專利名稱：聚明膠肽注射液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚明膠肽的處理，具體涉及一種以藥用明膠為原料生產(chǎn)血漿代用品聚明膠肽注射液及其制備方法。
背景技術(shù)：
聚明膠肽注射液作為血漿代用品，已經(jīng)在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)和上市多年，該產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于各種原因引起的失血、中毒休克等癥；具有迅速補(bǔ)充血容量、維持血壓的作用。但目前該產(chǎn)品所用的原料存在不同的制備方法，如公開號(hào)為CN1387912A的“聚明膠肽注射液制備方法”發(fā)明專利申請(qǐng)，該申請(qǐng)公開了以下技術(shù)方法1、溶膠用注射用熱水潮早牛骨、豬骨或其他明膠；2、熱降解調(diào)牛骨、豬骨或其他明膠水溶液PH值在5.0～6.0之間，升溫至110℃～125℃，維持這一溫度，測(cè)量相對(duì)粘度，至相對(duì)粘度達(dá)到2.0～2.5時(shí)，停止加熱，快速冷卻至30--37℃；3、交聯(lián)降解液調(diào)PH值至6.5～7.5，維持溫度25～35℃，加入明膠蛋白含量為0.7～1.2％的交聯(lián)劑，覺袢交聯(lián)1～3小時(shí)；4、加入電解質(zhì)調(diào)PH值7.4～7.6，加入氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣電解質(zhì)，使電解質(zhì)完全溶解；5、吸附澄清加入活化后的0.1～1.0％硅藻土，助口入邊攪拌，升溫至115℃并保溫，密封應(yīng)應(yīng)釜，降溫冷卻至35℃，靜置；6、將上述靜置后的液體用無菌虹吸轉(zhuǎn)到無菌容器中，加入活化的0.1～1.0％硅藻土與活性炭，檢測(cè)并調(diào)PH7.0～7.6，攪拌吸附，然后經(jīng)4級(jí)過濾，分裝；7、滅菌。該制備方法存在制備技術(shù)落后、可控性差，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，存在一定的安全隱患，主要缺點(diǎn)在于1、水解技術(shù)主要采用加熱水解，需要較高的溫度，生產(chǎn)成本較高，同時(shí)，因?yàn)闂l件激烈，產(chǎn)生氨基酸、小分子肽等小分子產(chǎn)物較多，增加了交聯(lián)難度；2、所采用的普通交聯(lián)技術(shù)，交聯(lián)度低，交聯(lián)后的小分子多肽極其不穩(wěn)定，除不能保證為球狀結(jié)構(gòu)外，只能在一定程度上控制分子量的大小，但卻不能保證其在人體內(nèi)存留的時(shí)間，致使產(chǎn)品臨床擴(kuò)容效果較差，難以保證臨床療效和臨床使用的安全性；3、部分交聯(lián)物的最大分子量超過40萬道爾頓，產(chǎn)品大分子物質(zhì)過多而對(duì)人體會(huì)造成致敏反應(yīng)，而且，帶負(fù)電荷基團(tuán)不多，在臨床使用中易與血管壁粘著或沉積，易引起寒戰(zhàn)等不良反應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種聚明膠肽注射液及其制備方法，該方法技術(shù)先進(jìn)、穩(wěn)定，可控性好，應(yīng)用該方法制備的原料制備的聚明膠肽注射液完全符合國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)人體無致敏反應(yīng)，如無寒戰(zhàn)等不良反應(yīng)，能夠延長(zhǎng)在血液中存留時(shí)間，增加膠體滲透壓，維持有效血容量，從而在臨床上達(dá)到穩(wěn)定和提升血壓的功效，經(jīng)臨床使用結(jié)果表明，該產(chǎn)品安全、有效。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的主要構(gòu)思是采用溫和的條件水解，使水解易于控制，使水解產(chǎn)生的氨基酸、小分子肽等減少，因而易于交聯(lián)；改善交聯(lián)方法，提高交聯(lián)度；增加交聯(lián)產(chǎn)物氧化過程，使最終所得的交聯(lián)產(chǎn)物大分子量不超過20萬；增加純化分離步驟，使小分子交聯(lián)物與大分子交聯(lián)物得到較徹底的分離，從而得到重均分子量在29500-39500之間的類似于白蛋白的穩(wěn)定的球狀交聯(lián)物，所制得的聚明膠肽注射液完全符合國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)人體無致敏反應(yīng)，能夠延長(zhǎng)在血液中存留時(shí)間，增加膠體滲透壓，維持有效血容量，從而在臨床上達(dá)到穩(wěn)定和提升血壓的功效，安全、有效。
本發(fā)明提出了一種聚明膠肽注射液制備方法，該方法包括以下步驟1、明膠水解將明膠用純水溶解，然后40～90℃用稀酸溶液水解；2、交聯(lián)并氧化調(diào)pH為8.0～10.0，大致在室溫條件下加自選自乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它縮合劑的縮合劑，反應(yīng)，然后將所得產(chǎn)物氧化；3、純化分離用乙醇析出沉淀，所得沉淀即為交聯(lián)的聚明膠肽；4、配制溶液將所得固體物質(zhì)用注射用水溶解，加入等滲物質(zhì)，調(diào)節(jié)溶液pH，吸附澄清，得到注射液；5、滅菌。
還可以包括6、燈檢、包裝。
更具體說，本發(fā)明的方法包括下述步驟1、用純化水將藥用明膠溶解，然后在40～90℃用稀酸溶液，優(yōu)選3-5重量％的稀酸溶液，如鹽酸、硫酸或其他無機(jī)酸水解，控制水解時(shí)間，使水解所得肽鏈的重均分子量達(dá)到10000～15000道爾頓；2、將上述所得明膠水解產(chǎn)物加入甲酸溶液，使溶液pH為8.0～10.0，在溫度10℃～30℃和pH為8.0～10.0條件下，加入縮合劑，如乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它縮合劑，優(yōu)選縮合劑的體積占液體總體積的0.5％～2.5％，連續(xù)反應(yīng)，優(yōu)選2～8小時(shí)，氧化所用氧化劑優(yōu)選過氧化氫，優(yōu)選其體積占水解溶液體積的2％～5％，氧化反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選3～4小時(shí)；3、將上述液體濃縮至原體積1/4～1/5，加熱至100～110℃保溫，保溫時(shí)間優(yōu)選0.5～2.0小時(shí)；4、冷卻至室溫，加入乙醇使所得混合溶液中乙醇體積占70～90％，攪拌均勻，靜置，回收乙醇，將沉淀真空干燥，還可以粉碎；5、將上述所得固體藥物使用注射用水溶解，配成10％濃度的溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，加活性炭攪拌均勻，在70～80℃保溫，優(yōu)選0.5～1.0小時(shí)，0.45μm膜過濾，將濾液和注射用水按1∶1體積比混合，加入氯化鉀、氯化鈣、氯化鈉，使溶液中k+、ca2+、Na+濃度達(dá)到本品國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的要求，即k+、ca2+、Na+濃度分別為2.0～4.0μmol/mL、0.2～2.0μmol/mL、139～152μmol/mL，加活性炭攪拌均勻，在70～80℃保溫，0.22μm膜過濾，灌裝；6、滅菌，如水浴滅菌、流通蒸氣滅菌、熱壓滅菌或其它滅菌方法；7、燈檢、包裝。
上述方法生產(chǎn)包裝的聚明膠肽注射液的規(guī)格可以是注射液溶液以毫升為單位，其中聚明膠肽以含氮量計(jì)為125ml藥液0.8g氮，即其分裝規(guī)格可以為每支250ml藥液1.6氮g、500ml藥液3.2g氮。
步驟1，使用稀酸水解技術(shù)可使明膠多肽鏈在溫和條件下發(fā)生斷裂，斷裂的多肽鏈分子量其重均分子量在10000～15000道爾頓之間，從而避免熱壓水解工藝中，因條件劇烈工藝不穩(wěn)定，使得氨基酸、小分子肽等小分子產(chǎn)物較多而增加了交聯(lián)難度；步驟2，采用適量的乙二醛、適合的PH值、適宜的溫度及濃度，讓小分子肽鏈連接成空間球狀結(jié)構(gòu)。技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，該技術(shù)所獲得的產(chǎn)品游離氨基為0.53～0.63，而同類產(chǎn)品游離氨基為0.7～0.8，該技術(shù)的使用避免了同類產(chǎn)品因交聯(lián)不完全而導(dǎo)致在臨床應(yīng)用上擴(kuò)容效果差的缺點(diǎn)，保證了臨床療效穩(wěn)定、效果好。將縮合物放入一定濃度的雙氧水溶液中，使縮合物中不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)得到破壞，從而控制縮合物的最大分子量不超過20萬道爾頓，增加了產(chǎn)品的穩(wěn)定性，該氧化技術(shù)的應(yīng)用，避免了同類產(chǎn)品中小分子多肽等大分子物質(zhì)過多而引起人體致敏反應(yīng)，如打寒戰(zhàn)；應(yīng)用該氧化技術(shù)的同時(shí)，能使部分基團(tuán)氧化成羧基，使本產(chǎn)品凍凝點(diǎn)降低，穩(wěn)定性得到提高，并使帶負(fù)電荷基團(tuán)增多，在臨床使用中使其不易與血管壁粘著或沉積；步驟4所用純化技術(shù)，即使用乙醇分離技術(shù)，能夠使小分子交聯(lián)物與大分子交聯(lián)物得到較徹底的分離，從而得到重均分子量在29500-39500之間的類似于白蛋白的穩(wěn)定的球狀交聯(lián)物。該產(chǎn)品分子結(jié)構(gòu)模仿人體血漿中白蛋白的球狀構(gòu)造，使其在臨床應(yīng)用中能夠延長(zhǎng)在血液中存留時(shí)間，增加膠體滲透壓，維持有效血容量，從而在臨床上達(dá)到穩(wěn)定和提升血壓的功效。
測(cè)量大分子物質(zhì)的重均分子量方法是已知技術(shù)，現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)此方面的內(nèi)容有大量描述，本申請(qǐng)中不再一一列舉。本發(fā)明中測(cè)量明膠水解產(chǎn)物或水解產(chǎn)物的交聯(lián)產(chǎn)物重均分子量的方法，優(yōu)選采用根據(jù)中國(guó)藥典2000年版二部附錄V H記載的照多糖的分子量與分子量分布測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。具體而言，①用凝膠色譜柱(TSK-G3000PWXL7.8mm×300mm)，以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀7.0g，二水合磷酸氫二鈉16.2g，疊氮化鈉0.8g，加水4000ml溶解，混勻)為流動(dòng)相，流速為每分鐘0.5ml，柱溫35℃，示差折光監(jiān)測(cè)器；②稱取5個(gè)已知分子量的右旋糖苷分子量對(duì)照品(分子量分別為7100、10000、21400、41100和84400)適量，分別用流動(dòng)相溶解制成每1ml溶液中約含10mg溶質(zhì)的溶液，吸取上述各對(duì)照品溶液20μl，依次分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以不同分子量的對(duì)照品與其相應(yīng)的保留時(shí)間計(jì)算回歸方程；③取待測(cè)樣品，測(cè)定同步驟②，記錄分子量分布曲線，再計(jì)算待測(cè)樣品的重均分子量。
本發(fā)明還提供了通過上述方法制備的聚明膠肽注射液。
其中，藥液明膠為動(dòng)物的皮、骨、腱與韌帶中含有的膠原經(jīng)部分水解后得到的一種制品，如豬或牛骨明膠，可以從醫(yī)藥商店購(gòu)買，規(guī)格符合國(guó)家醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)，具體如下性狀藥液明膠為淡黃色至黃色、半透明、微帶光澤的粉粒或薄片；無臭；潮濕后，易為細(xì)菌分解；在水中久浸即吸水膨脹并軟化，重量可增加5～10倍。藥液明膠在熱水、醋酸或甘油與水的熱混合液中溶解，在乙醇、氯仿或乙醚中不溶。
鑒別(1)取藥液明膠約0.5g，加水50ml，加熱使溶解后，取溶液5ml，加重鉻酸鉀試液4份與稀鹽酸1份的混合液數(shù)滴，即生成橘黃色絮狀沉淀。(2)取鑒別(1)項(xiàng)下剩余的溶液，加水100ml，搖勻后，加鞣酸試液數(shù)滴，即發(fā)生渾濁。(3)取本品，加鈉石灰后，加熱，即發(fā)生氨臭。
檢查酸度 取藥液明膠1.0g，加入100ml熱水中，充分振搖使溶解，放冷至35℃，依法測(cè)定(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VI H)，pH值應(yīng)為3.6～7.6。
透明度 取藥液明膠5.0g，加水90ml使膨脹后，在65～70℃水浴中加熱溶解，取出，加水使成100ml，分取5ml，置25ml納氏比色管中，立即與同體積的對(duì)照液(精密量取標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液30ml，置50ml量瓶中，加硝酸與硝酸銀試液各1ml，用水稀釋至刻度，在暗處放置5分鐘，必要時(shí)可用焦糖溶液調(diào)色)比較，不得更渾濁。
亞硫酸鹽 取藥液明膠20g，置長(zhǎng)頸圓底燒瓶中，加水50ml，放置使膨脹后，加稀硫酸50ml，即時(shí)連接冷凝管，用水蒸氣蒸餾，餾液導(dǎo)入過氧化氫試液(對(duì)甲基紅-亞甲藍(lán)混合指示液顯中性)20ml中，至餾出液達(dá)80ml，停止蒸餾，餾出液中加甲基紅-亞甲藍(lán)混合指示液數(shù)滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液顯草綠色，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正，消耗氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)不得過1.0ml。
干燥失重 取藥液明膠約1g，置經(jīng)105℃干燥至恒重的不銹鋼或鋁制器皿(直徑約75mm)中，精密稱定，加水10ml，放置，使膨脹后，置水浴上加熱溶解，蒸干，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過16.0％(中國(guó)藥典2000年版二部附錄附錄VIII L)。
灰分 取藥液明膠1.0g，置熾灼至恒重的坩堝中，精密稱定，緩緩熾灼至完全炭化時(shí)，逐漸升高溫度至600～700℃，使完全灰化并恒重，遺留灰分不得過2.0％。
重金屬 取灰分項(xiàng)下遺留的殘?jiān)?，加鹽酸2ml與硝酸0.5ml，置水浴上蒸干，加水5ml，再蒸干，加醋酸鹽緩沖液(pH3.5)5ml與水20ml，溫?zé)釘?shù)分鐘，加水適量使成50ml。分取20ml，加水5ml，依法檢查(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VII H第一法)，含重金屬不得過百萬分之五十。
砷鹽 取藥用明膠1.0g，加淀粉0.5g與氫氧化鈣1.0g，加水少量，攪拌均勻，干燥后，先用小火熾灼使炭化，再在500～600℃熾灼成灰白色，放冷，加鹽酸8ml與水20ml溶解后，依法檢查(中國(guó)藥典2000年版二部附錄VIII J第一法)，應(yīng)符合規(guī)定(0.0002％)。
凝凍濃度 取藥用明膠1.10g，置稱定重量的錐形瓶中，加水80ml，在15～18℃放置2小時(shí)，使完全膨脹后，置60℃水浴中加熱溶解，取出，稱重，加水適量使內(nèi)容物成100g，置內(nèi)徑13mm的試管中，在0℃冰浴中冷凍6小時(shí)，取出，倒置10秒鐘，應(yīng)不流下。
使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的聚明膠肽注射液通過了黑龍江省藥品檢驗(yàn)所的檢測(cè)，依據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-XG-011-2002檢驗(yàn)結(jié)果如下

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法技術(shù)確定，容易控制，其優(yōu)點(diǎn)具體如下

通過本發(fā)明方法獲得的聚明膠肽注射液，重均分子量為29500～39500，游離氨基為0.50～0.65，含氨量3.2g/500ml，其擴(kuò)容效果與人體白蛋白相當(dāng)，其膠體滲透壓、粘滯度、PH值及電解質(zhì)均與人體血漿相似，其分子空間結(jié)構(gòu)與人體白蛋白的球形分子結(jié)構(gòu)相似，因此使用本發(fā)明方法所得的聚明膠肽注射液在所有的血漿代用品中，具有較好的血液相容性。另外該聚明膠肽注射液還能明顯改善微循環(huán)和促進(jìn)組織灌流的效果，擴(kuò)容效果好，可迅速提高血容量，升高血壓，對(duì)凝血機(jī)制幾乎沒有影響，無網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)蓄積，安全性優(yōu)于其它血漿代用品。
動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，聚明膠肽注射液能夠影響血液流變學(xué)多項(xiàng)指標(biāo)，其中對(duì)ηb(全血粘度)、ηp(血漿粘度)、HCT(紅細(xì)胞壓積)有較明顯的降低，在注射后半小時(shí)起效，可持續(xù)8小時(shí)以上。
在聚明膠肽注射液治療創(chuàng)傷低血容量性休克的臨床試驗(yàn)中，89例患者中搶救成功88例，成功率為98.9％，其中84例(94.4％)于治療30分鐘內(nèi)恢復(fù)血壓，4例(4.5％)治療30～60分鐘血壓恢復(fù)正常，1例因胸主動(dòng)脈破裂失血而死亡。在治療閉塞性動(dòng)脈硬化癥64例的臨床試驗(yàn)中，總有效率為95.3％。在治療急性等容血液稀釋對(duì)腦腫瘤患者肺循環(huán)影響的臨床試驗(yàn)中，結(jié)果表明，與血液稀釋前比較，肺循環(huán)阻力降低37.7，右室每搏功指數(shù)升高18.7％。
一、本發(fā)明方法所得聚明膠肽注射液毒理學(xué)研究資料1材料和方法1.1材料聚明膠肽注射液由哈爾濱圣泰制藥有限公司提供；純種大耳白家兔、LACA小鼠和Wistar大鼠均由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。
1.2方法1.2.1急性發(fā)熱反應(yīng) 取家兔40只，雄性，隨機(jī)分成4組，每組10只。實(shí)驗(yàn)前測(cè)試正常體溫3次，隔15min測(cè)體溫1次，波動(dòng)不超過0.3℃者供實(shí)驗(yàn)用。將實(shí)驗(yàn)用家兔按表1的分組劑量經(jīng)耳緣靜脈注射給藥。給藥后各組家兔分別于3min、5min、10min、20min、30min測(cè)肛溫1次，并記錄。
1.2.2小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) LACA小鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，隨機(jī)分為4組，每組6只；生理鹽水組(NS)及聚明膠肽注射液8ml/kg、10ml/kg、12ml/kg組(低、中、高劑量組)。一次性尾靜脈緩慢注射給藥，對(duì)照組給予同等體積的NS。給藥后觀察小鼠的活動(dòng)情況。1天后解剖小鼠進(jìn)行肉眼觀察，取心、肝、脾、肺、腎及胃進(jìn)行病理學(xué)檢查。
1.2.3大鼠亞急性毒性實(shí)驗(yàn)Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量為160～180g，隨機(jī)分為4組聚明膠肽注射液8ml/kg、10ml/kg、12ml/kg，對(duì)照組給予NS(10ml/kg)，尾靜脈注射給藥，1次/d，連用90d。各組大鼠每14d稱體質(zhì)量1次，觀察體質(zhì)量的變化，據(jù)此調(diào)整給藥劑量，同時(shí)對(duì)大鼠的飲食量、毛發(fā)、行為活動(dòng)和糞便等進(jìn)行觀察。90d后檢查血液生化學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)。
2結(jié)果2.1急性發(fā)熱反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果家兔耳緣靜脈注射給藥后各組動(dòng)物各時(shí)點(diǎn)肛溫變化見表1。
表1 聚明膠肽注射液對(duì)家兔體溫的影響W劑量/ t正常/ t注射后升高/(x±s)℃組別(ml/kg-1) (x±s)℃ 0.5h 1h2h3h4h生理鹽水組 10mL/kg 39.28±0.230.11±0.040.28±0.120.22±0.170.06±0.010.05±0.02低劑量組8mL/kg 39.07±0.230.14±0.090.08±0.020.04±0.020.15±0.110.10±0.02中劑量組10mL/kg 39.15±0.230.21±0.180.11±0.040.21±0.460.18±0.090.13±0.04高劑量組12mL/kg 39.10±0.400.05±0.020.22±0.020.25±0.170.12±0.050.22±0.17與生理鹽水組比較注射后各時(shí)間點(diǎn)家兔體溫變化P＞0.05。
2.2小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果給藥后小鼠活動(dòng)及飲食如常。全部小鼠無一死亡，亦無驚厥、四肢癱瘓、步伐不穩(wěn)、豎毛、呼吸抑制等中毒癥狀。病理學(xué)檢查上述各臟器未見有意義改變。
2.3大鼠亞急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果血液及生化指標(biāo) 結(jié)果見表2。聚明膠肽注射液各組與對(duì)照組相比，肝功能、腎功能、總膽固醇、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等均無顯著差異(p＞0.05)。
表2 聚明膠肽注射液(90d)大鼠血液生化指標(biāo)結(jié)果(n＝14，x±s)聚明膠肽注射液 聚明膠肽注射液聚明膠肽注射液檢測(cè)項(xiàng) 對(duì)照組(小) (中) (大)紅細(xì)胞(×1012/L) 9.21±1.199.35±1.10 8.23±1.0710.2±1.59白細(xì)胞(×109/L)10.48±1.57 12.40±3.00 14.51±5.26 14.30±3.46血小板(×109/L)465.10±117.30464.5±31.4 558.1±22.30 480.3±56.50血紅蛋白(g/L) 132.5±13.90 150.6±4.10 132.5±13.90 135.0±8.00膽固醇(nmol/L) 1.93±0.241.42±0.27 1.58±0.231.50±0.23總蛋白(g/L) 66.2±3.9070.8±5.40 69.4±4.7070.0±5.70白蛋白(g/L) 33.30±1.40 45.10±2.60 42.00±5.20 39.20±3.20球蛋白(g/L) 27.80±1.50 25.7±5.50 27.40±5.20 30.5±7.30丙轉(zhuǎn)氨酶(μ/L) 0.35±0.040.29±0.04 0.36±0.090.33±0.07尿素氨(mmol/L) 4.44±0.674.32±0.86 5.57±1.215.19±1.11肌酐(μmol/L) 125.53±8.84 134.37±18.56118.45±46.00 136.14±21.22
3結(jié)論3.1聚明膠肽注射液使用后無發(fā)熱反應(yīng)。
3.2聚明膠肽注射液基本無毒性。
3.3聚明膠肽注射液慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，大鼠血液生化無異常。
二、本發(fā)明方法所得聚明膠肽注射液治療缺血性腦血管病45例臨床觀察哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院自2000年1月～2000年12月采用聚明膠肽注射液(哈爾濱圣泰制藥股份有限公司提供)治療缺血性腦血管病45例，取得較好療效，現(xiàn)報(bào)告如下1資料與方法1.1臨床資料來哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的缺血性腦血管病人按隨機(jī)的原則進(jìn)行分組。①聚明膠肽注射液組(治療組)45例，其中男性25例，年齡54～75歲，平均62.3歲；女性20例，年齡58～73歲，平均64.6歲；②對(duì)照組30例，其中男性19例，年齡51～76歲，平均62.5歲，女性11例，年齡54～73歲，平均63.8歲。兩組年齡性別無顯著差異。入選標(biāo)準(zhǔn)符合缺血性腦血管病的發(fā)病過程和臨床體征，頭顱CT確診腦梗塞或排除出血性腦血管病。
1.2方法治療組治療前查血流變學(xué)，給予聚明膠肽注射液500ml靜脈注射，1/日，共7天。對(duì)照組則采取活血化瘀，擴(kuò)血管，營(yíng)養(yǎng)支持腦神經(jīng)細(xì)胞的治療。
表345例聚明膠肽注射液治療療效病名 例數(shù)基本治愈(％) 顯著進(jìn)步(％) 進(jìn)步(％) 無效(％)TIA 21 5(23.81) 4(19.05) 9(42.86) 3(14.28)急性腦梗塞24 10(41.6) 12(50.0) 2(8.33) 0(0)總計(jì) 45 15(33.33) 16(35.56) 11(24.36)3(6.67)注TIA為暫時(shí)性腦缺血。
1.3療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法按全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議通過的腦卒中患者臨床神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(1995)，治療二周后對(duì)兩組分別判定?；救δ苋睋p評(píng)分減少；91％～100％，病殘程度為0級(jí)，顯著進(jìn)步功能缺損評(píng)分減少46％～90％，病殘程度1～3級(jí)；進(jìn)步功能缺損評(píng)分減少18％；無變化功能缺損評(píng)分減少＜17％或增加＜7％；惡化功能缺損評(píng)分增加＞18％或死亡。所測(cè)數(shù)據(jù)均以x±s表示。聚明膠肽注射液治療血液流變學(xué)各指標(biāo)前、后對(duì)比采用t檢驗(yàn)。
表4 聚明膠治療前、后血流變檢測(cè)結(jié)果(x±s)觀察指標(biāo) 治療前 治療后P全血粘度(低切)12.68±1.859.38±1.85＜0.001全血粘度(高切)5.76±0.6994.717±0.430 ＜0.001紅細(xì)胞壓積(％)50.14±2.197 45.92±2.426 ＜0.001纖維蛋白原3.92±0.37 3.55±0.38＜0.0012結(jié)果本組45例缺血性腦血管病患者經(jīng)7天聚明膠肽注射液治療總有效率93.25％，急性腦梗塞有效率100％。而對(duì)照組則為64.28％(P＜0.05)，說明有顯著差異。聚明膠肽注射液治療前、后全血粘度(高切，低切)，紅細(xì)胞壓積及纖維蛋白原均具有極顯著的差異(P＜0.001)。說明聚明膠肽注射液治療對(duì)血液質(zhì)和量的改善是迅速而效的。血液稀釋后，患者頭暈等癥狀減輕。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11、取100g藥用明膠，用550mL純化水溶解，然后在50℃，用20mL、4％稀鹽酸溶液水解2小時(shí)，使水解所得肽鏈的重均分子量為10000～10500道爾頓；2、向上述所得明膠水解產(chǎn)物加入15mL、2％的甲酸溶液，使溶液pH為9.5，在溫度為10℃和pH為9.5條件下，加入10mL縮合劑乙二醛，連續(xù)反應(yīng)5小時(shí)，加入10mL的過氧化氫，氧化3小時(shí)；3、將上述液體在真空度為-0.08Mpa、溫度為60℃條件下濃縮至130mL，加熱至100℃，保溫2.0小時(shí)；4、冷卻至室溫，加入300mL乙醇，攪拌均勻，靜置24小時(shí)，回收乙醇，將沉淀沉淀在-0.09Mpa、60℃條件下真空干燥；
5、將上述所得固體藥物碎末使用900mL注射用水溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0，加0.5g活性炭攪拌均勻，在80℃保溫30分鐘，0.45μm膜過濾，88mL注射用水，加入氯化鉀5.0mg、氯化鈣4.6mg和氯化鈉98mg，k+、ca2+、Na+濃度分別為3.2μmol/mL、1.2μmol/mL、141μmol/mL，再加入1g的活性炭攪拌均勻，在80℃保溫30分鐘，0.22μm膜過濾，灌裝；6、用100℃水浴滅菌50分鐘；7、燈檢、包裝，其分裝規(guī)格為250ml藥液1.6g氮。
實(shí)施例21、取500g藥用明膠，用1500mL純化水溶解，然后在80℃，用90mL、6％稀鹽酸溶液水解1.5小時(shí)，使水解所得肽鏈的重均分子量為12000～12500道爾頓；2、向上述所得明膠水解產(chǎn)物加入20mL、4％的甲酸溶液，使溶液pH為8，在溫度為30℃和pH為8條件下，加入16mL縮合劑丁二酸酐，連續(xù)反應(yīng)8小時(shí)，加入80mL的過氧化氫，氧化4小時(shí)；3、將上述液體在真空度為-0.08Mpa、溫度為50℃條件下濃縮至400mL，加熱至110℃保溫0.5小時(shí)；4、冷卻至室溫，加入3600mL乙醇，攪拌均勻，靜置15小時(shí)，回收乙醇，將沉淀沉淀在-0.08Mpa、60℃條件下真空干燥，粉碎；5、將上述所得固體藥物碎末使用3500mL注射用水溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0，加1.5g活性炭攪拌均勻，在70℃保溫60分鐘，0.45μm膜過濾，再加入3500mL注射用水，23.6mg、氯化鈣18.9mg和氯化鈉398mg，使k+、ca2+、Na+濃度分別為3.5μmol/mL、1.8μmol/mL、145μmol/mL，加3g的活性炭攪拌均勻，在80℃保溫40分鐘，0.22μm膜過濾，灌裝；6、用流通水蒸汽滅菌50分鐘；7、燈檢、包裝，其分裝規(guī)格為500ml藥液3.2g氮。
實(shí)施例31、取200g藥用明膠，用800mL純化水溶解，然后在90℃，用50mL、1％稀鹽酸溶液水解1.4小時(shí)，使水解所得肽鏈的重均分子量為14500～15000道爾頓；2、向上述所得明膠水解產(chǎn)物加入40mL、3％的甲酸溶液，使溶液pH為10，在溫度為20℃和pH為10條件下，加入24mL縮合劑戊二醛，連續(xù)反應(yīng)3小時(shí)，加入45mL的過氧化氫，氧化3小時(shí)；3、將上述液體在真空度為-0.09Mpa、溫度為50℃條件下濃縮至原體積的200mL，加熱至110℃，保溫2.5小時(shí)；4、冷卻至室溫，加入1600mL乙醇，攪拌均勻，靜置30小時(shí)，回收乙醇，將沉淀在-0.09Mpa、50℃條件下真空干燥，粉碎；5、將上述所得固體藥物碎末使用1800mL注射用水溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5，加1g活性炭攪拌均勻，在75℃保溫50分鐘，0.45μm膜過濾，再加入1800mL注射用水，加入氯化鉀4.8mg、氯化鈣6.2mg和氯化鈉201mg，使k+、ca2+、Na+濃度分別為3.0μmol/mL、0.8μmol/mL、149μmol/mL，加2g活性炭攪拌均勻，在75℃保溫30分鐘，0.22μm膜過濾，灌裝；6、用121℃熱壓滅菌40分鐘；7、燈檢、包裝，其分裝規(guī)格為500ml藥液3.2g氮。
實(shí)施例41、取300g藥用明膠，用1500mL純化水溶解，然后在70℃，用50mL、6％稀鹽酸溶液水解1小時(shí)，使水解所得肽鏈的重均分子量為14500～15000道爾頓；2、向上述所得明膠水解產(chǎn)物加入60mL、3％的甲酸溶液，使溶液pH為9，在溫度為20℃和pH為9條件下，加入8mL縮合劑戊二醛，連續(xù)反應(yīng)10小時(shí)，加入45mL的過氧化氫，氧化5小時(shí)；3、將上述液體在真空度為-0.08Mpa、溫度為55℃條件下濃縮至350mL，加熱至110℃，保溫2小時(shí)；4、冷卻至室溫，加入1400mL乙醇，攪拌均勻，靜置24小時(shí)，回收乙醇，將沉淀在-0.08Mpa、55℃條件下真空干燥，粉碎；5、將上述所得固體藥物碎末使用2700mL注射用水溶解，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.8，加1.5g活性炭攪拌均勻，在70℃保溫70分鐘，0.45μm膜過濾，再加入3700mL注射用水，加入氯化鉀7.6mg、氯化鈣14.5mg和氯化鈉296mg，使k+、ca2+、Na+濃度分別為3.3μmol/mL、1.2μmol/mL、148μmol/mL，加3g活性炭攪拌均勻，在75℃保溫40分鐘，0.22μm膜過濾，灌裝；6、用121℃熱壓滅菌40分鐘；7、燈檢、包裝，其分裝規(guī)格為250ml藥液1.6g氮。
權(quán)利要求
1.一種聚明膠肽注射液制備方法，該方法包括以下步驟a、明膠水解將明膠用純水溶解，然后40～90℃用稀酸溶液水解；b、交聯(lián)并氧化調(diào)pH為8.0～10.0，大致在室溫條件下加自選自乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它縮合劑的縮合劑，反應(yīng)，然后將所得產(chǎn)物氧化；c、純化分離用乙醇析出沉淀，所得沉淀即為交聯(lián)的聚明膠肽；d、配制溶液將所得固體物質(zhì)用注射用水溶解，加入等滲物質(zhì)，調(diào)節(jié)溶液pH，吸附澄清，得到注射液；e、滅菌。
2.如權(quán)利要求1的聚明膠肽注射液制備方法，其特征在于，還包括步驟f、燈檢、包裝。
3.如權(quán)利要求1的聚明膠肽注射液制備方法，其特征在于，步驟a中，所用稀酸為鹽酸、硫酸或其它無機(jī)酸，其濃度為3-5重量％。
4.如權(quán)利要求1的聚明膠肽注射液制備方法，其特征在于，步驟b中，縮合劑為乙二醛、丁二酸酐、戊二醛；縮合劑的體積占液體總體積的0.5％～2.5％；加入縮合劑反應(yīng)2～8小時(shí)；氧化所用氧化劑為過氧化氫；加入過氧化氫的體積占反應(yīng)所得溶液體積的2％～5％；氧化3～4小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1的聚明膠肽注射液制備方法，其特征在于，步驟b后、步驟c前還包括步驟b1、將上述液體濃縮至原體積1/4～1/5，加熱至100～110℃保溫，保溫時(shí)間優(yōu)選0.5～2.0小時(shí)。
6.如如權(quán)利要求5的聚明膠肽注射液制備方法，其特征在于，步驟c中，冷卻至室溫，加入乙醇使所得混合溶液中乙醇體積占70～90％，攪拌均勻，靜置，回收乙醇，將沉淀真空干燥，還可以粉碎。
7.如權(quán)利要求1的聚明膠肽注射液制備方法，其特征在于，步驟d中，將上述所得固體藥物使用注射用水溶解，配成10％濃度的溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，加活性炭攪拌均勻，在70～80℃保溫，優(yōu)選0.5～1.0小時(shí)，0.45μm膜過濾，將濾液和注射用水按1∶1體積比混合，加入氯化鉀、氯化鈣、氯化鈉，使溶液中k+、ca2+、Na+濃度達(dá)到本品國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的要求，即k+、ca2+、Na+濃度分別為2.0～4.0μmol/mL、0.2～2.0μmol/mL、139～152μmol/mL，加活性炭攪拌均勻，在70～80℃保溫，0.22μm膜過濾，灌裝。
8.如權(quán)利要求1的聚明膠肽注射液制備方法，其特征在于，步驟e中，滅菌為水浴滅菌、流通蒸氣滅菌、熱壓滅菌。
9.如權(quán)利要求2的聚明膠肽注射液制備方法，其特征在于，步驟f中，分裝規(guī)格為聚明膠肽含量以含氮量計(jì)是125ml藥液0.8g氮。
10.一種聚明膠肽注射液，其特征在于，該注射液由以下方法制備a、明膠水解將明膠用純水溶解，然后40～90℃用稀酸溶液水解；b、交聯(lián)并氧化調(diào)pH為8.0～10.0，大致在室溫條件下加自選自乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它縮合劑的縮合劑，反應(yīng)，然后將所得產(chǎn)物氧化；c、純化分離用乙醇析出沉淀，所得沉淀即為交聯(lián)的聚明膠肽；d、配制溶液將所得固體物質(zhì)用注射用水溶解，加入等滲物質(zhì)，調(diào)節(jié)溶液pH，吸附澄清，得到注射液；e、滅菌。
全文摘要
一種聚明膠肽注射液制備方法，該方法包括a.明膠水解將明膠用純水溶解，然后40～90℃用稀酸溶液水解；b.交聯(lián)并氧化調(diào)pH為8.0～10.0，大致在室溫條件下加自選自乙二醛、丁二酸酐、戊二醛或其它縮合劑的縮合劑反應(yīng)，氧化；c.使用乙醇進(jìn)行沉淀而純化分離；d.配制注射液；e.滅菌。還可燈檢、包裝。該方法技術(shù)先進(jìn)、穩(wěn)定，可控性好，水解易于控制，提高交聯(lián)度，小分子交聯(lián)物與大分子交聯(lián)物得到較徹底的分離，終所得產(chǎn)物重均分子量在29500－39500道爾頓，最大分子量不超過20萬，制備的聚明膠肽注射液符合國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)臨床使用結(jié)果表明，該產(chǎn)品安全、有效。
文檔編號(hào)A61K38/02GK1586620SQ20041006894
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者高翔, 高文 申請(qǐng)人:哈爾濱圣泰制藥股份有限公司