專利名稱：一種多糖類納米抗菌材料及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以殼聚糖為基礎(chǔ)原料，通過(guò)負(fù)載具有殺菌活性的金屬離子的多糖類納米抗菌材料及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
殼聚糖是天然的高分子生物低聚物，其降解產(chǎn)物為具有弱堿性的氨基葡萄糖，對(duì)人體組織無(wú)毒、無(wú)害。它除具有優(yōu)異生物相溶性外，還具有獨(dú)特的生物活性，能調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體免疫，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，有較強(qiáng)的抑菌活性，并能調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)膽固醇與脂質(zhì)代謝。殼聚糖作為飼料添加劑、重金屬螯合劑、吸附劑、藥物緩釋劑等多種功能性材料已應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域。多種殼聚糖改性產(chǎn)物，如交聯(lián)殼聚糖、殼聚糖微球、殼聚糖納米粒子等也已得到較好應(yīng)用。殼聚糖微球、珠狀殼聚糖已被研究應(yīng)用于抗癌藥物與蛋白質(zhì)的控釋系統(tǒng)。制備珠狀殼聚糖的方法有水油兩相法、乳滴技術(shù)、噴霧干燥法等，通常這些制備過(guò)程復(fù)雜且需要使用有機(jī)溶劑與表面活性劑，由此制備的殼聚糖微球不適合物化性質(zhì)表征觀察。
Zhengrong Cui；Russell J Mumper.Chitosan-based nanoparticles fortopical genetic immunization.Journal of Controlled Release.2001，75(3)409-419報(bào)道，CS(殼聚糖)-DNA納米粒子通過(guò)CS與DNA在酸性溶液中凝聚作用制得，CS-DNA納米粒子的粒徑在100-250nm之間，合成的CS-DNA納米粒子能應(yīng)用于小鼠基因免疫。
Yong Hu；Xiqun Jiang，Yin Ding，et.al.Synthesis and characterizationof chitosan-poly(acrylic acid)nanoparticles.Biomaterials，2002，233193-3201報(bào)道，通過(guò)丙烯酸在殼聚糖溶液中模板聚合作用制備CS-PAA(多聚丙烯酸)納米粒子，能夠穩(wěn)定分散于酸性介質(zhì)中。但以上所制得的納米粒子粒徑通常較大，成品率較低，且形成的微粒粒徑不均一。
納米材料已作為抗菌材料應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。具有抗菌功能的納米材料，根據(jù)殺菌機(jī)理的不同，可分為兩類一類為載有Ag+的納米材料，利用Ag+可使細(xì)胞膜上的蛋白失活，從而殺死細(xì)胞；另一類為載有ZnO或TiO2等材質(zhì)的納米材料，它們?cè)诠庹諚l件下，會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)帶電子和價(jià)帶空穴，而后者是良好的氧化劑，具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，可與表面吸附的H2O或OH-離子發(fā)生反應(yīng)而形成具有強(qiáng)氧化性的羥基，從而借助羥基的強(qiáng)氧化性而殺死細(xì)胞，而且可穿透細(xì)胞膜，破壞膜結(jié)構(gòu)，降解細(xì)胞產(chǎn)生的毒素《熊德鑫，梁明，崔德建.納米材料對(duì)常見(jiàn)需氧致病菌最低抑菌濃度的測(cè)定.中華臨床新醫(yī)學(xué)。2002，3(10)879-880》。在多孔性沸石微粒中用離子交換法將具有殺菌、抗菌活性的Ag、Cu、Zn等金屬超微粒子吸附于孔中，然后加入纖維中，制成對(duì)大腸桿菌、葡萄狀球菌、各種霉菌和水蟲(chóng)等有殺菌、抗菌性的纖維產(chǎn)品。但多孔性沸石微粒子晶體結(jié)構(gòu)的耐酸性差，因此，在酸性條件下，Ag、Cu、Zn的離子交換條件及吸附效果的再現(xiàn)性是困難的。日本于1990年開(kāi)發(fā)了具有抗菌性能的TiO2多孔微粒子以取代傳統(tǒng)沸石，使固體納米TiO2應(yīng)用于殺菌材料《劉景春，黃海，左美祥等.納米載銀抗菌材料與促進(jìn)健康.材料導(dǎo)報(bào).2000，10(14)300-301》。
殼聚糖與其它多糖一樣，在其復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)中含有高活性的功能基團(tuán)，表現(xiàn)出類抗生素的特征，能夠抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)與活性。具有生物相溶性可降解的殼聚糖由于其抗菌活性在制備抗菌有機(jī)納米材料方面顯現(xiàn)了很大前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可作為抗菌、抗病毒藥物或飼料添加劑應(yīng)用的多糖類納米抗菌材料及其制備方法。
本發(fā)明的多糖類納米抗菌材料是載金屬離子殼聚糖納米粒子，粒徑20-500nm，其中殼聚糖的分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％，金屬離子重量含量為1～30％。
本發(fā)明的多糖類納米抗菌材料的制備方法，有兩種方案。
方案1，制備步驟如下在20-60℃攪拌下，于稀酸溶液中加入分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％殼聚糖，配置0.1％～5％殼聚糖酸溶液，然后向殼聚糖酸溶液加入0.1～5％交聯(lián)劑溶液，反應(yīng)過(guò)程中，同時(shí)加入濃度為100～1000mg/L金屬離子溶液，反應(yīng)完全后，離心分離，沉淀物蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥即得多糖類納米抗菌材料。
方案2，制備步驟如下在20-60℃攪拌下，于稀酸溶液中加入分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％殼聚糖，配置0.1％～5％殼聚糖酸溶液，然后向殼聚糖酸溶液加入0.1～5％交聯(lián)劑溶液，形成微乳液，離心分離，沉淀物蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，再將殼聚糖納米粒子干粉置于濃度為100～1000mg/L金屬離子溶液中，振蕩吸附，將吸附后的殼聚糖納米粒子置于烘箱烘干，即得多糖類納米抗菌材料。
本發(fā)明中，所說(shuō)的稀酸為乙酸、醋酸或鹽酸；交聯(lián)劑為陰離子交聯(lián)劑，包括多聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉等；金屬離子溶液為銅離子、鋅離子的硫酸鹽、鹽酸鹽、硝酸鹽水溶液或?yàn)殂y離子的硝酸鹽水溶液。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明提供了一種在常溫、常壓下(即溫和條件下)制備多糖類納米抗菌材料方法。制備過(guò)程中，不使用任何有機(jī)試劑和表面活性劑，很好的解決了殼聚糖納米微粒的分離和純化問(wèn)題。
2)本發(fā)明制得的多糖類納米抗菌材料在相同制備條件下所得的納米粒子粒徑大小均勻(粒徑約為20～500nm)，形態(tài)好。
3)本發(fā)明以具有殺菌活性的金屬離子與殼聚糖為基質(zhì)，通過(guò)引入多價(jià)陰離子交聯(lián)劑制備納米粒子，它能夠作為抗菌、抗病毒藥物或飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)或作為抗菌藥物應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。


圖1為實(shí)例1制備得多糖類納米抗菌材料透視電鏡圖，粒徑約為30nm，放大倍數(shù)50000倍；圖2為實(shí)例2制備所得多糖類納米抗菌材料原子力顯微鏡圖，粒徑約為60nm，其中，圖a)是納米抗菌材料原子力顯微鏡平面圖，圖b)是其立體圖；圖3為實(shí)例3制備所得多糖類納米抗菌材料低倍掃描電鏡圖(放大倍數(shù)2000倍)，粒徑約為70nm；圖4為實(shí)例4制備所得多糖類納米抗菌材料原子力顯微鏡圖，粒徑約為60nm；其中，圖a)是納米抗菌材料原子力顯微鏡平面圖，圖b)是其立體圖；圖5為實(shí)例4制備所得多糖類納米抗菌材料粒徑分布圖；圖6為實(shí)例5制備所得多糖類納米抗菌材料原子力顯微鏡圖，粒徑約為50nm，圖a)是納米抗菌材料原子力顯微鏡平面圖，圖b)是其立體圖；圖7為實(shí)例5制備所得多糖類納米抗菌材料粒徑分布圖；圖8為實(shí)例6制備所得殼聚糖納米粒子原子力顯微鏡圖，其中，圖a)是納米抗菌材料原子力顯微鏡平面圖，圖b)是其立體圖；納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)，并呈較規(guī)則雪花狀聚集狀態(tài)，粒徑約為40nm；圖9為實(shí)例8多糖類納米抗菌材料藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)沙門氏菌殺菌作用原子力顯微鏡圖，其中，圖a)是經(jīng)納米抗菌材料作用后沙門氏菌菌體細(xì)胞形態(tài)圖，圖b)是其立體圖；沙門氏菌經(jīng)多糖類納米抗菌材料作用3h后，可以觀察到沙門氏菌細(xì)胞體內(nèi)容物外瀉，僅殘留細(xì)胞外形輪廓，納米粒子通過(guò)細(xì)胞壁空洞進(jìn)入沙門氏菌體內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)例120℃磁力攪拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量9kDa、脫乙酰度85％的殼聚糖，配置0.1％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入0.1％多聚磷酸鈉溶液，反應(yīng)過(guò)程中，加入銅離子濃度為100mg/L硫酸銅溶液，反應(yīng)完全后，3000rpm/min離心，沉淀物蒸餾水漂洗至中性后，冷凍干燥即得多糖類納米抗菌材料。
上述方法制備的載銅納米粒子平均粒徑約為30nm，其中銅含量約為1％，透視電鏡圖顯示納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例260℃磁力攪拌下，在0.5醋酸溶液中加入分子量10kDa、脫乙酰度84％的殼聚糖，配置5％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入5％硫酸鈉溶液，反應(yīng)過(guò)程中，加入鋅離子濃度為1000mg/L氯化鋅溶液，反應(yīng)完全后，9000rpm/min離心，沉淀物蒸餾水漂洗至中性后，冷凍干燥即得多糖類納米抗菌材料。
上述方法制備的載鋅納米粒子平均粒徑約為60nm，其中鋅含量約為30％，原子力顯微鏡圖顯示納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例330℃磁力攪拌下，在1％鹽酸溶液中加入分子量8kDa、脫乙酰度86％的殼聚糖，配置2％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入1％檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)過(guò)程中，加入銅離子濃度為800mg/L硝酸銅溶液，反應(yīng)完全后，6000rpm/min離心，沉淀物蒸餾水漂洗至中性后，冷凍干燥即得多糖類納米抗菌材料。
上述方法制備的載銅納米粒子平均粒徑約為70nm，其中銅含量約為10％，低倍掃描電鏡圖顯示納米粒子為不規(guī)則瘤狀突起結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖3)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例435℃磁力攪拌下，在1％乙酸溶液中加入分子量9kDa、脫乙酰度100％的殼聚糖，配置1.5％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入銅離子濃度為400mg/L硫酸銅溶液，反應(yīng)過(guò)程中，同時(shí)加入0.5％檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)完全后，3000rpm/min離心，沉淀物蒸餾水漂洗至中性后，冷凍干燥即得多糖類納米抗菌材料。
上述方法制備的多糖類納米抗菌材料平均粒徑約為60nm，其中銅含量約為20％，原子力顯微鏡圖顯示納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖4)，其粒徑分布見(jiàn)圖5，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例525℃磁力攪拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量8kDa、脫乙酰度50％的殼聚糖，配置1％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入0.5％檸檬酸鈉溶液，形成微乳液，4000rpm/min離心分離，沉淀物蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，將殼聚糖納米粒子干粉置于600mg/L鋅離子溶液中，300rpm/min振蕩吸附，吸附完全后，將吸附后殼聚糖納米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖類納米抗菌材料。
上述方法制備的多糖類納米抗菌材料平均粒徑約為50nm，其中鋅含量約為20％，原子力顯微鏡顯示多糖類納米抗菌材料為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖6)，其粒徑分布見(jiàn)圖7，，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例630℃磁力攪拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量80kDa、脫乙酰度84％的殼聚糖，配置2％殼聚糖酸溶液，向殼聚糖乙酸溶液中加入1％檸檬酸鈉溶液，形成微乳液，6000rpm/min離心分離，沉淀物蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，將殼聚糖納米粒子干粉置于800mg/L銅離子溶液中，400rpm/min振蕩吸附，吸附完全后，將吸附后殼聚糖納米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖類納米抗菌材料。
上述方法制備的多糖類納米抗菌材料平均粒徑約為40nm，其中銅含量約為10％，原子力顯微鏡圖顯示殼聚糖納米粒子為較規(guī)則球形結(jié)構(gòu)，并呈較規(guī)則雪花狀聚集狀態(tài)，多糖類納米抗菌材料原子力顯微鏡圖顯示形態(tài)較好球形結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖8)，能在pH值3～8內(nèi)穩(wěn)定保存。
實(shí)例7應(yīng)用本發(fā)明制備的多糖類納米抗菌材料作為抗菌藥物治療由大腸桿菌感染引起的仔豬腹瀉。以28日齡斷奶仔豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別以多糖類納米抗菌材料、抗生素為試驗(yàn)材料設(shè)兩個(gè)試驗(yàn)組，試驗(yàn)組分別下設(shè)添加、不添加大腸桿菌菌株兩個(gè)分組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)三個(gè)濃度梯度(濃度梯度的設(shè)定參考抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果)，每個(gè)濃度梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)，另設(shè)一個(gè)對(duì)照組(飼喂基礎(chǔ)日糧)。每日計(jì)錄采食量，計(jì)算日增重與腹瀉率。飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)，分別計(jì)算各試驗(yàn)組死亡率，并檢測(cè)十二指腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量以評(píng)定多糖類納米抗菌材料對(duì)腸道菌群影響。
表1給出了多糖類納米抗菌材料治療仔豬腹瀉實(shí)驗(yàn)效果。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多糖類納米抗菌材料能有效治療由于大腸桿菌感染引起的仔豬腹瀉，減少腸道內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量，降低仔豬死亡率，增強(qiáng)仔豬免疫力。
實(shí)例8多糖類納米抗菌材料藥敏實(shí)驗(yàn)。將待測(cè)細(xì)菌在滅菌Mueller-Hinton(MH)肉湯瓊脂平板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取菌落接種于滅菌試管中MH的內(nèi)，37℃、180rpm/min過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的菌液稀釋到2-7×105CFU/ml，向無(wú)菌的96孔平板中的第一到第十一孔各加入100微升的菌液，第十二孔不加菌液而加100微升MH肉湯。然后從第一孔到第十孔逐一加入相應(yīng)的抗菌劑溶液，第十一孔作為掃描對(duì)照孔，不加抗菌劑，37℃、90rpm/min培養(yǎng)18-24小時(shí)，這樣待測(cè)多糖類納米抗菌材料的終濃度分別為128，64，32，16……2.5μg/ml。最小抑菌濃度MIC(Minimal Inhibitory Concentration)就是能阻止50％以上細(xì)菌生長(zhǎng)的最小抗菌劑濃度。用酶標(biāo)儀在490nm下對(duì)平板進(jìn)行掃描，MIC的確定按照比對(duì)照孔(第十一孔)的渾濁程度低50％以上的最小濃度計(jì)算。從沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的平板孔中的內(nèi)容物中取10微升涂布到MH瓊脂平板上，37℃下培養(yǎng)18小時(shí)，以此來(lái)確定抗菌劑的MBC值。最小殺菌濃度MBC(Minimal BactericidalConcentration)就是能抑制任何殘余菌落生長(zhǎng)的抗菌劑的最低濃度。
表2為多糖類納米抗菌材料及陽(yáng)性對(duì)照物殼聚糖藥敏試驗(yàn)體外抑菌效果(ug/ml)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多糖類納米抗菌材料能夠有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌等有害菌的生長(zhǎng)，最小抑菌濃度在1/32-1ug/ml之間；多糖類納米抗菌材料溶劑對(duì)抑菌活性有較大影響，溶于0.5％醋酸溶液中具有顯著的抑菌效果；多糖類納米抗菌材料抑菌效果與溶液pH值(4.5-7.5)呈負(fù)相關(guān)。
表1多糖類納米抗菌材料治療仔豬腹瀉實(shí)驗(yàn)效果
表2殼聚糖、CSN、CSN改性產(chǎn)物體外抑菌效果(ug/ml) CS為殼聚糖陽(yáng)性對(duì)照，CSM為根據(jù)本發(fā)明所述制備方法制備的多糖類納米抗菌材料。
權(quán)利要求
1.一種多糖類納米抗菌材料，其特征在于它是載金屬離子殼聚糖納米粒子，粒徑20-500nm，其中殼聚糖的分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％，金屬離子重量含量為1～30％。
2.權(quán)利要求1所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是在20-60℃攪拌下，于稀酸溶液中加入分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％殼聚糖，配置0.1％～5％殼聚糖酸溶液，然后向殼聚糖酸溶液加入0.1～5％交聯(lián)劑溶液，反應(yīng)過(guò)程中，同時(shí)加入濃度為100～1000mg/L金屬離子溶液，反應(yīng)完全后，離心分離，沉淀物蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥即得多糖類納米抗菌材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說(shuō)的稀酸為乙酸、醋酸或鹽酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說(shuō)的交聯(lián)劑為陰離子交聯(lián)劑，包括多聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說(shuō)的金屬離子溶液為銅離子、鋅離子的硫酸鹽、鹽酸鹽、硝酸鹽水溶液或?yàn)殂y離子的硝酸鹽水溶液。
6.權(quán)利要求1所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是在20-60℃攪拌下，于稀酸溶液中加入分子量為2～80kDa，脫乙酰度為50～100％殼聚糖，配置0.1％～5％殼聚糖酸溶液，然后向殼聚糖酸溶液加入0.1～5％交聯(lián)劑溶液，形成微乳液，離心分離，沉淀物蒸餾水漂洗至中性，冷凍干燥得殼聚糖納米粒子，再將殼聚糖納米粒子干粉置于濃度為100～1000mg/L金屬離子溶液中，振蕩吸附，將吸附后的殼聚糖納米粒子置于烘箱烘干，即得多糖類納米抗菌材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說(shuō)的稀酸為乙酸、醋酸或鹽酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說(shuō)的交聯(lián)劑為陰離子交聯(lián)劑，包括多聚磷酸鈉、硫酸鈉或檸檬酸鈉。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多糖類納米抗菌材料的制備方法，其特征是所說(shuō)的金屬離子溶液為銅離子、鋅離子的硫酸鹽、鹽酸鹽、硝酸鹽水溶液或?yàn)殂y離子的硝酸鹽水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或6所述的多糖類納米抗菌材料，其特征是作為抗菌、抗病毒藥物或飼料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)的多糖類納米抗菌材料是以殼聚糖為基礎(chǔ)原料，通過(guò)負(fù)載具有殺菌活性的金屬離子制備而成，該多糖類納米抗菌材料的納米粒子粒徑20－500nm，其中殼聚糖分子量為2～80kDa，脫乙酰度50～100％，金屬離子重量含量為1～30％。它可以作為新型抗菌、抗病毒藥物或飼料添加劑，應(yīng)用于畜牧業(yè)或作為抗菌藥物應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1559433SQ200410016440
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月17日
發(fā)明者許梓榮, 亓立峰, 胡彩虹, 夏枚生 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)