裂活性，并可與其它生長因子發(fā)揮協(xié)同作用。因此，CTGF可以參與多種生理學(xué)過程，如血管生成、胚胎發(fā)育和分化、骨骼形成/再生、女性子宮及卵巢的功能再生、創(chuàng)傷愈合、肢體再生、器官移植等；另一方面，CTGF的過度表達(dá)可能在纖維化過程(尤其是依賴于TGF-β過量刺激的纖維化過程)中具有一定的作用，這些病理過程可能導(dǎo)致某些纖維化疾病的形成。
由于CTGF的這些生理學(xué)特性及生物學(xué)功能，使得CTGF在各類創(chuàng)傷修復(fù)，包括外傷修復(fù)、軟骨形成、角膜再生修復(fù)等方面較好的應(yīng)用潛力。近年來，有關(guān)該因子在各類創(chuàng)傷修復(fù)等方面已積累了許多資料，從各方面為CTGF做為創(chuàng)傷治療的細(xì)胞因子藥物提供了明確的證據(jù)，具體體現(xiàn)在(1)CTGF可以增強(qiáng)血小板的生物學(xué)活性，使創(chuàng)傷表面迅速止血；(2)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的趨化作用，清除傷口內(nèi)的壞死組織和細(xì)菌等；(3)促進(jìn)創(chuàng)傷表面的毛細(xì)血管上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的生長；(4)促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化及活性，并調(diào)節(jié)創(chuàng)傷部位的纖維修復(fù)；(5)在整體上促進(jìn)和加快創(chuàng)傷組織的修復(fù)。
但是，盡管CTGF具有這些生物學(xué)活性，但由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特征及其相關(guān)的生物學(xué)性質(zhì)，使得它至今尚未進(jìn)入臨床應(yīng)用。其具體原因?yàn)榈谝唬梭w產(chǎn)生的CTGF分子結(jié)構(gòu)中具有37個(gè)半胱氨酸，其極易形成多肽鏈中的二硫鍵，從而導(dǎo)致在原核表達(dá)系統(tǒng)或真核系統(tǒng)中制備重組CTGF時(shí)形成大量的不溶性蛋白包涵體，因此，在制備重組CTGF過程中形成較大的技術(shù)障礙，使得CTGF的規(guī)?；a(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)；第二，目前在有關(guān)CTGF的生物學(xué)活性研究中，實(shí)驗(yàn)表明，其無論以體外人工表達(dá)的形式還是體內(nèi)的自體表達(dá)形式，均呈現(xiàn)其生物活性的不穩(wěn)定性，這表現(xiàn)在CTGF的重組表達(dá)蛋白分子活性在組織培養(yǎng)檢測體系中無明顯的促細(xì)胞增殖活性，以及在體內(nèi)的CTGF分子表達(dá)增加時(shí)導(dǎo)致某些組織的纖維增生過度；第三，迄今尚無資料介紹有關(guān)CTGF或其突變體進(jìn)行動(dòng)物藥效學(xué)的研究，更無有關(guān)CTGF或其突變體的藥物制劑型或用于靈長類的創(chuàng)傷修復(fù)研究及相關(guān)的安全性實(shí)驗(yàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白(簡稱rhCTGF)。該突變體蛋白是對前述的本發(fā)明人已克隆到的結(jié)締組織生長基因進(jìn)行多點(diǎn)突變，并根據(jù)這些突變產(chǎn)物的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)篩選，挑取具有較高生物學(xué)活性和在創(chuàng)傷修復(fù)過程中具有較好的促纖維形成及其調(diào)節(jié)作用的rhCTGF突變體。
同時(shí)，本發(fā)明的另一個(gè)目的是在前期研究工作基礎(chǔ)上，針對其建立完整的生物學(xué)活性檢測體系，并進(jìn)行詳細(xì)的藥效學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)及藥劑學(xué)分析，完成該rhCTGF突變體做為創(chuàng)傷治療用藥物的臨床前研究，為其最終作為可用于臨床的治療性生物制劑而提供基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明從CTGF分子結(jié)構(gòu)的改變?nèi)胧?，以在一定程度上調(diào)整CTGF的生物學(xué)性質(zhì)，即是為將CTGF作為具有臨床應(yīng)用意義的生物制劑而進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改造研究工作。本發(fā)明的突變主要集中于結(jié)構(gòu)域II和結(jié)構(gòu)域III，因?yàn)檫@兩個(gè)結(jié)構(gòu)部位具有CTGF與細(xì)胞粘附相關(guān)的功能，對其的結(jié)構(gòu)調(diào)整，有可能控制CTGF與細(xì)胞相關(guān)信號(hào)分子的結(jié)合，從而穩(wěn)定CTGF的生物學(xué)活性，降低CTGF可能引起的纖維增生過度的作用。同時(shí)在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中，表現(xiàn)較穩(wěn)定的促細(xì)胞增殖作用。
本發(fā)明提供了一種人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白，其序列特征為①具有七個(gè)氨基酸的修飾突變，其分別為CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→絲氨酸；第115位的絲氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的絲氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；而且②核苷酸序列和人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白序列描述如下核苷酸序列1ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT49 CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT97 TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC145 TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG193 GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC241 TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC289 GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC337 GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC385 GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC433 AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC
481CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG529CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA577ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC625TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC673AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG721CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC769ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC817TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC865GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG913TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC961AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT1009 GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白序列1 MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV51LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG101 APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF151 PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL201 VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI251 KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT301 LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA本發(fā)明人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白的制備方法包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)了七個(gè)氨基酸的修飾突變，其分別為CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→絲氨酸；第115位的絲氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的絲氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；(2)設(shè)計(jì)了6對突變引物，使用QuikChange突變試劑盒，對pET-CTGF質(zhì)粒分別進(jìn)行突變操作，其引物分別為m15′_AggTgTAAgCCTCgTgCTggACgg_3′m25′_AgggCCTCTTCTgTgACTTCggCTCC_3′m35′_AgCggAgAgTCCTTCCAgAgCAgC_3′m45′_gTTCgTCTgCCCAgCCCTgAgTgCC_3′
m55′_CgggAAATgCTgCgAggAgTgggT_3′m65′_gTgTgACgAACCCAAggACCAAA_3′(3)依照QuikChange突變試劑盒操作指南將純化的pET-CTGF質(zhì)粒40ng與ml引物，正鏈及其互補(bǔ)鏈各125ng，dNTP1μl、反應(yīng)緩沖液5μl，及2.5單位PfuTutbo DNA聚和酶混合，在50μl反應(yīng)體系中以95℃30″→55℃60″→68℃6′的程序循環(huán)12次。反應(yīng)完成后降溫至37℃，加入DpnI孵育1hr，消化未突變的模版鏈。轉(zhuǎn)化XL1-Blue超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)并挑取陽性克隆，測序驗(yàn)證；同法完成m2-m6點(diǎn)突變。
(4)根據(jù)常規(guī)分子克隆的操作方法，將上述突變修飾后的基因以酶切-連接的方式插入載體質(zhì)粒，并在該基因前以突變方式插入序列片段-ATG GCT AGCATG ACT GGT GGA CAG CAA ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCC ATG GCT GAT ATC，以保證該基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠通過腸激酶酶切得以純化。
有益效果(1)本發(fā)明在對CTGF蛋白進(jìn)行了全面的結(jié)構(gòu)分析后，對其基因進(jìn)行了多點(diǎn)突變。獲得了較高生物學(xué)活性及較好穩(wěn)定性的CTGF突變體，使之在所選擇的原核表達(dá)體系獲得較高的表達(dá)量，并易于純化，同時(shí)，得到了具有較好臨床應(yīng)用意義的CTGF突變體分子；(2)根據(jù)CTGF結(jié)構(gòu)特征分析，針對其37個(gè)半胱氨酸所形成靶蛋白空間結(jié)構(gòu)中較多的二硫鍵而導(dǎo)致蛋白可溶性降低的情況，在確保表達(dá)rhCTGF突變體的基本構(gòu)象的前提下，設(shè)計(jì)了七個(gè)氨基酸的修飾突變，從而在一定程度上改變表達(dá)靶蛋白的構(gòu)象，使之表達(dá)量增加，并增加可溶性蛋白的比例，最重要的是，這七個(gè)氨基酸的突變，使得表達(dá)的CTGF具有穩(wěn)定的體外生物學(xué)活性，及在藥效學(xué)研究中所表現(xiàn)的對創(chuàng)傷處纖維形成的調(diào)節(jié)作用。


從下面給出的說明結(jié)合附圖，本發(fā)明的目的及特征將更加清楚明了。
圖1是突變修飾后的pET-CTGF原核表達(dá)情況，pET-CTGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21宿主菌后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可穩(wěn)定表達(dá)CTGF突變體蛋白；圖2是CTGF突變體原核表達(dá)蛋白分布分析，顯示CTGF突變體原核表達(dá)蛋白30％為可溶性蛋白，但大部分仍以不可溶性蛋白存在；圖3是CTGF突變體蛋白的免疫印記分析，顯示CTGF突變體蛋白保持了原有的免疫原性；圖4是CTGF突變體蛋白的生物學(xué)活性分析(MTT法)，表明CTGF突變體蛋白仍然保持了原有的生物活性；圖5是突變后的CTGF與未突變CTGF的生物學(xué)活性的差異分析，表明CTGF突變體蛋白生物學(xué)活性已有明顯提高；圖6(A)是顯示大鼠創(chuàng)傷模型CTGF突變體蛋白受試組，創(chuàng)面被再生上皮覆蓋，真皮肉牙組織纖維化間質(zhì)密，膠原纖維多；圖6(B)是顯示大鼠創(chuàng)傷模型對照組，真皮壞死，滲出組織的圖；圖6(C)是顯示大鼠創(chuàng)傷模型bFGF受試組，肉芽組織與纖維化纖維母細(xì)胞變長，有膠原纖維形成；注圖6(A)-圖6(C)系光鏡照片，HE染色，×100倍。
圖7(A)是顯示大鼠創(chuàng)傷模型CTGF突變體蛋白受試組，纖維排列精密、整齊；圖7(B)是顯示大鼠皮膚損傷模型，纖維排列紊亂；圖8(A)是顯示恒河猴創(chuàng)傷模型CTGF突變體蛋白受試組，纖維排列精密、整齊；圖8(B)是顯示恒河猴皮膚損傷模型，纖維排列紊亂；注圖7(A)-圖8(B)系掃描電鏡照片，×7000倍。
具體實(shí)施例方式
在下面的實(shí)施例中對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1(1)對原有的人結(jié)締組織生長因子，設(shè)計(jì)了七個(gè)氨基酸的修飾突變，其分別為CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→絲氨酸；第115位的絲氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的絲氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；(2)設(shè)計(jì)了6對突變引物，使用QuikChange突變試劑盒，對pET-CTGF質(zhì)粒分別進(jìn)行突變操作，其引物分別為m15′_AggTgTAAgCCTCgTgCTggACgg_3′m25′_AgggCCTCTTCTgTgACTTCggCTCC_3′m35′_AgCggAgAgTCCTTCCAgAgCAgC_3′m45′_gTTCgTCTgCCCAgCCCTgAgTgCC_3′m55′_CgggAAATgCTgCgAggAgTgggT_3′m65′_gTgTgACgAACCCAAggACCAAA_3′依照QuikChange突變試劑盒操作指南將純化的pET-CTGF質(zhì)粒40ng與m1引物，正鏈及其互補(bǔ)鏈各125ng，dNTP1μl、反應(yīng)緩沖液5μl，及2.5單位PfuTutbo DNA聚和酶混合，在50μl反應(yīng)體系中以95℃30″→55℃60″→68℃6′的程序循環(huán)12次。反應(yīng)完成后降溫至37℃，加入DpnI孵育1hr，消化未突變的模版鏈。轉(zhuǎn)化XL1-Blue超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)并挑取陽性克隆，測序驗(yàn)證；同法完成m2-m6點(diǎn)突變。
實(shí)施例2pET-CTGF表達(dá)載體改造。設(shè)計(jì)一條突變引物5-ATG GCT AGC ATGACT GGT GGA CAG CAA ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCC ATG GCT GAT ATC-3，其中包含了一個(gè)腸激酶酶切序列，并使其保證在改造pET-CTGF載體時(shí)，仍然維持pET-28a的讀碼框架，該序列插入在CTGF編碼區(qū)起始子ATG之前的幾個(gè)氨基酸位置。以保證該基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠通過腸激酶酶切得以純化，使表達(dá)蛋白在腸激酶酶切后產(chǎn)生在N-末端僅帶5個(gè)額外氨基酸的CTGF蛋白。
實(shí)施例3根據(jù)突變結(jié)果，對該CTGF突變體的表達(dá)情況，表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)原性，生物學(xué)活性進(jìn)行了全面分析，試驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下。
(1)突變后的pET-CTGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL-21宿主菌，設(shè)置不同條件檢測其表達(dá)情況，其條件為(1)0.5umol IPTG，1umol IPTG，2UMOL IPTG；(2)培養(yǎng)溫度的改變30℃，200rpm過夜，轉(zhuǎn)為37℃，200rpm誘導(dǎo)；30℃，200rpm過夜，30℃，200rpm誘導(dǎo)；37℃，200rpm過夜，37℃，200rpm誘導(dǎo)；其結(jié)果參見圖1.經(jīng)比較確定了37℃，200rpm過夜，1umol IPTG，37℃，200rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)條件。同時(shí)，對表達(dá)的突變體靶蛋白進(jìn)行了分布分析，結(jié)果參見圖2.
試驗(yàn)結(jié)果說明，經(jīng)突變后的CTGF突變體表達(dá)蛋白已有30％的比例為可溶性蛋白，但大部分仍以不可溶性蛋白存在。因而其純化系統(tǒng)仍需考慮靶蛋白的溶解和復(fù)性步驟?？傮w看來，突變修飾后的pET-CTGF的表達(dá)量已有較大幅度的提高，達(dá)到總菌蛋白的20％。
(2)突變修飾后的pET-CTGF表達(dá)蛋白的免疫原性分析為確定所設(shè)計(jì)的突變未影響CTGF的基本結(jié)構(gòu)，利用購自博士德生物工程有限公司的抗CTGF標(biāo)準(zhǔn)抗體，并使用購自Biovendor公司的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品對上述突變修飾后的pET-CTGF突變體表達(dá)蛋白進(jìn)行了Western blot分析，其操作方法按標(biāo)準(zhǔn)程序，其結(jié)果參見圖3。
Western blot實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)改造后的CTGF突變體表達(dá)蛋白仍然保持了原有的免疫原性。
(3)突變修飾后的pET-CTGF表達(dá)蛋白初純后的生物學(xué)活性分析為確定經(jīng)突變后的CTGF突變體表達(dá)蛋白仍然具有原有的生物活性，我們根據(jù)前期基礎(chǔ)工作中的活性檢測方法，對初步純化的CTGF突變體蛋白進(jìn)行了活性檢測，方法同樣用MTT法，其結(jié)果參見圖4。
MTT檢測證明，經(jīng)突變后的rhCTGF突變體表達(dá)蛋白仍然保持了原有的生物活性。利用MTT檢測分析了突變后的CTGF與未突變CTGF的生物學(xué)活性的差異，其結(jié)果表明，突變后的CTGF生物學(xué)活性已有明顯提高，其ED50＝1.15ng.而突變前CTGF的ED50＝1.45ng。其結(jié)果參見圖5.
(4)rhCTGF藥劑學(xué)處方研究根據(jù)藥效學(xué)研究的結(jié)果，確定了rhCTGF的臨床應(yīng)用方式為局部外用。因CTGF為蛋白質(zhì)多肽類，穩(wěn)定性相對較差，故以凍干劑型制備而成；經(jīng)過對動(dòng)物臨床藥效、制品穩(wěn)定性等方面指標(biāo)的分析，最終確定了用于創(chuàng)傷局部使用的rhCTGF制劑處方。每個(gè)劑量的組成為rhCTGF2500ng(2500IU)；甘露醇50mg，注射用水1ml。
rhCTGF突變體藥效學(xué)研究基于rhCTGF突變體制品在體外實(shí)驗(yàn)中所表現(xiàn)的生物學(xué)活性，根據(jù)藥學(xué)研究的規(guī)定，對rhCT6F突變體制品在不同動(dòng)物創(chuàng)傷模型中所表現(xiàn)的創(chuàng)傷治療作用進(jìn)行定性定量的研究分析。所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括兩類其一是常規(guī)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)所要求的SD大鼠；其二是靈長類動(dòng)物恒河猴。創(chuàng)傷模型均為動(dòng)物背部雙側(cè)深I(lǐng)I度燙傷。藥效分析指標(biāo)為創(chuàng)面面積及愈合時(shí)間；創(chuàng)面組織光學(xué)顯微鏡檢測；創(chuàng)面組織掃描電鏡檢測；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞生長周期，并由統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法得出最終結(jié)果。
rhCTGF突變體制品促進(jìn)大鼠燙傷創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)SD大鼠由東南大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為97004，實(shí)驗(yàn)環(huán)境合格證號(hào)為蘇動(dòng)[環(huán)]97008。實(shí)驗(yàn)前一周領(lǐng)取，雌雄各半，體重180-220g，實(shí)驗(yàn)時(shí)動(dòng)物室溫度15-22℃，相對濕度50-70％。
將受試鼠隨機(jī)分為受試藥組(CTGF突變體給藥量為100ng/創(chuàng)面)、陽性藥對照組(rhbFGF 250u/創(chuàng)面)和自體對照組，每組8只，單籠喂養(yǎng)。各組動(dòng)物左右兩側(cè)皮膚分別以電燙儀制備深I(lǐng)I度燙傷模型，每只背部雙側(cè)各設(shè)一個(gè)創(chuàng)傷面。造模后次日起開始給藥，另一側(cè)給等量生理鹽水，每日一次，共14天。每日觀察創(chuàng)面愈合狀況并拍照后行圖像分析，給藥第15天時(shí)取愈合組織行光鏡、電鏡觀測并分離細(xì)胞行細(xì)胞周期檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在大鼠創(chuàng)傷模型的CTGF突變體治療過程中，給藥后第15天時(shí)，給藥組動(dòng)物的受試側(cè)創(chuàng)面相對愈合面積與同組對照側(cè)差異顯著；創(chuàng)面愈合速度由快至慢分別為rhCTGF突變體、rhbFGF。創(chuàng)面完全脫痂時(shí)取組織進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察并評(píng)分發(fā)現(xiàn)，受試側(cè)與對照側(cè)相比差異顯著；掃描電鏡檢測反應(yīng)受試側(cè)纖維排列明顯較對照側(cè)更近似于正常皮膚；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，受試側(cè)細(xì)胞G1期較對照側(cè)短，并有顯著差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見附表1.1-1.6，圖6(A)～圖7(B)。提示局部應(yīng)用rhCTGF突變體可促進(jìn)受試大鼠深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面的愈合，并明顯縮短創(chuàng)面愈合的時(shí)間。
rhCTGF突變體制品促進(jìn)恒河猴燙傷創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)選用的靈長類動(dòng)物-恒河猴由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長類中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證為滇實(shí)動(dòng)證D2000005，實(shí)驗(yàn)環(huán)境合格證號(hào)為滇實(shí)動(dòng)證D2000005。雌雄各半，體重4-4.5Kg，單籠喂養(yǎng)，自由飲水，飲食，實(shí)驗(yàn)時(shí)動(dòng)物室溫度21-23℃，相對濕度44-65％。
將受試猴隨機(jī)分受試藥組(1100ng/創(chuàng)面)、陰性對照組和陽性對照組(rhbFGF 250u/創(chuàng)面)。每只動(dòng)物背部以電燙儀制備深I(lǐng)I度燙傷模型，雙側(cè)各三個(gè)創(chuàng)傷面，燙傷次日起始給受試藥，陰性對照采用等量生理鹽水。每日觀察創(chuàng)面愈合狀況并拍照后行圖像分析，給藥18天時(shí)取愈合組織行光鏡、電鏡檢測并分離細(xì)胞行細(xì)胞周期檢測。結(jié)果表明，在恒河猴創(chuàng)傷后局部用藥的第18天，受試動(dòng)物的受試側(cè)面相對愈合面積與同組對照側(cè)差異顯著；同時(shí)受試側(cè)創(chuàng)面相對愈合周期與同組對照側(cè)差異顯著；掃描電鏡可見受試側(cè)纖維排列明顯較對照側(cè)更近似于正常皮膚，這提示局部應(yīng)用rhCTGF可促進(jìn)恒河猴深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合的時(shí)間，結(jié)果詳見表2.1-2.6，圖8(A)～圖8(B)。
在上述應(yīng)用rhCTGF突變體的大鼠及恒河猴創(chuàng)傷治療藥學(xué)研究中，選用了作為基因工程產(chǎn)品的上市藥物bFGF作為陽性對照。bFGF的生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為刺激成纖維細(xì)胞的增生，因而可促進(jìn)創(chuàng)傷的修復(fù)，其在創(chuàng)傷臨床治療中意義已被明確，并已作為商品化藥物被廣泛使用。與bFGF相比較，rhCTGF突變體具有更為廣泛的生物學(xué)活性，它除了可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖之外，還具有刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的活性及增生的能力，尤其是具有針對創(chuàng)傷修復(fù)過程中纖維修復(fù)的調(diào)節(jié)作用，因此，在促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的治療過程中，其具有突出的調(diào)節(jié)創(chuàng)傷組織纖維疤痕形成的作用，避免了創(chuàng)傷修復(fù)過程中通常存在的疤痕形成這一生理學(xué)的結(jié)果，上述藥學(xué)研究中針對創(chuàng)傷組織的修復(fù)過程使用rhCTGF突變體調(diào)節(jié)其纖維形成作用的電鏡分析明確地證實(shí)了這一點(diǎn)。
因此，臨床前實(shí)驗(yàn)已表明，rhCTGF突變體具有較好的促創(chuàng)傷修復(fù)活性和安全性，可以作為創(chuàng)傷修復(fù)治療制劑用于創(chuàng)傷修復(fù)的臨床試驗(yàn)治療。
序列表1.結(jié)締組織生長因子突變體蛋白核苷酸序列SEQ ID NO11 ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT49 CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT97 TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC145TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG193GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC241TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC289GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC337GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC385GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC433AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC481CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG529CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA577ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC625TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC673AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG721CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC769ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC817TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC865GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG913TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC961AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT1009 GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA2.結(jié)締組織生長因子突變體蛋白序列SEQ ID NO21MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV51 LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG101 APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF151 PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL201 VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI251 KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT301 LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA
表1.1 rhCTGF對大鼠皮膚創(chuàng)面愈合面積的影響

x±sd，組內(nèi)Student t檢驗(yàn)，*p＜0.05表1.2 rhCTGF對大鼠II度燙傷創(chuàng)面愈合面積的影響Δ％

x±sd，組內(nèi)Student t檢驗(yàn)，*p＜0.05**p＜0.01
表1.3 rhCTGF對創(chuàng)面面積愈合60％時(shí)間的影響

表1.5 電鏡觀察rhCTGF對創(chuàng)面細(xì)胞及纖維的影響

表1.4 rhCTGF對創(chuàng)面愈合的組織學(xué)影響

x±sd，組內(nèi)Student t檢驗(yàn)，*p＜0.05
表1.6 rhCTGF對創(chuàng)面愈合細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

x±sd，組內(nèi)配對Student t檢驗(yàn)，*p≤0.05
表2.1 rhCTGF對獼猴皮膚創(chuàng)面愈合面積的影響

表2.2 rhCTGF對獼猴皮膚創(chuàng)面愈合周長的影響

表2.3 rhCTGF對獼猴II度燙傷創(chuàng)面愈合面積的影響Δ％

表2.4 rhCTGF對獼猴II度燙傷創(chuàng)面愈合周長的影響Δ％

表2.5 rhCTGF對創(chuàng)面面積愈合60％時(shí)間的影響

表2.6 rhCTGF對創(chuàng)面周長愈合60％時(shí)間的影響

權(quán)利要求
1.一種人結(jié)締組織生長因子(CTGF)突變體蛋白，其序列特征為在CTGF蛋白序列中具有七個(gè)氨基酸的修飾突變，該類突變?yōu)橄鄳?yīng)位置上的氨基酸的非特定置換。該突變體蛋白序列描述如下1 MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV51LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG101APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF151PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL201VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI251KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT301LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA
2.權(quán)利要求1所述及的人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白的編碼基因，其序列特征為在七個(gè)氨基酸的編碼子結(jié)構(gòu)上具有非特定的堿基置換，同時(shí)，在編碼區(qū)第1-100位堿基上進(jìn)行了密碼簡并性置換修飾，其序列描述如下1ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT49CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT97TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC145TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG193GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC241TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC289GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC337GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC385GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC433AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC481CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG529CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA577ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC625TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC673AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG721CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC769ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC817TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC865GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG913TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC961AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT1009GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA
3.包含權(quán)利要求2所述人結(jié)締組織生長因子編碼基因的，經(jīng)特定構(gòu)建的重組表達(dá)載體，其特征包括權(quán)利要求2的基因序列和具有易于純化該基因表達(dá)產(chǎn)物的特定酶切位點(diǎn)的編碼序列。
4.一種權(quán)利要求1所述的人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白在制備修復(fù)治療創(chuàng)傷的藥中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白以安全有效量與甘露醇，特定緩沖系統(tǒng)按比例配成的凍干藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人結(jié)締組織生長因子突變體蛋白及其應(yīng)用，其序列特征為①具有七個(gè)氨基酸的修飾突變，其分別為CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→絲氨酸；第115位的絲氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的絲氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸。同時(shí)，本發(fā)明在前期研究工作基礎(chǔ)上，針對其建立完整的生物學(xué)活性檢測體系，并進(jìn)行詳細(xì)的藥效學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)及藥劑學(xué)分析，完成該rhCTGF突變體做為創(chuàng)傷治療用藥物的臨床前研究，為其最終作為可用于臨床的治療性生物制劑而提供基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P27/02GK1657539SQ200410079560
公開日2005年8月24日 申請日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者李琦涵, 董承紅, 劉龍丁, 趙紅玲, 王麗春, 姜莉, 馬紹輝, 王晶晶, 趙樹棟, 廖蕓, 王烔, 和邵清 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所