專利名稱：具有抗血管生成活性和腫瘤消退作用的鯊魚軟骨提取物及其制備方法
背景技術(shù)：
軟骨是一種無血管組織，人們將其作為一種含有抗血管生成因子的潛在物質(zhì)加以研究。它還是一種相對抵抗腫瘤生長的組織。涉及軟骨的腫瘤，軟骨肉瘤是一種血管最少的固體腫瘤。血管生成是腫瘤發(fā)展的一個(gè)重要因子。如果腫瘤細(xì)胞能激發(fā)擴(kuò)大相鄰的血管網(wǎng)以供給其營養(yǎng)需求，就會(huì)出現(xiàn)分散的固體腫塊。因此，研究涉及刺激血管生成的因子對腫瘤生長的作用，研究抗血管生成因子及具有血管生成抑制活性的藥物并以其作為控制腫瘤生長或使腫瘤消退的工具。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鯨仔的肩胛軟骨含有一種抑制固體腫瘤中血管形成的物質(zhì)(Langer等，1976)。由于這種物質(zhì)作為抗腫瘤劑的潛在可能性，鼓舞著人們?nèi)ふ腋鼜V泛的軟骨來源。
鯊魚是這種血管生成抑制劑的可能來源之一，因?yàn)槠鋬?nèi)骨骼完全由軟骨組成(占其體重的6％，而鯨仔中的軟骨僅占其體重的0.6％)。鯊魚還有一個(gè)令人感興趣的特點(diǎn)，即其生長腫瘤的低傾向性。已有許多假設(shè)推測解釋這種鯊魚中生長腫瘤的低可能性。Marchalonis等(1990)顯示IgM抗體能迅速攻擊任何入侵性物質(zhì)。Mckinney等(1990)也表明鯊魚的巨噬細(xì)胞可將瘤細(xì)胞分化為普通細(xì)胞，從而破壞瘤細(xì)胞。Rosen和Woodhead(1980)假設(shè)elasmobranchs(一組附屬于鯊魚和鷂魚的動(dòng)物)中腫瘤的低發(fā)性可能是由于其組織中的高離子強(qiáng)度所致，這與其較高的體溫相當(dāng)。在這種情況下，這些作者認(rèn)為免疫系統(tǒng)發(fā)揮著接近100％的免疫監(jiān)視作用。Moore等(1993)年發(fā)現(xiàn)鯊魚產(chǎn)生一種具有抗菌和抗原蟲特性的氨基甾醇。最終，Lee和Langer(1983)及Klagsbrun(1987)顯示鯊魚產(chǎn)生一種抑制新血管形成的物質(zhì)。Lee和Langer(在所引的書中)在變性條件下從鯊魚軟骨中提取分離出這種物質(zhì)(胍提取)。但是該提取過程很長(41天)，并且會(huì)產(chǎn)生變性的提取物。從鯨魚分離的活性物質(zhì)的分子量為約16千道爾頓(kd)，但同組研究人員卻未能獲得從鯊魚中得到的活性物質(zhì)的精確分子量。對該種物質(zhì)的定義僅限于其分子量大于3500道爾頓。Oikawa等(1990)應(yīng)用Lee和Langer所述的一種相同提取方法，但時(shí)間要短的多(2天代替41天)。由Oikawa等從鯊魚軟骨中分離的物質(zhì)的分子量為1000-10000道爾頓。Schinitsky(USP4,473,551)描述了一種鯊魚軟骨粉的水提物，其大于100,000道爾頓的餾分單獨(dú)或與葡糖胺結(jié)合具有抗炎活性。但該專利并未提示該提取物中的一種組份具有抗血管生成和抗腫瘤活性。Kuetner等(USP 4,746,729)從牛的軟骨中分離出多形核中性白細(xì)胞(PMN)彈性蛋白酶抑制劑。該抑制劑是從軟骨的水提物中得到的，由其獲得的分子量大于50,000道爾頓。在Sephacryl S-200上分級分離得到許多餾分，在證實(shí)其具有抗彈性蛋白酶活性后，合并其中分子量為10-40千道爾頓的餾分。該活性成分的等電點(diǎn)是9.5，可能具有的分子量為約15,000道爾頓。Kuetner(USP 4,042,457)還表明一種分子量小于50,000道爾頓的分子量的牛軟骨成分具有細(xì)胞增殖抑制活性，但對內(nèi)皮細(xì)胞的生長不具有任何活性。Spilburg等(4,243,582)從牛軟骨中分離出兩種分子量為65KD，PI為3.8的糖蛋白(胍提取)，這兩種蛋白表現(xiàn)出抗胰蛋白酶活性和內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制活性。
鯨魚和鯊魚軟骨具有多種活性，如溶菌酶活性，細(xì)胞生長促進(jìn)活性，對I型和IV型膠原酶及彈性蛋白酶的抑制活性，和對蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶和血漿酶的抑制活性。
獲得鯊魚軟骨提取物和餾分的方法是已知的。其中的一些方法是生產(chǎn)軟骨粉原料，而不是任何提取物(USP 5,075,112)；其它一些方法使用了變性試劑，如胍(USP 4,243,582)；或酶反應(yīng)除去包圍軟骨的肌肉、神經(jīng)或血管結(jié)構(gòu)，及有機(jī)溶劑除去脂肪(USP 3,478,146，4,350,682和4,656,137)，從而獲得軟骨提取物；而其它一些方法僅除去不溶物簡單地制備軟骨的水提物(水(USP 4,473,551)或鹽溶液中(USP 4,746,729))。在后一種方法中獲得一定分子量的特定餾分以待進(jìn)一步研究和純化(參見上述討論)。
總之，已知鯊魚軟骨含有抗血管生成成分，成分的活性通常用兔角膜袋測定法和雞絨膜尿囊膜(CAM)測定法進(jìn)行測試。至今，已直接測試了軟骨全粉在體內(nèi)對腫瘤的作用，對移植到裸鼠中的異種移植物人黑素瘤的作用(USP 5,075,112)及在CAM中測試了其抗血管生成作用。但沒有證據(jù)表明軟骨提取物對腫瘤細(xì)胞具有直接作用。
血管生成作用不僅僅涉及到癌的生長。影響不同生理系統(tǒng)(以括弧表示)的許多疾病或病癥都是血管生成依賴性的，這些疾病或病癥的實(shí)例關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化斑(骨和韌帶)，糖尿病性視網(wǎng)膜炎，新血管性青光眼，砂眼和角膜移植性新血管生成(眼)，牛皮癬，硬皮病，血管瘤和疤痕體質(zhì)(皮膚)，血管粘連和血管纖維瘤(血液系統(tǒng))。因此，發(fā)現(xiàn)任何新的抗血管生成因子都具有治療這些疾病和癌癥的用途。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種具有抗血管生成特性(在體內(nèi)觀察到減少實(shí)驗(yàn)誘發(fā)性腫瘤的血管壁面積)，體內(nèi)腫瘤消退活性并對腫瘤細(xì)胞系顯示出直接抑制作用的提取物的制備方法。這些提取物來自通稱為多刺角鯊和黑刺角鯊(Squalusacanthias)的鯊魚軟骨。該方法不涉及任何變性溶劑或產(chǎn)物，也不涉及使用任何酶。它由下述步驟組成在中性PH水，優(yōu)選純水溶液中得到全軟骨混合物，將混合物離心，沉淀碎片和上清液待進(jìn)一步處理。將碎片凍干，測定凍干物和上清液或者凍干物的體內(nèi)和體外抗腫瘤和抗血管生成活性。上清液表現(xiàn)出體內(nèi)抗血管生成和抗腫瘤活性。使用不同方法研究上清液的組成。分餾該上清液表征出其中的數(shù)種活性成分。試驗(yàn)餾分在體外對癌細(xì)胞系的直接活性。由此可認(rèn)為未分餾的上清液也具有這種體外活性。凍干在很大程度上破壞了這些餾分的活性，因此值得強(qiáng)調(diào)的是固體和液體提取物及其餾分之間存在明顯不同。
本發(fā)明還涉及軟骨凍干物或固體提取物，軟骨提取液和其餾分，及獲得所有這些物質(zhì)的方法。
最后，本發(fā)明涉及軟骨提取物在治療血管生成依賴性疾病中的應(yīng)用。初步臨床試驗(yàn)表明含有濃縮的未分離提取液的藥物組合物能改善患血管生成依賴性疾病的患者的癥狀。在所述疾病中，皮膚性疾病如牛皮癬和一例前列腺癌得以成功地治療。另外，還意外地成功地治療了未確證為血管生成依賴性疾病的另一種皮膚病，粉刺。過度新血管形成被認(rèn)為是燒傷患者疤痕肥大的特征。經(jīng)試驗(yàn)，含有本發(fā)明軟骨提取物的組合物可防止這種現(xiàn)象。提供含有液體軟骨提取物為活性成分的藥物組合物也是本發(fā)明的目的之一。
附圖概述由下圖補(bǔ)充說明的具體實(shí)施方案將使本發(fā)明更易于理解，這些附圖旨在說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍附

圖1表示鯊魚軟骨(固體提取物)劑量的增加對ZR75-1和MCF-7細(xì)胞的抑制活性。
附圖2表明在濃度增加的雌二醇本身或雌二醇與兩種濃度的軟骨凍干物的存在下，通過其DNA含量測定的MCF-7的量的劑量依賴性曲線。
附圖3a)和b)顯示經(jīng)管飼給予軟骨凍干物和上清液與僅給予水的生長乳腺癌的大鼠肝切片的比較。
附圖4a)和b)顯示經(jīng)管飼給予軟骨凍干物和上清液與僅給予水的生長乳腺癌的大鼠腎切片的比較。
附圖5a)和b)顯示經(jīng)管飼給予軟骨凍干物和上清液與僅給予水的生長乳腺癌的大鼠肺切片的比較。
附圖6a)和b)顯示經(jīng)管飼給予軟骨凍干物和上清液與僅給予水的生長腫瘤的大鼠乳腺腫瘤切片的比較。
附圖7是由附圖6a)和b)得到的矩形圖，說明軟骨提取物對腫瘤中血管面積的影響。
附圖8表示在非變性條件下經(jīng)Rotofor分離的餾分的電泳圖譜；為與分離的餾分進(jìn)行比較，分離前將分子量標(biāo)記在左端，之后使原樣品滲透。
附圖9a)和9b)說明兩位牛皮癬患者施用含有效量的濃縮液體軟骨提取物的外用組合物(下圖)與未施用時(shí)(上圖)相比，其癥狀的明顯改善，其中一名患者患角化過度9a)，另一名不患角化過度9b)。
發(fā)明詳述捕捉后，從健康的黑刺角鯊和多刺角鯊獲得軟骨。用乙醇處理過的手術(shù)刀和剪除去所有肌肉和連接性組織。然后將軟骨真空包裝到塑料袋中并于-20℃下冷凍備用。
凍干軟骨的制備于4℃融化軟骨。然后使軟骨和等量(重量/體積)的水通過乙醇處理過的攪肉機(jī)孔三次得到第一種混合物，所述水經(jīng)反相滲透純化并濾過0.1μm濾膜?？墒褂枚喾N水溶液替代水，只要是PH中性的就可避免軟骨成分的分解或變性。
然后在工業(yè)攪拌機(jī)中于4℃以最大速度攪拌該混合物10分鐘使其勻化。在4℃使勻化物在Polytron崩解劑中崩解10分鐘得到液化的勻化物。該步驟中殘留物的粒徑小于500μm。在4℃和13,600×g下將該混合物離心15分鐘。將所得沉淀碎片凍干24-48小時(shí)。下文將第一種餾分定義為凍干物或固體提取物。
在24μm Whatman濾器上過濾上清液以除去可能影響超濾柱操作的顆粒。之后在孔率為500,000道爾頓的切向流過濾柱上超濾濾過物。將上清液無菌濾過0.22μm濾器，等份裝入無菌瓶中備用。下面該餾分被稱為上清液或提取液。
另外，還開發(fā)出高壓方法以獲得凍干物和上清液。其步驟為在13600×g離心15分鐘，接著以在裝有30μm孔率尼龍袋的CEPA離心機(jī)中以3000-4000×g轉(zhuǎn)速離心代替在Whatman濾器上的粗濾。用這種方法在30分鐘內(nèi)可離心20kg/20L制品，得到21升上清液。所得水溶液的體積甚至大于水的初始體積，這表明甚至獲取了軟骨本身含有的一部分水。凍干物和上清液具有如下組成凍干物脂類 7.35％1蛋白 46.2％2濕度 20.4％鈉4.16mg/g3
鉀2.64mg/g鈣114mg/g鎂1.49mg/g鋅和鐵 痕量上清液脂類0.10％1蛋白8mg/ml2濕度98.8％鈉33.6mg/100g3鉀39.2mg/100g鈣2.Omg/100g鎂1.1mg/100g鋅和鐵 痕量1，2分別按照AOAC Official(1984)第16.219-220和2.055節(jié)中的指導(dǎo)測定；3按照SAA方法測定。
經(jīng)Kjeldahl方法測定蛋白含量，該方法實(shí)際上測量的是有機(jī)氮(N)。用下式將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為相應(yīng)蛋白 但為檢測到蛋白多糖，一種假設(shè)是它們可能以蛋白多糖和/或粘多糖形式存在于一種或另一種提取物。在所測的濕度含量中也可能包含了這些化合物。凍干物的濕度含量是出乎意料的，該濕度是通過羥基測定的。因?yàn)?0％的水含量與軟骨一般保持的糖的百分含量接近，而凍干物的濕度應(yīng)接近0％，這種假設(shè)仍有待進(jìn)一步證實(shí)。
運(yùn)用USP XXII的詳細(xì)說明由下述控制無菌1)Laboratoire de genie sanitaire du Quebec Inc.
1090，1′Escarbot，Centre Industriel St-Malo，QuebecGln 4J4；和2)Northview Laboratories Inc.
1880，Holste Road，Northbrook，IL，60062 U.S.A.
FDA registration no.14-18028活性測定凍干物體外測定對激素依賴性癌細(xì)胞系MCF-7和ZR75-1(ATCC(R)號分別是22-HTB和1500-CRL)進(jìn)行測定。
ZR75-1細(xì)胞BASAL RPMI介質(zhì)在5L純水中混合52克不含酚紅的RPMI(Sigma R8755)，17.875克Hepes(Sigma H0763)，0.55克丙酮酸鈉(Sigma P5280)和10克NaHCO3，并用NaOH調(diào)PH至7.40。
如果不立即使用，該溶液須避光以防止光敏物質(zhì)被破壞。過濾該溶液，并將其分裝到500毫升無菌瓶中，貯藏于4℃，最長期限為3個(gè)月。
細(xì)胞培養(yǎng)維持培養(yǎng)基加有10％(v/v)FBS(胎牛血清)，100U青霉素G/50μg硫酸鏈霉素(Sigma P0906)/ml介質(zhì)，2mM L-谷胺酰胺(Sigma G1517)和1nM E2(β-雌二醇Sigma E8875)的基本RPMI培養(yǎng)基。
實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基加有5％FBSA(吸附在葡聚糖-活性炭上的胎牛血清)，2mM L-谷胺酰胺，100U青霉素G/50μg硫酸鏈霉素/ml介質(zhì)和50ng/mL胰島素(Sigma)的基本RPMI培養(yǎng)基。往該培養(yǎng)基中加入增高濃度的上述凍干物及不同濃度的雌二醇(10-12至-15M)。
MCF-7細(xì)胞基本DME-F12介質(zhì)
按照制造商的指導(dǎo)在純水中現(xiàn)配制DME-F12介質(zhì)(不含碳酸氫鹽，也不含酚紅；Sigma)。在1升介質(zhì)中，加入1.2g碳酸氫鈉并用NaOH/HCl調(diào)PH至7.4。將該溶液過濾，分配到500毫升的無菌瓶中，于4℃貯藏，最長期限為3個(gè)月。
細(xì)胞培養(yǎng)維持介質(zhì)加有10％(v/v)FBS(胎牛血清)，100U青霉素G/50μg硫酸鏈霉素/ml介質(zhì)，2mM L-谷胺酰胺(Sigma)和1nM E2(雌二醇)的基本DME-F12培養(yǎng)基。
實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基加有5％FBSA(吸附在葡聚糖-活性炭上的胎牛血清)，2mM L-谷胺酰胺，100U青霉素G/50μg硫酸鏈霉素/ml介質(zhì)和50ng/mL胰島素(Sigma)的基本DME-F12培養(yǎng)基。如在ZR75-1細(xì)胞中所述，加入相同濃度的上述凍干物和雌二醇。
FBSA的制備將胎牛血清與1％(w/v)活性炭(炭使生物堿脫色)。往活性炭-血清溶液中加入葡聚糖T70溶液使其達(dá)到0.1％(w/v)的濃度。在4℃于10,000×g離心30分鐘后，傾析血清，然后再與相同比例的活性炭和葡聚糖混合，在室溫下攪拌3小時(shí)后再離心。之后使血清在56℃加熱失活20分鐘，無菌過濾后等量分裝到錐形Falcon管中。
使ZR75-1和MCF-7細(xì)胞在20孔板上生長達(dá)20,000細(xì)胞/孔或在6孔板上生長達(dá)150,000細(xì)胞/孔的密度，并在有或沒有如上制備的不同濃度的凍干物存在下進(jìn)行處理。所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行三次。每兩天用新鮮培養(yǎng)基替換并除去舊培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)一、二、三或四中使細(xì)胞在含有5％CO2的恒溫環(huán)境的培養(yǎng)箱中在37℃分別生長17、7、3或3天。通過直接計(jì)數(shù)細(xì)胞或者測定一孔的總DNA含量測定細(xì)胞生長的抑制。
凍干物濃度 細(xì)胞抑制(％)MCF-7 ZR75-1實(shí)驗(yàn)一17天1mg/ml 1.5 2.00
5mg/ml 14.33 33.610mg/ml 62.66 90.8實(shí)驗(yàn)二7天1mg/ml 3.730.975mg/ml 15.729.0010mg/ml 68.37 66.0實(shí)驗(yàn)三3天5mg/ml 95.895.0010mg/ml 94.698.00實(shí)驗(yàn)四3天1mg/ml 34.451.520mg/ml 62.570.550mg/ml 95.895100mg/ml 94.698上文抑制細(xì)胞生長百分?jǐn)?shù)表明，冷凍物可以劑量依賴性方式這兩種細(xì)胞系的細(xì)胞生長。
圖1顯示劑量為50和100mg/ml的冷凍物在處理三天后明顯引起這些細(xì)胞系的發(fā)育不良。
圖2顯示在10-12-10-9M雌二醇存在下，處理細(xì)胞的反應(yīng)類似于未通過這些激素劑量率刺激的對照細(xì)胞。然而，在1nM以上時(shí)，對照細(xì)胞受到強(qiáng)烈刺激，且在10-7M雌二醇存在下DNA的濃度達(dá)到3.75ug(相對地，在沒有雌二醇的對照中為0.69ug)。在用30和50mg/ml冷凍物處理的細(xì)胞中，在最大刺激時(shí)測量的DNA分別為1.9和1.8ug。圖2顯示在30和50mg/ml雌二醇存在下，處理細(xì)胞與雌二醇的親和常數(shù)(Km)分別比對照細(xì)胞的Km的值高3和16倍。這意思是說，當(dāng)軟骨冷凍固體提取物存在時(shí)，高濃度雌二醇對完成細(xì)胞的相同生長來說是必須的。所以，這種提取物降低了最大反應(yīng)(其90％抑制作用)并增加處理細(xì)胞與雌二醇的親和常數(shù)。
體內(nèi)測定400只40天齡的雌性Sprague-Dawley大鼠(購自Charles River Co.，St-Constant，Quebec)適應(yīng)其環(huán)境12天。此時(shí)，灌胃給予20mg DMBA/1ml玉米油(9，10-二甲基-1，2-苯并蒽；購自Sigma Chemical Co.)。處理后3個(gè)月，選出240只發(fā)展為乳腺癌的大鼠并分為兩組。第一組由5個(gè)亞組組成。給予治療組的大鼠日劑量為溶于3ml水的增加濃度的冷凍提取物，共給藥8周，同時(shí)對照組給予相同體積的水。第二組由4個(gè)亞組組成，也給予治療組大鼠日劑量為溶于3ml水加或不加上清液的冷凍物(大約25mg的蛋白質(zhì))，共給藥10周，同時(shí)對照組接受相同體積的水。只有第二個(gè)組中的用3000mg/Kg/天濃度的冷凍物和3ml的上清液治療的一個(gè)亞組也通過腹膜內(nèi)(i.p.)給予小劑量的上清液注射液(大約8mg蛋白質(zhì)在1ml水中)。
在開始兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)，稱量大鼠體重為151-175g并隨意進(jìn)食和飲水。第一組大鼠的腫瘤的平均直徑為0.9cm而第二組大鼠的腫瘤的平均直徑為0.6cm。
結(jié)果摘錄如下灌胃給予的軟骨提取物的日劑量 ％腫瘤生長的抑制(與對照相比腫瘤直徑的減少)第一組試驗(yàn)期限為8周500mg/Kg/天 2％1000mg/Kg/天 4％3000mg/Kg/天14％5000mg/Kg/天15％第二組試驗(yàn)期限為10周3000mg/Kg/天12％3000mg/Kg/天+3ml上清液 18％3000mg/Kg/天+3ml上清液 20％
+1mli.p.注射的上清液這些結(jié)果表明，冷凍物含有胃腸道可吸收的活性成分并且該成分對腫瘤的大小有影響。該作用可能是直接影響腫瘤細(xì)胞或抗介導(dǎo)血管生產(chǎn)作用。
這些結(jié)果也表明，通過輔助減少5％的腫瘤直徑反映出上清液具有活性，甚至在很稀的情況下(存在于3ml上清液中的蛋白質(zhì)的量大約為25mg)。
病理組織學(xué)為了評價(jià)軟骨提取物的活性分子是無毒性的，通過斷頭殺死上文進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)所使用的動(dòng)物并進(jìn)行下列組織分析肝、肺、腎、心、腦。肌肉和乳腺。去除這些組織中的脂肪，此后在布安氏液中固定兩天。乙醇脫水后，固定組織被包埋在石蠟中。獲得其切片并將其置于載片上，用蘇木精染色并在顯微鏡下觀察。
組織學(xué)檢查揭示，當(dāng)單獨(dú)使用最大劑量的冷凍物(未顯示)或當(dāng)使用與上清液一起的冷凍物時(shí)未觀察到有害的作用(見圖3a和b，4a和b，和5a和b)。
這提示，冷凍物和上清液具有控制腫瘤大小進(jìn)展的活性。
在癌性乳腺中(見圖6a和b)，觀察到血管區(qū)顯著減少。然后，通過下列圖片和組織圖描述的結(jié)果證實(shí)這些活性成分的抗血管生成作用圖7顯示當(dāng)使用冷凍物(p.o.)-上清液(p.o.+i.p.)的組合物時(shí)(涉及圖6a和b)，觀察到血管區(qū)減少55％。
腫瘤大小的減少可能是由于其血管形成的明顯減少、對腫瘤細(xì)胞的直接作用或兩種現(xiàn)象的組合。上文已很好地描述了這些提取物的抗血管形成作用。體外在激素依賴性細(xì)胞上已觀察了直接的發(fā)育不良的作用，仍需體內(nèi)確證。
因?yàn)樯衔乃鼋Y(jié)果顯示，混懸劑具有在冷凍物對ZR-75作用之上的增強(qiáng)的作用，因此，進(jìn)一步研究了它的組分。
含有活性分子的液體餾分的OBTENTION除了去掉濃度梯度之外，按上文所述方法收集和加工鯊魚軟骨。離心后，棄去片狀物并按上文所述的相同方法加工上清液直到滅菌濾過0.22um的濾器。
下文將上清液制成粗滲透物，如超濾后的產(chǎn)物。
將如此獲得的粗滲透物通過FPLC(快速蛋白質(zhì)液相色譜層析)。
FPLC的條件柱Hiload 26mm×60cm Sephacryl S-300FPLC系統(tǒng)來自Pharmacia在裝柱之前，將所有樣品都濾過0.22um的濾器。洗脫緩沖液是過濾的磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)并且排氣(degazed)15分鐘。裝載樣品的體積通常為3.2ml(可高達(dá)13ml)。流速為1ml/分鐘。收集10ml餾分。通過其UV吸收率(280nm)來檢測洗脫的化合物。通過使用來自Sigma的MW-GF-1000校準(zhǔn)試劑盒來獲得校準(zhǔn)圖，該校準(zhǔn)樣品與分析樣品所裝體積相同(3.2ml)。樣品的洗脫體積是由校準(zhǔn)試劑盒的該分子量的化合物斑點(diǎn)所對應(yīng)的洗脫體積減去柱的空體積導(dǎo)出的。通過注射葡聚糖藍(lán)(M.W.＝2000000)獲得空體積。試驗(yàn)餾分對ZR75-1細(xì)胞的活性。鑒定感興趣的餾分并通過進(jìn)一步研究(下文)來證實(shí)其特征。
在Rotofor(Biorad 170-2950；見下文的等電聚焦)和不同截去值的Amicon濾器上進(jìn)行滲透物活性成分的其它定性來獲得分子量在10-30KD、30-100KD甚至超過100KD的餾分。
等電聚焦(Isoelectrofocalization)在4℃溫度下，使用Spectra pore#7 MWCO 3500 KD(Spectrum 132110)膜，將鯊魚軟骨制劑(46ml的滲透物1Kg/L)對4升含有5％甘油的純水透析過夜。將透析溶液與2.75ml的兩性電解質(zhì)(Pharmacia #80-1125-87)PH3.5-10.0和0.5gchaps(Sigma C3023；3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethyiammonio]-1-propane-sulfonate)混合。用純水將體積補(bǔ)充到55ml。將溶液裝到Rotofor上。在4℃溫度、保持12瓦的能量(3000Xi能量供應(yīng)Biorad 165-0554)并保持水循環(huán)以保證維持水溫下進(jìn)行等電聚焦。開始分離時(shí)，電壓調(diào)到380伏特并且電流強(qiáng)度調(diào)到31毫安。當(dāng)電流強(qiáng)度穩(wěn)定時(shí)(14毫安)，電壓讀數(shù)為870伏特。停止等電聚焦并收集20個(gè)餾分。
餾分體積(ml)PH1 3.7 3.562 2.1 4.013 2.2 4.184 2.3 4.315 2.2 4.636 2.1 5.037 2.5 5.308 2.1 5.509 2.4 5.81102.5 6.26112.3 7.00122.4 7.29132.4 7.64142.5 7.94152.3 8.32162.5 8.62172.4 8.94182.9 9.30193.1 9.88203.6 10.71通過在電泳凝膠上估計(jì)其分子量來鑒定這些蛋白質(zhì)(Laemmli，U.K.(1970)Nature(Lond.)227680)。
將這些餾分用裝載緩沖液進(jìn)行4倍稀釋(見Laemmli)并將8ul等分試樣在非還原的條件下進(jìn)行電泳。圖8顯示各個(gè)餾分和等電聚焦前材料的電泳圖。
將所有餾分在層流蓋下通過滅菌Millipack-60濾器(其孔隙度為0.22um)滅菌裝瓶。
通過Lowry劑量法評價(jià)餾分的蛋白質(zhì)成分。1Kg/2L(表示為每升滲透物的粗軟骨重量)的溶液以不同濃度的ZR75-1細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果概述如下第一個(gè)試驗(yàn)將滲透物冷凍干燥并通過FPLC。未檢測出細(xì)胞減生(hypoplasiant)活性(數(shù)據(jù)未顯示)。
第二個(gè)試驗(yàn)試驗(yàn)在Rotofor餾分上進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定鑒定的餾分 等電點(diǎn)中間值分子量7-8-9-10 5.30-6.265.78 29±1KD7-8-95.30-6.265.68 60±1KD12-13-14 7.29-7.947.62 48±1KD13-147.64-7.947.79 35±1KD對FPLC上的餾分進(jìn)行的第三個(gè)試驗(yàn)餾分 分子量6和7 1-2.5KD對100ul從Amicon分子濾器上獲得的餾分進(jìn)行的第四個(gè)試驗(yàn)試驗(yàn)濃度 分子量 ZR75-1細(xì)胞培養(yǎng)的抑制作用100μl/ml MW＞100KD 64％100μl/ml 30KD＜MW＜100KD 114％100μl/ml 10KD＜MW＜30KD127％400μl/ml MW＜10KD 149％FPLC餾分6和7含有非常小的分子量(1-2.5KD)的活性成分。
餾分的減生作用可比由冷凍物所觀察到的作用高達(dá)3300倍。上述結(jié)果表明冷凍基本上破壞和/或抑制洗脫液中所含的蛋白質(zhì)的活性而當(dāng)冷凍固體提取物時(shí)沒有此破壞發(fā)生。
洗脫液中活性成分的進(jìn)一步鑒定重新獲得下列分子量范圍的活性餾分(在ZR75-1細(xì)胞上試驗(yàn)的)，以相同滲透液(1Kg/L)開始，在10mm直徑×30cm長的Superose-12柱上使用上文所述的FPLC和rotofor方法來進(jìn)行另一種純化。選擇流速為1ml/分鐘。收集45個(gè)1ml的餾分。
餾分20-21 相應(yīng)于分子量為70-120KD的餾分的活性餾分22 相應(yīng)于分子量為60-70KD的餾分的活性餾分29-32 相應(yīng)于分子量為35-46KD的重疊餾分的活性餾分34-35 相應(yīng)于分子量為29KD的餾分的活性餾分38-39 相應(yīng)于分子量為1-2.5KD的餾分的活性特異性為了評價(jià)對腫瘤細(xì)胞活性的特異性，在其它源于間質(zhì)的細(xì)胞、人TENON成纖維細(xì)胞(HTFs)(它是正常的成纖維細(xì)胞)上，對超濾后獲得的滲透物進(jìn)行試驗(yàn)。
B、體外a.患者僅使用從兩名患者中獲得的HTFs(一個(gè)具有新血管青光眼(NVG)和另一個(gè)具有原發(fā)性開角型青光眼(POAG))。
b.HTFs的繼代培養(yǎng)和保養(yǎng)在37℃溫度下，用0.5ml 0.05％胰蛋白酶/0.5mMEDTA(Gibco 610-5300AG)洗滌并分離各個(gè)融合的培養(yǎng)物。然后加入1.5ml含有15％FBS的DMF/F-12介質(zhì)來中和胰蛋白酶/EDTA。
通過研制并轉(zhuǎn)移到25cm2T-燒瓶中來使細(xì)胞締合，再加入含有10％FBS的介質(zhì)。達(dá)到融合后，將HTFs轉(zhuǎn)入75cm2且可能為180cm2的T-燒瓶中。當(dāng)獲得足夠的細(xì)胞時(shí)，一些細(xì)胞用于下文所述的試驗(yàn)，其它一并冷凍保存以便進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
c.實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)完成融合時(shí)，通過上文所述方法分離來自一個(gè)患者的生長在兩個(gè)或三個(gè)相同的180cm2T-燒瓶中的細(xì)胞。短時(shí)間低速離心之后，用ZMI CoulterCounter 216013(裝有256-Channelyzer) 進(jìn)行計(jì)數(shù)。為了下面的所有體外實(shí)驗(yàn)，將大約五萬個(gè)細(xì)胞接種在1ml含有1％FBS的在各個(gè)16mm盤和12孔板的DMF/F-12介質(zhì)中。接種后17小時(shí)，加入用1％FBS(“絕對”對照)補(bǔ)充的1ml新鮮的相同介質(zhì)。依據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)(見上下文)，補(bǔ)充FBS介質(zhì)或不用GFs(生長因子)或用滲透物1Kg/2L(軟骨重量/水體積)溶液補(bǔ)充并滅菌過濾。在這一天(0天)，對某些樣品的細(xì)胞也進(jìn)行計(jì)數(shù)以確定平皿接種效率(應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨虼笥?5％)。
實(shí)驗(yàn)開始48小時(shí)后，清洗細(xì)胞并通過上文所述方法進(jìn)行分離，然后再進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)表達(dá)為由“絕對”對照獲得的細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)。
每一個(gè)“絕對”或陽性對照(分別含有1％或5％FBS)和每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組(用1％FBS和用單個(gè)的GF或軟骨滲透物補(bǔ)充的)均由三份樣品組成。
每一個(gè)實(shí)驗(yàn)在一個(gè)或兩個(gè)患者的細(xì)胞上進(jìn)行一次，并重復(fù)至少兩次。
將生長因子(GBs)或軟骨滲透物對成纖維細(xì)胞增殖的刺激作用與5％FBS的刺激作用進(jìn)行比較。
在這些實(shí)驗(yàn)中，分別以10-100ng/ml在1％FBS中的濃度加入GFs、豬PDGF(pPDGF)和人重組bFGF(bFGF)(由Dr.P.Brazeau從Farmita；iaCarlo Erba，Milan，Italy饋贈(zèng))。實(shí)驗(yàn)開始48小時(shí)后，通過Trypsin-EDTA分散細(xì)胞并用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。下文所顯示的所有重復(fù)三次的值等于每個(gè)孔中計(jì)數(shù)的二十分之一?；颊連青光眼 性別男 年齡53HTF前一天每孔細(xì)胞數(shù)46170DMF/F12-1％FBS-1％Pen.鏈球菌零天 每孔細(xì)胞數(shù)65214DMF/F12-1％FBS-1％Pen.鏈球菌第一天每孔細(xì)胞數(shù)62548DMF/F12-1％FBS-1％Pen.鏈球菌第二天每孔細(xì)胞數(shù)樣品/板 1 2 3 平均值 SEM ％對照生長DMF/F12板#11 0天 3,019 2,862 2,853 65,214 71FBS 1％FBS2 第一天 2,711 2,973 2,693 62,548 1,6551％FBS3 第二天 2,284 2,400 2,191 51,333 1,6551001％FBS4 第二天 3,084 2,834 3,115 67,446 1,627131**板#2DMF/F12PDGF5 對照2,558 2,181 2,216 51,931 2,199100(1％FBS)6 1ng/ml 2,425 2,58056,056 1,2281081％FBS7 10ng/ml 4,080 3,875 4,282 92,116 1,648177***1％FBS8 100ng/ml 4,625 4,356 4,450 100,285 1,442193***板#3 DMF/F12b-FGF9 對照 2,915 2,533 2,502 59,360 2,429100(1％FBS)10 1ng/ml 2,744 2,554 2,761 60,174 1,2131011％FBS
11 10ng/ml 3,606 3,143 3,19374,2342,683 1251％FBS12 100ng/ml 4,064 3,033 3,02675,5856,307 1271％FBS板#4 DMF/F12軟骨 13 對照 2,826 2,566 2,48658,8221,877 100(1Kg/2L) (1％FBS)(過濾的)14 1ug/ml 2,729 2,576 2,57558,837936 1001％FBS15 10ug/ml 2,643 2,493 2,58457,643789 981％FBS16 100ug/ml 2,918 2,883 2,76658,4832,461991％FBS**P＜0.02***P＜0.01 通過T檢驗(yàn)確定盡管生長因子如PDGF(血小板衍生的生長因子)和bFGF(基本的成纖維生長因子)對HTFs顯示刺激活性，但當(dāng)這些細(xì)胞在軟骨滲透物(1Kg/2L)存在下生長時(shí)，觀察到?jīng)]有作用、陽性作用或陰性作用。未觀察到發(fā)育不良的作用。這提示滲透物對腫瘤細(xì)胞具有特異的發(fā)育不良作用而對正常細(xì)胞未檢測到作用。同樣的軟骨提取物對另一類型的成纖維細(xì)胞，HSF(人皮膚成纖維細(xì)胞；數(shù)據(jù)未顯示)也沒有作用。盡管沒有實(shí)驗(yàn)，可設(shè)想出冷凍物對正常細(xì)胞也沒有作用。
臨床試驗(yàn)在進(jìn)行初步臨床試驗(yàn)之前，超濾后獲得的粗滲透物是2和20倍的濃度，提供濃縮的活性滲透物。在具有1000道爾頓孔隙度的切線流過濾柱上獲得這樣的濃度，它減少洗脫液體積2和20倍。濃縮的滲透物過濾通過孔隙度為0.22um的微孔濾器。當(dāng)用其它離心方法(使用具有孔隙度為30um膜的CEPA離心機(jī))制備軟骨素時(shí)，獲得幾乎與上述20倍濃縮提取物相同蛋白質(zhì)濃度的10倍濃度的濃縮提取物，如，12mg/ml(改進(jìn)的方法)代替14ng/ml(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的方法)。將滅菌的10倍濃縮滲透物分成7ml的等分試樣(大約85mg的蛋白質(zhì))，置于滅菌燒瓶中，在-80℃下冷凍過夜并在-20℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩４制泛蜐饪s滲透物之間的主要不同之處在于蛋白質(zhì)濃度的不同。將會(huì)注意到，所使用的測定蛋白質(zhì)的方法測量氮化合物而不僅僅是測定蛋白質(zhì)(Kjeldahl法)。這可以解釋為什么當(dāng)通過Lowry法測定蛋白質(zhì)成分時(shí)蛋白質(zhì)的濃度不是按常規(guī)情況隨體積濃度成比例增加。因此假定濃縮步驟允許水以及低分子量含氮化合物滲透通過。
將濃縮的滲透物用于治療與血管生成有關(guān)的疾病。在人體實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)了兩種不同類型的有代表性的與血管生成有關(guān)的疾病；第一類型是皮膚病(牛皮癬)和第二類型是癌(前列腺癌)。
在皮膚疾病中，選擇牛皮癬。在牛皮癬的試驗(yàn)中，值得注意的是與角化過度并發(fā)的牛皮癬和非并發(fā)牛皮癬之間的區(qū)別。這種疾病的角化成分基本上不受濃縮軟骨滲透物的影響，相反地，血管生成成分是以該活性成分的化合物為目標(biāo)的。下面實(shí)施例將說明并證實(shí)這種觀點(diǎn)。
患有前列腺癌的患者自愿接受10倍濃縮軟骨滲透物試驗(yàn)。該患者經(jīng)歷一系列連續(xù)的常規(guī)治療，暫時(shí)獲得成功。最近，在其癌癥顯示再犯后，他開始服用軟骨提取物。
下文所顯示的結(jié)果是非常鼓舞人心的并且相信預(yù)示著粗滲透物在所有與血管生成有關(guān)的疾病的治療中(而不僅僅是所試驗(yàn)的具體的某種疾病)有用的。在具有血管生成成分的疾病范圍內(nèi)，相信，本發(fā)明軟骨提取物在這一點(diǎn)上會(huì)是有效的，其條件是使它成為一種含有其有效量的組合物并且該組合物以適宜形式來給藥。所以，合適的是，本發(fā)明不被限定于下列具體的化合物，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠引申出各種組合物，其中可通過其給藥方式和靶向疾病組織來引導(dǎo)選擇?？赏ㄟ^不同途徑給予組合物如，局部給藥、口服、舌下、直腸、靜脈輸入、肌肉注射等等。
牛皮癬制備下列皮膚組合物并證實(shí)其對于患有牛皮癬的患者的效能-EmulgadeTMCLB 29％(W/W)-20倍的粗滲透物69.5％(W/W)-GermabenTMII1％(W/W)，和-Lavandula Angustifolia 0.5％(W/W)將EmulgadeTMCLB(硬脂酸酯、脂肪醇和非離子乳化劑的混合物，購自Henkel Canada Ltd.)在攪拌下加入到65-70℃。停止加熱但繼續(xù)保持?jǐn)嚢杌旌衔?。?dāng)混合物的溫度到45℃時(shí)，加入必須的油LavandulaAngustifolia和防腐劑GermabenTMII(diazonidyl urea 30％、對羥基苯甲酸甲酯11％、對羥基苯甲酸丙酯3％和丙二醇56％；購自SuttonLaboratories，NJ，U.S.A.)。當(dāng)混合物的溫度達(dá)到30℃時(shí)，加入軟骨提取物。如此獲得的組合物是光滑而不膩的霜?jiǎng)?；通過按照制造者的使用說明來改變Emulgade TM的百分含量，可獲得各種其它形式的粘性皮膚組合物(乳劑、洗劑、油膏)?？墒褂闷渌x形劑來獲得糊劑、凝膠劑和任何形式的透皮吸收的制劑。
在十二周的時(shí)期內(nèi)，將上述制劑一天兩次給予十名患有牛皮癬的病人(局部使用)，這些病人已經(jīng)接受過常規(guī)治療但后來變的難治。為了這個(gè)研究，選擇肢體兩側(cè)牛皮癬程度相似并對稱的病人。以雙盲形式繼續(xù)該試驗(yàn)，皮膚病醫(yī)生和病人都不知道哪側(cè)是用含有軟骨提取物治療的和哪側(cè)是用對照組合物治療的。在五名患有未并發(fā)角化過度的牛皮癬病人中，觀察到明顯的改善；將兩名病人身體的部分圖片顯示在圖9a)和9b)中。在圖9a)中，顯示治療一個(gè)月后，患有并發(fā)角化過度的牛皮癬的病人沒有顯示非常明顯的紅斑減少，但沒有了搔癢。然而角化過度仍很重。在治療三個(gè)月后，第二個(gè)患有未并發(fā)角化過度牛皮癬的病人的圖片(圖9b))顯示有非常好的改善。盡管牛皮癬表現(xiàn)為多因素疾病，可以設(shè)想，病人的反應(yīng)取決于在該疾病的建立和存在中所包括的血管生成因子的重要性。如果將該制劑與其它能治療所包含其它因素的治療劑(角質(zhì)層分離劑、消炎劑、抗組胺劑、免疫抑制劑等等)復(fù)合，則可能會(huì)獲得更好的結(jié)果。
這種復(fù)合可以服用修改劑型的形式來包括如有效量的角質(zhì)層分離劑。也可通過與本發(fā)明局部制劑同時(shí)或交替地分別給予此復(fù)合治療劑來劑型治療。而且，復(fù)合治療不需要通過相同途徑來給藥。
盡管有高比例的軟骨提取物，但上文制劑沒有顯示系統(tǒng)效果(作用局限于治療面)且沒有二級作用。
痤瘡(ACNAE)即使痤瘡不是本發(fā)明人的知識(shí)，因?yàn)榉肿餮苌深惣膊?，仍然吸引人來在受此影響的病人上試?yàn)液體軟骨提取物。為了在受痤瘡影響的病人中試驗(yàn)軟骨提取物，制備下列凝膠制劑CarboopolTM1.2％純化水77.2％NaOH 0.3％PhenoxetolTM0.3％Tween 80TM0.3％2×軟骨提取物20.0％40×蘆薈提取物0.5％2×軟骨提取物含有9-12mg/ml的蛋白質(zhì)。該制劑顯示在受非常嚴(yán)重或不嚴(yán)重形式的痤瘡(炎性痤瘡和kystic痤瘡)影響的病人皮膚方面有明顯的改善(數(shù)據(jù)未顯示)。
這些令人驚奇的結(jié)果可能是由于抗血管生成作用(因此揭示痤瘡的血管生成成分)、或它們可能是由于活性成分具有不同與抗血管生成的作用。這里回想起相同的提取物除抗血管生成作用之外還至少具有一種其它活性在癌細(xì)胞系中表明直接的發(fā)育不良的作用。
癌在患有前列腺癌的一個(gè)病人中試驗(yàn)了10倍濃縮的滲透物。在1986年診斷出腺瘤。那時(shí)進(jìn)行了發(fā)射治療。在1991年，PSA(前列腺血清抗原)為138ug/L，而正?？山邮艿妮^高限為4ug/L。然后，該病人通過與抗雄激素治療(Euflex TM)結(jié)合的閹割來進(jìn)行完全不同的治療。這種治療在三年中是有效的，此后，PSA又開始上升。從1994年六月，該病人服用10倍的滲透物(每日舌下劑量大約75mg/7ml的蒸餾水，相當(dāng)于大約1-1.5mg/Kg體重/天)。假如在DMBA治療的動(dòng)物(見上文)所獲得的結(jié)果是可靠的，即使該劑量的顯著一部分被吞服，它可能在胃腸道中吸收。PBS從12減少到0.9ug/ml(在1994年12月獲得最后一次結(jié)果)。該劑量范圍也可根據(jù)給藥途徑、活性成分的生物利用度和被控制疾病所需的進(jìn)展情況來隨意改變。此時(shí)，在大鼠(見上文實(shí)施例)和人中，已證實(shí)沒有毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。
在DMBA治療的大鼠上進(jìn)行的其它體內(nèi)試驗(yàn)中，液體提取物的劑量率是大約190-220mg的蛋白質(zhì)/Kg體重，它可能對減少癌血管面有很大的作用(當(dāng)與很大劑量的冷凍物組合時(shí)為55％)。所以推測，大約1-200mg/Kg體重/天的劑量對于通過減少或消除血管生成來治療癌來說是中間劑量(ED50)的合理范圍。
這些結(jié)果顯示軟骨液體提取物在治療與血管生成有關(guān)的疾病治療中具有很大的潛力。軟骨提取物的量及其制劑可隨意改變以符合具體的需要。推測，含有活性成分的粗滲透物的餾分也是有效的。這些餾分期待作進(jìn)一步的研究。
一個(gè)可以注意到的是，在蛋白質(zhì)的成分上，皮膚的局部制劑可含有大范圍劑量的軟骨提取物。在所試驗(yàn)的兩種具體類型的疾病，例如，在治療牛皮癬與痤瘡的制劑中的最終蛋白質(zhì)濃度的比率為4-5，而滲透物的稀釋比率為35。在與血管生成有關(guān)的所有預(yù)計(jì)的應(yīng)用中(從滴眼藥到皮膚和癌藥物制劑)，推測粗滲透物的最小最終蛋白質(zhì)濃度可以很低(低于0.1mg/ml)。這種較低范圍的劑量取決于可及性和活性成分對作用部位的滲透性以及這些組分的有效捕獲和組織對血管生成抑制劑的敏感性或反應(yīng)性。通常不知道在某些應(yīng)用的制劑中最終蛋白質(zhì)濃度的較高限制。嘗試的最高最終濃度在牛皮癬疾病制劑中大約為9mg/ml蛋白質(zhì)而在前列腺癌疾病中給予的7ml劑量單位中大約為12mg/ml。因?yàn)榇譂B透物在未丟失其活性的情況下不能被冷凍干燥，相信最高劑量取決于濃度的限制，可使用粗滲透物，如，直到obtention的濃糖漿。
所需材料-冷卻劑-外科用的儀器-肉刀-塑料袋-工業(yè)用攪拌機(jī)(購自Fisher Scientific的Waring 3-速攪拌機(jī))-水純化系統(tǒng)(反向滲透且0.1um濾器；Continental Water System，PRE2202型，系列號為91089，Modulab Bioscience RQ/Polishing System購自Fisher Scientific，Montreal，Quebec)。該系統(tǒng)提供高質(zhì)量的不致熱的水。
-精密天平Mettler，AE系列，購自Fisher Scientific-離心機(jī)Sorvall RC-285，購自DuPont Canada-離心機(jī)CEPA-30um孔隙度的尼龍袋-高壓消毒鍋(Sanyo自動(dòng)蒸汽滅菌器，MAC 350p型)-Nalgene 500ml容器，在132℃滅菌10分鐘并干燥35分鐘-Whaman Reeve Angel 24um孔隙度的圓錐型濾器-超濾柱(截餾分子量500KD和(1KD，當(dāng)可使用時(shí))；表面25平方英尺；流速130L/分鐘；進(jìn)口壓力30psi；出口壓力5psi；購自KochMembrane Systems Inc.，Wilmington，MA，USA)-衛(wèi)生離心泵(Monarch Industries，ACE-S100類，A型)，可產(chǎn)生130L/分鐘的流速-滅菌室(購自Ingram & Bell的NuAire層流室)-Millipack-60 0.22um滅菌濾器-滅菌透明或琥珀色的玻璃瓶-Amicon DC-10濃縮器-Rotofor Biorad 170-2950
-截流值分別為10、30和100KD的Aamicon濾器SIOY10、SIOY30和SIOY100-FPLC Pharmacia 216007(計(jì)算機(jī)Pharmacia 216014)-Hilstand S-300 26mm/60cm(Pharmacia)-Superose S-12 10mm/30cm(Pharmacia)-冷凍機(jī)Labconco 10273 A上文已經(jīng)描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)會(huì)意識(shí)到，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力和知識(shí)范圍內(nèi)，不脫離本申請的教導(dǎo)通過等同操作(會(huì)完成其相同的目的)取代本發(fā)明的某些要素來對本發(fā)明進(jìn)行修飾應(yīng)當(dāng)是十分可能的。相信這些顯而易見的改變都包含在本申請的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提取液，它基本上由上清液餾分組成，可通過以下方法得到將全鯊魚軟骨的含水勻漿離心后，至少進(jìn)行一次分級，一種分級是經(jīng)分子量截留值為500千道爾頓(KDa)的膜分離，該餾分中分子的分子量低于500KDa，所述提取液包括一種具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性的組分。
2.權(quán)利要求1的提取液，其包括在一種分子量截留值為1千道爾頓(KDa)的膜進(jìn)行的第二次分級，該餾分中分子的分子量在1至500KDa之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的提取液，其組成如下脂類 0.10％蛋白 8mg/ml濕度 98.8％鈉 33.6mg/100g鉀 39.2mg/100g鈣 2.0mg/100g鎂 1.1mg/100g鋅和鐵 痕量。
4.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，經(jīng)快速蛋白液相色譜測定，其分子量為1至2.5KDa，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
5.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)電泳測定，其分子量為29KDa，等電點(diǎn)在5.3-6.26，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
6.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)電泳測定，其分子量為35KDa，等電點(diǎn)在7.64-7.94，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
7.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)電泳測定，其分子量為48KDa，等電點(diǎn)在7.29-7.94，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
8.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)電泳測定，其分子量為60KDa，等電點(diǎn)在5.30-6.26，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
9.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)快速蛋白液相色譜測定，其分子量為70-120KDa，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
10.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)快速蛋白液相色譜測定，其分子量為60-70KDa，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
11.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)快速蛋白液相色譜測定，其分子量為35-46KDa，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
12.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)快速蛋白液相色譜測定，其分子量為29KDa，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
13.由權(quán)利要求1的提取液分離的液體組分，RotoforTM分離后，經(jīng)快速蛋白液相色譜測定，其分子量為1-2.5KDa，所述組分具有可獨(dú)立于抗血管生成活性的直接抗腫瘤活性。
14.如權(quán)利要求4-13的任一項(xiàng)定義的餾分，它們具有直接抗腫瘤活性，其中所述直接抗腫瘤活性是對乳腺癌細(xì)胞系體外可測量的。
15.一種獲得鯊魚軟骨提取液的方法，它包括以下步驟a)在大約中性pH水溶液中勻化鯊魚軟骨直至鯊魚軟骨的粒徑小于或等于500微米，得到顆粒和粗體液的混合物；b)將所述粗提液與所述顆粒分離；及c)進(jìn)一步分離粗提液以得到含分子量小于或等于500KDa的軟骨分子的最終提取液。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述中性pH水溶液由水組成，所述步驟均在4℃下進(jìn)行。
17.權(quán)利要求15的方法，其中步驟a)在30分鐘內(nèi)完成。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述鯊魚軟骨和所述中性pH水溶液的比例每1升溶液勻化濕重1Kg的軟骨。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述分離步驟b)通過離心完成。
20.權(quán)利要求15的方法，它還包括步驟d)將最終提取液濃縮，得到含分子量在1KDa和500KDa之間的軟骨分子的濃縮提取液。
21.權(quán)利要求15的方法，它還包括步驟d)分離所述提取液，得到所述提取液的液體餾分。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述分離步驟通過快速蛋白液相色譜進(jìn)行，并且其中所得液體餾分含分子量在1KDa和2.5KDa之間的軟骨分子。
23.權(quán)利要求21的方法，所述分離步驟通過RotoforTM分離和電泳進(jìn)行，其中所述液體餾分含有分子量為29KDa的軟骨分子且等電點(diǎn)為5.3至6.26。
24.權(quán)利要求21的方法，所述分離步驟通過RotoforTM分離和電泳進(jìn)行，其中所述液體餾分含有分子量為35KDa的軟骨分子且等電點(diǎn)為7.64至7.94。
25.權(quán)利要求21的方法，所述分離步驟通過RotoforTM分離和電泳進(jìn)行，其中所述液體餾分含有分子量為48KDa的軟骨分子且等電點(diǎn)為7.29至7.94。
26.權(quán)利要求21的方法，所述分離步驟通過RotoforTM分離和電泳進(jìn)行，其中所述液體餾分含有分子量為60KDa的軟骨分子且等電點(diǎn)為5.30至6.26。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述分離步驟通過RotoforTM分離和快速蛋白液相色譜進(jìn)行，并且其中所得液體餾分含分子量在70KDa和120KDa之間的軟骨分子。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述分離步驟通過RotoforTM分離和快速蛋白液相色譜進(jìn)行，并且其中所得液體餾分含分子量在60KDa和70KDa之間的軟骨分子。
29.權(quán)利要求21的方法，其中所述分離步驟通過RotoforTM分離和快速蛋白液相色譜進(jìn)行，并且其中所得液體餾分含分子量在35KDa和46KDa之間的軟骨分子。
30.權(quán)利要求21的方法，其中所述分離步驟通過RotoforTM分離和快速蛋白液相色譜進(jìn)行，并且其中所得液體餾分含分子量在29KDa。
31.權(quán)利要求21的方法，其中所述分離步驟通過RotoforTM分離和快速蛋白液相色譜進(jìn)行，并且其中所得液體餾分含分子量在1KDa和2.5KDa之間的軟骨分子。
32.權(quán)利要求15、20和21的任一項(xiàng)的方法，其中方法的步驟是在4℃下進(jìn)行的。
33.一種治療腫瘤增殖和血管生成疾病或適應(yīng)癥的組合物，它含有有效量的如權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)定義的軟骨提取液和藥學(xué)上適宜的載體。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述疾病為皮膚病癥或皮膚疾病。
35.權(quán)利要求34的組合物，其為局部施用的且其中加入軟骨提取液以使軟骨蛋白終的濃度為2至10毫克/毫升組合物。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述的疾病為牛皮癬，且所述軟骨蛋白終濃度為10毫克/毫升。
37.權(quán)利要求35的組合物，其中所述的疾病為粉刺，且所述軟骨蛋白終濃度為2毫克/毫升。
38.權(quán)利要求33的組合物，其中所述的疾病為癌癥。
39.如權(quán)利要求38的組合物，其中7毫升水中的所述軟骨提取液的終濃度為75毫克蛋白。
40.如權(quán)利要求39的組合物，該組合物為舌下用組合物。
41.鯊魚軟骨提取物在制備用于治療腫瘤增殖或血管生成疾病或適應(yīng)癥的藥物的用途，它包括向需此治療的患者施用有效量的如權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)定義的軟骨提取液和藥學(xué)上適宜的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及鯊魚軟骨提取物及其制備方法，這些提取物具有抗血管生成特性(在體內(nèi)觀察到減少實(shí)驗(yàn)誘發(fā)性腫瘤的血管壁面積)和體內(nèi)的腫瘤消退活性，并且對腫瘤細(xì)胞系顯示出直接抑制作用。該方法不涉及任何變性溶劑或產(chǎn)物，也不涉及使用任何酶。它由下述步驟組成在中性pH水，優(yōu)選純水溶液中得到全軟骨混合物，將混合物離心，沉淀碎片和上清液待進(jìn)一步處理。將碎片凍干，測定凍干物和上清液或者凍干物的體內(nèi)和體外抗腫瘤和抗血管生成活性。上清液表現(xiàn)出體內(nèi)抗血管生成和抗腫瘤活性。使用不同方法研究上清液的組成。分餾該上清液表征出其中的數(shù)種活性成分。試驗(yàn)餾分在體外對癌細(xì)胞系的直接活性。由此可認(rèn)為未分餾的上清液也具有這種體外活性。凍干在很大程度上破壞了這些餾分的活性，但在固體提取物卻沒有觀察到這種活性的消失。
文檔編號A61K33/26GK1541656SQ20041003977
公開日2004年11月3日 申請日期1995年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月28日
發(fā)明者E·杜邦, E 杜邦, P·布拉澤奧, 蟀, C·朱尼奧, 嵐 申請人:萊斯實(shí)驗(yàn)室阿特納公司