專利名稱：與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NerveGrowth Factor, NGF)分子量為 140kDa 左右，由 α、β、 Y 3種亞基借非共價(jià)鍵構(gòu)成，其組合比例為α2β y 2 (Greene and Shooter, 1980) 0其中 β亞基是由兩條相同的單鏈以非共價(jià)健連接而成的同源二聚體，其單鏈含有118個(gè)氨基 酸殘基。β亞基的三維空間結(jié)構(gòu)單元是由三對(duì)反向平行的β折疊構(gòu)成的一種立體構(gòu)型， 含有四個(gè)環(huán)區(qū)。環(huán)區(qū)具有識(shí)別不同受體的特征，是NGF與受體結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵區(qū) 域(Greene LA, Shooter EM(1980)The nerve growth factor :biochemistry, synthesis, and mechanism of action. Annu Rev Neurosci3 :353_402.)。它是唯一具有 NGF 生物活 性的片段，可以完全表現(xiàn)NGF的功能效應(yīng)(BaxB，Blundell TL, Murray-Rust J, McDonald NQ (1997) Structure of mouse 7S NGF -.a complex of nerve growth factor with four binding proteins. Structure5 :1275-1285.)。在生理情況下NGF可以調(diào)控交感和感覺(jué)神 經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育及分化。周?chē)窠?jīng)損傷后，NGF可保護(hù)神經(jīng)元并促進(jìn)軸突再生。因此NGF對(duì) 于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療起著重要的作用(Sofroniew MV, Howe CL, Mobley WC(2001)Nerve growth factor signaling,neuroprotection, and neural repair. Annu Rev Neurosci24 1217-1281.)。臨床應(yīng)用證實(shí)，局部用藥可以使神經(jīng)直接得到營(yíng)養(yǎng)，利于神經(jīng)的軸漿流動(dòng)，促使神 經(jīng)再生。目前NGF治療神經(jīng)損傷的用藥方式主要有①在損傷局部直接給藥；②局部通過(guò)微 滲透泵緩慢釋放；③通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將表達(dá)NGF的細(xì)胞移植到損傷局部。然而在實(shí)際應(yīng)用 中，由于體液的快速擴(kuò)散作用，一次性在損傷局部直接給藥無(wú)法使NGF長(zhǎng)時(shí)間保留在神經(jīng) 損傷部位，并保持有效的生物濃度，這造成了治療的低效率。因此需要間隔性的多次給藥， 這種方式需要的藥物量很大，治療費(fèi)用非常昂貴，而且由于過(guò)量的使用NGF，會(huì)引起炎癥反 應(yīng)，帶來(lái)副作用。微滲透泵存在有排斥反應(yīng)和體內(nèi)吸收問(wèn)題；基因治療的載體選擇和安全性 問(wèn)題較難解決，這些方法都難以在臨床推廣應(yīng)用。層粘連蛋白是神經(jīng)元細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，它與其他細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu) 成了神經(jīng)元生長(zhǎng)的空間支架(Yurchenco PD, Smirnov S, Mathus T(2002)Analysis of basement membrane self-assembly and cellular interactions with native and recombinant glycoproteins. Methods Cell Biol 69:111-144·)。當(dāng)周?chē)窠?jīng)受到損傷 時(shí)，損傷部位的施旺細(xì)胞會(huì)大量分泌層粘連蛋白(Fu SY,Gordon T(1997)The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobioll4 :67_116.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其編碼基因與應(yīng)用。
本發(fā)明提供的與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(LBD-NGF)，它自氨基末端至羧 基末端依次包括層粘連蛋白結(jié)合區(qū)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基片段；所述層粘連蛋白結(jié)合區(qū)(LBD)如序列表的1所示。所述與神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基片段為神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基(GenBank Accession Number :AAA59931)自氨基末端第122-239位氨基酸殘基；LBD是一個(gè)基本核心，在其前后加十個(gè)左右的氨基酸都不會(huì)影響其功能。即 XXXXXXXXXX “LBD”YYYYYYYYYY，其中X和Y為任意氨基酸殘基。所述與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子中還可包括組氨酸標(biāo)簽序列；所述與層粘 連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子自氨基末端至羧基末端依次包括所述組氨酸標(biāo)簽序列、所述 層粘連蛋白結(jié)合區(qū)和所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基片段。所述與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子具體可為如下(a)或(b)或(C)的蛋白 質(zhì)(a)由序列表中序列3自氨基末端第22至287位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將(a)或(b)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與神經(jīng)損傷修復(fù)相關(guān)的由其衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)或(b)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列 組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
一種與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，它自氨基末端至羧基末端依次包括層粘連蛋白結(jié)合區(qū)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基片段；所述層粘連蛋白結(jié)合區(qū)如序列表的序列1所示；所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基片段為神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基(GenBank Accession NumberAAA59931)自氨基末端第122 239位氨基酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其特征在于所述層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng) 因子中還包括組氨酸標(biāo)簽序列；所述層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子自氨基末端至羧基末 端依次包括組氨酸標(biāo)簽序列、層粘連蛋白結(jié)合區(qū)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基片段。
3.如權(quán)利要求1或2所述的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其特征在于所述層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng) 生長(zhǎng)因子為如下(a)或(b)或(c)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3自氨基末端第22至287位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將(a)或(b)的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且與神經(jīng)損傷修復(fù)相關(guān)的由其衍生的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的編碼基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或 3)或4)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列4自5'末端第64至861位核苷酸所示的DNA分子；2)其編碼序列是序列表中序列4所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA分子。
6.含有權(quán)利要求4或5所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將含有序 列表的序列4自5'末端第64至861位核苷酸的DNA片段導(dǎo)入pET28a得到的重組質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求1至3中任一所述與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、權(quán)利要求4或5中 任一所述與層粘連蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子的編碼基因、權(quán)利要求6或7所述重組表 達(dá)載體中的任意一種在制備神經(jīng)損傷修復(fù)藥物中的應(yīng)用。
9.一種神經(jīng)損傷修復(fù)藥物，它的活性成分為權(quán)利要求1至3中任一所述與層粘連蛋白 特異結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、權(quán)利要求4或5中任一所述與層粘連蛋白特異結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng) 因子的編碼基因、權(quán)利要求6或7所述重組表達(dá)載體中的至少一種。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于所述神經(jīng)損傷為周?chē)窠?jīng)損傷，具體為坐 骨神經(jīng)損傷。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的與層粘連蛋白結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，它自氨基末端至羧基末端依次包括層粘連蛋白結(jié)合區(qū)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基片段；所述層粘連蛋白結(jié)合區(qū)的GenBankAccession Number為NM205527；所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基片段為神經(jīng)生長(zhǎng)因子β亞基(GenBank Accession NumberAAA59931)自氨基末端第122-239位氨基酸殘基。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在保持神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性的同時(shí)，大大減少其用量，減少用量過(guò)大造成的風(fēng)險(xiǎn)，其方法可同時(shí)適用于所有促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的因子以及富含層粘連蛋白的組織修復(fù)，具有重大意義。
文檔編號(hào)A61P25/02GK101955543SQ20091008971
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2009年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日
發(fā)明者孫文杰, 戴建武, 肖志峰, 陳冰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所