專利名稱：：傳輸物質(zhì)穿過血腦屏障的人工低密度脂蛋白載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人工低密度脂蛋白(LDL)顆粒有效地靶向并傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障(BBB)的用途。本發(fā)明進一步提供用于預(yù)防和治療各種腦疾病的人工LDL顆粒組合物，方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：血腦屏障(BBB)能有效保護腦免受循環(huán)毒素的影響，但是也在諸如阿爾茨酶默病，帕金森氏病和腦癌和腦疾病的藥理治療中產(chǎn)生許多困難。大部分帶電分子和大部分超過700道爾頓的分子不能穿過屏障，而較小的分子可在肝中結(jié)合。這些因素在腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病如阿爾茨海默病、帕金森氏病、細(xì)菌和病毒感染與癌癥的藥理治療中產(chǎn)生許多困難。治療腦和CNS疾病和障礙的許多治療劑的親水性足以阻礙直接傳輸穿過BBB。而且，這些藥物和試劑易于在血液和周圍組織中降解，必須增加劑量以達到治療有效血清濃度。本發(fā)明提供的方法是通過將治療劑封裝在人工低密度脂蛋白顆粒(LDL)中，傳遞治療劑到BBB。本發(fā)明的LDL有助于通過胞吞轉(zhuǎn)運用傳輸治療劑穿過BBB。由于大部分太親水性而無法穿過BBB的藥物和治療劑也太親水性而無法摻入LDL顆粒中，本發(fā)明提供產(chǎn)生治療劑與LDL組分的共軛物的方法，促使其摻入LDL顆粒中，傳輸穿過BBB并隨后將治療劑釋放在細(xì)胞中。傳送藥物穿過BBB的先有方法一般包括三種(1)基于脂質(zhì)體的方法，其中治療劑被封裝在載體內(nèi)；(2)基于合成聚合物的方法，其中顆粒是使用合成聚合物形成的，以獲得精確限定的尺寸特征；和(3)使載體與藥物直接結(jié)合，其中治療劑與載體如胰島素共價結(jié)合。A.脂質(zhì)體脂質(zhì)體是在水溶液中超聲處理磷脂時自發(fā)形成的小顆粒，由成形為包圍水相環(huán)境的中空球的對稱脂雙層組成。以此作為傳輸水溶性藥物通過細(xì)胞膜的方法是有吸引力的，因為磷脂可以在質(zhì)膜中吸收，能將脂質(zhì)體的內(nèi)含物自動釋放入細(xì)胞液中。該技術(shù)更成功的變化包括使用陽離子脂質(zhì)，能在膜中協(xié)同形成納米孔。陽離子脂質(zhì)廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)，在實驗培養(yǎng)細(xì)胞中引入水溶性物質(zhì)如DNA分子。因為脂質(zhì)體的承載力大，所以對于傳輸藥物穿過BBB是有吸引力的。但是脂質(zhì)體通常太大而無法有效地通過BBB，本來是不穩(wěn)定的，其構(gòu)成的脂質(zhì)會被血漿中的脂結(jié)合蛋白質(zhì)吸收而逐漸損失。比如，在一些研究中，所用大尺寸脂質(zhì)體產(chǎn)生給出腦攝取的假像的微型栓塞。在一些研究中，與Polysorbate80共注射的脂質(zhì)體作為穩(wěn)定劑，Polysorbate80是能破壞BBB的清潔劑。在這些研究中，Polysorbate80對BBB的破壞作用是任何觀察到傳輸穿過BBB的原因。因此，脂質(zhì)體作為傳輸藥物穿過BBB的載體具有變化多端的歷史。多次試圖將脂質(zhì)體導(dǎo)向特定細(xì)胞目標(biāo)。使用BBB的靶內(nèi)源性受體的肽模擬物單克隆抗體(mAh)將加入聚乙二醇的免疫脂質(zhì)體靶向各種BBB受體，目的是獲得受體介導(dǎo)的攝取。但是，這種方法還需要單克隆抗體昂貴的生產(chǎn)、測試成本，和政府的批準(zhǔn)。因為mAb通常是在小鼠中產(chǎn)生的，易于降解，引入肽模擬物單克隆抗體不僅面臨顯著的管理障礙，而且證明難以用于病人環(huán)境。例如，免疫脂質(zhì)體的構(gòu)建過程中涉及將單克隆抗體(mAb)共價附著于脂質(zhì)體表面上。由于這些免疫脂質(zhì)體立刻被血漿蛋白質(zhì)包被，觸發(fā)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝取，該系統(tǒng)迅速破壞單克隆抗體(mAb)-共軛的脂質(zhì)體，已經(jīng)在稱為加入聚乙二醇的過程中用聚乙二醇(PEG)處理免疫脂質(zhì)體。不幸的是，PEG分子干擾mAb，由于空間干擾而使其非特異性。Huwyler等(1996)Proc.Nat′1.Acad.SciUSA9314164-14169通過形成在PEG尾端具有馬來酰亞胺部分的免疫脂質(zhì)體避免了這個問題，該免疫脂質(zhì)體可以與硫醇鹽化mAb共軛。制備的這些加入聚乙二醇的0X26免疫脂質(zhì)體內(nèi)部具有柔紅霉素，顯示在血漿中比游離治療劑或簡單、未加入聚乙二醇的脂質(zhì)體更穩(wěn)定。但是共焦顯微鏡方法表明，雖然脂質(zhì)體被胞吞入鼠腦毛細(xì)管中，但是它們并未到達腦細(xì)胞，且仍附著于內(nèi)皮細(xì)胞。因此，加入聚乙二醇的和馬來酰亞胺處理的脂質(zhì)體作為藥物傳遞載體似乎相對無效。1997年，Dehouck等人發(fā)現(xiàn)，結(jié)合ApoE的LDL受體參與LDL的胞吞轉(zhuǎn)運穿過BBB。在一系列的三篇出版物中，Versluis等人描述了ApoE富集的脂質(zhì)體用來傳遞柔紅霉素至小鼠中的癌細(xì)胞。選擇ApoE作為LDL-受體靶向蛋白質(zhì)是基于以下發(fā)現(xiàn)，即腫瘤細(xì)胞在其膜上表達高水平的LDL受體。Versluis等(1998)也提出使用天然LDL，但是并未對此進行試驗，隨后的論文只是集中于ApoE富集的脂質(zhì)體上。Versluis等(1999)研究了柔紅霉素的組織分布，但是沒有有關(guān)腦攝取的數(shù)據(jù)，表明并未設(shè)想將此方法作為傳輸?shù)廊峒t素穿過BBB的途徑。另外，Versluis等人使用的共軛化學(xué)不同于本發(fā)明。為了將藥物固定在脂質(zhì)體膜上，作者使3a-O-(油?；?-4β-膽甾烷酸(石膽酸的酯)與四肽Ala-Leu-Ala-Leu偶聯(lián)，然后與親水性抗腫瘤劑柔紅霉素共價連接。從而用共軛的非游離柔紅霉素治療腫瘤。雖然石膽酸是已經(jīng)含有可激活酸基的類固醇，但是酸基位于類固醇側(cè)鏈而非3-OH部位，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)不夠理想。游離柔紅霉素可以只在被強酸性溶酶體中的蛋白酶儲備裂解之后產(chǎn)生，會使共軛部分或試劑暴露在蛋白酶，酸和其他水解酶的降解作用中。然后治療劑會釋放入溶酶體內(nèi)空間中，在那里可發(fā)生進一步降解并被排出細(xì)胞中排出。相反，本發(fā)明的共軛化學(xué)優(yōu)選通過酯鍵結(jié)合治療劑，酯鍵容易在細(xì)胞液中切割，從而避免了Versluis等人的方法所需要的苛刻溶酶體條件。因此，本發(fā)明的共軛治療劑更可能保持流動到其靶，在靶處以有效方式釋放。也比脂質(zhì)體更可能被傳輸穿過BBB。Versluis等人的方法也需要大量固相肽化學(xué)步驟來合成四肽，以及若干附加步驟使其與FMOC共軛并使共軛物與石膽酸反應(yīng)，最終與藥物反應(yīng)。本發(fā)明使用少得多的步驟，每個步驟都產(chǎn)生幾乎定量的產(chǎn)率。因此本發(fā)明還提供改進的效率并降低成本。目前的臨床應(yīng)用中以阿霉素的其他脂質(zhì)體制劑作為癌癥的可能治療；但是并沒有推廣使用LDL的產(chǎn)品。Deneule等人發(fā)現(xiàn)黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白(p97)通過胞吞轉(zhuǎn)動被傳輸穿過BBB，可得出涉及LDL受體的結(jié)論，建議使用該蛋白質(zhì)作為藥物傳遞體系。B.合成聚合物還嘗試過涂有Polysorbate80的合成聚合物如聚(氰基丙烯酸丁酯)或聚丙烯酰胺。這些聚合物是有吸引力的，因為顆粒的親水性足以使其變得水溶性，但又能長時間保持其結(jié)構(gòu)形態(tài)，從而保護治療劑免于攝取入肝和腎中，在那里發(fā)生自然解毒過程。在兩種情況下，通常假設(shè)攝取是由通過細(xì)胞膜的被動擴散發(fā)生的，或者被涂布有網(wǎng)格蛋白的囊泡防御性攝取。在前一種情況下，治療劑然后被截留在內(nèi)皮細(xì)胞中，不比以前更接近靶，而在后一種情況下，治療劑被傳輸至溶酶體，這是細(xì)胞中的強酸性區(qū)室，其中含有蛋白酶和類似于胃內(nèi)容物的其他消化酶。因此，在后一種情況中，治療劑必須能在更極端的條件下保持穩(wěn)定。在這兩種情況下，所載藥物都沒有穿過細(xì)胞并注入腦實質(zhì)中，這不是理想的結(jié)果。因此，不覺驚奇的是，這兩種方法都沒有獲得多大的臨床應(yīng)用。研究人員們嘗試了上述方法的各種改進，以提高穿過BBB的載體攝取，但成功甚微。例如，Kreuter等(2002)J.DrugTarget10(4)317-25設(shè)計了使含有多種載脂蛋白的合成顆粒結(jié)合位于BBB上的載脂蛋白受體。他們證明了與聚(氰基丙烯酸丁酯)納米粒結(jié)鍵合的藥物傳輸，并用Polysorbate80涂布。攝取要求用Polysorbate80，ApoE或ApoB涂布。載脂蛋白AII，CII和J涂層不起作用。但是由于這些納米粒不是天然產(chǎn)生的，所以它們可具有不利的副作用。丙烯酸酯聚合物對于引發(fā)自身免疫反應(yīng)是特別眾所周知的；通常使用化學(xué)相關(guān)的聚合物聚(丙烯酰胺)作為助劑。Alyaudin等(2001)J.DrugTarget9(3)209-21用外涂有Polysorbate80的聚(氰基丙烯酸丁酯)納米粒傳送[3H]-dalargin穿過BBB，估計該過程是胞吞之一，接著可能是胞吞轉(zhuǎn)運。這種聚合物也具有免疫并發(fā)癥。C.治療劑共軛物還嘗試了藥劑與可傳送穿過BBB的物質(zhì)如胰島素的直接共軛。已知胰島素和胰島素樣生長因子通過專門的促進擴散體系穿過血腦屏障(Reinhard等(1994)Endocrinology135(5)1753-1761)。胰島素通過由內(nèi)皮胰島素受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)動被攝取(Pardridge等(1986)Ann.Intern.Med.105(1)82-95)。葡萄糖和大氨基酸如色氨酸也存在特異性轉(zhuǎn)動。但是，已經(jīng)證明胰島素轉(zhuǎn)動子的特異性太高，無法允許藥劑與胰島素共價結(jié)合而穿入腦中。用葡萄糖和氨基酸共軛物也得到類似結(jié)果，觀察到攝取遵守與其他低分子量物質(zhì)相同的一般原則，只有低于700Da的未帶電分子才能明顯地進入腦中。不方便設(shè)計化學(xué)合成生物分子的共軛形式，產(chǎn)生出乎意料的毒性效應(yīng)的危險，以及完全新穎化合物可能需要獲得FDA的批準(zhǔn)，這減弱了對這種方法的熱情。傳輸載體，如陽離子化的白蛋白，或運鐵蛋白受體的0X26單克隆抗體分別發(fā)生通過BBB的吸收性介導(dǎo)和受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)動。已用來傳輸少量藥物。這種方法具有高開支和難以產(chǎn)生單克隆抗體與陽離子化白蛋白的缺點，不適用于其他類型的分子。同樣地，陽離子化蛋白質(zhì)由于其免疫原性和形成沉積在腎中的免疫復(fù)合物，而顯示出毒性。Wu等(2002)J.DrugTarget10(3)239-45證明了使用由鏈毒抗生物素蛋白(SA)和大運鼠鐵蛋白受體的鼠0X26單克隆抗體的共軛物，以及與載體(稱為bio-bFGF/0X26-SA)結(jié)合的生物素酰化bFGF(bio-bFGF)的共軛物組成的藥物傳遞載體，將一種蛋白質(zhì)神經(jīng)保護劑-人堿性成纖細(xì)胞生長因子(bFGF)傳輸穿過BBB。雖然他們證明[125I]標(biāo)記的bio-bFGF被大量攝取入周圍器官中，但是每克腦只攝取0.01％的注射劑量。而且，此方法需要藥物的共價修飾，可能只對有限種類的藥物有用。載體還包括作為一種組分的小鼠單克隆抗體，會在病人中引起免疫反應(yīng)。Kang等(2000)J.DrugTarget8(6)425-34還使用抗生物素蛋白-生物素連接的嵌合肽來傳輸肽穿過BBB，但是只達到每克組織攝取0.12％注射劑量。Kang和Pardridge(Pharm.Res.111257-1264)將陽離子化人血清白蛋白與中性輕抗生物素蛋白共軛，然后使其與放射性標(biāo)記的生物素結(jié)合。生物素/cHSA/NLA復(fù)合體在血液中穩(wěn)定達24小時，但是共軛物在腦中選擇性地降解，以釋放游離生物素。如上所述，已顯示陽離子化蛋白質(zhì)因為其免疫原性而具有毒性。還已使用陽離子化的單克隆抗體(mAb)。Pardridge(J.Neurochem.701781-2)用共焦顯微鏡證明只有在蛋白質(zhì)陽離子化之后，天然人源化的4D5MAb才通過吸收性介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運穿過BBB。但是，此方法具有生產(chǎn)和化學(xué)修飾單克隆抗體的高開支的缺點，且不適用于其他類型的分子。Witt等(2000)J.Pharmacol.Exp.Ther.295(3)972-8用胰島素傳輸δ-阿片樣受體選擇性肽D-青霉胺(DPDPE)穿過BBB，這是一種蛋氨酸-腦腓肽類似物。但是胰島素產(chǎn)生許多危害，從而限制其用作一種治療對策。而且，其他研究者發(fā)現(xiàn)胰島素受體是非常選擇性的。因此，除了生產(chǎn)嵌合的困難之外，這種方法局限于狹窄的藥劑種類。其他研究者試圖使藥物與葡萄糖共軛，例如使用糖肽。但是證明通過BBBGlutl糖載體蛋白轉(zhuǎn)運子不能明顯傳輸任何糖肽。使試圖用載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運子如Glutl葡萄糖轉(zhuǎn)運子，膽堿轉(zhuǎn)過子或LATl大氨基酸轉(zhuǎn)運子的等高傳輸率失敗的問題是，載體轉(zhuǎn)運子的選擇性太高不能接受共軛的基質(zhì)。問題還在于，作為多藥抗性基因一員的P-糖蛋白迅速作用以主動地從腦中除去許多小分子，包括設(shè)法穿過屏障的藥物。除了LDL受體之外，BBB還包含結(jié)合具有高親和性的LDL的II型清除受體(SR)。清除受體與LDL的修飾形式如乙?；疞DL特別有效。與SR的結(jié)合僅導(dǎo)致胞吞，而不是理想的胞吞轉(zhuǎn)動。Rigotti等(1995)J.Biol.Chem.27016221-4發(fā)現(xiàn)乙?；疞DL不傳輸穿過BBB，而陽離子化牛IgG更有效，如Bickel等(1993)Adv.Drug.Del.Rev.10205-245中所述。證明乙?；疞DL胞吞噬轉(zhuǎn)動的失敗阻止許多研究者對LDL實驗作進一步嘗試。Protter等(WO87/02061)描述了一種藥物傳遞體系，使用來源于載脂蛋白如ApoE和ApoB，與藥劑或含試劑的載體共價結(jié)合。但是，使用分子共軛物只局限于少量藥物種類，且產(chǎn)生許多與上述相同的問題。Mller等(美國專利6288040)描述了與ApoE分子共價結(jié)合的合成聚(氰基丙烯酸丁酯)顆粒的用途。通過表面活性劑或者共價結(jié)合親水性聚合物進一步修飾顆粒表面。如上所述，因為這些顆粒不是天然產(chǎn)生的，所以它們具有各種不利的副作用。Samain等(WO92/21330)描述了合成顆粒載體的用途，載體含與固態(tài)親水性核共價結(jié)合的脂質(zhì)，還含有ApoB，用于傳遞物質(zhì)至腫瘤或巨噬細(xì)胞。但是他們并沒有公開將這種載體用于傳遞藥物穿過BBB的任何實用性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及人工低密度脂蛋白(LDL)顆粒靶向和傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障進入腦中的用途。本發(fā)明的另一個目的是合成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，非免疫原性，能防止多種藥物發(fā)生降解、滅活、水解、共軛和被攝入非靶組織的LDL載體。本發(fā)明提供了用作治療劑載體的LDL顆粒，以及將這種藥物和試劑傳遞穿過BBB的的改進方法，如與前述方法相比。例如與脂質(zhì)體不同的是，LDL顆粒是固態(tài)顆粒，因此具有大于脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。本發(fā)明進一步的目的是提供預(yù)防和治療多種腦疾病的包含LDL載體的組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明提供的方法是，使親水性治療劑與膽甾醇共軛，以促進共軛的治療劑摻入本發(fā)明的人工LDL顆粒中。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明提供了膽甾醇-共軛的阿霉素和四環(huán)素。這些過程和制得的膽甾醇共軛物以及這種共軛物的組合物用于提供能通過胞吞轉(zhuǎn)動傳送治療劑穿過血腦屏障的LDL顆粒，這是一種受體介導(dǎo)的過程，在腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞中操作，作為向腦中輸入膽甾醇和必需脂肪酸的途徑，便于并改善治療腦和CNS的各種疾病與障礙。另外，本發(fā)明的膽甾醇共軛物用于傳遞相應(yīng)的治療劑穿過BBB，無需將共軛物摻入本發(fā)明的LDL顆粒中。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的膽甾醇共軛物通過酯鍵結(jié)合，通過普遍存在的內(nèi)源酯酶的作用，從共軛物中釋放治療劑。將本發(fā)明的膽甾醇共軛物摻雜入本發(fā)明的LD顆粒中能保護膽甾醇共軛物免受這些酯酶的水解。本發(fā)明進一步提供了包含蛋黃磷脂酰膽堿(EYPC)，油酸膽甾醇酯和載脂蛋白E3(ApoE3)的人工LDL顆粒。形成固態(tài)顆粒的組成脂類包含三個層由膽甾醇，膽甾醇酯和活性劑組成的固態(tài)脂質(zhì)核心；由磷脂酰膽堿的脂肪酸鏈的混合物組成的中間界面層；和由磷脂頭基和ApoE3組成的表面層。本發(fā)明的LDL顆粒顯著提高活性劑靶向毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞并通過胞吞轉(zhuǎn)動便于傳輸穿過血腦連接。包圍治療劑的蛋白質(zhì)和磷脂組分還起到保護治療劑免受降解和攝入非靶細(xì)胞中的作用。本發(fā)明還涉及根據(jù)人工LDL顆粒輔助的試劑傳輸治療疾病和癥狀的方法。例如，本發(fā)明為治療各種腦疾病提供藥物組合物和方法，包括使用本發(fā)明的人工LDL顆粒將特定試劑靶向腦組織。本發(fā)明提供的人工LDL顆粒包含外部磷脂單層和固態(tài)脂質(zhì)核心，其特征在于外部磷脂單層包含至少一種載脂蛋白，固態(tài)脂質(zhì)核心包含至少一種治療劑。在實施例中，至少一種載脂蛋白選自ApoA，ApoB，ApoC，ApoD或ApoE，或一種載脂蛋白的異構(gòu)體，或脂蛋白和/或異構(gòu)體的組合。在優(yōu)選實施例中，至少一種載脂蛋白是ApoE。在更優(yōu)選的實施例中，至少一種載脂蛋白選自ApoE2，ApoE3和ApoE4。本發(fā)明還涉及進一步包含其他靶向分子或試劑的人工LDL顆粒，這些其他靶向分子或試劑能增強LDL復(fù)合物向腦組織的靶向傳遞。在最優(yōu)選的實施例中，至少一種載脂蛋白是ApoE3，單獨使用或者與一種或多種氧甾醇和/或其他選自ApoB和ApoE4的載脂蛋白聯(lián)合使用。本發(fā)明提供的人工LDL顆粒用于傳輸治療劑穿過血腦屏障。在優(yōu)選實施例中，至少一種治療劑選自氨基酸，肽，蛋白質(zhì)，碳水化合物和脂類。在另一個實施例中，至少一種治療劑是膽甾醇與選自氨基酸，肽，蛋白質(zhì)，碳水化合物和脂類的試劑之間形成的共軛物。在優(yōu)選實施例中，至少一種治療劑選自神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子，酶，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)質(zhì)，抗生素，抗病毒劑，抗真菌劑和化學(xué)治療劑。人工LDL顆粒的外部磷脂單層可包含任何磷脂或磷脂的組合，包括但并不限于磷脂酸，磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰丙三醇等。在優(yōu)選實施例中，外部磷脂單層包含磷脂酰膽堿和至少一種載脂蛋白。本發(fā)明的人工LDL顆粒優(yōu)選具有約15到50納米的直徑。在更優(yōu)選的實施例中，人工LDL顆粒具有約20到30納米的直徑。本發(fā)明人工LDL顆粒優(yōu)選具有約1.00到1.07克/毫升的密度。在更優(yōu)選的實施例中，人工LDL顆粒具有約1.02到1.06克/毫升的密度。而且，本發(fā)明的人工LDL顆粒具有至少2小時的血清穩(wěn)定性。本發(fā)明提供的人工LDL顆粒能通過胞吞轉(zhuǎn)運用傳輸穿過BBB。在優(yōu)選實施例中，腦對本發(fā)明顆粒的攝取專一性至少比肝大3倍。本發(fā)明人工LDL顆粒的固態(tài)脂質(zhì)核心可包含一種或多種脂類，包括但并不限于三酰甘油，膽甾醇，膽甾醇酯，脂肪酰酯等。在優(yōu)選實施例中，固態(tài)脂質(zhì)核心包含膽甾醇酯，其中膽甾醇被飽和脂肪酸酯化，包括但并不限于豆蔻酸酯，棕櫚酸酯，硬脂酸酯，花生酸酯，木蠟酸酯等，或不飽和脂肪酸，包括但并不限于棕櫚油酸酯，油酸酯，異油酸酯，亞油酸酯，亞麻酸酯，花生四烯酸酯等。在更優(yōu)選的實施例中，固態(tài)脂質(zhì)核心包含膽甾醇酯，油酸膽甾醇酯。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明人工LDL顆粒的固態(tài)脂質(zhì)核心包含至少一種治療劑，是膽甾醇和阿霉素或四環(huán)素之間形成的共軛物。在優(yōu)選實施例中，共軛物的膽甾醇和治療劑通過酯鍵連接。本發(fā)明還提供了用于傳遞治療劑穿過血腦屏障的組合物，該組合物包含本發(fā)明的人工LDL顆粒和藥學(xué)上可接受載體。本發(fā)明還提供了一種共軛物，它包含與選自氨基酸，肽，蛋白質(zhì)，碳水化合物和脂類的治療劑連接的膽甾醇。在優(yōu)選實施例中，治療劑選自神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子，酶，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)質(zhì)，抗生素，抗病毒劑，抗真菌劑和化學(xué)治療劑。在更優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明共軛物的治療劑是阿霉素或四環(huán)素。在最優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明共軛物的膽甾醇和治療劑通過酯鍵連接。本發(fā)明的每種共軛物可以與上述藥學(xué)上可接受載體混合，用于本發(fā)明藥物傳遞的任何方法。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)本發(fā)明人工LDL顆粒的方法，包括以下步驟1)將含有共軛或非共軛治療劑的磷脂懸浮在緩沖溶液中；2)超聲處理溶液，形成外部磷脂單層和固態(tài)脂質(zhì)核心；和3)添加包含至少一種載脂蛋白的溶液，該載脂蛋白摻入外部磷脂單層中。在優(yōu)選實施例中，由本發(fā)明方法制備的人工LDL顆粒具有10到50納米的直徑。本發(fā)明還提供了傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障的方法，所述方法包括給予需要的哺乳動物施用有效量的任何本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還提供了傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障的試劑盒，所述試劑盒包括含有本發(fā)明任何組合物的容器和使用說明書。本發(fā)明還提供了共軛物、人工LDL顆粒和本發(fā)明組合物用于生產(chǎn)治療腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病的藥物，這些話病癥如阿爾茨黑默疾、帕金森氏病、細(xì)菌和病毒感染和癌癥。附圖簡要說明圖1放射性標(biāo)記的脂類和LDL的溴化鉀密度梯度分布。圖2腦(左)和肝(右)中LDL和脂類的攝取。圖3(左)腦和肝中LDL與脂質(zhì)顆粒的攝取比。(右)LDL和脂質(zhì)顆粒的腦攝取比。圖414C標(biāo)記的LDL顆粒的血漿濃度的時間過程。圖5通過酞酸酯與膽甾醇連接的親水性分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。顯示特定親水性分子是阿霉素。不發(fā)生共軛時，單獨的阿霉素太親水性不能摻入LDL顆粒中。圖6通過硫醚酯與膽甾醇連接的親水性分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。顯示特定親水性分子是四環(huán)素。不發(fā)生共軛時，單獨的四環(huán)素太親水性太大不能摻入LDL顆粒中。發(fā)明詳述定義這里所用術(shù)語“人工LDL顆?！笔侵赴ㄇ蛐瘟字瑔螌雍凸虘B(tài)脂質(zhì)核心的結(jié)構(gòu)。這里所用術(shù)語“脂質(zhì)體”是指包括球形脂質(zhì)雙層和含水核心的結(jié)構(gòu)。這里所用術(shù)語“攝取專一性”是指腦和肝臟中人工LDL顆粒對脂質(zhì)顆粒(與人工LDL顆粒相同，除在外部磷脂單層中不包含脫輔蛋白質(zhì)以外)的攝取比。注射入Sprague-Dawley鼠之后2小時，在腦和肝臟中測量人工LDL顆粒和脂質(zhì)顆粒的攝取。用腦中人工LDL顆粒攝取對脂質(zhì)顆粒攝取的比值除以肝臟中人工LDL顆粒攝取對脂質(zhì)顆粒攝取的比值，計算攝取專一性。這里所用術(shù)語“血清穩(wěn)定性”是指血漿中保留至少75％注射的人工LDL顆粒的時間長度。這里所用術(shù)語“載脂蛋白”和“脫輔蛋白質(zhì)”是指與脂蛋白的磷脂單層相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括但并不限于ApoA；ApoB；ApoC；ApoD；ApoE；及其所有異構(gòu)體。這里所用術(shù)語“ApoE”是指ApoE的一種或多種異構(gòu)體，包括但并不限于ApoE2，ApoE3和ApoE4。這里所用術(shù)語“ApoB”是指ApoB的一種或多種異構(gòu)體，包括但并不限于ApoB48和ApoB-100。這里所用術(shù)語“外部磷脂單層”是指包括至少一種磷脂的單層，其中磷脂的磷酸酯頭基朝向外側(cè)，脂肪酰鏈朝向內(nèi)側(cè)的固態(tài)脂質(zhì)核心。磷脂包括但并不限于磷脂酸，磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油等。這里所用術(shù)語“固態(tài)核心”是指被球形磷脂單層包封的人工LDL顆粒部分。固態(tài)核心可包含一種或多種脂類，包括但并不限于三酰甘油，膽甾醇，膽甾醇酯，脂肪酰酯等。這里所用術(shù)語“膽甾醇酯”是指被飽和脂肪酸酯化的膽甾醇，包括但并不限于肉豆蔻酸酯，棕櫚酸酯，硬脂酸酯，花生酸酯，木蠟酸酯等，或不飽和脂肪酸，包括但并不限于棕櫚油酸酯，油酸酯，異油酸酯，亞油酸酯，亞麻酸酯，花生四烯酸酯。這里所用術(shù)語“治療劑”是指治療有用的氨基酸，肽，蛋白質(zhì)，核酸，包括但并不限于多核苷酸，寡核苷酸，基因等，碳水化合物和脂類。本發(fā)明的治療劑包括神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子，酶，抗體，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)質(zhì)，抗生素，抗病毒素，抗真菌劑和化學(xué)治療劑等。本發(fā)明的治療劑包括藥物，前體藥物和當(dāng)治療劑傳遞至靶組織時可激活的前體。這里所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受載體”是指一種化學(xué)組合物或化合物與活性組分混合，混合后可用來將活性組分施用給受試者。這里所用術(shù)語“生理學(xué)上可接受的”酯或鹽是指活性組分的酯或鹽形式，能與藥物組合物的任何其他組分相容，對施用該組合物的受試者沒有害處。這里所用術(shù)語“藥物學(xué)上可接受載體”還包括但并不限于以下一種或多種物質(zhì)賦形劑；表面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；成粒和崩解劑；粘合劑；潤滑劑；甜味劑；增香劑；著色劑；防腐劑；生理學(xué)上可降解的組合物，如明膠；含水載體和溶劑；油性載體和溶劑；懸浮劑；分散或潤濕劑；乳化劑；緩和劑；緩沖劑；鹽；增稠劑填充劑乳化劑；抗氧化劑；穩(wěn)定劑；和藥學(xué)上可接受的聚合或疏水物質(zhì)。本發(fā)明藥物組合物中可以包括其他“附加組分”是本領(lǐng)域中已知的，如Genaro編著，1985，《雷明登藥物科學(xué)》(Remington′sPharmaceuticalSciences)，MackPublishingCo.，Easton，Pa納入作為參考。這里所用術(shù)語“有效量”是指足以產(chǎn)生治療反應(yīng)的量。LDL顆粒和脫輔蛋白質(zhì)的性質(zhì)本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)人工LDL顆粒能通過稱為胞吞轉(zhuǎn)運的主動受體介導(dǎo)的過程有效地靶向和傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障。胞吞轉(zhuǎn)運在腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞中自然發(fā)生，作為將膽甾醇和必需脂肪酸輸入腦中的途徑。因此本發(fā)明的人工LDL載體系統(tǒng)提供了有效靶向和傳送藥物至腦中的方法，其中BBB或其他不利副作用的破壞最小。天然LDL顆粒的平均直徑大約為22納米。內(nèi)核由大約150-200個甘油三酯分子和1500-2000個膽甾醇酯分子構(gòu)成。顆粒表面包含由大約450個磷脂分子，185個神經(jīng)鞘磷脂分子和1個脫輔蛋白質(zhì)分子，通常是ApoB-100構(gòu)成的單層(Hevonoja等(2000)BiochimBiophysActa1488(3)189-210)。天然LDL顆粒還可以包含大約600個未酯化的膽甾醇分子和較少量的溶血磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，二酰甘油，神經(jīng)酰胺和磷脂酰肌醇，以及痕量的其他生物脂類(Hevonoja等(2000)BiochimBiophysActa1488(3)189-210)。其他脫輔蛋白質(zhì)，包括ApoE，在LDL，VLVL和HDL中發(fā)現(xiàn)，但是具有不同的受體結(jié)合特性(Bradly等(1984)J.Biol.Chem.259(23)14728-35)。因此，LDL顆粒的表面是非均勻地覆蓋著脫輔蛋白質(zhì)，但由具有不同物理性質(zhì)的不同區(qū)域組成。脫輔蛋白質(zhì)分子負(fù)責(zé)保持顆粒的結(jié)構(gòu)完整性，與肝，腎和血腦屏障上的脂蛋白受體結(jié)合。脫輔蛋白質(zhì)根據(jù)脂質(zhì)組分的狀態(tài)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化(Mims等(1990)Biochemistry29(28)6639-47)。脫輔蛋白質(zhì)E(ApoE)是參與全身中膽甾醇傳輸和血漿脂蛋白代謝的蛋白質(zhì)。在周圍細(xì)胞中，ApoE通過導(dǎo)向其傳輸而影響膽甾醇的細(xì)胞濃度。在神經(jīng)元中，膽甾醇濃度的變化影響在阿爾茨海默病中改變的相同位置處微管相關(guān)蛋白質(zhì)tau的磷酸化狀態(tài)。ApoE具有三種主要異構(gòu)體ApoE4，ApoE3和ApoE2，其區(qū)別在于單氨基酸取代。ApoE3是正常異構(gòu)體，而ApoE4和ApoE2是功能異常的。ApoE2與III型高脂蛋白血癥相關(guān)。ApoE4與動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病的風(fēng)險增加，認(rèn)知功能減低和神經(jīng)突贅疣的減少相關(guān)。除了年齡之外，ApoE4是散發(fā)性阿爾茨海默病的最重要風(fēng)險因素。ApoE4具有取決于鈣的毒性作用(Veinbergs等(2002)J.Neurosci.Res.67(3)379-87)，但是其主要效應(yīng)似乎是削弱ApoE3對β-淀粉樣蛋白的清除率(Holtzman等(2001)J.Mol.Neurosci.17(2)147-55)。發(fā)現(xiàn)這些作用在血腦屏障中發(fā)生(Shibata等(2000)J.Clin.Invest.106(12)1489-99)，因此可以是重要的治療應(yīng)用。人工LDL顆粒制備在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的人工LDL顆粒包含蛋黃磷脂酰膽堿(EYPC)，油酸膽甾醇酯和ApoE3的混合物。形成固態(tài)顆粒的脂類組分由三個層構(gòu)成(Hevonoja等(2000)Biochim.Biophys.Acta1488189-210)含有膽甾醇，膽甾醇酯和活性藥劑的固態(tài)脂質(zhì)核心，活性藥劑可以與膽甾醇共軛或者非共軛；含有磷脂酰膽堿的脂肪酸鏈混合物的中間界面層；以及含有磷脂頭基和ApoE3的表面層。固態(tài)核心和ApoE3的存在，區(qū)分了本發(fā)明的LDL顆粒和脂質(zhì)體，后者由包圍含水核心的球形脂質(zhì)雙層構(gòu)成，是不穩(wěn)定的。此外，LDL顆粒是由天然非免疫原性組分制成的，這一點區(qū)分了天然LDL顆粒與人造納米粒，分子或化學(xué)共軛物，或膠體懸浮液。ApoE3通過胞吞轉(zhuǎn)運的主動細(xì)胞介導(dǎo)過程與毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異受體結(jié)合，傳輸整個顆粒穿過連接處。一旦在腦內(nèi)，隨著膽甾醇和磷脂逐漸被腦同化和利用，治療劑從LDL顆粒中自然釋放。雖然上述脂質(zhì)組分是優(yōu)選的，但是本發(fā)明考慮其他脂類，例如不同脂類組成的LDL顆粒，包括化學(xué)改性的脂類，或者其他自然形成的親脂性分子的混合物，這些脂類也能同樣發(fā)揮作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解可以對其進行改進，使LDL載體系統(tǒng)適合于特定治療劑或治療應(yīng)用。優(yōu)選由人工LDL和克隆ApoE3制備LDL顆粒。這能大大促進治療劑有效和穩(wěn)定地?fù)饺隠DL的脂質(zhì)中心，并避免因為可能的翻譯后修改，變異，或從人供體純化的不純ApoE3蛋白質(zhì)的純化而出現(xiàn)的抗原性問題。還能避免ApoE3或脂類被血源性疾病如HIV或其他病毒無意的污染。這種污染一直是使用人源物質(zhì)的嚴(yán)重缺點。在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涉及制備人工LDL顆粒的改進微乳劑方法，包括以下步驟將含有共軛或非共軛藥物的脂類懸浮在磷酸酯緩沖的鹽水(PBS)溶液中，并在54℃氮氣氣氛下使用至少約25瓦的超聲波儀(探針振幅18微米，22千赫)對該溶液進行1小時的超聲處理。這種功率水平對產(chǎn)生適當(dāng)尺寸的LDL顆粒以促進傳輸穿過BBB是重要的，優(yōu)選直徑小于50納米，更優(yōu)選直徑小于30納米。利用水夾套的超聲室，將含有LDL顆粒的樣品保持在恒溫下，優(yōu)選在大約53和56℃之間。超聲處理之后，脂質(zhì)類溶液與ApoE一起溫育，以285000，在溴化鉀(KBr)分布梯度中超離心分離產(chǎn)生的脂蛋白顆粒。然后對PBS透析除無KBr。可以在4℃保存顆粒以備后用，優(yōu)選保存達2周。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到可以對該方法的各個方面進行替換。例如，可以替換其他合適的密度梯度，如氯化銫或蔗糖。在替換實施例中，可以用尺寸排阻層析，電泳或其他方法代替離心分離本發(fā)明的LDL顆粒。這里所述方法產(chǎn)生含藥物的LDL顆粒具有能穿過BBB的適當(dāng)尺寸，并保持不穩(wěn)定的共摻入分子的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。對于傳遞到腦而言，LDL顆粒尺寸通常應(yīng)小于50納米，優(yōu)選直徑是20到30納米。在另一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的LDL顆粒包括EYPC，油酸膽甾醇酯和ApoE3的混合物，以每克脂質(zhì)體0.02到0.2克比例存在，能有效摻入藥劑和胞吞噬轉(zhuǎn)運穿過BBB。在更優(yōu)選的實施例中，范圍是每克脂質(zhì)體0.08到0.12克。更優(yōu)選EYPC對油酸膽甾醇酯和ApoE3的摩爾比是23∶2.2(以重量為基礎(chǔ))。在本發(fā)明進一步的實施例中，基于LDL的載體體系可以包含另外的靶向分子共摻入在表面層上，以進一步便于將試劑傳輸和傳遞至腦中。例如，膽甾醇的氧化衍生物(氧甾醇)，包括膽甾醇?xì)溥^氧化物，膽甾醇環(huán)氧化物和羥基膽甾醇衍生物也可用來提高攝取。LDL顆粒還可以摻入其他脫輔蛋白質(zhì)，如ApoB或ApoE4。本發(fā)明還涉及摻入一種或多種物質(zhì)，包括治療劑，以治療各種腦疾病或障礙。LDL載體體系的優(yōu)點之一是能安全和自然地傳遞多種藥物，包括那些化學(xué)不穩(wěn)定，高度反應(yīng)活性，或容易在水溶液中水解的藥物。可能的試劑包括但并不限于神經(jīng)營養(yǎng)因子，如NGF或從淀粉樣蛋白前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)片段，用于治療腦損傷和神經(jīng)變性疾??；酶，如苯丙氨酸羥化酶，用于代替通過遺傳缺損而造成的喪失；酶，如酪氨酸羥化酶和DOPA脫羧酶，用于再生帕金森氏病中喪失的多巴胺；酶激活劑或抑制劑以恢復(fù)失去的生物合成功能抗生素，如四環(huán)素，用于治療傳染??；神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，用于治療疼痛，或包括運動，認(rèn)知和行為異常的疾?。换瘜W(xué)治療劑和抗-AIDS藥物，如依托泊甙，三唑核苷，或抗組胺劑，如洛羅塔丁，非索非那定，或西替利嗪(Zyrtec)，與系統(tǒng)地給予可耐受劑量時足量不能到達腦中的試劑一起用于治療腦腫瘤或其他疾病；診斷劑，包括造影劑，如釓衍生物，碘海醇，或碘克酸鹽，或者因為系統(tǒng)施用時對腦的滲透差而目前不使用的試劑；治療或診斷蛋白質(zhì)，如抗體，改造和天然的；和編碼基因或蛋白質(zhì)的治療序列，或其部分，由DNA，RNA，或可非侵入性地引入穿過BBB的氨基酸。存在于LDL載體中的治療劑的量很不同，取決于分子的類型。LDL載體中的最佳摻入，治療劑量應(yīng)小于0.1摩爾/摩爾膽甾醇。預(yù)計較高水平可使LDL顆粒不穩(wěn)定。本發(fā)明進一步考慮可以在相同顆粒中可存在多種藥物或其他試劑。在實施例中，要求活性物質(zhì)的非共價修飾摻入本發(fā)明LDL顆粒中，條件是該物質(zhì)的疏水性足以保持具有膽甾醇的微乳液。對于大多數(shù)中性和適度帶電分子同樣如此。在另一個實施例中，如果治療劑是高度帶電的，像DNA或肽，或者為了防止擴散，該試劑可以與膽甾醇共價連接。在優(yōu)選實施例中，連接是通過酯鍵完成的，腦組織中發(fā)現(xiàn)普遍存在的酯酶能釋放試劑(Yordanov等，(2000)J.Med.Chem.45(11)2283-8；Yang等(1995)Pharm.Res.12(3)329-36)?；蛘撸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇其他結(jié)合方式起同樣作用，它們可與磷脂酰膽堿，一些其他親脂性化合物，或ApoE本身共價結(jié)合。如上所述，本發(fā)明的LDL顆粒與加入聚乙二醇的脂質(zhì)體，納米粒和類似的人造物質(zhì)相比，具有若干優(yōu)點。本發(fā)明的LDL顆粒是由血漿的正常組分制成的，與其天然受體結(jié)合，作為腦對外源必需脂肪酸的自然需要的一部分，通過正常途徑傳輸至細(xì)胞中。因此，其毒性明顯低于聚合物基載體和破壞細(xì)胞膜完整性的試劑。目前用于傳遞藥物至腦中的方法是用甘露醇滲透性破壞BBB。但是破壞BBB是嚴(yán)重缺點，事實是它允許毒素和甚至細(xì)菌與具有嚴(yán)重間接效應(yīng)的所需治療劑一起進入腦中。本發(fā)明的人工LDL載體體系還提供在血漿中保持高濃度至少2小時的優(yōu)點(附圖4)。這對維持足夠有效的血漿濃度(通常被稱為“血漿濃度曲線下的面積”或AUC)，使物質(zhì)充分?jǐn)z入和傳遞到腦中是重要的。通過特定地靶向腦組織，如實施例3中所示，本發(fā)明的人工LDL顆粒顯著提高藥物的治療效果，因為藥物被肝臟吸收，被解毒途徑滅活，包括被肝酶如P450滅活的可能性小得多。包含人工LDL顆粒的組合物可以用各種方法配制本發(fā)明的LDL顆粒，取決于待治療的腦疾病類型。因此本發(fā)明的藥物組合物中包括配制至少一種含藥物的LDL顆粒復(fù)合體用于人或獸醫(yī)。這種組合物可以與藥學(xué)上可接受載體或賦形劑，任選與輔助藥劑一起使用。常規(guī)載體也能與本發(fā)明一起使用?？山邮茌d體包括但并不限于葡萄糖，鹽水和磷酸鹽緩沖鹽水。處理除去游離的治療劑或其他非摻入分子之后，使藥學(xué)上可接受載體中的LDL顆粒懸浮液達到所需濃度施用給病人。因為LDL顆粒太大不能在腸道外有效地吸收，設(shè)計這些組合物供靜脈使用，但也可以設(shè)想肌肉內(nèi)或動脈內(nèi)施用，或甚至胃腸外給藥或口服產(chǎn)生適當(dāng)?shù)母倪M。因此，本發(fā)明提供的組合物靶向施用到BBB，其中包括在LDL顆粒中包含的選擇的活性試劑溶液和藥學(xué)上可接受載體，優(yōu)選是含水載體。制得的組合物可以消毒并包裝在試劑盒中使用，或者在無菌條件下過濾并凍干。用于靜脈給藥的試劑盒(含凍干的制劑)還可包括消毒水溶液，用于施用前混合。根據(jù)接近的生理條件的需要，組合物中可以包含藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑，滲透性調(diào)節(jié)劑等，如乙酸鈉，乳酸鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣等。這些制劑中LDL顆粒的濃度可以很大不同，即從小于約0.5％，通常等于或至少約1％，到多達5到10重量％。制備可靜脈內(nèi)施用LDL顆粒制劑的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些方法如Goodman和Gilman，《治療學(xué)的藥理基礎(chǔ)》(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics)JoelG.Hardman(編輯)，LeeE.LimbirdMcGraw-HillProfessional；ISBN0071354697；第10版(2001年8月13日)中所述。使用人工LDL載體的治療方法在進一步的實施例中，人工LDL顆?？梢越o予需要治療的哺乳動物宿主，有效地傳遞試劑穿過BBB到腦中。對于治療應(yīng)用，可以采用任何方式給予受試者有效量的含藥物L(fēng)DL顆粒，使毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞攝取LDL顆粒。在臨床應(yīng)用中，LDL顆粒傳遞體系顯著提高了藥物的療效，例如用于治療阿爾茨默病，帕金森氏病和腦癌。例如，可以在LDL顆粒中摻入神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子，使肽能攝入腦中。這會引起新神經(jīng)的生長過程，有利于一些神經(jīng)變性疾病。如本文所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到使用本發(fā)明的LDL載體體系具有各種可供選擇的臨床應(yīng)用。膽甾醇治療劑的共軛物膽甾醇是相對化學(xué)不活躍的分子。因此，必須在膽甾醇與含胺的治療劑反應(yīng)之前活化膽甾醇。例如，可以通過與環(huán)酸酐和酞酸酐或琥珀酸酐反應(yīng)，產(chǎn)生含有羧基的酞酸酯或琥珀酸酯來活化膽甾醇。然后通過與五氟苯酚反應(yīng)和然后與二異丙基碳化二亞胺反應(yīng)，產(chǎn)生與含胺治療劑的酰胺鍵合來活化羧基。制得的產(chǎn)物是膽甾醇-治療劑共軛物，其中治療劑通過酯鍵合與膽甾醇共軛。膽甾醇-治療劑共軛物的親脂性足以允許摻入本發(fā)明的人工LDL顆粒中。同樣，由于優(yōu)選的鍵合是酯鍵，所以治療劑可以通過與普遍存在的內(nèi)源酯酶作用而從膽甾醇部分中釋放出來。因此，治療劑從共軛物中的釋放并不取決于苛刻條件和溶酶體中發(fā)現(xiàn)的非特異性肽酶的作用。雖然膽甾醇和治療劑之間的優(yōu)選鍵合是酯鍵，但是本發(fā)明考慮其他鍵合，包括但并不限于醚，酰胺和肽鍵?；蛘?，可以通過硫代膽甾醇，治療劑和雙官能交聯(lián)劑的反應(yīng)使含胺或含羥基的治療劑與硫代膽甾醇共軛，雙官能交聯(lián)劑包括但并不限于PMPI。制得的共軛物是膽甾醇和治療劑通過硫醚鍵連接的共軛物。如果治療劑含有一個氨基，則能利用一種市售雙官能交聯(lián)劑與硫代膽甾醇共軛，這些市售雙官能交聯(lián)劑包括但并不限于琥珀酰亞胺-4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯。-旦形成，膽甾醇-治療劑共軛物可與未共軛的油酸膽甾醇酯，磷脂，脂蛋白混合，如本文所述，從而產(chǎn)生本發(fā)明的人工LDL顆粒。上述引用的各參考文獻都完整納入本文作為參考。實施例以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，不應(yīng)認(rèn)為以任何方式對本發(fā)明范圍的限制。實施例l純化全長度脫輔蛋白質(zhì)E(ApoE)將從AantiPolarLipids，Inc.獲得的DMPC(1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿)以100毫克/毫升的濃度懸浮在玻璃管內(nèi)的苯中，用臺式超聲波儀超聲處理。將DMPC懸浮液是殼冷凍的，并凍干過夜，然后再懸浮于30毫升標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(10毫摩爾Tris-HCl.pH7.6，0.15摩爾NaCl，1毫摩爾EDTA，0.0005％NaN3)中，形成10-20毫克/毫升DMPC，并轉(zhuǎn)移至50毫升塑料錐形管中。將管置于水浴中，用超聲波儀和微型尖管超聲處理4個10分鐘間隔，2-3分鐘交替冷卻。重復(fù)超聲處理，直到溶液變得幾乎透明。然后將超聲處理的DMPC以2000轉(zhuǎn)/分的速度離心20分鐘，除去在超聲處理過程中脫落的任何鈦。離心收集表達克隆ApoE的細(xì)菌細(xì)胞，并在具有大尖管的Branson超聲波儀中在冰上進行超聲處理，使用4個周期30秒的高強度超聲處理，通過2分鐘冷卻間隔分離。在4℃以39.000xg離心超聲處理的懸浮液20分鐘，除去細(xì)胞碎片，在100毫克/升原始培養(yǎng)基中將懸浮液與DMPC混合。混合物在24℃(這是DMPC的轉(zhuǎn)換溫度)水浴中溫育過夜。然后添加固態(tài)KBr，使DMPC-ApoE混合物的密度升到1.21克/毫升，以55000轉(zhuǎn)/分的速度在15℃，在60TiBeckman固定角轉(zhuǎn)頭中以分步梯度(1.21，1.10和1.006克/毫升)離心過夜。丟棄靠近管頂含有游離DMPC的白色帶狀物，并取出其下方的ApoE-DMPC復(fù)合體，以密度1.009克/毫升漂清的。用凝膠電泳證實ApoE的存在。然后在4℃用0.1摩爾NH4HCO3和0.0005％NaN3對適當(dāng)組分透析，三次更換緩沖液。然后用凝血酶消化蛋白質(zhì)，除去由載體留下的聚組氨酸標(biāo)記。以1∶500凝血酶ApoE重量比將活化的凝血酶與蛋白質(zhì)混合，在37℃溫育至少1小時，用凝膠電泳分析等分試樣，以確保蛋白質(zhì)完全切割。因為存在兩個切割位點，所以不完全的切割會導(dǎo)致分子量較高的第二個帶狀物。一旦證明完全切割，添加β-巰基乙醇至1％最終濃度，停止反應(yīng)。然后在50毫升經(jīng)酸洗的管中將ApoE起殼冷凍，并凍干過夜。用30毫升冷的氯仿/甲醇(2∶1v/v)洗滌ApoE，并用J6Beckman離心機在4℃以1500轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘收集。將顆粒再懸浮于小體積的冷甲醇中并渦動，然后用冷甲醇灌滿管并離心。這個步驟除去了任何殘余的氯仿。倒出甲醇，在管中留下少量，進行渦動，從顆粒形成糊。添加5毫升含有6摩爾胍-HCl，0.1摩爾TrisHCl，pH7.4，0.01％EDTA，1％β-巰基乙醇，和0.005％疊氮化鈉的溶液，將溶液裝在SephacrylS-300柱上，該分離柱用4摩爾胍-HCl，0.1摩爾Tris-HCl，pH7.4，0.1％β-巰基乙醇和0.0005％NaN3平衡。用含有0.1％β-巰基乙醇和0.0005％疊氮化鈉的4摩爾胍緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。用0.1摩爾NH4HCO3和0.0005％NaN3透析組分，緩沖液更換4次。用YM10AmiconCentriprep濃縮器(Milllipore)濃縮純化的ApoE至1-2毫克/毫升的最終濃度，在-20℃儲存。實施例2LDL-脂質(zhì)體的ApoE富集1.制備脂質(zhì)餅狀物將蛋黃磷脂酰膽堿(25毫克)和油酸膽甾醇酯(2毫克)溶解(比例是25∶1)在甲醇/氯仿(2∶3)中。在氮氣下4℃蒸發(fā)溶劑。2.制備脂質(zhì)體在12毫升10毫摩爾Tris-HCl緩沖液中水合脂質(zhì)餅狀物，緩沖液pH8.0，含有0.1摩爾預(yù)先在氮氣下鼓泡的氯化鉀。在氮氣流下54℃對混合物超聲處理1小時，以18微米輸出，并離心除去在超聲處理過程中產(chǎn)生的任何鈦顆粒。3.制備人工LDL將步驟2中制備的脂質(zhì)體與ApoE蛋白質(zhì)以1/10(w/w)蛋白質(zhì)/脂質(zhì)的比在37℃溫育30分鐘。然后利用密度是1.064，1.019和1.006克/立方厘米的三層KCl分步梯度在4℃以285000xg進行18小時的密度梯度超離心，純化并濃縮脂質(zhì)體。向脂質(zhì)體溶液中添加KBr，提高其密度至1.21，應(yīng)用于離心管底部。Optiseal管(Beckman)適用于超離心步驟。離心之后，看到的脂質(zhì)體是距離管頂部大約1/4的乳白色窄層。取出該層并在4℃對含有1毫摩爾EDTA的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)滲析過夜。LDL懸浮液穩(wěn)定至少為7，能在氬氣或氮氣下-20℃儲存。實施例3人工LDL顆粒在腦中的攝取將含有大約1毫克脂質(zhì)的PBS中的14C-LDL懸浮液注射入Sprague-Dawley大鼠(150克)的尾靜脈中。以不同的間隔，用含EGTA的注射器通過心臟穿刺獲取血樣。在水中勻化血漿，RBC和組織，在閃爍計數(shù)器中測量14C。附圖2顯示腦(左)和肝(右)中LDL和脂類攝取的結(jié)果。用含有14C-膽甾醇的LDL或脂質(zhì)顆粒對雄性Sprague-Dawley大鼠進行靜脈內(nèi)注射，2小時之后測量腦和肝中的放射性。與除了存在ApoE之外相同組成的脂質(zhì)顆粒相比，腦和肝分別從LDL中攝取19.8和4.7倍的標(biāo)記物。這表明攝取是由通過LDL受體(p(＞T)＝0.00055)介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)動引起的。圖3(左)顯示腦和肝中LDL對脂質(zhì)顆粒攝取的比值。與肝(p(＞T)＝0.0003)相比，腦摻入的LDL百分比大于脂質(zhì)顆粒，表明與肝相比，靶器官具有＞4倍的LDL專一性。圖3(右)顯示LDL和脂質(zhì)顆粒的腦攝取對肝攝取的比值。腦∶肝比是對器官專一性的另一種測量，LDL的腦∶肝比大于脂質(zhì)顆粒(p(＞T)＝0.0003)。換言之，肝攝取的脂質(zhì)顆粒比腦多5.88倍，而肝攝取的LDL顆粒僅比腦(p(＞T)＝0.034)多1.36倍。圖4顯示14C-標(biāo)記LDL顆粒的血漿濃度的時間過程。注射LDL之后，血液14C保持恒定至少2小時，表明標(biāo)記沒有被其他器官從循環(huán)中除去。實施例4伯胺與14C膽甾醇的共軛制備膽甾醇-酞酸酯用氮氣蒸發(fā)膽甾醇(1毫克)并凍干除去乙醇。將固體溶解在最小體積的THF中，轉(zhuǎn)移至玻璃反應(yīng)瓶中。添加固態(tài)酞酸酐(1-2毫克，＞4當(dāng)量)，接著是50Et3N。在100℃加熱混合物5分鐘，添加≈20微升吡啶，使懸浮液變透明。在100℃加熱混合物30分鐘，直到溶液是紅色，在TLC(Silica/UV254板)上用EtOH/甲苯(2∶1)純化。從板上刮下最暗的UV條帶(RP＝0.74)，并用THF洗脫產(chǎn)物(產(chǎn)率98＝100％)。用五氟苯酚活化羧基向酞酸膽甾醇酯中添加THF中的10毫克五氟苯酚(PFP)，接著是5微升DIIC(二異丙基碳化二亞胺)。室溫下在反應(yīng)瓶中使溶液反應(yīng)1小時，用TLC(CHCl3/CH3OH30∶5)純化活化的膽甾醇-酞酸酯-PFP，并用THF洗脫(產(chǎn)率100％)。生產(chǎn)活化酰胺將THF中的活化膽甾醇-酞酸酯-PFP蒸發(fā)至10微升，添加溶解在DMF中的2當(dāng)量伯胺。DMF可導(dǎo)致副反應(yīng)，但是如果存在過量胺則不是問題。添加甲醇或乙醇會大大降低產(chǎn)率。添加3微升DIIC，使溶液在室溫下反應(yīng)過夜，并用TCL(CHCl3/CH3OH30∶5)純化(產(chǎn)率98％)。重要的是，只能使用SilicaGelG-25UV254板(Alltech809021)進行純化。硅膠60板產(chǎn)生損害純化的模糊不清條帶。實施例5合成阿霉素-膽甾醇(1)將THF中的活化膽甾醇-酞酸酯-PFP蒸發(fā)至10微升。添加溶解在DMF中的2當(dāng)量阿霉素。使用過量胺減少與DMF的副反應(yīng)。添加甲醇或乙醇會大大降低產(chǎn)率。添加3微升DIIC，在室溫下使溶液反應(yīng)過夜，用TLC(CHCl3/CH3OH30∶5)純化(產(chǎn)率95％)。此條帶含有阿霉素-DIIC共軛物和產(chǎn)物。用100％CH3OH中的C18-反相位HPLC可分離膽甾醇-阿霉素共軛物(流速＝0.5毫升/分，檢測＝A471)。4.7分鐘時，大約膽甾醇和阿霉素之間的一半距離，洗脫產(chǎn)物?？偖a(chǎn)率95％。阿霉素-膽甾醇共軛物(I)的結(jié)構(gòu)如圖5所示。實施例6含羥基化合物與14C膽甾醇的共軛將N-[對-馬來酰亞胺苯基]異氰酸酯(PMPI)(5毫克)與200微升DMSO中的1當(dāng)量含羥基化合物混合，在室溫下反應(yīng)30分鐘。添加硫代膽甾醇(6.4毫克)。在室溫下溫育混合物120分鐘，用預(yù)先涂布0.1摩爾EDTApH8.0的硅膠GUV254板通過薄層色譜法分離產(chǎn)物，使用EtOH/H2O1∶1作為溶劑。實施例7合成四環(huán)素-膽甾醇(II)凍干四環(huán)素除去任何溶劑，將200微升DMSO中的2.2毫克四環(huán)素與5毫克PMPI混合，并在室溫下反應(yīng)30分鐘。添加硫代膽甾醇(6.4毫克)。在室溫下溫育混合物120分鐘，使用預(yù)先涂布0.1摩爾EDTApH8.0的硅膠GUV254板通過薄層色譜法分離產(chǎn)物，使用EtOH/H2O作為溶劑。四環(huán)素-膽甾醇共軛物(II)的結(jié)構(gòu)如附圖6所示。參考文獻下列各參考文獻整體納入本文作為參考。1.Alyaudtinetal.(2001)Interactionofpoly(butylcyanoacrylate)nanoparticleswiththeblood-brainbarrierinvivoandinvitro.J.DrugTarget9(3)209-21.(體內(nèi)和體外中聚(丁基氰丙烯酸酯)納米粒與血腦屏障的相互作用)2.Bickeletal.(1993)Deliveryofpeptidesandproteinsthroughthebloodbrainbarrier.AdvDrug.Del.Rev.10205-245.(傳遞肽和蛋白質(zhì)穿過血腦屏障)3.Bradleyetal.(1984)Low-densitylipoproteinreceptorbindingdeterminantsswitchfromapoproteinEtoapoproteinBduringconversionofhypertriglyceridemicvery-low-densitylipoproteintolow-densitylipoproteins.JBiolChem259(23)14728-35.(在高甘油三酯血癥極低密度脂蛋白向低密度脂蛋白轉(zhuǎn)變期間，低密度脂蛋白受體結(jié)合決定子從脫輔蛋白質(zhì)E轉(zhuǎn)到脫輔蛋白質(zhì)B。)4.Goodman&Gilman，ThePharmacologicalBasisofTherapeuticsbyJoelG.Hardman(Editor)，LeeE.LimbirdMcGraw-HillProfessional；ISBN0071354697；10thedition(August13，2001).(治療學(xué)和藥理基礎(chǔ))5.Hevonojaetal.(2000)Structureoflowdensitylipoprotein(LDL)particlesbasisforunderstandingmolecularchangesinmodifiedLDL.BiochimBiophysActa1488(3)189-210.(低密度脂蛋白(LDL)顆粒的結(jié)構(gòu)了解修飾的LDL中分子變化的基礎(chǔ))6.Holtzman(2001)RoleofApoE/AbetainteractionsinthepathogenesisofAlzheimer’sdiseaseandcerebralamyloidangiopathy.JmolNeurosci17(2)147-55.(阿爾茨海默病和大腦淀粉樣血管病的發(fā)病機制中ApoE/Abeta相互的作用功用)7.Huwyleretal.(1996)Braindrugdeliveryofsmallmoleculesusingimmunoliposomes.Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA934164-14169.(使用免疫脂質(zhì)體傳遞小分子腦用藥物)8.Kangetal.Braindelieveyofbiotinboundtoaconjugateofneutralavidinandcationizedhumanalbumin.Pharm.Res.11，1257-1264.(與神經(jīng)抗生物素蛋白和陽離子化人白蛋白共軛物結(jié)合的生物素腦部傳遞)9.Kangetal.(2000)Stabilityofthedisulfidebondinanavidin-biotinlinkedchimericpeptideduringinvivotranscytosisthroughbrainendothelialcells.JdrugTarget8(6)425-34).(體內(nèi)胞吞轉(zhuǎn)運穿過腦內(nèi)皮細(xì)胞過程中，抗生物素蛋白-生物素連接的嵌合肽中二硫鍵的穩(wěn)定性)10.Kreuteretal.(2002)Apolipoprotein-mediatedtransportofnanoparticle-bounddrugsacrosstheblood-brainbarrier.JdrugTarget10(4)317-25.(納米粒結(jié)合藥物穿過血腦屏障的載脂蛋白介導(dǎo)的傳輸)11.Mimsetal.(1990)EffectofparticlesizeandtemperatureontheconformationandphysiologicalbehaviorofapolipoproteinEboundtomodellipoproteinparticles.Biochemistry29(28)6639-47.(粒徑和溫度對與模型脂蛋白顆粒結(jié)合的載脂蛋白E構(gòu)型和生理行為的影響)12.Pardrideg(1990)CNSdrugdesignbasedonprinciplesofblood-brainbarriertransport.J.Neurochem701781-2.(基于血腦屏障傳輸原理的CNS藥物設(shè)計)13.Pardridegetal.(1986)Blood-brainbarrierinterfacebetweeninternalmedicineandthebrain.AnnInternMed105(1)82-95.(血腦屏障內(nèi)科醫(yī)學(xué)和腦之間的界面)14.Reinhardetal.(1994)Insulin-likegrowthfactorscrosstheblood-brainbarrier.Endocrinology135(5)1735-1761.(胰島素樣生長因子穿過血腦屏障)15.Rigottietal.(1995)TheclassBscavergerreceptorsSR-BIandCD36arereceptorsforanionicphospholipids.J.Biol.Chem.270，16221-4.(B型清除受體SR-BI和CD36是陰離子磷脂的受體)16.Shibataetal.(2000)ClearanceofAlzheimer’samyloid-ss(1-40)peptidefrombrainbyLDLreceptor-relatedprotein-1attheblood-brainbarrier.J.Clin.Invest.106(12)1489-99.(通過血腦屏障上的LDL受體相關(guān)蛋白質(zhì)-1從腦中清除阿爾茨海默淀粉樣蛋白-ss(1-40)肽)17.Veinbergsetal.(2002)NeurotoxiceffectsofapolipoproteinE4aremediatedviadysregulationofcalciumhomeostasis.JneurosciRes67(3)379-89.(通過鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)障礙介導(dǎo)載脂蛋白E4的神經(jīng)毒性作用)18.Wittetal.(2000)Insulinenhancementofopioidpeptidetransportacrosstheblood-brainbarrierandassessmentofanalgesiceffect.PharmacolExpTher295(3)972-8.(胰島素增強阿片樣肽傳輸穿過血腦屏障和鎮(zhèn)痛效果的評估)19.Wuetal.(2002)Pharmacokineticsandbrainuptakeofbiotinylatedbasicfibroblastgrowthfactorconjugatedtoablood-brainbarrierdrugdeliverysystem.JdrugTarget10(3)329-45.(與血腦屏障藥物傳遞體系共軛的生物素化的堿性成纖維細(xì)胞生長因子的藥物動力學(xué)和腦攝取)20.Yangetal.(1995)Softdrugs.XX.Design，synthesis，andevaluationofultrashortactingbeta-blockers.PharmRes12(3)329-36.(軟藥.XX.超短作用的β-阻斷劑的設(shè)計，合成和評價)21.Yordanovetal.(2002)Acyl-protectedhydroxylaminesasspinlabelgeneratorsforEPRbrainimaging.J.Med.Chem.45(11)22838.(?；Ｗo的羥胺作為EPR腦成像的自旋標(biāo)記發(fā)生劑)22.Dehoucketal.(1977)AnewfunctionfortheLDLreceptor；transcytosisofLDLacrosstheblood-brainbarrier.J.Cell.Biol.138(4)877-89.(LDL受體的新功能穿過血腦屏障的LDL胞吞噬轉(zhuǎn)運)23.Versluisetal.(1998)SynthesisofalipophilicdaunorubicinderivativeanditsincorporationintolipidiccarriersdevelopedforLDLreceptor-mediatedtumortherapy.Pharm.Res.15(4)531-537.(為LDL受體-介導(dǎo)的腫瘤治療開發(fā)的親脂性柔紅霉素衍生物合成及其摻入脂的載體)24.Versluisetal.(1998)Low-densitylipoproteinreceptor-mediateddeliveryofalipophilicdaunorubicinderivativetoB16tumorsinmiceusingapolipoproteinE-enrichedliposomes.B.r.J.Cancer78(12)1607-14.(使用載脂蛋白E富集的脂質(zhì)體將親脂性柔紅霉素衍生物通過低密度脂蛋白受體介導(dǎo)傳遞至小鼠的B16腫瘤處)25.Versluisetal.(1999)StableincorporationofalipophilicdaunorubicinprodrugintoapolipoproteinE-exposingliposomesinducesuptakeofprodrugvialow-densitylipoproteinreceptorinvivo.J.Pharmacol.Exp.Ther.289(1)1-7.(親脂性柔紅霉素前藥穩(wěn)地?fù)饺胼d脂蛋白E-暴露的脂質(zhì)體中，通過體內(nèi)低密度脂蛋白受體引發(fā)前藥的攝取)26.Annunziatoetal.(1993)p-Maleimidophenylisocyanateanovelheterobifunctionallikerforhydroxyltothiolcoupling.BioconjugateChem.4212-218.(對-馬來酰亞胺苯基異氰酸酯用于羥基與硫醇偶聯(lián)的新穎異雙官能結(jié)合劑)27.Demeuleetal.(2002)Hightranscytosisofmalanotransferrin(P97)acrosstheblood-brainbarrier.J.Neurochem83(4)924-33.(穿過血腦屏障的黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白(P97)的高胞吞轉(zhuǎn)運)。權(quán)利要求1.一種人工LDL顆粒，包括外部磷脂單層和固態(tài)脂質(zhì)核心，其特征在于，所述外部磷脂單層包含至少一種載脂蛋白，所述固態(tài)脂質(zhì)核心包含至少一種治療劑。2.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于至少一種載脂蛋白是ApoE。3.如權(quán)利要求2所述的人工LDL顆粒，其特征在于至少一種載脂蛋白是ApoE3。4.如權(quán)利要求3所述的人工LDL顆粒，其特征在于外部磷脂單層還包含一種或多種氧甾醇和/或選自ApoB和ApoE4的附加載脂蛋白。5.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于至少一種治療劑選自氨基酸，肽，蛋白質(zhì)，碳水化合物和脂類。6.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于至少一種治療劑是膽甾醇和選自氨基酸，肽，蛋白質(zhì)，核酸，碳水化合物和脂類的一種試劑之間形成的共軛物。7.如權(quán)利要求5所述的人工LDL顆粒，其特征在于治療劑選自神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子，酶，抗體，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)質(zhì)，抗生素，抗病毒劑，抗真菌劑和化學(xué)治療劑。8.如權(quán)利要求6所述的人工LDL顆粒，其特征在于治療劑選自神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子，酶，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)質(zhì)，抗生素，抗病毒劑，抗真菌劑和化學(xué)治療劑。9.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于外部磷脂單層包含磷脂酰膽堿和至少一種載脂蛋白。10.如權(quán)利要求9所述的人工LDL顆粒，其特征在于至少一種載脂蛋白是ApoE。11.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于顆粒具有約15到50納米的直徑。12.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于顆粒具有約20到30納米的直徑。13.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于顆粒具有約1.00到1.07克/毫升的密度。14.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于顆粒具有約1.02到1.06克/毫升的密度。15.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于顆粒具有至少2小時的血清穩(wěn)定性。16.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于顆粒通過胞吞轉(zhuǎn)運傳輸穿過血腦屏障(BBB)。17.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于腦對顆粒的攝取專一性至少比肝大3倍。18.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于至少一種治療劑是膽甾醇和阿霉素之間形成的共軛物。19.如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒，其特征在于至少一種治療劑是膽甾醇和四環(huán)素之間形成的共軛物。20.如權(quán)利要求18所述的人工LDL顆粒，其特征在于共軛物的膽甾醇和阿霉素是通過酯鍵連接的。21.如權(quán)利要求19所述的人工LDL顆粒，其特征在于共軛物的膽甾醇和四環(huán)素是通過酯鍵連接的。22.用于傳遞試劑穿過血腦屏障的人工LDL顆粒，包括外部磷脂酰膽堿單層，含有脂肪酰-膽甾醇酯的固態(tài)脂質(zhì)核心，以及在外部單層中的ApoE。23.如權(quán)利要求22所述的人工LDL顆粒，其特征在于固態(tài)脂質(zhì)核心還包含膽甾醇。24.如權(quán)利要求22所述的人工LDL顆粒，其特征在于外部單層中的ApoE是ApoE3。25.用于傳遞試劑穿過血腦屏障的組合物，包含如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒和藥學(xué)上可接受載體。26.用于傳遞試劑穿過血腦屏障的組合物，包含如權(quán)利要求4所述的人工LDL顆粒和藥學(xué)上可接受載體。27.用于傳遞試劑穿過血腦屏障的組合物，包含如權(quán)利要求5所述的人工LDL顆粒和藥學(xué)上可接受載體。28.一種共軛物，包含與治療劑連接的膽甾醇，治療劑選自氨基酸，肽，蛋白質(zhì)，核酸，碳水化合物和脂類。29.如權(quán)利要求28所述的共軛物，其特征在于治療劑選自神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子，酶，抗體，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)質(zhì)，抗生素，抗病毒劑，抗真菌劑和化學(xué)治療劑。30.如權(quán)利要求29所述的共軛物，其特征在于治療劑是阿霉素。31.如權(quán)利要求30所述的共軛物，其特征在于阿霉素和膽甾醇通過酯鍵合連接。32.如權(quán)利要求29所述的共軛物，其特征在于治療劑是四環(huán)素。33.如權(quán)利要求32所述的共軛物，其特征在于四環(huán)素和膽甾醇通過酯鍵合連接。34.生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述的人工LDL顆粒的方法，包括以下步驟1)將含有共軛或非共軛治療劑的磷脂懸浮在緩沖溶液中；2)超聲處理溶液，形成外部磷脂單層和固態(tài)脂質(zhì)核心；和3)添加含有至少一種載脂蛋白的溶液，其特征在于載脂蛋白摻入外部磷脂單層中。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于生產(chǎn)的人工LDL顆粒具有10到50納米的直徑。36.傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障的方法，所述方法包括給予需要的哺乳動物有效量的如權(quán)利要求25所述的組合物。37.傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障的方法，所述方法包括給予需要的哺乳動物有效量的如權(quán)利要求26所述的組合物。38.傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障的方法，所述方法包括給予需要的哺乳動物有效量的如權(quán)利要求27所述的組合物。39.用于傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障的試劑盒，所述試劑盒包括含有如權(quán)利要求25所述的組合物的容器和使用說明。40.用于傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障的試劑盒，所述試劑盒包括含有如權(quán)利要求26所述的組合物的容器和使用說明。41.用于傳遞物質(zhì)穿過血腦屏障的試劑盒，所述試劑盒包括含有如權(quán)利要求27所述的組合物的容器和使用說明書。全文摘要本發(fā)明涉及用于靶向傳遞治療劑穿過血腦屏障(BBB)的高效人工低密度脂蛋白(LDL)載體體系。本發(fā)明尤其涉及含有三種脂質(zhì)成分的人工LDL顆粒磷脂酰膽堿，脂酰膽甾醇酯和至少一種載脂蛋白。本發(fā)明進一步涉及能使藥物靶向并穿過BBB用于預(yù)防和治療腦疾病的包含人工LDL顆粒的組合物、方法和試劑盒。文檔編號A61K47/28GK1717223SQ200380104563公開日2006年1月4日申請日期2003年12月2日優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日發(fā)明者T·J·尼爾森,A·夸特特朗,D·L·阿爾康申請人:布朗歇特洛克菲勒神經(jīng)科學(xué)研究所