專利名稱：一種多糖類納米抗癌材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以殼聚糖為基礎(chǔ)原料的多糖類納米抗癌材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖是天然的高分子生物低聚物，其降解產(chǎn)物為具有弱堿性的氨基葡萄糖，對(duì)人體組織無毒、無害。它除具有優(yōu)異生物相溶性外，還具有獨(dú)特的生物活性，能調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，有較強(qiáng)的抑菌活性，并能調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)膽固醇與脂質(zhì)代謝。殼聚糖作為飼料添加劑、重金屬螯合劑、吸附劑、藥物緩釋劑等多種功能性材料已應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域。多種殼聚糖改性產(chǎn)物，如交聯(lián)殼聚糖、殼聚糖微球、殼聚糖納米粒子等也已得到較好應(yīng)用。殼聚糖微球、珠狀殼聚糖已被研究應(yīng)用于抗癌藥物與蛋白質(zhì)的控釋系統(tǒng)。制備珠狀殼聚糖的方法有水油兩相法、乳滴技術(shù)、噴霧干燥法等，通常這些制備過程復(fù)雜且需要使用有機(jī)溶劑與表面活性劑，由此制備的殼聚糖微球不適合物化性質(zhì)表征觀察。
Zhengrong Cui；Russell J Mumper.Chitosan-based nanoparticles fortopical genetic immunization.Journal of Controlled Release.2001，75(3)409-419報(bào)道，CS(殼聚糖)-DNA納米粒子通過CS與DNA在酸性溶液中凝聚作用制得，CS-DNA納米粒子的粒徑在100-250nm之間，合成的CS-DNA納米粒子能應(yīng)用于小鼠基因免疫。
Yong Hu；Xiqun Jiang，Yin Ding，et.al.Synthesis and characterizationof chitosan-poly(acrylic acid)nanoparticles.Biomaterials，2002，233193-3201報(bào)道，通過丙烯酸在殼聚糖溶液中模板聚合作用制備CS-PAA(多聚丙烯酸)納米粒子，能夠穩(wěn)定分散于酸性介質(zhì)中。但以上所制得的納米粒子粒徑通常較大，成品率較低，且形成的微粒粒徑不均一。
殼聚糖具有增強(qiáng)抗腫瘤藥物作用，能促進(jìn)白細(xì)胞介素2(IL-2)的生成，IL-2對(duì)NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞活性均有增強(qiáng)作用。殼聚糖是一種帶正電荷天然高分子生物聚合物，顯示極強(qiáng)的生理活性。腫瘤細(xì)胞表面帶有更高負(fù)電荷，聚陽離子電解質(zhì)能吸附到癌細(xì)胞表面使電荷中和，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。在酸性環(huán)境中能形成陽離子基團(tuán)，與體細(xì)胞產(chǎn)生親和性，活化體細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫力(Hiroshi Ueno，et.al Topical formulat ions and wound healingapplications of chitosan.Advanced Drug Delivery Reviews，2001，52105-115)。殼聚糖具有清除體內(nèi)自由基細(xì)胞毒素的能力，可作為早期癌癥的治療藥物。
癌細(xì)胞會(huì)釋放大量的癌毒素，低聚殼聚糖在腸道內(nèi)形成的小分子容易被腸吸收，抑制癌毒素在體內(nèi)的釋放，同時(shí)殼聚糖吸附在血管壁細(xì)胞的表面，可抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
已有研究報(bào)道鋅、鈷等金屬離子具有較高的抗癌活性。通過將此類金屬離子負(fù)載于具有生物相溶性可降解的殼聚糖制備復(fù)合抗癌納米材料，能夠提高其抗癌活性，并能發(fā)揮緩釋、長(zhǎng)效、無殘留作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可作為抗癌藥物應(yīng)用的多糖類納米抗癌材料及其制備方法。
本發(fā)明的多糖類納米抗癌材料是分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％的殼聚糖納米粒子，粒徑20-500nm?；蛘呤禽d金屬離子殼聚糖納米粒子，粒徑20-500nm，其中殼聚糖的分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％，金屬離子含量(重量)為1～20％。
本發(fā)明的多糖類納米抗癌材料有兩種制備方法。
方法1，制備步驟如下在20-60℃攪拌下，于稀酸溶液中加入分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％殼聚糖，配置0.1％～5％殼聚糖酸溶液，然后向殼聚糖酸溶液加入0.1～5％交聯(lián)劑溶液，交聯(lián)反應(yīng)形成納米粒子微乳液，將納米粒子微乳液離心分離，沉淀物蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥，即得多糖類納米抗癌材料。
方法2，制備步驟如下在20-60℃攪拌下，于稀酸溶液中加入分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％殼聚糖，配置0.1％～5％殼聚糖酸溶液，然后向殼聚糖酸溶液加入0.1～5％交聯(lián)劑溶液，形成微乳液，離心分離，沉淀物蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，將殼聚糖納米粒子干粉置于濃度為100～1000mg/L金屬離子溶液中，振蕩吸附，將吸附后的納米粒子置于烘箱中烘干，即得多糖類納米抗癌材料。
本發(fā)明中，所說的稀酸為乙酸、醋酸或鹽酸；交聯(lián)劑為陰離子交聯(lián)劑，包括多聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉等；金屬離子溶液為鋅離子的硫酸鹽、鹽酸鹽、硝酸鹽水溶液或?yàn)殁掚x子的硝酸鹽水溶液。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明提供了一種在常溫、常壓下(即溫和條件下)制備多糖類納米抗癌材料方法。制備過程中，不使用任何有機(jī)試劑和表面活性劑，很好的解決了殼聚糖納米微粒的分離和純化問題。
2)本發(fā)明制得的多糖類納米抗癌材料粒徑均勻，形態(tài)好。
3)本發(fā)明以具有抗癌活性的金屬離子與殼聚糖為基質(zhì)，通過引入多價(jià)陰離子交聯(lián)劑制備納米粒子，能夠作為新型抗癌藥物應(yīng)用于胃癌、腸癌、肝癌等多種領(lǐng)域。


圖1為實(shí)例1制備所得多糖類納米抗癌材料透視電鏡圖，粒徑約為50nm，放大倍數(shù)50000倍；圖2為實(shí)例2制備所得多糖類納米抗癌材料原子力顯微鏡圖，粒徑約為60nm；圖3為實(shí)例3制備所得多糖類納米抗癌材料原子力顯微鏡圖，粒徑約為70nm；圖4為實(shí)例4制備所得多糖類納米抗癌材料原子力顯微鏡圖，粒徑約為60nm；圖5為實(shí)例5制備所得多糖類納米抗癌材料原子力顯微鏡圖，粒徑約為140nm；圖6為實(shí)例6制備所得多糖類納米抗癌材料原子力顯微鏡圖，納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)，粒徑約為70nm；圖7為實(shí)例7多糖類納米抗癌材料處理胃癌細(xì)胞24h前后相差顯微鏡圖，a為對(duì)照組，b為試驗(yàn)組。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)例120℃磁力攪拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量9kDa、脫乙酰度85％的殼聚糖，配置0.1％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入0.1％多聚磷酸鈉溶液，反應(yīng)完全后，3000rpm/min離心，沉淀物蒸餾水漂洗至中性后，冷凍干燥即得多糖類納米抗癌材料。
上述方法制備的納米粒子平均粒徑約為50nm，透視電鏡圖顯示納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)(見圖1)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例260℃磁力攪拌下，在0.5％醋酸溶液中加入分子量10kDa、脫乙酰度84％的殼聚糖，配置5％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入5％硫酸鈉溶液，形成微乳液，4000rpm/min離心分離，蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，將殼聚糖納米粒子干粉置于600mg/L鈷離子溶液中，300rpm/min振蕩吸附，吸附完全后，將吸附后殼聚糖納米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖類納米抗癌材料。
上述方法制備的載鈷納米粒子平均粒徑約為60nm，其中鈷含量約為10％，原子力顯微鏡圖顯示納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)(見圖2)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例330℃磁力攪拌下，在1％鹽酸溶液中加入分子量8kDa、脫乙酰度86％的殼聚糖，配置2％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入1％檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)完全后，6000rpm/min離心，沉淀物蒸餾水漂洗至中性后，冷凍干燥即得多糖類納米抗癌材料。
上述方法制備的納米粒子平均粒徑約為70nm，原子力顯微鏡圖顯示納米粒子為球形結(jié)構(gòu)(見圖3)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例435℃磁力攪拌下，在1％乙酸溶液中加入分子量9kDa、脫乙酰度100％的殼聚糖，配置1.5％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入0.5％檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)完全后，3000rpm/min離心，沉淀物蒸餾水漂洗至中性后，冷凍干燥即得多糖類納米抗癌材料。
上述方法制備的多糖類納米抗癌材料平均粒徑約為60nm，原子力顯微鏡圖顯示納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)(見圖4)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例525℃磁力攪拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量8kDa、脫乙酰度50％的殼聚糖，配置1％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入0.5％檸檬酸鈉溶液，形成微乳液，4000rpm/min離心分離，蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，將殼聚糖納米粒子干粉置于600mg/L鈷離子溶液中，300rpm/min振蕩吸附，吸附完全后，將吸附后殼聚糖納米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖類納米抗癌材料。
上述方法制備的多糖類納米抗癌材料平均粒徑約為140nm，其中鈷含量約為20％，原子力顯微鏡顯示多糖類納米抗癌材料為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)(見圖5)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例630℃磁力攪拌下，在0.5％醋酸溶液中加入分子量9kDa、脫乙酰度80％的殼聚糖，配置2％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入1％檸檬酸鈉溶液，形成微乳液，6000rpm/min離心分離，蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，將殼聚糖納米粒子干粉置于800mg/L鋅離子溶液中，400rpm/min振蕩吸附，吸附完全后，將吸附后殼聚糖納米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖類納米抗癌材料。
上述方法制備的多糖類納米抗癌材料平均粒徑約為70nm，其中鋅離子含量約為8％，多糖類納米抗癌材料原子力顯微鏡圖顯示形態(tài)較好球形結(jié)構(gòu)(見圖6)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例7胃癌細(xì)胞株MGC803置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后再傳代。
細(xì)胞懸液培養(yǎng)24h后，棄原培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液100ul，測(cè)定孔加11ul不同濃度多糖類納米抗癌材料與陽性對(duì)照藥物，對(duì)照孔加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液，各設(shè)4個(gè)重復(fù)。重新放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72、120h后取出，每孔加入MTT20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入DMSO100ul，震蕩10min，使紫藍(lán)色甲完全溶解，酶標(biāo)儀490nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)各孔OD值，計(jì)算抑制率。抑制率＞30％為藥敏陽性，反之陰性。表1給出了多糖類納米抗癌材料對(duì)胃癌細(xì)胞毒性MTT試驗(yàn)。
抑制率＝(1-藥物OD值/對(duì)照OD值)×100％。
表1多糖納米抗癌材料對(duì)胃癌細(xì)胞毒性MTT試驗(yàn)

n＝4，**與0ug/ml組1％乙酸相比P＜0.01，++與ACA(100)組相比P＜0.01，ACA為殼聚糖醋酸溶液，其余為不同濃度的殼聚糖納米粒子水溶液。
權(quán)利要求
1.一種多糖類納米抗癌材料，其特征在于它是分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％的殼聚糖納米粒子，粒徑20-500nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖類納米抗癌材料的制備方法，其特征是在20-60℃攪拌下，于稀酸溶液中加入分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％殼聚糖，配置0.1％～5％殼聚糖酸溶液，然后向殼聚糖酸溶液加入0.1～5％交聯(lián)劑溶液，交聯(lián)反應(yīng)形成納米粒子微乳液，將納米粒子微乳液離心分離，沉淀物蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥，即得多糖類納米抗癌材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多糖類納米抗癌材料的制備方法，其特征是所說的稀酸為乙酸、醋酸或鹽酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說的交聯(lián)劑為陰離子交聯(lián)劑，包括多聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉。
5.一種多糖類納米抗癌材料，其特征在于它是載金屬離子殼聚糖納米粒子，粒徑20-500nm，其中殼聚糖的分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％，金屬離子含量(重量)為1～20％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多糖類納米抗癌材料的制備方法，其特征是在20-60℃攪拌下，于稀酸溶液中加入分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％殼聚糖，配置0.1％～5％殼聚糖酸溶液，然后向殼聚糖酸溶液加入0.1～5％交聯(lián)劑溶液，形成微乳液，離心分離，沉淀物蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，將殼聚糖納米粒子干粉置于濃度為100～1000mg/L金屬離子溶液中，振蕩吸附，將吸附后的納米粒子置于烘箱中烘干，即得多糖類納米抗癌材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多糖類納米抗癌材料的制備方法，其特征是所說的稀酸為乙酸、醋酸或鹽酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說的交聯(lián)劑為陰離子交聯(lián)劑，包括多聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說的金屬離子溶液為鋅離子的硫酸鹽、鹽酸鹽、硝酸鹽水溶液或?yàn)殁掚x子的硝酸鹽水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開的多糖類納米抗癌材料是以殼聚糖為基礎(chǔ)原料制備的，該多糖類納米抗癌材料的納米粒子粒徑20－500nm，其中殼聚糖分子量為2～80kDa，脫乙酰度50～100％。它可以作為新型抗癌藥物應(yīng)用于胃癌、腸癌、肝癌等多種領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K9/14GK1559614SQ20041001644
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月17日
發(fā)明者許梓榮, 亓立峰, 胡彩虹, 夏枚生 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)