專利名稱：珊塔瑪內(nèi)酯素作為細(xì)胞毒型抗癌劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，具體地說(shuō)是化合物珊塔瑪內(nèi)酯素作為細(xì)胞毒型抗癌劑的應(yīng)用背景技術(shù)癌癥是威脅人類生命的第二大殺手，每年奪去約700萬(wàn)人的生命，是國(guó)際上急待攻克的難題。手術(shù)、化療、放療綜合治理迄今仍是治療癌癥的主要手段。但是化療、放療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也殺死宿主的正常細(xì)胞，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，破壞了機(jī)體的免疫功能，使免疫系統(tǒng)難以對(duì)抗入侵的細(xì)菌和病毒?，F(xiàn)行的抗癌藥物缺乏對(duì)癌細(xì)胞的特異性、選擇性、不能有效對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的惡變及手術(shù)后的癌轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散。對(duì)癌細(xì)胞的多藥抗藥性也束手無(wú)策。這種現(xiàn)狀促使藥物化學(xué)家開辟新思路，尋找、研制新結(jié)構(gòu)、新活性作用機(jī)理的抗癌活性成分。
從天然藥物中尋找抗癌劑或先導(dǎo)物是新藥研究的重要途徑，而體外活性篩選則是待研藥物必經(jīng)的第一關(guān)卡?；熕幬镏饕羌?xì)胞毒類藥物，就是用國(guó)際通用的癌細(xì)胞系進(jìn)行體外細(xì)胞毒試驗(yàn)，藥物細(xì)胞毒活性達(dá)到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(IC50≤4μg/ml)，則認(rèn)為具有細(xì)胞毒活性。細(xì)胞毒藥物是通過(guò)干擾與細(xì)胞的生長(zhǎng)、死亡、分化及功能相關(guān)的機(jī)制，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)甚至殺死癌細(xì)胞。細(xì)胞毒類藥物引起細(xì)胞死亡有兩種機(jī)制，一種是細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡(凋亡)，第二種是細(xì)胞處于(藥物)劇烈損傷條件下引起細(xì)胞壞死。
本發(fā)明人的在先發(fā)明專利公開了從杯菊中提取化合物珊塔瑪內(nèi)酯素及其分離提純的方法，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì)具有抗癌活性。其結(jié)構(gòu)式為

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從天然藥物杯菊中獲得天然產(chǎn)物化合物珊塔瑪內(nèi)酯素(Santamarine，自編號(hào)為CP-B)作為細(xì)胞毒型抗癌劑的應(yīng)用。
本發(fā)明是將具有細(xì)胞毒活性的珊塔瑪內(nèi)酯素作為抑制五種癌細(xì)胞的細(xì)胞毒型抗癌劑。它對(duì)五種癌細(xì)胞具有選擇性，能有效殺死L1210(小鼠白血病)、CCRF-CEM(人類白血病)、KB(人鼻咽癌)、MCF-7(人乳腺癌)、LS174T(人結(jié)腸癌)等五種癌細(xì)胞。其中IC50(半數(shù)殺傷率濃度)分別是0.41、0.59、0.16、0.92、0.53μg/ml。
珊塔瑪內(nèi)酯素(CP-B)對(duì)L1210細(xì)胞毒活性，是細(xì)胞毒類型，藥物直接作用于細(xì)胞膜，抑制有絲分類，限制核苷摻入細(xì)胞的DNA中，其機(jī)理與抑制微管蛋白有關(guān)，引起細(xì)胞壞死，而不是引起細(xì)胞凋亡。
珊塔瑪內(nèi)酯素(CP-B)對(duì)L1210等五種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的影響與作用時(shí)間(在72小時(shí)內(nèi))及濃度有關(guān)。濃度越大作用時(shí)間越長(zhǎng)，L1210細(xì)胞生長(zhǎng)率越低。
以下是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1.細(xì)胞毒試驗(yàn)樣品珊塔瑪內(nèi)酯素的細(xì)胞毒試驗(yàn)用錐蟲蘭染料排除法測(cè)定細(xì)胞毒活性，同時(shí)用生長(zhǎng)曲線法測(cè)定藥物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，并推算IC50。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)珊塔瑪內(nèi)酯素對(duì)L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒活性，IC50分別為0.41、0.59、0.16、0.92、0.53μg/ml。
對(duì)L1210細(xì)胞系活細(xì)胞生長(zhǎng)影響低濃度下(0.1，0.3μg/ml)活細(xì)胞增加，低濃度對(duì)L1210癌細(xì)胞無(wú)抑制作用；在細(xì)胞毒濃度下(1.0，3.0，10.0μg/ml)作用時(shí)間越長(zhǎng)活細(xì)胞數(shù)越少，24小時(shí)和48小時(shí)癌細(xì)胞基本被殺死。見表1及圖1。
表1CP-B濃度及作用時(shí)間對(duì)體外L1210細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
表1藥物濃度24h48h(ug/ml)細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞生長(zhǎng)率細(xì)胞數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)率對(duì)照組 0 7.22±0.40 14.9±0.07CP-B0.16.70±0.63 90.5 12.9±0.3086.60.35.34±1.26 82.8 9.20±0.1461.71.04.71±0.71 65.2 2 86±0.9019.23.01.61±0.06 26.0 0.10±0.200.710.0 0.36±0.30 5.0 0.00±0.000.02.細(xì)胞毒類活性作用機(jī)理試驗(yàn)1)用微量滴定克隆測(cè)定法(Microtitration clonogenic assays)和菌落形成試驗(yàn)(Colony formation assays)測(cè)定細(xì)胞毒活性是細(xì)胞毒類活性(cytotoxic)還是生長(zhǎng)抑制活性(cytostatic)。結(jié)果見表2、圖2。
表2用微量滴定克隆測(cè)定法，CP-B作用于L1210細(xì)胞2、6、24小時(shí)后，對(duì)L1210細(xì)胞菌落形成的影響。
表2不同藥物濃度相對(duì)于對(duì)照組的L1210細(xì)胞菌落形成率(％)(ug/ml)2h6h 24h對(duì)照組 0 100 100100CP-B0.183.0±0.4 77.8±8.0 66.1±4.20.370.3±10.662.2±6.7 51.1±10.91.049.8±13.432.1±2.8 27.4±4.83.028.9±13.422.2±3.3 0.3±0.310.0 14.2±2.6 8.6±1.8 0.3±0.3結(jié)果表明珊塔瑪內(nèi)酯素(Santamarine，CP-B)抑制菌落形成取決于藥物作用的時(shí)間和濃度，作用時(shí)間為2h時(shí)，隨濃度增加，菌落形成逐漸降低；作用24h時(shí)，細(xì)胞毒性明顯增加。結(jié)論CP-B細(xì)胞毒類活性比細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性更敏感。
2)氚代脫氧胸腺嘧啶核苷摻入試驗(yàn)([3H]-thymidine incoporation)，研究CP-B對(duì)L1210細(xì)胞核酸代謝作用的影響。結(jié)果見表3、圖3。
表3CP-B作用于L1210系2、6、24小時(shí)后，對(duì)氚代-胸苷摻入L1210細(xì)胞的影響。
表3不同藥物濃度相對(duì)于對(duì)照組對(duì)[3H]-thymidine的摻入率(％)(ug/ml)2h 6h 24h對(duì)照組0 100 100100CP-B 0.195.3±2.490.9±5.4 86.3±3.90.385.8±2.982.3±2.6 81.2±2.81.066.7±8.865.3±4.1 58.3±5.63.048.7±3.047.3±19.2 3.8±1.910.0 38.6±4.419.2±4.2 0.7±0.5結(jié)果表明CP-B隨著時(shí)間和濃度的變化明顯抑制氚代脫氧胸苷摻入L1210細(xì)胞的DNA中。當(dāng)作用2h時(shí)，3H胸苷摻入L1210細(xì)胞的百分比開始下降，隨著時(shí)間的增加，抑制增強(qiáng)，24h時(shí)，濃度增至10ug/mL，抑制作用最強(qiáng)。結(jié)論①隨CP-B濃度及作用時(shí)間增加，抑制氚代-胸苷摻入L1210細(xì)胞內(nèi)的作用增強(qiáng)；②CP-B細(xì)胞毒性與抑制DNA合成有關(guān)。
3)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CP-B對(duì)L1210細(xì)胞周期分布的影響。
表4、圖4是CP-B對(duì)L1210細(xì)胞系細(xì)胞周期分布的作用。圖5是CP-B處理后，L1210的流式細(xì)胞法矩形圖。
由表和圖可見，CP-B阻斷L1210細(xì)胞于G2/M相，推測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及菌落形成與細(xì)胞有絲分裂作用有關(guān)。
表4CP-B作用于L1210細(xì)胞系2、6、24、48小時(shí)后，對(duì)各時(shí)相細(xì)胞周期分布的影響。
表4溫育時(shí)間 濃度 細(xì)胞周期分布百分率(％)(ug/mL) HD*G0/G1SG2/M PP*對(duì)照組0h 0 0.7±0.139.1±1.330.2±1.226.0±1.5 4.2±1.1CP-B 2h0 0.7±0.139.1±1.330.2±1.226.0±1.5 4.2±1.10.1 0.9±0.138.5±1.527.6±2.129.4±2.4 4.7±1.30.3 0.8±0.238.7±1.527.3±1.828.0±3.8 5.2±1.71.0 1.5±0.537.2±1.327.6±3.430.9±1.6 4.3±1.33.0 1.0±0.331.0±1.028.3±0.635.3±2.6 4.9±1.610.0 1.0±0.432.2±3.227.1±3.735.6±2.3 6.5±1.36h 0 0.9±0.340.0±1.330.1±2.126.8±1.4 3.2±1.20.1 0.9±0.440.2±3.429.1±2.226.5±1.6 3.4±1.90.3 1.2±0.240.1±3.725.9±5.628.0±2.0 5.1±3.51.0 1.1±0.439.2±3.124.9±4.530.3±3.0 4.5±3.13.0 3.1±2.123.0±6.224.9±5.943.7±5.8 5.3±1.310.0 1.4±0.722.6±1.320.0±5.649.9±2.4 5.5±4.724h0 0.7±0.342.2±1.330.7±1.422.7±1.4 5.2±1.30.1 0.5±0.439.5±1.429.1±2.126.9±1.5 4.0±1.40.3 0.7±02 40.6±2.226.5±1.327.4±1.7 5.4±1.21.0 0.9±0.431.2±1.727.4±2.131.4±2.0 9.3±2.13.0 19.7±7.2 23.1±5.220.5±5.623.4±6.8 13.5±1.710.0 21.0±3.9 19.3±6.325.7±1.421.0±8.4 13.0±5.348h0 2.1±1.842.9±0.826.7±2.420.4±2.5 4.9±2.10.1 2.4±0.443.4±0.727.0±0.022.0±0.1 5.5±0.50.3 1.9±1.144.0±1.026.3±0.524.3±1.2 5.8±1.31.0 2.3±0.138.4±1.722.9±0.525.6±2.4 14.9±1.93.0 31.0±6.3 16.9±4.511.8±5.721.6±7.3 15.7±0.710.0 44.0±8.6 22.4±4.615.3±0.116.7±3.8 16.7±3.84)DNA斷裂分析(DNA fragmentation assay)見圖6，經(jīng)48小時(shí)藥物作用后，L1210細(xì)胞系中提取DNA瓊脂糖膠電泳圖。由圖表明CP-B未出現(xiàn)DNA“梯子”型標(biāo)準(zhǔn)的斷裂現(xiàn)象。說(shuō)明CP-B是細(xì)胞毒型的抗癌劑，它引起的細(xì)胞毒是使細(xì)胞壞死，而不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明的有益效果是1.從對(duì)珊塔瑪內(nèi)酯素的系統(tǒng)的藥理研究提供充分的依據(jù)，證實(shí)珊塔瑪內(nèi)酯素的抗癌活性是屬于細(xì)胞毒類型，其活性作用機(jī)理與抑制微管蛋白有關(guān)，引起細(xì)胞壞死。珊塔瑪內(nèi)酯素細(xì)胞毒活性強(qiáng)，具有選擇性，能有效殺死L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細(xì)胞，半數(shù)殺傷率濃度IC50分別為0.41、0.59、0.16、0.92、0.53μg/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，珊塔瑪內(nèi)酯素是優(yōu)良的細(xì)胞毒類抗癌劑。
2.植物杯菊中珊塔瑪內(nèi)酯素含量高，不同季節(jié)的原料，其含量是十萬(wàn)分之五～十萬(wàn)分之八之間，該植物可以人工培植，能得到充足的原料。
3.從杯菊原料中提取珊塔瑪內(nèi)酯素，分離提純簡(jiǎn)單易行。


圖1是本發(fā)明的CP-B濃度和作用時(shí)間對(duì)L1210細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖2是本發(fā)明的用微量滴定測(cè)定法CP-B作用于L1210細(xì)胞2、6、24小時(shí)后對(duì)L1210細(xì)胞系菌落形式的影響。
圖3是本發(fā)明的CP-BL1210細(xì)胞系2、6、24小時(shí)后，對(duì)氚代一胸苷摻入L1210細(xì)胞的影響。
圖4是本發(fā)明的CP-B(3μg/ml)作用于L1210細(xì)胞2、6、24小時(shí)后，G、S、G2/M、HD、PP各時(shí)相細(xì)胞的百分率(％)。
圖5是本發(fā)明的L1210細(xì)胞經(jīng)CP-B處理后，CP-B對(duì)L1210細(xì)胞周期分布的流式細(xì)胞術(shù)矩形圖，濃度和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
圖6是本發(fā)明的DNA斷裂實(shí)驗(yàn)，藥物作用48小時(shí)后，L1210的DNA提取物的瓊脂糖膠電泳譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例化合物珊塔瑪內(nèi)酯素在制備抗癌劑中的應(yīng)用。
1.化合物珊塔瑪內(nèi)酯素按以下方法分離提純1)將杯菊全株干燥粉碎后，取粉碎樣10千克，用95％乙醇浸泡30天，提取浸膏，得浸膏CP0≈800克；2)取此浸膏800克，與硅藻土按1∶1比例混合，用95％乙醇攪拌混合均勻，在水浴上炒干，稱重，W樣＝710克，用1L索式提取器，分別用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝3∶1、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次萃取，得粗組分CP1(120克)、CP2(100克)、CP3(100克)、CP4(130克)、CP5(150克)。
3)用L1210細(xì)胞分別對(duì)CP1～CP5進(jìn)行細(xì)胞毒活性篩選，結(jié)果，抗癌活性大小依次為CP2＞CP3＞CP1＞CP4＞CP5。
4)對(duì)CP2進(jìn)行柱層析，用40～63μm硅膠作吸附劑，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作洗脫劑，濕法裝柱，分得11個(gè)組分，經(jīng)細(xì)胞毒活性試驗(yàn)測(cè)定，得到三個(gè)活性組分(用A4、A5、A7表示)。
5)對(duì)活性組分A5用TLC級(jí)硅膠作吸附劑，用正己烷-乙酸乙酯-甲醇作洗脫劑，真空柱層析，重結(jié)晶，得純晶體CP-B。
6)用L1210癌細(xì)胞系對(duì)粗提物對(duì)組分和純晶體CP-B進(jìn)行抗癌活性篩選，得珊塔瑪內(nèi)酯素抗癌活性成分。(可參考發(fā)明專利申請(qǐng)02128070.3的公開說(shuō)明書)2.用染料排斥法測(cè)珊塔瑪內(nèi)酯素細(xì)胞毒活性及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，來(lái)確定珊塔瑪內(nèi)酯素抗癌活性與濃度(使用量)的關(guān)系1)樣品處理稱取珊塔瑪內(nèi)酯素樣品1mg，溶于二甲亞砜(DMSO)中，溶解后，每個(gè)培養(yǎng)槽中加4μL，把等體積的(4μL)無(wú)藥樣的二甲亞砜單獨(dú)加在對(duì)照組槽中，每個(gè)槽中樣品濃度計(jì)算如下表

2)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用10％小牛血清的RPM11640培養(yǎng)基，(在24槽的培養(yǎng)基內(nèi)，對(duì)L1210細(xì)胞系)配成5×104個(gè)細(xì)胞的懸浮液，溫育24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞不受損。然后，分裝在上述不同濃度的實(shí)驗(yàn)組的24孔槽中。在37℃溫箱中培養(yǎng)48至72小時(shí)。
3)取等體積的(0.4ml)0.2％錐蟲蘭與細(xì)胞懸浮液混合后，在室溫下作用5分鐘，在15分鐘內(nèi)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在相對(duì)比顯微鏡(Phase-contrastmicroscopy)下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，未顯色的是活細(xì)胞，呈藍(lán)色的是死細(xì)胞。
4)上述細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是三次實(shí)驗(yàn)的平均值。
3.結(jié)果評(píng)定 (對(duì)照組活細(xì)胞率應(yīng)在90％以上)以L1210活細(xì)胞百分率為縱坐標(biāo)，以CP-B濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得細(xì)胞生長(zhǎng)率曲線，推算半數(shù)殺傷率濃度IC50。
由圖得出結(jié)論珊塔瑪內(nèi)酯素對(duì)L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五種癌細(xì)胞的IC50分別為0.41、0.59、0.16、0.92、0.53μg/ml?？梢宰鳛榭拱﹦┦褂?抗癌劑是制備成最終抗癌藥的中間產(chǎn)品)珊塔瑪內(nèi)酯素還可溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有機(jī)溶劑中。
其他癌細(xì)胞的濃度配制CCRF-CEM癌細(xì)胞配成1×105/槽；KB、MCF-7、LS174T細(xì)胞系濃度為4×104/槽；操作與L1210一樣。
4.根據(jù)上述測(cè)定的珊塔瑪內(nèi)酯素抗癌活性與濃度(使用量)的關(guān)系，針對(duì)不同的癌細(xì)胞，不同的應(yīng)用領(lǐng)域，按本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，配制成不同溶劑、不同濃度的CP-B抗癌劑溶液。
權(quán)利要求
1.化合物珊塔瑪內(nèi)酯素作為抑制五種癌細(xì)胞小鼠白血病、人類白血病、人鼻咽癌、人乳腺癌、人結(jié)腸癌的細(xì)胞毒型抗癌劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是從天然藥物中獲取的化合物珊塔瑪內(nèi)酯素(Santamarine)作為細(xì)胞毒型抗癌劑的應(yīng)用。它對(duì)L1210、CCRF－CEM、KB、MCF－7及LS174T等五種癌細(xì)胞具有選擇性。珊塔瑪內(nèi)酯素對(duì)上述五種癌細(xì)胞的IC50分別為0.41、0.59、0.16、0.92、0.53μg/ml，抗癌活性與藥物濃度及作用癌細(xì)胞的時(shí)間有關(guān)。濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞毒活性越強(qiáng)。對(duì)L1210癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，屬于細(xì)胞毒型(cytotoxic)而不是細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性(Cytostatic)，它殺死癌細(xì)胞的機(jī)理與抑制微管蛋白有關(guān)，使癌細(xì)胞壞死而不是使細(xì)胞凋亡。是一種優(yōu)良的抗癌劑。
文檔編號(hào)A61K31/365GK1634034SQ20041007956
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者李祖強(qiáng) 申請(qǐng)人:云南大學(xué)