專利名稱：以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的材料、其相關(guān)的組合物和用途的制作方法
背景技術(shù)：
近年來，被稱為“糖聚合物(glycopolymer)”的具有凸出的糖部分的聚合物(Bioconj.Chem.，3256(1992))越來越引人注意，這在很大程度上是由于其是生物學(xué)上重要的碳水化合物分子的多價體形式的支架。這些糖聚合物已經(jīng)被用作有效的病毒宿主細胞附著和白細胞-內(nèi)皮細胞粘附的抑制劑(FEBS，272209(1990)；Can.J.Microbiol.，37233(1991)；J.Am.Chem.Soc.，1193161(1997))。糖聚合物還被開發(fā)用作藥物和基因靶向遞送的載體(J.Hepatology，21806(1994))以及用作細胞粘附的人工底物(J.Cell Biol.，115485(1991))。對糖聚合物作為生物相容性植入材料的適應(yīng)性研究較少，僅限于例如Microbiol.Chem.Phys.，1953597(1994)中描述的很少的幾個實例。
對于用作生物相容性植入材料的聚合物而言，其性質(zhì)、特別是表面組成尤為重要。所做的努力包括向整個系統(tǒng)(bulk system)中和其表面上引入生物相容性組分。例如J.Colloid Interface Sci.，14984(1992)中所述的研究已經(jīng)表明在具有共價結(jié)合的中性多糖的整體或表面中具有凸出的葡萄糖單位的共聚物可減少血小板粘附和蛋白質(zhì)吸附。
因此，易于制備的生物相容性聚合物材料將可用于藥物遞送和其它生物醫(yī)學(xué)用途。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種通過將帶有包合主體(如環(huán)糊精)的聚合物與帶有至少兩個可以作為包合客體與該包合主體形成包合絡(luò)合物的官能團的連接分子進行交聯(lián)而形成的材料。對于其中環(huán)糊精是包合主體的聚合物而言，包合客體的實例包括萘酚、金剛烷、膽固醇和它們的衍生物。在某些實施方案中，聚合物帶有包合客體，使用帶有包合主體如環(huán)糊精的連接分子與該聚合物進行交聯(lián)?？梢杂蒙鲜霾牧蟻磉f送治療劑，如蛋白質(zhì)、核酸和藥物。
附圖簡要說明

圖1用圖描述了本發(fā)明的交聯(lián)聚合物基質(zhì)。
圖2說明了本發(fā)明的包含治療部分的基質(zhì)。
圖3描述了作為聚合時間的函數(shù)的CD-PEG3400的分子量。
圖4表示轉(zhuǎn)染實驗的結(jié)果。
圖5表示細胞通過本文所述的基質(zhì)的遷移。
圖6表示沒有交聯(lián)的CD-PEG3400聚合物的動態(tài)頻率掃描。濃度為100mg/ml，在PBS中，溫度為37℃，且應(yīng)變?yōu)?.5％。
圖7表示沒有交聯(lián)劑的CD-PEG3400聚合物的動態(tài)頻率掃描。濃度為100mg/ml，在PBS中，溫度為20℃，且應(yīng)變?yōu)?.5％。
圖8提供了含有36.5mg/ml二-金剛烷-PEG交聯(lián)劑的CD-PEG3400聚合物(100mg/ml)的動態(tài)頻率掃描。溫度為37℃，且應(yīng)變?yōu)?.5％。
圖9是含有36.5mg/ml二-金剛烷-PEG交聯(lián)劑的CD-PEG3400聚合物(100mg/ml)的動態(tài)頻率掃描。溫度為20℃，且應(yīng)變?yōu)?.5％。
圖10表示2.4mg/ml的牛膠原基質(zhì)的動態(tài)頻率掃描。溫度為37℃，且應(yīng)變?yōu)?.5％。
圖11說明了用本文所述的基質(zhì)進行的體外分析的結(jié)果。
圖12描繪了用主題組合物處理傷口的結(jié)果。(12A)用基質(zhì)A(左側(cè)傷口)和基質(zhì)B(右側(cè)傷口)處理的ICR小鼠。在手術(shù)后4天處死時動物的表現(xiàn)。紫色墨水是用手術(shù)筆做的標記，不是基質(zhì)中所用的染料(顏色為深藍色/黑色)。在實際的傷口部位幾乎沒有染料殘留；但是，殘留的染料可能是由于在使用傷口輔料后發(fā)生的從基質(zhì)向周圍未受傷組織的滲出和擴散而產(chǎn)生的。(12B)用基質(zhì)A(左側(cè)傷口)和基質(zhì)B(右側(cè)傷口)處理的ICR小鼠。在手術(shù)后4天處死時動物的表現(xiàn)。左側(cè)和右側(cè)的傷口分別顯示基質(zhì)A和基質(zhì)B在注射后沒有擴散到周圍的組織。
圖13表示用主題組合物處理傷口的結(jié)果。(13A)用基質(zhì)A(左側(cè)傷口)和基質(zhì)B(右側(cè)傷口)處理的ICR小鼠。在手術(shù)后4天處死時動物的表現(xiàn)。在左側(cè)和右側(cè)傷口中均可以看到自然的傷口縮小?？梢钥吹缴倭康膩碜宰畛踝⑸涞娜玖蠚埩?；但是，在周圍未受傷的組織中不存在染料。(13B)用基質(zhì)A(左側(cè)傷口)和基質(zhì)B(右側(cè)傷口)處理的ICR小鼠。在手術(shù)后4天處死時動物的表現(xiàn)。左側(cè)和右側(cè)傷口分別顯示基質(zhì)A和基質(zhì)B在注射后沒有擴散到周圍的組織。
圖14描述了處理的海綿中的PDGF-B表達水平。對來自每個處理組的各個海綿樣品進行QRT-PCR。數(shù)據(jù)表示為所分析的6個海綿的均值±標準差。
圖15說明了處理組中的GAPDH RNA水平。
圖16表示處理的海綿中的病毒PDGF-B DNA。對來自每個處理組的海綿樣品進行QPCR分析。PCR引物靶向于人PDGF-B序列的特異表達，不與大鼠PDGF-B DNA交叉反應(yīng)。
圖17描繪了海綿中的GAPDH DNA含量。
圖18描述了海綿處理組中的病毒六鄰體DNA。
圖19給出了PVA海綿的形態(tài)學(xué)分析。
發(fā)明詳述I.概述環(huán)糊精具有籃樣形狀的環(huán)結(jié)構(gòu)。這種形狀使得環(huán)糊精可以將許多種類的分子包合到其內(nèi)腔中。參見例如Szejtli，Cyclodextrins and Their InclusionComplexs；Akademiai Klado，Budapest，1982；和Bender等人，CyclodextrinChemistry，Springer-Verlag，柏林，1978。環(huán)糊精能與一系列有機分子形成包合絡(luò)合物，所述的有機分子包括例如藥物、殺蟲劑、除草劑和軍事物質(zhì)。參見Tenjarla等人，J.Pharm.Sci.，87425-429(1998)；Zughul等人，Pharm.Dev.Technol.，343-53(1998)；和Albers等人，Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSyst.，12311-337(1995)。
以前已經(jīng)證明以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的線性聚合物(CDP)在體外(在許多不同的細胞系中)和體內(nèi)均具有低毒性(Gonzalez等人，1999BioconjugateChem101068-1074；和Hwang等人，2001Bioconjugate Chem12(2)280-290)。本發(fā)明至少部分涉及以帶有或包含環(huán)糊精部分的聚合物為基礎(chǔ)的生物相容性材料，如圖1所示，其是通過將該線性鏈與帶有兩個或多個可與環(huán)糊精形成包合絡(luò)合物的部分的連接分子進行交聯(lián)而形成的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到這一概念可自然延伸至將帶有或包含環(huán)糊精以外的包合主體的聚合物與帶有可與這些包合主體形成包合絡(luò)合物的包合客體的連接分子相連接，或者，將帶有包合客體的聚合物與帶有或包含可與這些包合客體形成包合絡(luò)合物的包合主體的連接分子相連接。環(huán)糊精以外的包合主體和相關(guān)的環(huán)狀直鏈淀粉(cylcoamylose)的實例包括全氫化苯并[9，10]菲(其與聚乙烯形成包合絡(luò)合物)、脲/硫脲(其與脂肪酸和美國專利US4,776,984、5,106,542和4,170,601中所述的相關(guān)分子形成包合絡(luò)合物)、環(huán)芳類物質(zhì)(如美國專利US 4,116,955中所述的那些)以及美國專利US4,841,081、4,367,072和4,898,654中所述的那些，在此將所有這些文獻全文引入作為參考。
在本發(fā)明的某些實施方案中，如下文的實施例19中所述的那樣，一種聚合物既帶有包合主體又帶有包合客體，因此其可以通過在該聚合物鏈的主體和客體之間和/或在毗鄰聚合物鏈的主體和客體之間形成包合絡(luò)合物來與自身進行交聯(lián)。進行交聯(lián)的條件將影響這兩類包合絡(luò)合物之間的平衡。例如，在高稀釋度下進行絡(luò)合將有利于形成分子內(nèi)絡(luò)合物，而在高濃度下進行絡(luò)合將有助于形成分子間絡(luò)合物，在一些情況下包括索烴-和輪烷-型結(jié)構(gòu)。在某些該類實施方案中，高度的分子間相互作用增加了所述材料的剛性、熔點和強度。
對于本發(fā)明的應(yīng)用目的而言，聚合物通過在該聚合物鏈內(nèi)含有包合主體而‘結(jié)合有’包合主體如環(huán)糊精部分，例如從該聚合物中除去包合主體將需要斷裂聚合物鏈。該類聚合物的實例有以上所提及的以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的線性聚合物?！畮в小h(huán)糊精部分的聚合物具有連接有包合主體的聚合物鏈，例如包合主體被連接在不同的聚合物鏈上。本文中所述的聚乙烯亞胺-CD聚合物是該類聚合物的實例。‘包含’包合主體的聚合物是那些‘帶有’或‘結(jié)合有’或既‘帶有’又‘結(jié)合有’包合主體的聚合物，或者具有共價結(jié)合的、作為聚合物鏈的一部分的包合主體的聚合物。在本申請中可以使用任何包含包合主體的聚合物。在某些實施方案中，結(jié)合有包合主體的聚合物是線性(即無分支的)聚合物。在某些實施方案中，包合主體、例如結(jié)合在聚合物中的或者聚合物上所帶有的包合主體在整個聚合物中或沿著組合物有規(guī)律地間隔分布。
可以通過對可形成不同強度的包合絡(luò)合物的部分進行選擇來改變所得材料的物理性質(zhì)；絡(luò)合物的強度越大，所得材料的耐久性和剛性越強。類似地，正如增加連接分子與聚合物質(zhì)量比例所實現(xiàn)的那樣，使用帶有兩個以上該類部分的連接分子也可以通過增加交聯(lián)度來增加該材料的強度和剛性。還可以通過改變連接分子本身的柔韌性或通過改變環(huán)糊精聚合物本身中的連接物的柔韌性來改變該材料的物理性質(zhì)。
此外，可以通過在基質(zhì)中使用在生理條件下不穩(wěn)定的鍵來改變基質(zhì)的體內(nèi)性質(zhì)。例如，聚合物鏈、交聯(lián)分子或聚合物鏈和交聯(lián)分子可以包含在生理條件下不穩(wěn)定的鍵，如酯鍵和肽鍵。在置于生理環(huán)境中后，這些鍵將逐漸開始裂解，從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)完整性的逐漸降解和損失?？梢酝ㄟ^改變聚合物鏈中該類鍵的出現(xiàn)頻率、通過以不同比例組合不穩(wěn)定的和有抵抗力的交聯(lián)分子或者通過選擇具有不同強度的不同的不穩(wěn)定鍵來得到各種不同的性質(zhì)。例如，肽鍵的抗裂解性通常比酯鍵強，而酯鍵又比硫酯鍵穩(wěn)定。
正如普通生物相容性聚合物領(lǐng)域中眾所周知的那樣，可以通過形成包合絡(luò)合物或通過不形成包合絡(luò)合物的簡單混合或包封來用聚合物對化合物和物質(zhì)如治療劑、病毒、輔劑等進行配制。
如圖2所示，可以通過將包合絡(luò)合物客體軛合到所關(guān)注的實體上并將該軛合物包含在交聯(lián)材料中而將可增加該材料治療效用的化合物如信號肽、有助于細胞遷移的其它部分或輔劑結(jié)合入該材料中。所述軛合物可以在交聯(lián)過程之前、期間或之后被包含到其中。還可以以這種方式將治療性化合物包含在其中，優(yōu)選地其中藥物和包合客體/主體之間的連接在生理條件下不穩(wěn)定，如酯鍵。參見美國專利申請公布No.20030008818和20030017972。
II.定義為了方便，將本說明書、實施例以及所附權(quán)利要求中所用的某些術(shù)語集中在此。
本文中所用的術(shù)語‘輔劑’是本身幾乎沒有或沒有治療價值、但是可增加治療劑功效的化合物。輔劑的實例包括輻射敏化劑、轉(zhuǎn)染促進劑(transfection-enhancing agent)(如氯喹及其類似物)、趨化劑和化學(xué)吸引劑、調(diào)節(jié)細胞粘附和/或細胞移動性的肽、細胞通透劑、多藥耐藥性和/或外排泵(efflux pump)的抑制劑等。
當涉及聚合物時，所用的術(shù)語“生物相容性聚合物”和“生物相容性”是本領(lǐng)域所公知的。例如，生物相容性聚合物包括其本身對主體(例如動物或人)無毒并且在主體體內(nèi)以不產(chǎn)生毒性濃度的單體或低聚體亞基或其它副產(chǎn)物的速率降解(如果該聚合物降解的話)的聚合物。在本發(fā)明的某些實施方案中，生物降解通常涉及聚合物在生物體內(nèi)的降解，例如降解成已知實際上無毒的其單體亞基。但是，由該類降解產(chǎn)生的中間的低聚體產(chǎn)物可能具有不同的毒理學(xué)性質(zhì)，或者降解可能涉及產(chǎn)生聚合物單體亞基以外的分子的氧化或其它生物化學(xué)反應(yīng)。因此，在某些實施方案中，可以在一種或多種毒性分析后確定用于體內(nèi)使用如植入或注射到患者體內(nèi)的生物可降解聚合物的毒性。任何主題組合物并不必須均具有100％的純度才被認為是生物相容性的。因此，主題組合物可以包含99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％或甚至更少的生物相容性聚合物，例如包含聚合物和本文所述的其它物質(zhì)和賦形劑，且其仍然是生物相容性的。
為了確定一種聚合物或其它物質(zhì)是否是生物相容性的，可能必須進行毒性分析。該類分析是本領(lǐng)域中眾所周知的。該類分析的一個實例可以用活的癌細胞如GT3TKB腫瘤細胞以以下方法進行使樣品在1M NaOH中于37℃下進行降解直至觀察到完全降解。然后，將該溶液用1M HCl中和。將約200μL各種濃度的降解的樣品產(chǎn)物置于96-孔組織培養(yǎng)板中并用人胃癌細胞(CT3TKB)以104/孔的密度進行接種。將該降解的樣品產(chǎn)物與GT3TKB細胞一起溫育48小時。用相對生長百分數(shù)對組織培養(yǎng)孔中降解樣品的濃度作圖來用圖表示分析的結(jié)果。此外，還可以用公知的體內(nèi)試驗來評價本發(fā)明的聚合物和制劑，如皮下植入到大鼠體內(nèi)以證實其不會在皮下植入部位造成顯著水平的刺激或炎癥。
術(shù)語“生物可降解的”是本領(lǐng)域中所公知的，并且包括將在使用期間降解的聚合物、組合物和制劑，如本文中所述的那些。典型地，生物可降解的聚合物與不能生物降解的聚合物不同，前者可以在使用期間降解。在某些實施方案中，該類使用涉及體內(nèi)使用，如體內(nèi)治療，在其它某些實施方案中，該類使用涉及體外使用。一般而言，可歸于生物降解性的降解涉及生物可降解的聚合物降解成其組成亞基或者該聚合物被消化成較小的非聚合物亞基，例如被生物化學(xué)過程消化成該類亞基。在某些實施方案中，通?？设b別兩種不同類型的生物降解。例如，一種類型的生物降解可能涉及聚合物主鏈中的鍵(共價鍵或其它鍵)的裂解。在該類生物降解中，典型地，產(chǎn)生單體和低聚體，甚至更典型地，該類生物降解通過斷裂連接聚合物的一個或多個亞基的鍵而發(fā)生。相反，另一種類型的生物降解可能涉及側(cè)鏈內(nèi)的鍵或?qū)?cè)鏈連接到聚合物主鏈上的鍵(共價鍵或其它鍵)的裂解。例如，可以通過生物降解將作為側(cè)鏈連接到聚合物主鏈上的治療劑或其它化學(xué)部分釋放出來。在某些實施方案中，在聚合物的使用過程中，可能發(fā)生一種類型或另一種類型或兩種一般類型的生物降解。
本文中所用的術(shù)語“生物降解”包括這兩種一般類型的生物降解。生物可降解的聚合物的降解速率常常部分取決于包括產(chǎn)生任何降解的鍵的化學(xué)特性、該類聚合物的分子量、結(jié)晶度、生物穩(wěn)定性和交聯(lián)度、植入物的物理特性(例如形狀和大小)以及施用的方式和位置在內(nèi)的許多因素。例如，分子量越高、結(jié)晶度越高和/或生物穩(wěn)定性越高，任何生物可降解的聚合物的生物降解通常越慢。術(shù)語“生物可降解的”旨在包括也被稱為“生物可蝕解的”材料和過程。
在某些其中生物可降解的聚合物還含有與其聯(lián)用的治療劑或其它物質(zhì)的實施方案中，可以用該類物質(zhì)的釋放速率來描述該類聚合物的生物降解速率。在該類情況下，生物降解速率可能不僅取決于聚合物的化學(xué)特性和物理特性，而且還取決于其中所結(jié)合的一種或多種物質(zhì)的特性。主題組合物的降解不僅包括分子內(nèi)鍵的裂解，例如通過氧化和/或水解所發(fā)生的裂解，而且還包括分子間鍵的瓦解，如通過與外來的包合主體競爭性形成絡(luò)合物而發(fā)生的主體/客體絡(luò)合物的解離。
在某些實施方案中，本發(fā)明的聚合物制劑在一段時間內(nèi)進行生物降解，該段時間在所需應(yīng)用中是可以接受的。在某些實施方案中，如在體內(nèi)治療中，當與pH為6至8且溫度為25至37℃的生理溶液接觸時，該類降解在通常小于約5年、1年、6個月、3個月、1個月、15天、5天、3天或甚至1天的一段時間內(nèi)發(fā)生。在其它實施方案中，聚合物在約1小時至數(shù)周的一段時間內(nèi)降解，這取決于所需的應(yīng)用。
生物可水解的鍵(例如酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯或二酰亞胺)是指在生理條件下可以裂解的鍵(例如酯裂解形成羥基和羧酸)。生理條件包括消化道(例如胃、腸等)的酸性和堿性環(huán)境、腫瘤的酸性環(huán)境、酶裂解、代謝和其它生物學(xué)過程，并且優(yōu)選是指脊椎動物如哺乳動物中的生理條件。
術(shù)語“健康護理提供者”是指為人、公眾等提供健康護理服務(wù)的個人或組織。“健康護理提供者”的實例包括醫(yī)生、醫(yī)院、持續(xù)護理退休社區(qū)、專業(yè)護理機構(gòu)、亞急性護理機構(gòu)、診所、多?？圃\所、獨立式門診中心(freestanding ambulatory center)、家庭保健服務(wù)機構(gòu)和HMO′s。
本文中所用的“使用說明書”是指屬于藥盒的描述相關(guān)物質(zhì)或方法的文件。這些材料可以包括以下內(nèi)容的任何組合背景信息、組分列表及其有效性信息(購買信息等)、使用該藥盒的簡單或詳細方案、問題解答(trouble-shooting)、參考資料、技術(shù)支持和任何其它相關(guān)文件。使用說明書可以與藥盒一起提供或者作為獨立的組成部分被提供，其為紙件形式或者為可以在計算機可讀存儲設(shè)備上被提供的或可以從互聯(lián)網(wǎng)站點下載的電子形式或者為音像形式。使用說明書可以包括一種或多種文件，并且意欲包括未來的最新資料。
本文中所用的“藥盒”是指構(gòu)成藥盒的至少兩種組分的集合。各組分一起構(gòu)成了用于給定目的的功能單位。在物理形式上，各組成組分可以被包裝在一起或者被獨立包裝。例如，包括如何使用藥盒的使用說明書的藥盒在物理形式上可以包括或不包括其它各組成組分的使用說明書。或者，使用說明書可以作為獨立的組成組分被提供，其可以為紙件形式或者為可以在計算機可讀存儲設(shè)備上被提供的或可以從互聯(lián)網(wǎng)站點下載的電子形式或者為音像形式。
本文中所用的術(shù)語‘RNAi構(gòu)建體’是一種總稱，包括小干擾RNA(siRNA)、發(fā)夾RNA以及可在體內(nèi)裂解形成siRNA的其它RNA種類。本文中的RNAi構(gòu)建體還包括能引起可在細胞中形成dsRNA或發(fā)夾RNA的轉(zhuǎn)錄物和/或能在體內(nèi)產(chǎn)生siRNA的轉(zhuǎn)錄物的表達載體(也稱為RNAi表達載體)。
在涉及主題治療方法時，主題化合物的‘有效量’是指當作為所需劑量方案的一部分被應(yīng)用時，根據(jù)臨床上可接受的標準對于治療或預(yù)防特定病癥可提供益處的制劑中的治療劑的量。
用主題方法治療的‘患者’或‘個體’是動物，優(yōu)選哺乳動物，包括人。
術(shù)語“預(yù)防性或治療性”治療是本領(lǐng)域所公知的，包括對主體施用一種或多種主題組合物。如果在臨床表現(xiàn)出不希望的病癥(例如主體動物的疾病或其它不希望的狀態(tài))之前進行施用，則該治療是預(yù)防性的，即其保護主體防止其發(fā)生不希望的病癥，而如果在表現(xiàn)出不希望的病癥之后施用，則該治療是治療性的，(即用于減輕、改善或穩(wěn)定已經(jīng)存在的不希望的病癥或其副作用)。
術(shù)語“預(yù)防”是本領(lǐng)域所公知的，當與病癥如局部復(fù)發(fā)(例如疼痛)、疾病如癌癥、綜合征如心力衰竭或任何其它醫(yī)學(xué)病癥聯(lián)用時，其在本領(lǐng)域中可以被十分良好地理解，其包括施用組合物，與未接受該組合物的個體相比較，所述組合物可以降低該個體的醫(yī)學(xué)病癥癥狀的頻率或延緩其發(fā)作。因此，癌癥的預(yù)防包括例如與未經(jīng)治療的對照群體相比降低接受預(yù)防性治療的患者群體中可察覺的癌生長數(shù)量和/或與未經(jīng)治療的對照群體相比延緩治療群體中可察覺的癌生長的出現(xiàn)，例如以統(tǒng)計學(xué)和/或臨床上顯著的量降低或延遲。感染的預(yù)防包括例如與未經(jīng)治療的對照群體相比降低治療群體中診斷出感染的數(shù)量和/或與未經(jīng)治療的對照群體相比延緩感染癥狀的發(fā)作。疼痛的預(yù)防包括例如與未經(jīng)治療的對照群體相比降低治療群體中個體所經(jīng)歷的疼痛感覺的頻率或者延緩個體所經(jīng)歷的疼痛感覺。
本文所用的術(shù)語“治療劑”包括當施用于生物體(人或非人動物)時可通過局部和/或全身作用產(chǎn)生所需的藥理學(xué)、致免疫性和/或生理學(xué)作用的任何合成的或天然存在的生物學(xué)活性化合物或物質(zhì)組合物。因此，該術(shù)語包括那些通常被稱為藥物、疫苗和生物藥(包括分子如蛋白質(zhì)、肽、激素、核酸、基因構(gòu)建體等)的化合物或化學(xué)物質(zhì)。更具體而言，術(shù)語“治療劑”包括在所有主要治療領(lǐng)域中使用的化合物或組合物，其包括但不限于輔劑；抗感染劑如抗菌劑和抗病毒劑；鎮(zhèn)痛劑和鎮(zhèn)痛劑組合、食欲抑制劑、抗炎劑、抗癲癇劑、局部和全身麻醉劑、催眠劑、鎮(zhèn)靜劑、抗精神病藥、精神安定劑、抗抑郁劑、抗焦慮劑、拮抗劑、神經(jīng)元阻滯劑、抗膽堿藥和擬膽堿藥、抗毒蕈堿藥和擬毒蕈堿藥、抗腎上腺素能藥、抗心律失常藥、抗高血壓藥、激素和營養(yǎng)物、抗關(guān)節(jié)炎藥、抗哮喘藥、抗驚厥藥、抗組胺藥、止惡心藥、抗腫瘤藥、止癢劑、退熱劑；解痙藥、心血管制劑(包括鈣通道阻滯劑、β-阻滯劑、β-激動劑和抗心律失常藥)、抗高血壓藥、利尿劑、血管舒張藥；中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑；咳嗽和感冒制劑；減充血藥；診斷劑；激素；骨生長刺激劑和骨吸收抑制劑；免疫抑制劑；肌肉松弛藥；精神興奮劑；鎮(zhèn)靜劑；安定藥；蛋白質(zhì)、肽及其片段(無論是天然存在的、化學(xué)合成的還是重組制備的)；以及核酸分子(兩個或多個核苷酸的聚合物形式，所述的核苷酸為核糖核苷酸(RNA)或脫氧核糖核苷酸(DNA)，包括雙鏈和單鏈分子、基因構(gòu)建體、表達載體、反義分子等)、小分子(例如阿霉素)和其它生物活性大分子如例如蛋白質(zhì)和酶。這些物質(zhì)可以是醫(yī)學(xué)(包括獸醫(yī)學(xué))應(yīng)用和農(nóng)業(yè)如植物以及其它領(lǐng)域中所用的生物學(xué)活性劑。術(shù)語治療劑還包括但不限于藥物；維生素；礦物補充劑；用于治療、預(yù)防、診斷、治愈或減輕疾病或病情的物質(zhì)；或影響機體結(jié)構(gòu)或功能的物質(zhì)；或在被置于預(yù)定的生理環(huán)境中后變得有生物學(xué)活性或者生物學(xué)活性更高的前體藥物。
術(shù)語“治療指數(shù)”是指被定義為LD50/ED50的藥物治療指數(shù)。
‘?；侵高m于將氮原子酰化從而形成酰胺或氨基甲酸酯、將碳原子?；瘡亩纬赏?、將硫原子?；瘡亩纬闪虼狨セ?qū)⒀踉吁；瘡亩纬甚セ幕鶊F，例如連接在-C(＝O)-部分上的烴。優(yōu)選的?；ū郊柞；?、乙?；?、叔丁基乙?；?、新戊?；腿阴；?。更優(yōu)選的?；ㄒ阴；捅郊柞；?。最優(yōu)選的酰基是乙?；?。
術(shù)語‘酰基氨基’是本領(lǐng)域中所公知的，優(yōu)選是指可以用以下通式表示的部分 其中R9和R′11各自獨立地表示氫或烴取代基，如烷基、雜烷基、芳基、雜芳基、碳環(huán)脂族和雜環(huán)脂族基團。
術(shù)語‘胺’和‘氨基’是本領(lǐng)域中所公知的，是指未取代的和取代的胺以及銨鹽，例如可以用以下通式表示的基團 或 其中R9、R10和R′10各自獨立地表示氫或烴取代基，或者R9和R10與它們所連接的N原子一起形成在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有4至8個原子的雜環(huán)。在優(yōu)選的實施方案中，R9、R10和R′10中沒有一個是?；鏡9、R10和R′10選自氫、烷基、雜烷基、芳基、雜芳基、碳環(huán)脂族和雜環(huán)脂族基團。本文中所用的術(shù)語‘烷基胺’是指具有至少一個與其連接的取代的或未取代的烷基的以上所定義的胺基團。荷正電荷(例如R′10存在)的氨基被稱為‘銨’基。在銨基以外的氨基中，胺優(yōu)選是堿性的，例如其共軛酸具有高于7的pKa。
術(shù)語‘酰氨基’和‘酰胺’是本領(lǐng)域中所公知的，為氨基-取代的羰基，如可以用以下通式表示的部分 其中R9和R10如以上所定義。在某些實施方案中，酰胺將包括二酰亞胺。
‘烷基’是指具有1至18個碳原子、優(yōu)選1至12個、更優(yōu)選1至6個、還更優(yōu)選1至4個碳原子的飽和或不飽和烴鏈。烷基鏈可以是直鏈(例如正丁基)或支鏈(例如仲丁基、異丁基或叔丁基)。優(yōu)選的支鏈烷基具有一個或兩個分支，優(yōu)選一個分支。優(yōu)選的烷基是飽和的。不飽和的烷基具有一個或多個雙鍵和/或一個或多個三鍵。優(yōu)選的不飽和烷基具有一個或兩個雙鍵或一個三鍵，更優(yōu)選具有一個雙鍵。烷基鏈可以是未取代的或被1至4個取代基取代。優(yōu)選的烷基是未取代的。優(yōu)選的取代的烷基是單-、二-、或三取代的。優(yōu)選的烷基取代基包括鹵素、鹵代烷基、羥基、芳基(例如苯基、甲苯基、烷氧基苯基、烷氧基羰基苯基、鹵代苯基)、雜環(huán)基和雜芳基。
術(shù)語‘鏈烯基’和‘炔基’是指長度和可能的取代與上述烷基相似但是分別含有至少一個雙鍵或三鍵的不飽和脂族基團。當沒有特別說明時，術(shù)語鏈烯基和炔基優(yōu)選分別是指低級鏈烯基和低級炔基。當在術(shù)語鏈烯基和炔基的列表中出現(xiàn)術(shù)語烷基時，術(shù)語烷基是指除鏈烯基和炔基之外的飽和烷基。
本文中所用的術(shù)語‘烷氧基’和‘烷氧’是指基團-O-烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。‘醚’是通過氧共價連接的兩個烴。因此，使烴成為醚的烴的取代基可以是烷氧基或者另外的部分如-O-芳基、-O-雜芳基、-O-雜烷基、-O-芳烷基、-O-雜芳烷基、-O-碳環(huán)脂族基團或-O-雜環(huán)脂族基團。
術(shù)語‘烷硫基’是指基團-S-烷基。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等?！蛎选侵概c兩個烴取代基鍵合的硫原子，例如其中氧被硫替代的醚。因此，碳原子上的硫醚取代基是指烴取代的硫原子取代基，如烷硫基或芳硫基等。
本文中所用的術(shù)語‘芳烷基’是指被芳基取代的烷基。
‘芳基環(huán)’是指芳族烴環(huán)體系。芳族環(huán)是單環(huán)或稠合的雙環(huán)體系，如苯基、萘基等。單環(huán)的芳族環(huán)在環(huán)中含有約5至約10個碳原子，優(yōu)選5至7個碳原子，并且最優(yōu)選5至6個碳原子。雙環(huán)的芳族環(huán)在環(huán)中含有8至12個碳原子，優(yōu)選9或10個碳原子。術(shù)語‘芳基’還包括其中僅有一個環(huán)是芳族環(huán)、例如其它環(huán)是環(huán)烷基、環(huán)烯基或雜環(huán)基的雙環(huán)體系。芳族環(huán)可以是未取代的或者在環(huán)上被1至約5個取代基取代。優(yōu)選的芳族環(huán)取代基包括鹵素、氰基、低級烷基、雜烷基、鹵代烷基、苯基、苯氧基或其任何組合。更優(yōu)選的取代基包括低級烷基、氰基、鹵素和鹵代烷基。
‘碳環(huán)脂族環(huán)’是指飽和或不飽和的烴環(huán)。碳環(huán)脂族環(huán)不是芳族環(huán)。碳環(huán)脂族環(huán)是單環(huán)或者是稠合、螺環(huán)或橋連的雙環(huán)環(huán)體系。單環(huán)的碳環(huán)脂族環(huán)在環(huán)中含有約4至約10個碳原子，優(yōu)選4至7個碳原子，并且最優(yōu)選5至6個碳原子。雙環(huán)的碳環(huán)脂族環(huán)在環(huán)中含有8至12個碳原子，優(yōu)選9至10個碳原子。碳環(huán)脂族環(huán)可以是未取代的或在環(huán)上被1至4個取代基取代。優(yōu)選的碳環(huán)脂族環(huán)取代基包括鹵素、氰基、烷基、雜烷基、鹵代烷基、苯基、苯氧基或其任何組合。更優(yōu)選的取代基包括鹵素和鹵代烷基。優(yōu)選的碳環(huán)脂族環(huán)包括環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。更優(yōu)選的碳環(huán)脂族環(huán)包括環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。
術(shù)語‘羰基’是本領(lǐng)域中所公知的，包括可以用以下通式表示的該類部分 或
其中X是鍵或者表示氧或硫，且R11表示氫、烴取代基，或可藥用的鹽，R11’表示氫或烴取代基。當X是氧且R11或R11’不是氫時，該式表示‘酯’。當X是氧且R11如以上所定義時，該部分在本文中被稱為羧基，且特別是當R11是氫時，該式表示‘羧酸’。當X是氧且R11’是氫時，該式表示‘甲酸酯’。通常，當上式中的氧原子被硫替代時，該式表示‘硫代羰基’。當X是硫且R11或R11’不是氫時，該式表示‘硫代酸酯’。當X是硫且R11是氫時，該式表示‘硫代羧酸’。當X是硫且R11’是氫時，該式表示‘硫代甲酸酯’。另一方面，當X是鍵、R11不是氫且羰基與烴鍵合時，上式表示‘酮’基。當X是鍵、R11是氫且羰基與烴鍵合時，上式表示‘醛’或‘甲?！?br> ‘Ci烷基’是具有i個成員原子的烷基鏈。例如，C4烷基含有4個碳成員原子。C4烷基可以是飽和的或者是具有一個或兩個雙鍵(順式或反式)或一個三鍵的不飽和烷基。優(yōu)選的C4烷基是飽和的。優(yōu)選的不飽和C4烷基具有一個雙鍵。C4烷基可以是未取代的或者被一個或兩個取代基取代。優(yōu)選的取代基包括低級烷基、低級雜烷基、氰基、鹵素和鹵代烷基。
‘鹵素’是指氟、氯、溴或碘取代基。優(yōu)選的鹵素是氟、氯和溴；更優(yōu)選的是氯和氟。
‘鹵代烷基’是指具有一個或多個鹵素取代基的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴。優(yōu)選的鹵代烷基是C1-C12鹵代烷基；更優(yōu)選是C1-C6鹵代烷基；還更優(yōu)選是C1-C3鹵代烷基。優(yōu)選的鹵素取代基是氟和氯。最優(yōu)選的鹵代烷基是三氟甲基。
‘雜烷基’是碳原子和至少一個雜原子的飽和或不飽和鏈，其中沒有兩個雜原子是毗鄰的。雜烷基鏈在鏈中含有1至18個成員原子(碳原子和雜原子)，優(yōu)選1至12個、更優(yōu)選1至6個、還更優(yōu)選1至4個成員原子。雜烷基鏈可以是直鏈的或支鏈的。優(yōu)選的支鏈雜烷基具有一個或兩個分支，優(yōu)選一個分支。優(yōu)選的雜烷基是飽和的。不飽和的雜烷基具有一個或多個雙鍵和/或一個或多個三鍵。優(yōu)選的不飽和雜烷基具有一個或兩個雙鍵或一個三鍵，更優(yōu)選一個雙鍵。除非特別說明，否則雜烷基鏈可以是未取代的或被1至約4個取代基取代。優(yōu)選的雜烷基是未取代的。優(yōu)選的雜烷基取代基包括鹵素、芳基(例如苯基、甲苯基、烷氧基苯基、烷氧基羰基苯基、鹵代苯基)、雜環(huán)基、雜芳基。例如，被以下取代基取代的烷基鏈是雜烷基烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基)、芳氧基(例如苯氧基、氯苯氧基、甲苯氧基、甲氧基苯氧基、芐氧基、烷氧基羰基苯氧基、酰氧基苯氧基)、酰氧基(例如丙酰氧基、苯甲酰氧基、乙酰氧基)、氨基甲酰氧基、羧基、巰基、烷硫基、酰硫基、芳硫基(例如苯硫基、氯苯硫基、烷基苯硫基、烷氧基苯硫基、芐硫基、烷氧基羰基苯硫基)、氨基(例如氨基、單-和二-C1-C3烷基氨基、甲基苯基氨基、甲基芐基氨基、C1-C3烷基酰氨基、氨基甲酰氨基(carbamamido)、脲基、胍基)。
‘雜原子’是指多價的非碳原子，如硼、磷、硅、氮、硫或氧原子，優(yōu)選氮、硫或氧原子。含有一個以上雜原子的基團可以含有不同的雜原子。
‘雜芳基環(huán)’是指在環(huán)中含有碳原子和1至約4個雜原子的芳族環(huán)體系。雜芳族環(huán)是單環(huán)或稠合的雙環(huán)環(huán)體系。單環(huán)的雜芳族環(huán)在環(huán)中含有約5至約10個成員原子(碳和雜原子)，優(yōu)選5至7個、最優(yōu)選5至6個成員原子。雙環(huán)的雜芳環(huán)在環(huán)中含有8至12個成員原子，優(yōu)選9或10個成員原子。術(shù)語‘雜芳基’還包括其中僅有一個環(huán)是芳族環(huán)、例如其它環(huán)是環(huán)烷基、環(huán)烯基或雜環(huán)基的雙環(huán)環(huán)體系。雜芳族環(huán)可以是未取代的或者在環(huán)上被1至約4個取代基取代。優(yōu)選的雜芳族環(huán)取代基包括鹵素、氰基、低級烷基、雜烷基、鹵代烷基、苯基、苯氧基或其任何組合。優(yōu)選的雜芳族環(huán)包括噻吩基、噻唑基、噁唑基、吡咯基、嘌呤基、嘧啶基、吡啶基和呋喃基。更優(yōu)選的雜芳族環(huán)包括噻吩基、呋喃基和吡啶基。
‘雜環(huán)脂族環(huán)’是在環(huán)中含有碳原子和1至約4個雜原子的非芳族的飽和或不飽和環(huán)，其中在環(huán)中沒有兩個雜原子是毗鄰的且優(yōu)選地與雜原子相連的環(huán)中的碳不再具有與其相連接的羥基、氨基或硫醇基。雜環(huán)脂族環(huán)是單環(huán)或者是稠合或橋連的雙環(huán)環(huán)體系。單環(huán)的雜環(huán)脂族環(huán)在環(huán)中含有約4至約10個成員原子(碳原子和雜原子)，優(yōu)選4至7個、且最優(yōu)選5至6個成員原子。雙環(huán)的雜環(huán)脂族環(huán)在環(huán)中含有8至12個成員原子，優(yōu)選9或10個成員原子。雜環(huán)脂族環(huán)可以是未取代的或者在環(huán)上被1至約4個取代基取代。優(yōu)選的雜環(huán)脂族環(huán)取代基包括鹵素、氰基、低級烷基、雜烷基、鹵代烷基、苯基、苯氧基或其任何組合。更優(yōu)選的取代基包括鹵素和鹵代烷基。雜環(huán)基包括例如噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、色烯、呫噸、酚黃素(phenoxathin)、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、中氮茚、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、乙內(nèi)酰脲、噁唑啉、咪唑啉三酮、三唑啉酮、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、喹啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、氧雜環(huán)戊烷(oxolane)、硫雜環(huán)戊烷(thiolane)、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺如氮雜環(huán)丁烷酮和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺酸內(nèi)酯等。優(yōu)選的雜環(huán)脂族環(huán)包括哌嗪基、嗎啉基、四氫呋喃基、四氫吡喃基和哌啶基。雜環(huán)還可以是多環(huán)。
術(shù)語‘羥基’是指-OH。
‘低級烷基’是指包含1至5個、優(yōu)選1至4個碳成員原子、更優(yōu)選1或2個碳成員原子的烷基鏈。低級烷基可以是飽和的或不飽和的。優(yōu)選的低級烷基是飽和的。低級烷基可以是未取代的或被1或約2個取代基取代。低級烷基上優(yōu)選的取代基包括氰基、鹵素、三氟甲基、氨基和羥基。在本申請中，優(yōu)選的烷基是低級烷基。在優(yōu)選的實施方案中，本文中被稱為烷基的取代基是低級烷基。同樣，‘低級鏈烯基’和‘低級炔基’具有相似的鏈長度。
‘低級雜烷基’是指包含1至4個、優(yōu)選1至3個成員原子、更優(yōu)選1至2個成員原子的雜烷基鏈。低級雜烷基含有一個或兩個不毗鄰的雜原子成員原子。優(yōu)選的低級雜烷基含有一個雜原子成員原子。低級雜烷基可以是飽和的或不飽和的。優(yōu)選的低級雜烷基是飽和的。低級雜烷基可以是未取代的或被1或約2個取代基取代。低級雜烷基上優(yōu)選的取代基包括氰基、鹵素、三氟甲基和羥基。
‘Mi雜烷基’是具有i個成員原子的雜烷基鏈。例如，M4雜烷基含有1或2個不毗鄰的雜原子成員原子。含有1個雜原子成員原子的M4雜烷基可以是飽和的或不飽和的(具有一個雙鍵(順式或反式)或一個三鍵)。優(yōu)選的含有2個雜原子成員原子的M4雜烷基是飽和的。優(yōu)選的不飽和M4雜烷基具有一個雙鍵。M4雜烷基可以是未取代的或被1或2個取代基取代。優(yōu)選的取代基包括低級烷基、低級雜烷基、氰基、鹵素和鹵代烷基‘異氰酸酯(鹽)’是指基團-NCO。
‘成員原子’是指構(gòu)成鏈或環(huán)的一部分的鏈或環(huán)體系中的多價原子(例如C、O、N或S原子)。例如，在甲酚中，六個碳原子是該環(huán)的成員原子，而氧原子和甲基取代基的碳原子則不是該環(huán)的成員原子。
本文中所用的術(shù)語‘硝基’是指-NO2。
‘可藥用的鹽’是指在任何酸性基團(例如異羥肟酸或羧酸)上形成的陽離子鹽或在任何堿性基團(例如氨基或胍基)上形成的陰離子鹽。該類鹽在本領(lǐng)域中是眾所周知的。參見例如Johnston等人的于1987年9月11日公布的世界專利出版物87/05297，將其引入本文作為參考。該類鹽用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備。應(yīng)當理解的是普通技術(shù)人員可以較另一種鹽優(yōu)選這一種鹽以改善溶解度、穩(wěn)定性、配制容易性、價格等。該類鹽的確定和最優(yōu)化在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實踐的范圍內(nèi)。優(yōu)選的陽離子包括堿金屬(如鈉和鉀)和堿土金屬(如鎂和鈣)以及有機陽離子如三甲銨、四丁銨等。優(yōu)選的陰離子包括鹵化物(如氯化物)、磺酸根、羧酸根、磷酸根等。在該類鹽中顯然包括可以提供在之前沒有的光學(xué)中心的加成鹽。例如，可以由本發(fā)明的化合物制備手性酒石酸鹽。本定義包括該類手性鹽。
‘苯基’是一種可以不被取代或者被1至5個取代基取代的六元單環(huán)芳族環(huán)。所述的取代基可以位于苯環(huán)的鄰位、間位或?qū)ξ?，或者可以是其任何組合。優(yōu)選的苯基取代基包括鹵素、氰基、低級烷基、雜烷基、鹵代烷基、苯基、苯氧基或其任何組合。苯環(huán)上更優(yōu)選的取代基包括鹵素和鹵代烷基。最優(yōu)選的取代基是鹵素。
術(shù)語‘多環(huán)基’和‘多環(huán)的基團’是指其中一個環(huán)的兩個或多個成員原子是第二個環(huán)的成員原子的兩個或多個環(huán)(例如環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜芳基、芳基和/或雜環(huán)基)。通過不毗鄰的原子被連接到一起的環(huán)被稱為‘橋連的’環(huán)，通過毗鄰的原子被連接到一起的環(huán)是‘稠合環(huán)’。
術(shù)語‘有機小分子’是指小于約2500amu、優(yōu)選小于1500amu的有機化合物。該術(shù)語包括不是蛋白質(zhì)或核酸的大多數(shù)藥用物質(zhì)。
術(shù)語‘巰基’是指-SH，術(shù)語‘磺?；侵?SO2-。
有機小分子上的‘取代’或‘取代基’一般是指與氫以外的部分相結(jié)合的多價原子上的位置，例如鏈或環(huán)的成員原子以外的鏈或環(huán)上的位置。該類部分包括本文中所定義的那些和本領(lǐng)域中已知的那些，例如鹵素、烷基、鏈烯基、炔基、疊氮化物、鹵代烷基、羥基、羰基(如羧基、烷氧基羰基、甲酰基、酮或酰基)、硫代羰基(如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷?；?、膦酸酯、次膦酸酯、胺、酰胺、脒、亞胺、氰基、硝基、疊氮基、巰基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺?；?、磺酰氨基、磺?；?、甲硅烷基、醚、環(huán)烷基、雜環(huán)基、雜烷基、雜鏈烯基和雜炔基、雜芳烷基、芳烷基、芳基或雜芳基。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解的是如果適宜的話，某些取代基如芳基、雜芳基、多環(huán)基、烷氧基、烷基氨基、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、鏈烯基、炔基、雜烷基、雜鏈烯基和雜炔基本身可以被取代。并非旨在以任何方式用有機化合物可能的取代基限制本發(fā)明。應(yīng)當理解的是，‘取代’或‘被取代’包括的暗含前提是該類取代是被取代原子且是該取代基的原子價所允許的，并且該取代產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如不會自發(fā)進行轉(zhuǎn)化如通過重排、環(huán)化、消除、水解等進行轉(zhuǎn)化的化合物。
當在任何結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次以上時，本文中所用的各表達例如烷基、m、n等的定義與其在該結(jié)構(gòu)中其它位置的定義是彼此獨立的。
縮寫Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts和Ms分別表示甲基、乙基、苯基、三氟甲磺酰基、九氟丁磺?；?、對甲苯磺?；图谆酋；ournal ofOrganic Chemistry各卷第一期中給出了本領(lǐng)域普通技術(shù)的有機化學(xué)工作人員所用的縮寫的更全面的列表；典型地，這種列表存在于標題為標準縮寫列表的表中。所述列表中所含有的縮寫以及本領(lǐng)域普通技術(shù)的有機化學(xué)工作人員所用的所有縮寫均引入本文作為參考。
術(shù)語鄰、間和對分別應(yīng)用于1，2-、1，3-和1，4-二取代的苯。例如，1，2-二甲基苯和鄰-二甲基苯的稱呼是同義的。
術(shù)語三氟甲磺?；?、甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁磺?；潜绢I(lǐng)域所公知的，分別是指三氟甲烷磺?；?甲苯磺?；⒓淄榛酋；途欧⊥榛酋；?。術(shù)語三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁磺酸酯是本領(lǐng)域所公知的，分別是指三氟甲烷磺酸酯、對-甲苯磺酸酯、甲烷磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯官能基和含有所述基團的分子。
本文中所用的短語‘保護基’是指可保護可能的活性官能團防止其發(fā)生不希望的化學(xué)轉(zhuǎn)化的臨時取代基。該類保護基的實例分別包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚以及醛和酮的縮醛和縮酮。已經(jīng)對保護基化學(xué)領(lǐng)域進行了綜述(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis，第2版；Wiley紐約，1991；和Kocienski，P.J.Protecting Groups，GeorgThieme Verlag紐約，1994)。
術(shù)語‘前體藥物’旨在包括在生理條件下可轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的治療活性劑的化合物。一種制備前體藥物的普通方法是包括所選擇的可在生理條件下被水解從而釋放出所需分子的部分如酯或縮酮。在其它實施方案中，前體藥物通過主體動物的酶活性來進行轉(zhuǎn)化。
對于本發(fā)明的目的而言，根據(jù)元素周期表、CAS版本、HandbookofChemistry and Physics，第67版，1986-87內(nèi)封頁來確定化學(xué)元素。對于本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“烴”還包括具有至少一個碳-氫鍵的所有可能的化合物或部分。在廣義上，所述的可能的烴包括無環(huán)的和環(huán)狀的、支鏈的和無支鏈的碳環(huán)和雜環(huán)、芳族和非芳族的有機化合物，其可以是取代的或未取代的。
所考慮的上述化合物的等同物包括與其相當且具有與其相同的有用性質(zhì)的其它化合物，其中進行的取代基的一種或多種簡單變化不會對化合物的功效產(chǎn)生不利影響。通常，本發(fā)明的化合物可以通過例如以下所述的一般反應(yīng)流程圖中所述的方法或通過其變體、用易于獲得的起始材料、試劑和常規(guī)合成操作來進行制備。在這些反應(yīng)中，也可能使用本身已知但是本文中沒有提及的變體。
III.舉例性方法和組合物應(yīng)用本發(fā)明的治療組合物含有治療劑和本發(fā)明的材料，如以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的材料。所述的治療劑可以是任何合成的或天然存在的生物學(xué)活性治療劑，包括本領(lǐng)域中公知的那些。適宜的治療劑的實例包括但不限于抗菌劑、類固醇、多核苷酸(例如基因組DNA、cDNA、mRNA和反義寡核苷酸)、質(zhì)粒、蛋白質(zhì)、多肽、肽片斷、小分子(例如阿霉素)和其它生物學(xué)活性大分子如例如蛋白質(zhì)和酶。在某些實施方案中，該物質(zhì)可以與遞送系統(tǒng)聯(lián)用，例如核酸可以被包含在病毒中，或者該物質(zhì)可以被載荷在脂質(zhì)體或微球中，并且將遞送系統(tǒng)分散在整個材料中。
本發(fā)明的治療組合物可以用本領(lǐng)域中公知的方法來進行制備。在優(yōu)選的實施方案中，將本發(fā)明的材料如以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的材料與上述治療劑混合或在上述治療劑存在下進行制備。根據(jù)本發(fā)明，該材料用作治療劑的遞送載體?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將治療劑(和/或輔劑)與材料相結(jié)合，所述的方法如例如靜電相互作用、氫鍵、疏水性相互作用、與包合主體形成包合絡(luò)合物或與聚合物共價連接，優(yōu)選通過一種可逆的連接如酯或碳酸酯相結(jié)合。在某些實施方案中，治療劑和/或輔劑可以共價連接、任選地通過一種可逆的鍵共價連接到可與包合主體例如環(huán)糊精形成包合絡(luò)合物的部分上。可以用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)來測定締合度，所述的技術(shù)包括例如熒光研究、DNA移動性研究、光散射、電子顯微鏡，締合度將隨著治療劑的不同而變化。就遞送方式而言，例如，可以用本發(fā)明的含有本發(fā)明的材料和DNA的治療組合物來幫助轉(zhuǎn)染，即將DNA攝入動物(例如人)細胞中。(Boussif，O.Proceedings of the National Academy of Sciences，927297-7301(1995)；Zanta等人，Bioconjugate Chemistry，8839-844(1997))。
在某些實施方案中，本發(fā)明的治療組合物是適于注射的形式，在其它實施方案中，組合物適于局部應(yīng)用。根據(jù)治療組合物的狀態(tài)，本發(fā)明的治療組合物的其它施用方式包括本領(lǐng)域中公知的那些，例如但不限于口服施用、胃腸外、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、顱內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。
根據(jù)所用治療劑的類型，可以用多種治療方法(例如DNA疫苗、抗菌劑、抗病毒劑)使用本發(fā)明的治療組合物來治療先天性或后天性病癥如例如囊性纖維化、戈謝病、肌營養(yǎng)不良、AIDS、癌癥(例如多發(fā)性骨髓瘤、白血病、黑素瘤和卵巢癌)、心血管病癥(例如進行性心力衰竭、再狹窄和血友病)以及神經(jīng)學(xué)病癥(例如腦創(chuàng)傷)。在其它實施方案中，主題組合物可用于治療傷口如切口、糖尿病性潰瘍、褥瘡、裂傷、燒傷等。
治療劑可以是核酸(如載體、RNAi構(gòu)建體或反義寡核苷酸)或蛋白質(zhì)以及有機小分子。在某些實施方案中，治療劑是抗癌(如喜樹堿或相關(guān)衍生物)、抗真菌、抗細菌、抗霉菌或抗病毒治療劑。在某些實施方案中，治療劑是受體激動劑。在某些實施方案中，治療劑是受體拮抗劑。在某些實施方案中，治療劑是蛋白酶抑制劑。此外，本發(fā)明的聚合物可以含有一種治療劑或者可以含有一種以上的治療劑。例如，在組合物中可以含有兩種或多種不同的抗癌劑或者抗癌劑和免疫抑制劑或者抗菌劑和抗炎劑。
根據(jù)所用治療劑的類型，可以在多種治療方法中(例如DNA疫苗、抗菌劑、抗病毒劑)使用本發(fā)明的治療組合物以治療先天性或后天性病癥如例如囊性纖維化、戈謝病、肌營養(yǎng)不良、AIDS、癌癥(例如多發(fā)性骨髓瘤、白血病、黑素瘤和卵巢癌)、心血管病癥(例如進行性心力衰竭、再狹窄和血友病)以及神經(jīng)學(xué)病癥(例如腦創(chuàng)傷)。
在某些特定的實施方案中，本發(fā)明的組合物可用于治療傷口(即促進傷口愈合)。雖然可以僅用基質(zhì)作為傷口封閉劑，但是該類組合物可以包含例如PDGF-B或用于在靶細胞中產(chǎn)生PDGF-B的表達載體、細胞增殖或分化刺激劑、干細胞或祖細胞和/或已知可有效促進愈合、抑制感染的其它化合物等。
在其它實施方案中，本發(fā)明的組合物可用于治療癌癥。該類組合物可以包含化療劑、血管生成抑制劑、細胞增殖抑制劑、輻射敏化劑和/或任何可用于治療癌癥的其它物質(zhì)。
例如可以被配制到治療癌癥的主題組合物中的化合物包括氨魯米特、安吖啶、阿納曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗、比卡魯胺、博來霉素、布舍瑞林、白消安、喜樹堿、卡培他濱、卡鉑、卡氮芥、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、氯膦酸鹽、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、更生霉素、柔紅霉素、雙烯雌酚、己烯雌酚、多西他賽、阿霉素、表阿霉素、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭、氟達拉濱、氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟羥甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、染料木素、戈舍瑞林、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、干擾素、伊立替康、伊濃替康(ironotecan)、來曲唑、甲酰葉酸、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、羅氮芥、氮芥、甲羥孕酮、甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、巰嘌呤、巰基乙磺酸鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、洛可達唑、奧曲肽、奧沙利鉑、紫杉醇、氨羥二磷酸二鈉、噴司他丁、光輝霉素、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈脲霉素、蘇拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睪酮、硫鳥嘌呤、噻替哌、二氯環(huán)戊二烯鈦、拓撲替康、曲妥單抗、維甲酸、長春堿、長春新堿、長春地辛和長春烯堿。
這些化療劑可以按照它們的作用機理被分類為例如以下各組抗代謝劑/抗癌劑，如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他濱、吉西他濱和阿糖胞苷)和嘌呤類似物、葉酸拮抗劑和相關(guān)的抑制劑(巰嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱))；抗增殖劑/抗有絲分裂劑，包括天然產(chǎn)物如長春花生物堿(長春堿、長春新堿和長春烯堿)、微管干擾劑如紫杉烷(紫杉醇、多西他賽)、長春新堿、長春堿、洛可達唑、埃坡霉素(epothilone)和諾維本、epidipodophyllotoxins(替尼泊苷)、DNA破壞劑(放線菌素、安吖啶、蒽環(huán)霉素、博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、表阿霉素、烏洛托品、奧沙利鉑、異環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、merchlorehtamine、絲裂霉素、米托蒽醌、亞硝基脲、光輝霉素、丙卡巴肼、替尼泊苷、噻替哌和依托泊苷(VP16))；抗菌劑如更生霉素(放線菌素D)、柔紅霉素、阿霉素(羥基柔紅霉素)、伊達比星、蒽環(huán)霉素、米托蒽醌、博來霉素、光輝霉素(普卡霉素)和絲裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其全身性代謝L-天冬酰胺并使不具有合成自己的天冬酰胺能力的細胞損失)；抗血小板劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑如氮芥(氮芥、環(huán)磷酰胺及類似物、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥)、氮丙啶和甲基蜜胺類物質(zhì)(methylmelamines)(烏洛托品和噻替哌)、烷基磺酸酯類物質(zhì)-白消安、亞硝基脲(卡氮芥(BCNU)及類似物、鏈脲霉素)、trazenes-達卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物如葉酸類似物(甲氨蝶呤)；鉑配位絡(luò)合物(順鉑、卡鉑)、丙卡巴肼、羥基脲、米托坦、氨魯米特；激素、激素類似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特)和芳香酶抑制劑(來曲唑、阿納曲唑)；抗凝劑(肝素、合成肝素鹽以及其它凝血酶抑制劑)；纖維蛋白溶解劑(如組織纖溶酶原激活物、鏈激酶和尿激酶)、阿司匹林、COX-2抑制劑、雙嘧達莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔單抗；抗遷移劑；抗分泌藥(breveldin)；免疫抑制劑(環(huán)孢菌素、他克莫司(FK-506)、西羅莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、麥考酚酸嗎啉乙酯)；抗血管生成化合物(TNP-470、染料木素)和生長因子抑制劑(血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑、成纖維細胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管緊張素受體阻滯劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥單抗)；細胞周期抑制劑和分化誘導(dǎo)劑(維甲酸)；mTOR抑制劑、拓撲異構(gòu)酶抑制劑(阿霉素(羥基柔紅霉素)、安吖啶、喜樹堿、柔紅霉素、更生霉素、依尼泊苷(eniposide)、表阿霉素、依托泊苷、伊達比星和米托蒽醌、拓撲替康、伊立替康)、皮質(zhì)類固醇(可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松和潑尼松龍)；生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶抑制劑；線粒體功能障礙誘導(dǎo)劑和半胱天冬酶活化劑；染色質(zhì)干擾劑。
根據(jù)本發(fā)明，一種治療方法是施用治療有效量的本發(fā)明的治療組合物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的那樣，治療有效量將根據(jù)不同情況來確定。要考慮的因素包括但不限于所治療的病癥和患有該病癥的個體的身體特性。
本發(fā)明的另一個實施方案是含有至少一種具有農(nóng)業(yè)學(xué)效用的生物學(xué)活性化合物和本發(fā)明的環(huán)糊精修飾的線性聚合物或氧化環(huán)糊精修飾的線性聚合物的組合物。所述的農(nóng)業(yè)學(xué)上的生物學(xué)活性化合物包括本領(lǐng)域中所公知的那些。例如，適宜的農(nóng)業(yè)學(xué)上的生物學(xué)活性化合物包括但不限于殺真菌劑、除草劑、殺蟲劑和殺霉菌劑(mildewcide)。
IV.舉例性組合物在某些實施方案中，基礎(chǔ)的聚合物是包含環(huán)糊精的線性聚合物，例如。聚合物主鏈包含環(huán)糊精部分。例如，聚合物可以是通過提供至少一種被修飾為在恰好兩個位置的每個位置上帶有活性位點的環(huán)糊精衍生物并使該環(huán)糊精衍生物與恰好具有兩個在聚合條件下能與所述的活性位點形成共價鍵的活性部分的連接物進行反應(yīng)所制得的水溶性的線性環(huán)糊精聚合物，所述的聚合條件可促進所述的活性位點與所述的活性部分進行反應(yīng)從而在連接物和環(huán)糊精衍生物之間形成共價鍵，從而制得一種包含交替的環(huán)糊精衍生物和連接物單位的線性聚合物。在美國專利申請20020151523和10/656,838中描述了多種適宜的聚合物。或者，聚合物可以是一種具有線性聚合物主鏈的水溶性的線性環(huán)糊精聚合物，該聚合物在線性聚合物主鏈中包含多個取代的或未取代的環(huán)糊精部分和連接物部分，其中位于聚合物鏈末端的環(huán)糊精部位以外的每個環(huán)糊精部分被連接到兩個所述的連接物部分上，每個連接物部分與兩個環(huán)糊精部分共價連接。在另外一個實施方案中，聚合物是包含與多個連接物部分共價連接在一起的多個環(huán)糊精部分的水溶性的線性環(huán)糊精聚合物，其中位于聚合物鏈末端的環(huán)糊精部分以外的每個環(huán)糊精部分被連接到兩個連接物部分上以形成線性環(huán)糊精聚合物。
所述的一個或多個連接物基團可以是亞烷基鏈、聚乙二醇(PEG)鏈、聚琥珀酸酐、聚-L-谷氨酸、聚(乙烯亞胺)、寡糖、氨基酸鏈或任何其它適宜的鍵合。在某些實施方案中，連接物基團本身可以是在生理條件下穩(wěn)定的，如亞烷基鏈，或者可以是在生理條件下可被裂解的，如被酶裂解(例如該鍵合含有為肽酶底物的肽序列)或被水解(例如該鍵合含有可水解的基團，如酯或硫代酸酯)。該連接物基團可以是無生物學(xué)活性的，如PEG、聚乙醇酸或聚乳酸鏈，或者可以是有生物學(xué)活性的，如寡肽或多肽，當從所述的部分裂解下來時其與受體結(jié)合、使酶滅活等。各種生物相容性的和/或生物可蝕解的低聚連接物基團是本領(lǐng)域中已知的，鍵合的選擇可影響材料的最終性質(zhì)，如當被植入時其是否耐久、在植入后其是否逐漸變形或收縮或者其是否被機體逐漸降解和吸收。連接物基團可以通過任何適宜的鍵或官能團(包括碳-碳鍵、酯、醚、酰胺、胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、磺酰胺等)連接到所述的部分上。
在舉例性實施方案中，用于形成所述材料的環(huán)糊精聚合物是環(huán)糊精和聚乙二醇(PEG)的共聚物。該類聚合物可以用本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)來制備，如以下反應(yīng)式所例舉的反應(yīng) 其中梯形表示以下所詳細描述的環(huán)糊精部分，且n表示1至20、優(yōu)選2至12的整數(shù)。該聚合物可以被修飾，例如可以通過共價連接治療劑部分來進行修飾，例如通過可以在生理條件下裂解的連接物進行共價連接。
在該類聚合物中，環(huán)糊精部分可以占共聚物重量的至少2％，優(yōu)選占共聚物重量的至少5％或10％，或甚至多達20％、40％、50％、60％、80％，或甚至90％。
在某些實施方案中，用于形成所述材料的環(huán)糊精聚合物具有下式的結(jié)構(gòu) 其中R每次出現(xiàn)時各自獨立地表示H、低級烷基、環(huán)糊精部分或 且m每次出現(xiàn)時各自獨立地表示2-10,000、優(yōu)選10至5,000或100至1,000的整數(shù)。這種類型的適宜的聚合物在美國專利申請No.10/372,723和PCT申請WO 03/072637中進行了更詳細的討論。
在某些實施方案中，R表示環(huán)糊精部分，使得至少約1％、更優(yōu)選至少約3％且高至約5％、10％、20％、35％或甚至50％的否則將為伯胺(即帶有兩個表示H的R)的氮原子不再是伯胺。
在某些實施方案中，環(huán)糊精部分占環(huán)糊精修飾聚合物的至少約2％、3％或4％重量高至5％、7％或甚至10％重量。
在某些實施方案中，聚合物中至少約2％、3％或4％重量、高至5％、7％或甚至10％的亞乙基亞胺(ethylenimine)亞基被環(huán)糊精部分修飾。
也可以用帶有易于被衍生化的親核氨基取代基的聚(乙烯亞胺)與環(huán)糊精部分的共聚物來制備本發(fā)明范圍內(nèi)的環(huán)糊精修飾的聚合物。
舉例性的環(huán)糊精部分包括基本由6至9個糖部分組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如環(huán)糊精和氧化的環(huán)糊精。環(huán)糊精部分任選地包含可在所述環(huán)狀結(jié)構(gòu)和聚合物主鏈之間形成共價鍵的連接物部分，其優(yōu)選在鏈中具有1至20個原子，如烷基鏈，包括二羧酸衍生物(如戊二酸衍生物、琥珀酸衍生物等)，和雜烷基鏈，如低聚乙二醇鏈。環(huán)糊精部分還可以包含一個或多個直接(即通過碳水化合物鍵)或通過連接物基團連接在環(huán)狀核上的碳水化合物部分，優(yōu)選簡單的碳水化合物部分如半乳糖。
環(huán)糊精是含有α-(1，4)鍵合的天然存在的D-(+)-吡喃葡萄糖單位的環(huán)狀多糖。最常見的環(huán)糊精是分別含有6、7或8個吡喃葡萄糖單位的alpha(α)-環(huán)糊精、beta(β)-環(huán)糊精和gamma(γ)-環(huán)糊精。在結(jié)構(gòu)上，環(huán)糊精的環(huán)狀性質(zhì)形成了具有內(nèi)部非極性或疏水性空穴的環(huán)形曲面或環(huán)形室樣形狀，仲羥基位于環(huán)糊精環(huán)形曲面的一側(cè)，伯羥基位于另一側(cè)。因此，以(β)-環(huán)糊精為例，環(huán)糊精常常如下圖所示。
仲羥基所位于的一側(cè)比伯羥基所位于的一側(cè)具有更寬的直徑。環(huán)糊精內(nèi)部空穴的疏水性質(zhì)使得可以包合各種化合物。(ComprehensiveSupramolecular Chemistry，第3卷，J.L.Atwood等人編輯，PergamonPress(1996)；T.Cserhati，Analytical Biochemistry，225328-332(1995)；Husain等人，Applied Spectroscopy，46652-658(1992)；FR 2 665 169)。在Suh，J.和Noh，Y.，Bioorg.Med.Chem.Lett.1998，8，1327-1330中描述了對聚合物進行修飾的其它方法。
通過與可以適合于環(huán)糊精的疏水性空穴的各種藥物形成包合絡(luò)合物或與其它生物學(xué)活性分子如寡核苷酸及其衍生物形成非共價締合的絡(luò)合物環(huán)糊精已經(jīng)被用作各種治療性化合物的遞送載體。例如，參見美國專利4,727,064、5,608,015、5,276,088和5,691,316。各種含有環(huán)糊精的聚合物及其制備方法也是本領(lǐng)域中所公知的。Comprehensive SupramolecularChemistry，第3卷，J.L.Atwood等人編輯，Pergamon Press(1996)。已經(jīng)通過將環(huán)糊精或環(huán)糊精混合物和其它碳水化合物用聚合劑例如表氯醇、二異氰酸酯、雙環(huán)氧化合物進行連接或交聯(lián)來制備環(huán)糊精聚合物(不溶性環(huán)糊精聚合物小珠，Chem.Abstr.No.222444m，10294；Zsadon和Fenyvesi，1st.Int.Symp.on Cyclodextrins，J.Szejtli編輯，D.Reidel Publishing Co.，Boston，327-336頁；Fenyvesi等人，1979，Ann.Univ.Budapest，SectionChim.151322；和Wiedenhof等人，1969，Die Stirke 21119-123)。這些聚合劑能與碳6、2和3上的伯羥基和仲羥基反應(yīng)?？梢詫h(huán)糊精修飾的聚合物載體與生物識別分子進行偶聯(lián)以將藥物靶向遞送至它們的作用部位。還可以參見美國專利6,180,739、5,981,740、5,929,131、5,910,551和5,792,821(公開了可聚合的環(huán)糊精衍生物)、6,048,736(討論了使用環(huán)糊精聚合物進行的藥物遞送)、(公開了可聚合的環(huán)糊精衍生物)、5,856,416和5,593,768(公開了帶有環(huán)糊精部分的單體和聚合物)、5,608,015(公開了制備可聚合的環(huán)糊精衍生物的方法)和5,516,766(描述了環(huán)糊精聚合物的應(yīng)用)。
交聯(lián)分子通常包含兩個或多個可與環(huán)糊精或另一種包合主體形成包合絡(luò)合物的部分，該部分通過一個使該部分以相距0.5至50nm、優(yōu)選相距1至30nm的距離被間隔開的原子的鏈共價連接。該部分可選自可以與包合主體如環(huán)糊精形成包合絡(luò)合物的任何分子，例如苯環(huán)、金剛烷多環(huán)、膽固醇、萘酚衍生物等。參見例如Szejtli，Cyclodextrins and Their InclusionComplexes；Akademiai Klado，Budapest，1982；和Bender等人，Cyclodextrin Chemistry，Springer-Verlag，柏林，1978。環(huán)糊精能與一系列有機分子形成包合絡(luò)合物，所述的有機分子包括例如藥物、殺蟲劑和除草劑。參見Tenjarla等人，J.Pharm.Sci.，87425-429(1998)；Zughul等人，Pharm.Dev.Technol.，343-53(1998)；和Albers等人，Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSyst.，12311-337(1995)。在交聯(lián)分子中該部分可以相同或不同，并且可以在一種單一材料中同時使用不同的交聯(lián)分子。
這些部分之間的共價鍵可以是任何適宜的鍵，如亞烷基鏈、聚乙二醇(PEG)鏈、聚(乙烯亞胺)、寡糖、氨基酸鏈或任何其它適宜的鍵。該鍵可以是在生理條件下穩(wěn)定的，如亞烷基鏈，或者可以是在生理條件下可被裂解的，如被酶裂解(例如該鍵合含有為肽酶底物的肽序列)或者被水解(例如該鍵合含有可水解的基團，如酯或硫代酸酯)。該鍵合可以是無生物學(xué)活性的，如PEG、聚乙醇酸或聚乳酸鏈，或者可以是有生物學(xué)活性的，如寡肽或多肽，當從所述的部分裂解下來時其與受體結(jié)合、使酶滅活等。各種生物相容性的和/或生物可蝕解的低聚鍵合是本領(lǐng)域中已知的，鍵合的選擇可影響材料的最終性質(zhì)，如當被植入時其是否耐久、在植入后其是否逐漸變形或收縮或者其是否被機體逐漸降解和吸收。該鍵合可以通過任何適宜的鍵或官能團(包括碳-碳鍵、酯、醚、酰胺、胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、磺酰胺等)連接到所述的部分上。
在一個舉例性的實施方案中，交聯(lián)分子包含為生物學(xué)活性藥物的部分，其通過有生物學(xué)活性并且可以在生理條件下水解的鍵合被連接。在植入后，該鍵合逐漸裂解，釋放出活性藥物并且該材料的結(jié)構(gòu)被部分降解。如果支撐環(huán)糊精的聚合物也是生物可降解的，則該材料將逐漸分解，緩慢釋放絡(luò)合在其中的生物學(xué)活性藥物。在該類實施方案中，在該材料中可以但不是必需包含另外的藥物以獲得治療作用。
本發(fā)明的材料還可以包含一種或多種生物學(xué)活性劑。所述活性劑也可以與環(huán)糊精形成包合絡(luò)合物或者可以僅分散在該材料中。所述活性劑的實例包括核酸、病毒、多肽、聚合復(fù)合物(polyplexes)、藥物、有機小分子、抗體或任何其它治療劑。
在某些實施方案中，主題組合物包含RNAi構(gòu)建體，例如用于用RNA干擾(RNAi)來擊倒靶基因。RNAi構(gòu)建體包含可特異性地阻斷靶基因表達的雙鏈RNA，適合用于使用主題組合物的遞送。RNAi提供了一種有用的在體外或體內(nèi)抑制基因表達的方法。RNAi構(gòu)建體可以包含與靶核酸序列相同或基本相同的dsRNA的長段序列或僅與靶核酸序列的一定區(qū)域相同或基本相同的dsRNA的短段序列。
任選地，RNAi構(gòu)建體含有一個核苷酸序列，該核苷酸序列可在細胞的生理條件下雜交成用于被抑制基因(即“靶”基因)的mRNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分的核苷酸序列。雙鏈RNA僅需要與天然RNA足夠相似以便其具有介導(dǎo)RNAi的能力。因此，本發(fā)明的優(yōu)點是能耐受由于基因突變、菌株多形性或進化趨異而預(yù)期可能發(fā)生的序列變化。耐受的靶序列和RNAi構(gòu)建體序列之間的核苷酸錯配的數(shù)目為在5個堿基對中不超過1個，或者在10個堿基對中不超過1個，或者在20個堿基對中不超過1個，或者在50個堿基對中不超過1個。siRNA雙鏈體中心的錯配最為關(guān)鍵并且可能基本上廢止靶RNA的裂解。相反，與靶RNA互補的siRNA鏈的3′末端上的核苷酸對靶標識別的特異性沒有顯著貢獻?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的序列比較和對比算法(參見Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991以及其中所引用的參考資料)并通過例如使用缺省參數(shù)的BESTFIT軟件程序(例如University of Wisconsin Genetic ComputingGroup)中所應(yīng)用的Smith-Waterman算法計算核苷酸序列之間的差異百分數(shù)來最優(yōu)化序列一致性。優(yōu)選抑制性RNA和靶基因部分之間的序列一致性大于90％或甚至為100％?；蛘?，可以將RNA的雙鏈體區(qū)域在功能上定義為能與一部分靶基因轉(zhuǎn)錄物雜交的核苷酸序列(例如400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃雜交12-16小時；然后洗滌)。
由自我互補的RNA單鏈或兩個互補的RNA鏈可以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。RNA雙鏈體的形成可以在細胞內(nèi)或細胞外引發(fā)?？梢砸允沟孟蛎總€細胞遞送至少一個拷貝的量引入RNA。更高劑量(例如每個細胞至少5、10、100、500或1000個拷貝)的雙鏈材料可產(chǎn)生更有效的抑制作用，但更低的劑量也可以用于特定的應(yīng)用。抑制是序列特異性的，因為與RNA雙鏈體區(qū)域相應(yīng)的核苷酸序列定向于基因抑制。
主題RNAi構(gòu)建體可以是“小干擾RNA”或“siRNA”。這些核酸長度為約19-30個核苷酸，甚至更優(yōu)選長度為21-23個核苷酸。認為siRNA募集核酸酶復(fù)合物并通過與特定的序列配對而將該復(fù)合物導(dǎo)向靶mRNA。結(jié)果，靶mRNA被該蛋白質(zhì)復(fù)合物中的核酸酶降解。在一個特定的實施方案中，21-23個核苷酸的siRNA分子包含3′羥基。在某些實施方案中，siRNA構(gòu)建體可以通過對更長的雙鏈RNA進行加工、例如于酶dicer存在下進行加工來制備。在一個實施方案中，使用果蠅屬體外系統(tǒng)。在該實施方案中，dsRNA與衍生自果蠅屬胚胎的可溶性提取物結(jié)合，從而產(chǎn)生一種組合。將該組合維持在一定條件下，在該條件下dsRNA可被加工成約21至約23個核苷酸的RNA分子?？梢杂迷S多本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)純化siRNA分子。例如，可以用凝膠電泳來純化siRNA。或者，可以用非變性方法如非變性柱色譜法來純化siRNA。此外，還可以用色譜法(例如尺寸排阻色譜法)、甘油梯度離心法、使用抗體的親和純化法來純化siRNA。
可以用化學(xué)合成方法或重組核酸技術(shù)來進行RNAi構(gòu)建體的制備。處理的細胞的內(nèi)源性RNA聚合酶可介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，或者可以用克隆的RNA聚合酶來進行體外轉(zhuǎn)錄。RNAi構(gòu)建體可以包括對磷酸酯-糖主鏈或核苷酸的修飾，例如以降低對細胞核酸酶的敏感性、提高生物利用度、改善制劑特性和/或改變其它藥動學(xué)性質(zhì)。例如，可以對天然RNA的磷酸二酯鍵進行修飾以包含至少一個氮或硫雜原子?？梢詫NA結(jié)構(gòu)中的修飾進行調(diào)整以產(chǎn)生特定的基因抑制，同時避免對dsRNA的廣泛反應(yīng)。同樣，可以對堿基進行修飾以阻斷腺苷脫氨酶的活性。RNAi構(gòu)建體可以通過酶的作用產(chǎn)生或者通過部分/全有機合成來產(chǎn)生，可以通過體外酶合成或有機合成引入任何修飾的核糖核苷酸?；瘜W(xué)修飾RNA分子的方法可能適用于修飾RNAi構(gòu)建體(參見例如Heidenreich等人(1997)Nucleic Acids Res，25776-780；Wilson等人(1994)J Mol Recog789-98；Chen等人(1995)Nucleic Acids Res232661-2668；Hirschbein等人(1997)Antisense NucleicAcid Drug Dev755-61)。僅僅作為舉例說明，可以用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合體甲基膦酸酯-磷酸二酯、肽核酸、包含5-丙炔基-嘧啶的低聚物或糖變體(例如2′-取代的核糖核苷，a-構(gòu)型)修飾RNAi構(gòu)建體的主鏈。
在一些情況下，siRNA分子中至少一個鏈具有長度為約1至約6個核苷酸、但是長度也可以為2至4個核苷酸的3′突出端。更優(yōu)選地，該3′突出端長度為1-3個核苷酸。在某些實施方案中，一個鏈具有3′突出端，另一個鏈是平端或者也具有突出端。各鏈突出端的長度可以相同或不同。為了進一步增強siRNA的穩(wěn)定性，可穩(wěn)定3′突出端對抗降解。在一個實施方案中，通過包含嘌呤核苷酸如腺苷或鳥苷核苷酸來穩(wěn)定RNA。或者，可以耐受修飾的類似物對嘧啶核苷酸的取代，例如2′-脫氧thyinidine對尿苷核苷酸3′突出端的取代，并且所述取代不影響RNAi的功效。不存在2′羥基顯著增強了突出端在組織培養(yǎng)物中的核酸酶抗性，可能在體內(nèi)有益。
RNAi構(gòu)建體還可以是長雙鏈RNA形式。在某些實施方案中，RNAi構(gòu)建體為至少25、50、100、200、300或400個堿基。在某些實施方案中，RNAi構(gòu)建體長度為400-800個堿基。例如，雙鏈RNA被細胞內(nèi)消化，例如在細胞內(nèi)產(chǎn)生siRNA序列。但是，在體內(nèi)使用長雙鏈RNA并不總是可行，推測是因為可由不依賴于序列的dsRNA反應(yīng)造成的有害作用。在該類實施方案中，優(yōu)選使用可降低干擾素或PKR作用的局部遞送系統(tǒng)和/或物質(zhì)。
或者，RNAi構(gòu)建體為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形狀(被稱為發(fā)夾RNA)。發(fā)夾RNA可以被外源性合成或者可以通過體內(nèi)轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶III啟動子形成。在例如Paddison等人，Genes Dev，2002，16948-58；McCaffrey等人，Nature，2002，41838-9；McManus等人，RNA，2002，8842-50；Yu等人，Proc Natl Acad Sci USA，2002，996047-52中描述了制備和將該類發(fā)夾RNA用于哺乳動物細胞中的基因沉默的實例。優(yōu)選地，在細胞或哺乳動物中改造該類發(fā)夾RNA以確保所需基因的連續(xù)和穩(wěn)定表達。本領(lǐng)域中已知可以通過在細胞中加工發(fā)夾RNA來制備siRNA。
PCT申請WO 01/77350描述了用于轉(zhuǎn)基因雙向轉(zhuǎn)錄以在真核細胞中產(chǎn)生該轉(zhuǎn)基因的有義和反義RNA轉(zhuǎn)錄物的載體的實例。因此，在某些實施方案中，對于最終的遞送，主題組合物包含具有以下獨特特性的重組載體其包含具有兩個相反取向排列的重疊轉(zhuǎn)錄單位且在側(cè)面連接有用于所關(guān)注的RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因的病毒復(fù)制子，其中所述的兩個重疊轉(zhuǎn)錄單位在主體細胞中由相同的轉(zhuǎn)基因片斷產(chǎn)生有義和反義RNA轉(zhuǎn)錄物。
V.商業(yè)方法本發(fā)明的其它方面為某些工商業(yè)方法做了準備。具體而言，實施本發(fā)明的方法使得可以得到新的治療組合物及其改良制劑。當與一種或多種另外的步驟相結(jié)合時，該技術(shù)步驟為進行藥學(xué)或優(yōu)選地生命科學(xué)工商業(yè)的新方法做了準備。例如，可以對用本發(fā)明的方法制備的治療組合物在各種疾病模型中作為治療劑的功效進行試驗，然后在制備、包裝和隨后將所得的用于治療疾病的制劑進行銷售之前對該治療組合物的可能毒性和其它安全性進行試驗?；蛘?，出于某些考慮也可以將研發(fā)和銷售所述制劑或進行所述步驟的權(quán)力授予第三方。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種進行藥學(xué)工商業(yè)的方法，其包括a.制備包含本文中所公開的任何組分的藥物組合物的制劑或藥盒；和b.銷售給健康護理提供者，在疾病或病癥的治療中使用所述的制劑或藥盒而獲益。
在其它實施方案中，本發(fā)明公開了一種進行藥學(xué)工商業(yè)的方法，其包括a.提供一種銷售本文中所公開的任何組分的藥物組合物的配送網(wǎng)絡(luò)；和b.為患者或醫(yī)生提供使用所述的制劑來治療疾病或病癥的使用說明材料。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種進行藥學(xué)工商業(yè)的方法，其包括a.確定本文中所公開的任何組分的藥物組合物的適宜制劑和劑量；b.在動物中進行步驟(a)中所確定的制劑在功效和毒性方面的治療性質(zhì)描述；和c.提供用于銷售步驟(b)中所確定的具有可接受的治療性質(zhì)的一種或多種制劑的配送網(wǎng)絡(luò)。
實施方案的另一個步驟包括提供向健康護理提供者銷售所述制劑的銷售團隊。
在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了一種進行藥學(xué)工商業(yè)的方法，其包括a.確定本文中所公開的任何組分的藥物組合物的適宜制劑和劑量；和
b.將進一步研發(fā)和銷售所述制劑的權(quán)利授予第三方。
實施例現(xiàn)在已經(jīng)對本發(fā)明進行了一般性描述，參考以下實施例可以更容易地理解本發(fā)明，給出這些實施例的目的僅僅是為了對本發(fā)明的某些方面和實施方案進行舉例說明，而并非旨在限制本發(fā)明。
實施例1聚乙烯亞胺(PEI)-環(huán)糊精軛合物的合成(Suh等人1992，J.Am.Chem.Soc.114 7916-7917) 將支化PEI(60mg，Aldrich Mw 25,000)溶解在DMSO(4mL)和脫氣的水(6mL)溶劑混合物中。在氬氣下向該溶液中加入環(huán)糊精單甲苯磺酸酯(928mg，Cyclodextrin Technologies Development，Inc.)。將該混合物于70℃下攪拌約1小時后，該渾濁的溶液變澄清。在該溫度、氬氣下48小時后，該溶液變成淺黃色。將溶液轉(zhuǎn)移到Spectra/Por MWCO 25,000膜中并用水透析6天。然后通過冷凍干燥除去水。將該溶液冷凍干燥后得到白色粉末(134mg)。根據(jù)1H NMR質(zhì)子積分計算環(huán)糊精/PEI比例。
實施例2可水解的聚乙烯亞胺(PEI)-環(huán)糊精軛合物的合成
Ahn等人2002Journal of Controlled Release80，273-282 如參考文獻Ahn等人2002Journal of Controlled Release80，273-282中所述合成可水解的PEI-PEG。將所得的可水解的PEI聚合物溶解在DMSO(4mL)和脫氣的水(6mL)溶劑混合物中。在氬氣下向該溶液中加入環(huán)糊精單甲苯磺酸酯(Cyclodextrin Technologies Development，Inc.)。然后，使反應(yīng)混合物沉淀到冷乙醚中并將產(chǎn)物在真空下干燥過夜。根據(jù)1H NMR質(zhì)子積分計算環(huán)糊精/PEI比例。
實施例3以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的線性聚乙二醇聚合物(CD-PEG)的合成通過將雙官能化的β-環(huán)糊精單體(A)與雙官能化的聚乙二醇共聚單體(B)聚合以得到ABAB產(chǎn)物來制備CD-PEG聚合物。該合成方法包括首先根據(jù)文獻方法(Gonzalez等人1999Bioconiugate Chem.101068-1074；和Hwang等人2001Bioconiugate Chem.12(2)280-290)制備雙官能化的β-環(huán)糊精(6A，6D-二脫氧-6A，6D-二(2-氨基乙硫基)-β-環(huán)糊精(稱為二半胱胺-β-環(huán)糊精)。用市售可得的雙官能化聚乙二醇來進行該聚合步驟。對三種方法進行了研究。
方法I使用二酸-聚乙二醇
合成具有不同分子量的二酸-PEG(Mw＝250、600、3000、6000)購自Fluka，Milwaukee，WI。在典型的實驗中，將PEG600-(COOH)2(0.096g，0.16mmol)溶解在pH 6.5的1mL 25mM MES緩沖液(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)中。向其中加入溶解在2mL 25mM MES緩沖液(pH 6.5)中的二半胱胺-β-環(huán)糊精(0.2g，0.16mmol)。然后，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(0.612g，3.2mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)和N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)(0.026g，0.12mmol，Pierce，Rockford，IL)。將所得溶液在室溫下攪拌過夜。然后，將該聚合物溶液轉(zhuǎn)移到Spectra/Por 7MWCO 10,000膜(Spectrum，Houston，TX)中并用水透析24小時。然后，將溶液冷凍干燥至干。得到272mg白色固體(收率93％)。
表征法光散射和分子量測定在磷酸鹽緩沖的鹽水1×(PBS)(Cellgro，Mediatech，Inc，Herndon，VA)中用Bausch & Lomb ABBE-3L折射儀測定比折射率(specific refractiveindex)增量，dn/dc。然后，在配有ERC-7512 RI檢測器、Precision DetectorsPD2020/DLS靜態(tài)光散射檢測器和PL aquagel-OH 30(polymerLaboratories，Amherst，MA)柱的Hitachi D6000 HPLC系統(tǒng)上分析聚合物樣品，用磷酸鹽緩沖的鹽水1×作為洗脫劑，流速為0.7ml/分鐘。在下表中報告了測得的各個樣品的dn/dc、重均分子量Mw和多分散性指數(shù)Mw/Mn。
表1CD-PEG聚合物的靜態(tài)光散射和分子量測定。

方法II使用二琥珀酰亞胺基丙酸酯聚乙二醇

合成將二琥珀酰亞胺基丙酸酯聚乙二醇(PEG3400-(SPA)2)(1.0854g，0.32mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)在5mL DMSO中的溶液加入到溶解在2mL DMSO中的二半胱胺-β-環(huán)糊精(0.4g，0.32mmol)溶液中。立即形成一種粘性溶液。然后，將該反應(yīng)混合物在氬氣、室溫下攪拌過夜。向其中加入乙醚以使聚合物沉淀，然后用移液管將其傾出。蒸除殘余的醚并將聚合物重新溶解在水中。然后，將所得溶液轉(zhuǎn)移到10,000MWCO Spectra/Por膜中并用水透析24小時。然后，將溶液冷凍干燥至干。得到1.329g白色固體(收率95％)。
表征法光散射和分子量測定用與上述相同的技術(shù)來表征該聚合物。計算得到的dn/dc為0.1316，測得的重均分子量Mw為184,000Da，多分散性指數(shù)Mw/Mn為2.18。
方法III使用二-苯并三唑碳酸酯聚乙二醇
合成將二-苯并三唑碳酸酯聚乙二醇(PEG3400-(BTC)2)(1g，0.32mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)在5mL DMSO中的溶液加入到溶解在2mL DMSO中的二半胱胺-β-環(huán)糊精(0.4g，0.32mmol)溶液中。立即形成一種粘性溶液。將該反應(yīng)混合物在氬氣、室溫下攪拌過夜。向其中加入乙醚以使聚合物沉淀，然后用移液管將其傾出。蒸除殘余的醚并將聚合物重新溶解在水中。然后，將所得溶液轉(zhuǎn)移到10,000 MWCO Spectra/Por膜中并用水透析24小時。然后，將溶液冷凍干燥至干。得到1.3g白色固體(收率95％)。
實施例4CD-PEG聚合物的分子量控制將二半胱胺-β-環(huán)糊精·2HCl(0.577g，0.46mmol)在真空下于100℃干燥16小時。然后，加入二琥珀酰亞胺基丙酸酯聚乙二醇(PEG3400-(SPA)2)(1.565g，0.46mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)。向該混合物中加入無水DMSO(8mL)。攪拌10分鐘后，在氬氣下加入DIEA(176μL，1.01mmol)。在選定的時間(15分鐘、30分鐘、60分鐘、1小時、2小時和5小時)取出一部分聚合溶液(1mL)。然后，將這些樣品轉(zhuǎn)移到10,000MWCO Spectra/Por膜中并用水透析24小時。然后，將溶液冷凍干燥至干。如上所述測定所得固體的MW。
如圖3所示，在5小時的時間過程中聚合物Mw增加至約80kDa?？梢詫⒕酆衔颩w控制在50至80kDa之間。
實施例5可水解的以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的線性聚乙二醇聚合(CD-PEG)的合成方法I使用NHS-HBA-CM-PEG3400-CM-HBA-NHS 將NHS-HBA-CM-PEG3400-CM-HBA-NHS(0.2g，0.06mmol，Shear-water Polymers，Inc，Huntsville，AL)在1.5mL DMSO中的溶液加入到溶解在2mL DMSO中的二半胱胺-β-環(huán)糊精(0.074g，0.06mmol)溶液中。將該反應(yīng)混合物在氬氣、室溫下攪拌過夜。將所得聚合物用乙醚沉淀、過濾并真空干燥。
方法II使用PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(PEG-(SS)2)
合成將二琥珀酰亞胺基琥珀酸酯聚乙二醇(PEG3400-(SS)2)(SunBio，Inc.，980-5 Kwan-yang Dong，Anyang City，韓國)(0.3mmol)在5mL DMSO中的溶液加入到溶解在2mL DMSO中的二半胱胺-β-環(huán)糊精(0.3mmol)溶液中。將該反應(yīng)混合物在氬氣、室溫下攪拌過夜。將所得聚合物用乙醚沉淀、過濾并真空干燥。
實施例6可水解的以環(huán)糊精為基礎(chǔ)的線性聚合物的合成 合成將乙二醇二[琥珀酰亞胺基琥珀酸酯](EGS)(0.2mmol，Pierce，Rockford，IL)在2mL DMSO中的溶液加入到在100℃下真空干燥并被溶解在1.5mL DMSO中的二半胱胺-β-環(huán)糊精(0.2mmol)溶液中。將該反應(yīng)混合物在氬氣、室溫下攪拌過夜。將所得的混合物用丙酮沉淀，過濾并真空干燥。
實施例7二金剛烷交聯(lián)劑二(2-(1-金剛烷基)乙基)磷酸酯的合成(Zhang等人1997，J.Am.Chem.Soc.119(7)1676-1681)
合成將無水吡啶(10mL，Aldrich，Milwaukee，WI)在冰浴中冷卻并向其中滴加二氯磷酸甲酯(1.488g，10mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將該混合物再冷卻15分鐘。在此期間，形成N-甲基吡啶鎓二氯磷酸鹽沉淀。向其中加入1-金剛烷乙醇(4.758g，26.4mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)，將密封的混合物在室溫下攪拌過夜。然后，將其倒入10％NaHCO3(50mL)中并在真空下蒸除吡啶。將該淺黃色固體溶解在1L水中并用乙醚萃取(三份，每份150mL)。將水相用2N HCl酸化至pH1，然后用每份150mL的三份CHCl3∶正-BuOH(7∶3)萃取。將合并的有機層(乙醚和CHCl3∶正-BuOH)用水洗滌并在該混合溶劑中形成淺黃色沉淀，這時，在真空下蒸除溶劑。形成淺黃色固體并用丙酮/己烷將其重結(jié)晶。將固體真空干燥，收率為60％。
表征法用1H NMR和13C NMR表征該產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ1.45-1.75(m，28H，-CH2-，金剛烷基)，1.95(m，6H，C-H，金剛烷基)，4.07(q，4H，-CH2-)和8.60(br，1H，POOH)。13C NMR(CDCl3，500MHz)δ28.59，31.77，37.02，42.52，43.96，44.02，64.21，64.26。還用質(zhì)譜電噴霧電離表征該產(chǎn)物421[M-H]-。
實施例8可水解的金剛烷交聯(lián)劑的合成
合成將1-金剛烷甲基胺(0.152g，0.92mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入到乙二醇二[琥珀酰亞胺基琥珀酸酯](EGS)(0.2g，0.43mmol，Pierce，Rockford，IL)在10mL無水二氯甲烷中的溶液中。將所得溶液在室溫下攪拌5小時。然后，用0.1N HCl將其酸化并用二氯甲烷進行萃取。將有機相用MgSO4干燥，然后將其在真空下濃縮至干。得到0.22g固體(收率為90％)。
表征法用質(zhì)譜電噴霧電離表征該產(chǎn)物557[M+H]+，579[M+Na]+，1135[2M+Na]+。
實施例9二金剛烷聚乙二醇交聯(lián)劑的合成對多種方法進行了研究方法I使用二酸-聚乙二醇 將1-金剛烷甲基胺(0.64mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入到溶解在二氯甲烷中的PEG-二酸(0.32mmol，F(xiàn)luka，Milwaukee，WI)中。向其中加入1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(3.2mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)并將所得溶液在室溫下攪拌過夜。將沉淀(二環(huán)己基異脲，DCU)濾出并用18％HCl洗滌濾液。將有機相用MgSO4干燥，然后在真空下濃縮至干。將所得固體重新溶解在水中以便使殘余的DCC沉淀。將DCC濾出并將濾液冷凍干燥。
方法II使用二琥珀酰亞胺基丙酸酯聚乙二醇
將1-金剛烷甲基胺(0.1g，0.60mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入到溶解在10mL二氯甲烷中的二琥珀酰亞胺基丙酸酯聚乙二醇(PEG3400-(SPA)2)(1.02g，0.30mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)中。將所得溶液在室溫下攪拌過夜。在真空下蒸除溶劑，將殘余物溶解在水中并離心以除去過量的1-金剛烷甲基胺。然后，將上清液轉(zhuǎn)移到1,000 MWCO Spectra/Por膜中并用水透析24小時。然后，將溶液冷凍干燥至干。得到0.88g固體(收率84％)。
方法III使用聚乙二醇(Sandier等人2000，Langmuir161634-1642) 通過在70℃、真空下加熱過夜干燥聚乙二醇(Mw＝1000)(1g，1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將其溶解在無水二氯甲烷(25mL)中后，將異氰酸1-金剛烷酯(0.39g，2.2mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入該干燥的聚乙二醇中。然后，向其中加入兩種催化劑，二月桂酸二丁基錫(63.2mg，0.1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)和三乙胺(10.1mg，0.1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將該反應(yīng)混合物在回流下加熱7小時。除去溶劑后，將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在蒸餾水中。通過加入活性炭并連續(xù)過濾將該水溶液進行純化，然后將其冷凍干燥。以70％的收率回收到所得聚合物并用1H NMR對其進行表征。
方法IV使用二-苯并三唑碳酸酯聚乙二醇
將1-金剛烷甲基胺(0.1g，0.60mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入到溶解在10mL二氯甲烷中的二苯并三唑碳酸酯聚乙二醇(PEG3400-(BTC)2)(1.02g，0.30mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)中。將所得溶液在室溫下攪拌過夜。在真空下蒸除溶劑，將殘余物溶解在水中并離心以除去過量的1-金剛烷甲基胺。然后，將上清液轉(zhuǎn)移到1,000 MWCOSpectra/Por膜中并用水透析24小時。然后，將溶液冷凍干燥至干。得到0.88g固體(收率為84％)。
實施例10可水解的二金剛烷聚乙二醇交聯(lián)劑的合成對多種方法進行了研究方法I使用聚乙二醇 通過在真空、70℃下加熱過夜干燥聚乙二醇(Mw＝1000)(1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將其溶解在無水甲苯(15mL)中后，將1-金剛烷乙酸(2.2mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入該干燥的聚乙二醇中。然后，向其中加入催化量的對-甲苯磺酸(Aldrich，Milwaukee，WI)。用Dean-Stark裝置將所得混合物共沸回流16小時。反應(yīng)完全后，在真空下除去溶劑并將所得聚合物用乙醚沉淀。
方法II使用二琥珀酰亞胺基琥珀酸酯聚乙二醇 將1-金剛烷甲基胺(0.1g，0.60mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入到溶解在10mL二氯甲烷中的二琥珀酰亞胺基琥珀酸酯聚乙二醇(PEG3400-(SS)2)(SunBio，Inc.，980-5 Kwan-yang Dong，Anyang City，S.Korea)(0.30mmol)中。將所得溶液在室溫下攪拌過夜。在真空下蒸除溶劑并將所得聚合物用乙醚沉淀。
實施例11三金剛烷交聯(lián)劑的合成 將1-金剛烷甲基胺(0.212g，1.29mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入到溶解在10mL無水二甲基甲酰胺(Aldrich，Milwaukee，WI)中的氨基三乙酸三琥珀酰亞胺基酯(TSAT)(0.2g，0.41mmol，Pierce，Rockford，IL)中。將所得混合物在室溫、氬氣下攪拌14小時。將沉淀濾出并用質(zhì)譜電噴霧電離表征633.4[M+H]+，655.6[M+Na]+，1265.3[2M+H]+，1287.1[2M+Na]+。
實施例12四金剛烷交聯(lián)劑的合成 將1-金剛烷甲基胺(0.212g，1.29mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入到溶解在5mL無水二甲基甲酰胺(Aldrich，Milwaukee，WI)中的四-(N-琥珀酰亞胺基羧基丙基)季戊四醇(NHS-4)(0.1g，0.12mmol，MolecularBiosciences，Boulder，CO)中。將所得混合物在室溫、氬氣下攪拌14小時。將沉淀濾出并用質(zhì)譜電噴霧電離表征1013.7[M+H]+，1035.8[M+Na]+。
實施例13四-金剛烷聚乙二醇交聯(lián)劑的合成方法I使用季戊四醇乙氧基化物(15/4 EO/OH)
通過在70℃、真空下加熱過夜干燥季戊四醇乙氧基化物(15/4 EO/OH)(Mn＝797)(1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將其溶解在無水二氯甲烷(25mL)中后，將異氰酸1-金剛烷酯(4.4mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入該干燥的聚合物中。然后，向其中加入兩種催化劑，二月桂酸二丁基錫(0.1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)和三乙胺(0.1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將反應(yīng)混合物在回流下加熱7小時。除去溶劑后，將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在蒸餾水中。通過加入活性炭并連續(xù)過濾將該水溶液進行純化，然后冷凍干燥。
方法II使用4臂PEG
通過在70℃、真空下加熱過夜干燥4臂PEG(Mn＝10000)(1mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)。將其溶解在無水二氯甲烷(25mL)中后，將異氰酸1-金剛烷酯(4.4mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入該干燥的聚合物中。然后，向其中加入兩種催化劑，二月桂酸二丁基錫(0.1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)和三乙胺(0.1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將反應(yīng)混合物在回流下加熱7小時。除去溶劑后，將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在蒸餾水中。通過加入活性炭并連續(xù)過濾將該水溶液進行純化，然后冷凍干燥。
實施例14可水解的四-金剛烷聚乙二醇交聯(lián)劑的合成方法I使用季戊四醇乙氧基化物(15/4 EO/OH) 通過在70℃、真空下加熱過夜干燥季戊四醇乙氧基化物(15/4 EO/OH)(Mn＝797)(1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將其溶解在無水甲苯中后，將1-金剛烷乙酸(4.4mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入該干燥的聚合物中。然后，向其中加入催化量的對-甲苯磺酸(Aldrich，Milwaukee，WI)。用Dean-Stark裝置將所得混合物共沸回流16小時。反應(yīng)完全后，在真空下除去溶劑并將所得聚合物用乙醚沉淀。
方法II使用4臂PEG 通過在70℃、真空下加熱過夜干燥4臂PEG(Mn＝10000)(1mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)。將其溶解在無水甲苯中后，將1-金剛烷乙酸(4.4mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入該干燥的聚合物中。然后，向其中加入催化量的對-甲苯磺酸(Aldrich，Milwaukee，WI)。用Dean-Stark裝置將所得混合物共沸回流16小時。反應(yīng)完全后，在真空下除去溶劑并將所得聚合物用乙醚沉淀。
方法III使用4-臂PEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(PEG-SS)4 將1-金剛烷甲基胺(0.069g，0.44mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入1g事先溶解在10mL二氯甲烷中的二琥珀酰亞胺基琥珀酸酯聚乙二醇((PEG10k-SS)4)(SunBio，Inc.，980-5 Kwan-yang Dong，Anyang City，韓國)(0.1mmol)中。將所得溶液在室溫下攪拌過夜。在真空下蒸除溶劑并將所得聚合物用乙醚沉淀。
實施例15八-金剛烷聚乙二醇交聯(lián)劑的合成 通過在70℃、真空下加熱過夜干燥8臂PEG(Mn＝10000)(1mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)。將其溶解在無水二氯甲烷(25mL)中后，將異氰酸1-金剛烷酯(4.4mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入該干燥的聚合物中。然后，向其中加入兩種催化劑，二月桂酸二丁基錫(0.1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)和三乙胺(0.1mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)。將反應(yīng)混合物在回流下加熱7小時。除去溶劑后，將反應(yīng)產(chǎn)物溶解在蒸餾水中。通過加入活性炭并連續(xù)過濾將該水溶液進行純化，然后冷凍干燥。
實施例16可水解的八-金剛烷聚乙二醇交聯(lián)劑的合成
通過在70℃、真空下加熱過夜干燥8臂PEG(Mn＝10000)(1mmol，Shearwater Polymers，Inc，Huntsville，AL)。將其溶解在無水甲苯中后，將1-金剛烷乙酸(4.4mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)加入該干燥的聚合物中。然后，向其中加入催化量的對-甲苯磺酸(Aldrich，Milwaukee，WI)。用Dean-Stark裝置將所得混合物共沸回流16小時。反應(yīng)完全后，在真空下除去溶劑并將所得聚合物用乙醚沉淀。
實施例17多金剛烷交聯(lián)劑的合成方法I使用支化PEI 將1-金剛烷乙酸(Aldrich，Milwaukee，WI)加入溶解在MES緩沖液25mM，pH 6.5中的PEI(Aldrich，Milwaukee，WI)中。然后，向該反應(yīng)混合物中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(Aldrich，Milwaukee，WI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(Aldrich，Milwaukee，WI)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時，然后轉(zhuǎn)移到10000MWCOSpectra/Por膜中并用水透析24小時。然后，將該溶液冷凍干燥至干。
方法II使用支鏈淀粉(Akiyoshi等人1993，Macromolecules263062-3068) 將異氰酸1-金剛烷酯(Aldrich，Milwaukee，WI)與支鏈淀粉(Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI)在含有吡啶的無水DMSO中于80℃下反應(yīng)8小時。向該反應(yīng)混合物中加入乙醇，并將所得混合物在4℃下貯存過夜。分離出沉淀，通過用水透析將其進行純化并冷凍干燥至干。用1H NMR測定金剛烷基的取代度。
實施例18可水解的多金剛烷交聯(lián)劑的合成(Sunamoto等人1992，Macromolecules255665-5670)
在60℃下，將支鏈淀粉(Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI)溶解在無水DMF中。將1-金剛烷碳酰氯(Aldrich，Milwaukee，WI)溶解在無水DMF中并向其中加入無水吡啶。將所得混合物在60℃下攪拌2小時并將其在室溫下再攪拌1小時。將混合物傾入乙醇中。收集沉淀并用乙醇、然后用乙醚洗滌。將該固體在50℃下真空干燥2小時。用1H NMR測定金剛烷基的取代度。
實施例19自交聯(lián)聚合物的合成含有環(huán)糊精和金剛烷官能團的聚合物的合成分三步進行。
1.步驟1單體6A，6D-二-(2-氨基-2-羧基乙硫基)-6A，6D-二脫氧-β-環(huán)糊精，(CD-二Cys)的合成 將167mL 0.1M碳酸鈉緩沖液在一個配有磁力攪拌棒、冷凝器和隔片的500mL 2-頸圓底燒瓶中脫氣45分鐘。向該溶液中加入1.96g(16.2mmol)L-半胱氨酸和10.0g(73.8mmol)二-碘-β-環(huán)糊精(Gonzalez 等人1999Bioconjugate Chem.101068-1074；和Hwang等人2001BioconjugateChem.12(2)280-290；Gonzalez，H.，Hwang，S.J.和Davis，M.E.(2000)線性環(huán)糊精共聚物WO 001734A1)。將所得混懸液在回流溫度下加熱4.5小時直至該溶液變得澄清、無色。然后，將其冷卻至室溫并用1N HCl酸化至pH 3。通過緩慢加入丙酮(該溶液的3倍重量比)使產(chǎn)物析出。得到9.0g(收率為90.0％)CD-二Cys。將所得固體用陰離子交換柱色譜進行處理，用0-0.4M碳酸氫銨溶液梯度洗脫。ESI/MS(m/z)1342[M]+，1364[M+Na]+。用HPLC測定CD-二Cys的純度。
2.步驟2CD-二Cys-PEG3400共聚物的合成 將CD-二Cys(2g，1.49mmol)和SPA-PEG3400-SPA(5.07g，1.49mmol，Shearwater Inc.)溶解在無水DMSO(40mL)中。10分鐘后，在氬氣下向其中加入二異丙基乙基胺(DIEA，0.571mL，2.2當量，Aldrich)。將該反應(yīng)混合物在氬氣下攪拌2-6天。觀察到粘度的增加是聚合時間的函數(shù)。在劇烈攪拌下向該聚合溶液中加入水(200mL)。然后，將該溶液在25,000MWCO Spectra/Por 7膜中在約10mg聚合物/mL水的濃度下透析2.5天。冷凍干燥后，得到松散的白色粉末(6.2g，收率為92％)。
表征法光散射和分子量測定在磷酸鹽緩沖的鹽水1×(PBS)(Cellgro，Mediatech，Inc，Herndon，VA)中用Bausch & Lomb ABBE-3L折射儀測定比折射率增量，dn/dc。然后，在配有ERC-7512 RI檢測器、Precision Detectors PD2020/DLS靜態(tài)光散射檢測器和PL aquagel-OH 30(Polymer Laboratories，Amherst，MA)柱的Hitachi D6000 HPLC系統(tǒng)上分析聚合物樣品，用磷酸鹽緩沖的鹽水1×作為洗脫劑，流速為0.7mL/分鐘。計算得到的dn/dc為0.1348，測得的重均分子量Mw為103,500Da，多分散性指數(shù)Mw/Mn為1.71。
3.金剛烷對CD-二Cys-PEG3400共聚物的軛合
將CD-二Cys-PEG3400共聚物(0.32mmol重復(fù)單位)溶解在干燥DMSO中并將其攪拌10分鐘。向該聚合物溶液中加入1-金剛烷甲基胺(0.76mmol，Aldrich，Milwaukee，WI)、DIEA(0.76mmol)、EDC(0.96mmol)和NHS(0.71mmol)。將該混合物攪拌約16小時。向所得混合物中加入水以除去過量的1-金剛烷甲基胺。過濾沉淀后，將溶液用水在10,000MWCOSpectra/Por膜中透析48小時并冷凍干燥至干。用1H NMR測定金剛烷基的取代度。
實施例20RGD-修飾的金剛烷-PEG衍生物的合成 步驟1VS-PEG5000-AD(2)的合成將乙烯基砜-PEG5000-NHS(1)(Shearwater Polymers，0.147mmol)加入配有攪拌棒的圓底燒瓶中并將其溶解在5mL DMSO中。向其中加入金剛烷甲基胺(Aldrich，0.147mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌1小時。將所得混合物用3500MWCO膜(Spectra Por)透析過夜。然后將該溶液冷凍干燥，得到乙烯基砜-PEG5000-AD(2)。
步驟2RGDpep-PEG-AD軛合物的合成將如Kok等人(Bioconjugate Chemistry(2002)，13(1)，128-135)所述合成的RGDpep-SH溶解在PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)1×，pH 7.2中。然后，將乙烯基砜-PEG5000-AD(2)加入該RGDpep-SH溶液中。將所得溶液在室溫下攪拌2小時。然后，將該聚合物溶液轉(zhuǎn)移到Spectra/Por 7 MWCO 3500膜(Spectrum，Houston，TX)中并用水透析24小時。然后，將該溶液冷凍干燥至干，得到RGDpep-PEG5000-AD(3)。
實施例21材料的制備將帶有包合主體的聚合物(實施例1-6)以100mg/mL溶解在PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)1×，pH 7.2中。然后，向其中加入交聯(lián)劑(實施例7-18)(比例金剛烷/環(huán)糊精1/1或1/2)。將所得混合物劇烈混合以得到在溶液中的交聯(lián)劑。在約10分鐘內(nèi)觀察到粘度增加。
實施例22離子型材料的制備使用多價離子將帶有包合主體和羧基的聚合物(見實施例19，步驟2)以100mg/mL溶解在0.1M CaCl2水溶液中，然后將其加入含有交聯(lián)劑混合物(實施例7-18)(比例金剛烷/環(huán)糊精1/1或1/2)的小瓶中。將所得混合物劇烈混合以得到在溶液中的交聯(lián)劑和二氨基化合物。觀察到粘度增加。
使用二氨基化合物將帶有包合主體和羧基的聚合物(見實施例19，步驟2)以100mg/mL溶解在水中，然后將其加入含有交聯(lián)劑(實施例7-18)(比例金剛烷/環(huán)糊精1/1或1/2)和二氨基化合物如PEG3400-(NH2)2(Shearwater Polymers)或CnH2n-(NH2)2(比例NH2/COO-1/1或1/2)混合物的小瓶中。將所得混合物劇烈混合以得到在溶液中的交聯(lián)劑和二氨基化合物。觀察到粘度增加。
使用聚陽離子將帶有包合主體和羧基的聚合物(見實施例19，步驟2)以100mg/mL溶解在水中，然后將其加入含有交聯(lián)劑(實施例7-18)(比例金剛烷/環(huán)糊精1/1或1/2)和聚陽離子如聚賴氨酸或聚乙烯亞胺的混合物的小瓶中。將所得混合物劇烈混合以得到在溶液中的交聯(lián)劑和聚陽離子。觀察到粘度增加。
實施例23含有病毒或蛋白質(zhì)的材料的制備將帶有包合主體的聚合物(實施例1-6)以所需濃度溶解在含有蛋白質(zhì)或病毒的PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)1×，pH 7.2中，得到終濃度為100mg/mL的聚合物溶液。然后，加入交聯(lián)劑(實施例7-18)(比例金剛烷/環(huán)糊精1/1或1/2)。將所得混合物劇烈混合以得到在溶液中的交聯(lián)劑。在約10分鐘內(nèi)觀察到粘度增加。
實施例24含有信號肽的材料的制備將帶有包合主體的聚合物(實施例1-6)以所需濃度溶解在PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)1×，pH 7.2(當需要時含有蛋白質(zhì)、病毒或其它藥物或藥物遞送系統(tǒng))中，得到終濃度為100mg/mL的聚合物溶液。然后，加入交聯(lián)劑(實施例7-18)(比例金剛烷/環(huán)糊精1/2)和信號肽(實施例20)(比例金剛烷/環(huán)糊精1/2)。將所得混合物劇烈混合以得到在溶液中的交聯(lián)劑。在約10分鐘內(nèi)觀察到粘度增加。
實施例25關(guān)于細胞通過基質(zhì)的移動性的研究a.如實施例21所述制備基質(zhì)(0.2mL，包含CD-PEG3400和二-(2(1-金剛烷基)乙基)磷酸酯)，將其加入FluoroBlok Inserts(用于24孔格式，F(xiàn)alconCatalog # 351152)的底部。
b.將CCD細胞用PBS洗滌，然后與5μM Calcein-AM(一種熒光標記物)接觸15-30分鐘。
c.然后，將CCD細胞進行胰蛋白酶消化，并且在0.5mL培養(yǎng)基中以10,000個細胞/Insert將其涂布于在Insert中的所述基質(zhì)的頂部。
d.然后，向下室中加入1mL含有10ng/mL人PDGF蛋白的培養(yǎng)基。
e.用熒光顯微鏡法對細胞通過基質(zhì)和進入下室的移動性監(jiān)測3天。通過在涂布后72小時用熒光顯微鏡法觀察到在下室中存在細胞證明了細胞通過基質(zhì)和穿過Insert的成功遷移，如圖5所示。
實施例26用基質(zhì)配制的CD-PEI聚合復(fù)合物進行的CCD成纖維細胞轉(zhuǎn)染研究將24-孔板的孔底用～0.2mL以下物質(zhì)涂布a.不涂布(對照)。
b.基質(zhì)。
c.含有1μg包含螢光素酶基因的質(zhì)粒的基質(zhì)。
d.含有CDP聚合復(fù)合物的基質(zhì)。
e.含有CDPEI聚合復(fù)合物的基質(zhì)。
f.不涂布。游離的CDPEI聚合復(fù)合物(陽性對照I常規(guī)轉(zhuǎn)染方法)。
g.不涂布。游離的CDP聚合復(fù)合物(陽性對照II常規(guī)轉(zhuǎn)染方法)。
將CCD(成纖維細胞，ATCC)以40,000個細胞/孔涂布在24孔板中。涂布細胞后24小時，取出培養(yǎng)基，將細胞用PBS洗滌并進行細胞裂解。用螢光素酶分析法對細胞裂解產(chǎn)物的螢光素酶蛋白活性進行分析。以RLU/孔報告結(jié)果。本實驗證明細胞能成功地遷移到基質(zhì)中并且可以被包含在所述基質(zhì)中的聚合復(fù)合物轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效率僅略低于培養(yǎng)基中游離的聚合復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。
注該基質(zhì)包含用二金剛烷交聯(lián)劑(二-(2(1-金剛烷基)乙基)磷酸酯，見合成方法的實施例7)交聯(lián)的CD-PEG(見實施例3，合成方法的方法II)?；|(zhì)制備方法如實施例21所述。當基質(zhì)中包含聚合復(fù)合物時，通過在最佳電荷比下向10μL包含螢光素酶基因的質(zhì)粒的溶液(0.1mg/mL)中加入10μL聚合物溶液制備聚合復(fù)合物。將聚合復(fù)合物包含在用于溶解基質(zhì)的CD-PEG組分的緩沖液中并如實施例21所述制備基質(zhì)。
對于陽性對照實驗，如所述的那樣制備聚合復(fù)合物并將其直接加入細胞培養(yǎng)基中。
實施例27如圖1所示，可以通過包含環(huán)糊精(CD)的聚合物(A)和末端具有能與該包含環(huán)糊精的聚合物形成包合絡(luò)合物的分子的二-或多-官能團連接物(B)的自我裝配來制備這些材料。可以將這些材料(P)制備成含有蛋白質(zhì)、細胞、病毒、聚合復(fù)合物或其它治療劑或含有治療劑的遞送系統(tǒng)。
可以根據(jù)Breslow和Zhang，JACS(1996)，118，8495-8496以及Zhang和Breslow，JACS(1993)，115，9353-9354中所述的方案來制備以下的舉例性連接物 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)對該方案進行修改從而得到一系列不同的可用作本文中所用術(shù)語所表示的連接分子的連接物。雙官能團連接物或包含環(huán)糊精的聚合物可以含有生物可降解的鍵以便有助于治療劑的釋放和/或該材料的降解。
如圖2所示，可以通過將包合絡(luò)合物客體與所關(guān)注的實體軛合并將該軛合物包含在所述材料中而將可增加該材料治療效用的化合物如信號肽或有助于細胞遷移的其它部分結(jié)合入材料中。該軛合物可以在交聯(lián)過程之前、期間或之后被包含在其中。
例如，由下式的重復(fù)亞單位組成的聚合物 例如其中單體的Mw為約4800，可以被制備成100mg/mL的該聚合物在PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水)1×，pH7.2中的溶液?？蓪⒒旌衔镫x心，然后將溶液進行攪拌以使聚合物溶解?？梢詫?3.3μL 132mg/mL的連接分子 在二氯甲烷中的溶液的等分試樣放置到小瓶中，使二氯甲烷在室溫下或在烘箱中于37℃下蒸發(fā)。然后，可以將1mL聚合物溶液加入殘余的連接物中，任選地對其進行研磨以有助于溶解。然后，可以將溶液靜置，在一段時間例如10分鐘后，溶液可變粘。為了將外來物質(zhì)如治療劑或病毒微粒包含在交聯(lián)聚合物中，可以在最后的靜置期之前使該物質(zhì)存在于溶液中。例如，該物質(zhì)可存在于用于溶解環(huán)糊精聚合物的溶劑中或存在于初始的連接分子的溶液中，或者可以在交聯(lián)反應(yīng)之前將其加入組分中或加入最終的溶液中。
實施例28方法和結(jié)果使用基質(zhì)1(根據(jù)實施例3，方法II制得的60kD聚合物和根據(jù)實施例9，方法II制得的交聯(lián)劑)和基質(zhì)2(根據(jù)實施例3，方法II制得的80kD聚合物和根據(jù)實施例9，方法II制得的交聯(lián)劑)。
60kD基質(zhì)的體內(nèi)應(yīng)用將300μl 60kD基質(zhì)吸入1cc注射器中并通過往復(fù)移動注射器活塞除去所有氣泡。23G針足夠大可以使該基質(zhì)在所需的一定壓力下通過。20G針足夠大可以使該基質(zhì)容易地通過。
將雄性Sprague-Dawley大鼠處死、刮毛并在其背部區(qū)域造成一個8mm的傷口。使用具有20G針的1cc注射器，排出過量的60kD基質(zhì)直至剩下100μL的體積。然后，將基質(zhì)應(yīng)用于8mm的傷口沖孔上，沒有任何滿溢。進行相同的操作，不同點在于使用150μl基質(zhì)1并且其滿溢大鼠背部皮膚上的8mm沖孔傷口。
研究了將基質(zhì)應(yīng)用于切開傷口上的可能性。在大鼠背部造成一個長度約2英寸的全層皮膚切口。在注射器中裝入200μL 60kD基質(zhì)并用20G針將其在切口部位成功地進行皮內(nèi)注射。
80kD基質(zhì)的應(yīng)用在大鼠背部造成兩個8mm的全層皮膚沖孔。將一個沖孔用1cc注射器和20G針以100μL 80kD基質(zhì)進行處理。使該體積均勻填充入該沖孔中；但是，與60kD基質(zhì)相比，遞送80kD的基質(zhì)需要更大的力。150μL 80kD基質(zhì)滿溢8mm的皮膚沖孔。通過皮內(nèi)注射成功地遞送了200μL 80kD基質(zhì)，但是完成該注射需要很大的力。
實施例29進行了研究以獲得用二-金剛烷-PEG(36.5mg/ml)(實施例9，方法II)交聯(lián)之前和之后CD-PEG3400基質(zhì)(100mg/ml)(實施例3，方法II)的初步流變學(xué)數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)與2.4mg/ml的膠原基質(zhì)(臨床前模型研究中使用的標準制劑之一)進行比較。
結(jié)果用無交聯(lián)劑的100mg/ml的CD-PEG3400聚合物進行了第一個系列的實驗。在各種恒定的應(yīng)變下進行頻率掃描。
圖7表示37℃下的頻率掃描。G″大于G′，導(dǎo)致tanδ為約3.2。如所預(yù)計的那樣，該聚合物溶液表現(xiàn)出最具粘性的特性。這一點可以通過作為頻率函數(shù)的G′的斜率得到證實。對于純粹的粘性流體，預(yù)計理論斜率為2，而對于純粹的彈性流體，預(yù)計在一定頻率范圍內(nèi)斜率為0。在結(jié)構(gòu)水平上，這些結(jié)果的解釋是聚合物分子通過某類弱相互作用而彼此相互作用。應(yīng)用于材料的能量可以通過移動相互作用的節(jié)點(旋轉(zhuǎn)、纏結(jié))而被分子彈性貯存。然后，這種能量的大部分被消散成熱。在10.0rad/s下，測得的該聚合物溶液的復(fù)數(shù)粘度為0.27Pa s。
圖8表示在20℃下的相同材料。觀察到在10rad/s下粘度增加至1.46Pa s。該值比37℃下的粘度高約7倍。
圖9表示用36.5mg/mL二-金剛烷-PEG交聯(lián)的CD-PEG3400聚合物的頻率掃描。加入該交聯(lián)劑將基質(zhì)的粘度增加了100倍以上，增加至約33.1Pas。同時，tanδ降低約3倍，降低至值為1.2，G′的斜率降至0.58。這些結(jié)果與彈性特性的增加相一致。在結(jié)構(gòu)上，在材料中聚合物的移動被限制，所應(yīng)用的能量可以以更有限的方式被貯存在網(wǎng)點之間。通過觀察到當將浸入的物體從該表面拉出時交聯(lián)的基質(zhì)具有拖長絲的趨勢也證明了這種特性。總之，粘力仍然占優(yōu)勢(tanδ＞1)(見圖11)。
圖10表示在20℃下的交聯(lián)的聚合物。粘度進一步增加至約50Pa s，而所有的其它特性仍然相似。
作為比較，圖11表示2.4mg/ml的膠原基質(zhì)的頻率掃描。在其凝固狀態(tài)(set state)(即在37℃下)下的膠原基質(zhì)表現(xiàn)出典型的凝膠特性，tanδ為0.14的低值，G′的斜率為0.07。在結(jié)構(gòu)上，這表示一種永久性的和有序排列的網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用的能量僅能在有限程度上被貯存于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點之間，并且在很大程度上被返回。該材料的復(fù)數(shù)粘度為12.8Pa s。
實施例30體外生物相容性實驗方法用根據(jù)實施例3，方法II制得的58kD環(huán)糊精(CD)聚合物和得自實施例9，方法II的交聯(lián)劑制備基質(zhì)。在制備該基質(zhì)時，將pEGFP DNA或GFCB病毒與該基質(zhì)混合在一起。配制低劑量和高劑量的DNA或病毒。各處理組在表2中列出。對于所有組，58kD環(huán)糊精基質(zhì)的終濃度均為100mg/mL。將各約100μL的各試劑用移液管移入48孔平底板中。將每個組一式兩份地進行試驗。將含有供試制劑的48-孔板在室溫下放置約30分鐘。將2.5×104CCD-1074sk細胞(人皮膚成纖維細胞)置于交聯(lián)基質(zhì)制劑的頂部，在體積為200μL的含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中。在進行細胞計數(shù)時，CCD-1074sk細胞系約70％融合，通過錐蟲藍染色發(fā)現(xiàn)細胞生存力大于95％。每天在倒置顯微鏡下檢查包括第1-8組的每個孔的細胞生存力和GFP熒光信號。在實驗開始后第4天和第8天向各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基(不進行替換)。將該板在37℃下用5％CO2進行溫育。
CD-lPEI的合成 將線性PEI25,000(500mg，Polysciences，Inc.)和6-單甲苯磺?；?β-環(huán)糊精(3.868g，Cyclodextrin Technologies Development，Inc.)溶解在36mLDMSO中。將所得混合物在70℃下攪拌6天。該溶液變成淺黃色。然后，將溶液轉(zhuǎn)移到Spectra/Por MWCO 10,000膜中并用水透析6天。然后通過冷凍干燥除去水，得到一種略微有色的固體。根據(jù)1H NMR質(zhì)子積分計算環(huán)糊精/PEI比例(Varian 300MHz，D2O)δ5.08ppm(s br.，CD的C1H)，3.3-4.1ppm(m br.CD的C2H-C6H)，2.5-3.2ppm(m br.PEI的CH2)。
β環(huán)糊精聚合物(CDP-咪唑)
根據(jù)以前所述的方法(Gonzalez，H.，Hwang，S.& Davis，M.(1999)Bioconjugate Chem.10，1068-74)合成βCDP。通過用4-咪唑乙酸(Aldrich，St.Louis，MO)將聚合物末端的伯胺酰胺化而將咪唑軛合在該βCDP聚合物上(Sehgal，D.& Vijay，I.(1994)Anal Biochem.218，87-91)。在典型的實驗中，將200mg(33.3μmol)βCDP溶解在800μL 25mM MES(pH 6.5)緩沖液中，向該緩沖液中加入4-咪唑乙酸鈉鹽水合物(49.3mg，0.333mmol)。用該溶液溶解1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)(0.128g，0.666mmol)。然后，向聚合物溶液中立即加入溶解在200μL 25mM MES(pH 6.5)緩沖液中的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(3.83mg，33.3μmol)。將所得溶液在室溫下攪拌24小時，然后用水在Spectra Por膜MWCO 1000中進行透析。將該溶液冷凍干燥至干。用TNBS分析測定咪唑含量(Hermanson，G.T.(1996)Bioconjugate Techniques，132頁，Academic Press，Rockford，IL)，然后進行UV測定以對未反應(yīng)的聚合物端基進行定量。咪唑軛合為73％。
表2處理組/孔(48-孔平底板)

結(jié)果第1天第1-4組開始死亡。它們開始從板上抬起。CCD-1074sk細胞在形態(tài)學(xué)上“聚集”并漂浮。第5-8組看起來健康。這些細胞附著在板上并且在形態(tài)學(xué)上“伸展”(成纖維細胞的典型狀態(tài))；但是，此時這些組中沒有任何一組具有GFP表達。見圖12。
第2天第5-8組看起來健康。CCD-1074sk細胞附著在板上并“伸展”。對于GFP表達，第5-6組(GFCB組)為陽性。高劑量的GFCB(第5組)比低劑量的GFCB(第6組)具有更多的GFP表達。此時，第1、3和4組看起來完全死亡；但是，在第2組(0.025mg/mL pEGFP+CDP-咪唑，在58kD環(huán)糊精中)中有數(shù)個細胞存活下來。在第1-4組中沒有可檢測到的GFP表達。
第4天第1-4組的CCD-1074sk細胞呈現(xiàn)死亡。細胞漂浮。在這些組的任何一個組中均未檢測到GFP表達。第5-8組健康。第5-6組GFP表達為陽性，并且顯示表達比第2天更活躍。
第5天第1-4組的CCD-1074sk細胞死亡并且未看到GFP表達。第5-8組健康。對于GFP表達，第5-6組為陽性并且顯示表達水平又比前一天更活躍。
第6天第1-4組的CCD-1074sk細胞死亡并且未看到GFP表達。不再對這些細胞進行監(jiān)測。第5-8組健康。第5-6組仍然表達GFP并且顯示表達水平比前一天更活躍。
第8天第5-8組的CCD-1074sk細胞看起來仍然健康。在形態(tài)學(xué)上，它們看起來與第6天沒有任何不同。它們?nèi)匀槐磉_GFP并且顯示處于所觀察到的最活躍的強度。
第12天第5-8組的CCD-1074sk細胞健康。細胞計數(shù)顯示比第8天略微更多；但是，顯示GFP表達下降。
第13天顯示第5-8組的CCD-1074sk細胞健康，但是GFP表達開始下降。
實施例29方法按照Insert Therapeutics，Inc的書面方案制備基質(zhì)A和基質(zhì)B的組分?；|(zhì)A是100mg/mL在pH 7.2的PBS中的β-環(huán)糊精-PEG3400聚合物(實施例3，方法II)和4.4mg/mL二-金剛烷化合物交聯(lián)劑(實施例9，方法II)。將兩種組分等分并分別保存直至使用。基質(zhì)B是100mg/mL在pH 7.2的PBS中的β-環(huán)糊精-PEG3400聚合物和36.5mg/mL二-金剛烷PEG3400化合物交聯(lián)劑。將兩種組分等分并分別保存。
對三種不同的遞送方法進行試驗1)用手術(shù)敷料將基質(zhì)A遞送至傷口部位和在用手術(shù)敷料覆蓋之前將基質(zhì)B遞送至傷口部位將ICR小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉。將背部區(qū)域的毛剃掉并造成兩個8mm的皮膚沖孔。將50μL基質(zhì)A(最終的調(diào)節(jié)體積)進行混合，其含有少量染料，然后將其置于一小方塊OpSite敷料上。使該基質(zhì)膠凝約2分鐘。在此期間，用Mastisol敷料粘合劑為小鼠左側(cè)傷口沖孔做準備。然后，將含有混合的基質(zhì)A的OpSite敷料翻轉(zhuǎn)(“粘性”面向下)并將其放置在左側(cè)傷口部位上。用Mastisol粘合劑敷料為右側(cè)傷口沖孔做準備。也以50μL的最終調(diào)節(jié)體積制備含有少量染料的基質(zhì)B并將其直接放置在右側(cè)傷口部位上。使其膠凝約2分鐘，然后用OpSite敷料覆蓋。使動物從該手術(shù)中恢復(fù)并在4天后將其處死。
2)通過預(yù)先應(yīng)用的手術(shù)敷料將預(yù)混合的基質(zhì)A和未預(yù)混合的基質(zhì)B遞送至傷口部位將ICR小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉。將背部區(qū)域的毛剃掉并造成兩個8mm的皮膚沖孔。用Mastisol粘合劑為兩個傷口部位做準備并將1單層OpSite敷料放置到傷口上。將基質(zhì)A制備成含有少量染料的50μL總注射體積。將該基質(zhì)直接吸入1cc注射器中并將一個23G針放置到該注射器上。將過量的基質(zhì)從注射器中排出直至剩下約50μL。然后，將該材料通過OpSite敷料注射到左側(cè)傷口床上。對于右側(cè)傷口，將基質(zhì)B制備成～100μL總注射體積。用含23G針的1cc注射器吸取約82μL基質(zhì)B。然后，將一個小空氣袋吸入注射器中。然后，將約18μL相伴的交聯(lián)劑吸入該注射器針中。再向該注射器中吸入另一個小空氣袋。最后，將少量(～2-4μL)染料吸入該注射器中。在右側(cè)傷口部位的一端放置27G針通過敷料以從被覆蓋的傷口部位排出空氣。將含有獨立的基質(zhì)B的組分的具有23G針的注射器通過敷料放置(未預(yù)混合組分)并將該材料注射到傷口部位。27G針為注射器中的小空氣袋提供了通氣。使動物從手術(shù)中恢復(fù)并在4天后將其處死。
3)使用各種型號的針將基質(zhì)A和B注射到PVA海綿中將HSD大鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉并將PVA海綿皮下植入到大鼠的腹側(cè)。用傷口夾將切口閉合并使動物恢復(fù)4天。配制基質(zhì)A，調(diào)整的注射體積為～200μL，含有染料(～2-4μL)。通過22G針將該基質(zhì)混合物吸入1cc注射器中并將其在注射器中混合。努力除去過量的氣泡。將混合的基質(zhì)注射到被處死的動物的PVA海綿的中心。數(shù)分鐘后，將傷口部位打開并對海綿區(qū)域進行檢查。
將基質(zhì)B制備成～200μL注射劑。該基質(zhì)含有少量染料并用22G針將其吸入1cc注射器中，將該針取下并用更短的23G針代替22G針用于注射。將該材料在注射器中混合并努力除去過量的氣泡。將材料注射到PVA海綿的中心，使之停留數(shù)分鐘，然后將動物打開以對注射的海綿進行檢查。
結(jié)果1)用手術(shù)敷料將基質(zhì)A遞送至傷口部位和在用手術(shù)敷料覆蓋之前將基質(zhì)B遞送至傷口部位將50μL基質(zhì)A(最終的調(diào)節(jié)體積)與少量染料混合，將其置于一小方?jīng)QOpSite敷料上，使該基質(zhì)膠凝短時間(～2分鐘)，然后翻轉(zhuǎn)(“粘性”面向下)放置在左側(cè)傷口部位上。在手術(shù)后4天將動物處死時，該傷口呈現(xiàn)干狀態(tài)并且觀察到動物毫無困難地耐受基質(zhì)A?；|(zhì)仍保持在其遞送時的初始位置，即位于包括一些周圍未受傷組織在內(nèi)的傷口部位的頂部。保留在傷口部位的基質(zhì)比手術(shù)當天淺且量小。在傷口部位沒有出現(xiàn)肉眼可見的炎癥。見圖12A-12B。
也以50μL的最終調(diào)節(jié)體積制備含有少量染料的基質(zhì)B并將其直接放到右側(cè)傷口部位上，然后用OpSite敷料覆蓋。當4天后處死動物時，該傷口呈現(xiàn)干狀態(tài)并且動物似乎良好地耐受基質(zhì)B。在傷口部位周圍肉眼未見炎癥或任何其它不良作用。在手術(shù)后，基質(zhì)未分散到周圍組織，而是仍然保持在最初的傷口部位。處死時仍然保留在傷口部位的基質(zhì)比手術(shù)當天淺且量小。見圖12A-12B。
2)通過預(yù)先應(yīng)用的手術(shù)敷料將預(yù)混合的基質(zhì)A和未預(yù)混合的基質(zhì)B遞送至傷口部位將50μL基質(zhì)A(最終的調(diào)節(jié)體積)與少量染料混合，然后將其直接注射到OpSite敷料下和左側(cè)傷口部位上?；|(zhì)保留在傷口部位局部，未分散到周圍未受傷的組織。由于注射器中有氣泡，不能精確測量給藥體積。在手術(shù)后4天將動物處死時，傷口呈現(xiàn)干狀態(tài)并且動物耐受基質(zhì)A，沒有任何可觀察到的不良作用?；|(zhì)仍保持在其遞送時的初始位置，即位于包括一些周圍未受傷組織在內(nèi)的傷口部位。手術(shù)后基質(zhì)未分散到其它周圍組織；但是，基質(zhì)僅在傷口表面上且比手術(shù)時量小。在用肉眼檢查時，在傷口部位未觀察到炎癥。見圖13A-13B。
將100μL終體積的含有少量染料的基質(zhì)B吸入注射器中。將該基質(zhì)的各組分(聚合物、交聯(lián)劑和染料)分別吸入注射器中，用空氣袋將各組分分離開。將用于消除注射器中的空氣袋的通氣針通過敷料放置在傷口的一端并在未預(yù)先混合的情況下將基質(zhì)B的各獨立的組分通過OpSite敷料直接注射到右側(cè)傷口部位上。這種方法需要最小量的壓力將基質(zhì)成功注射到傷口部位，通氣針用來消除皮膚下的空氣袋。一旦將基質(zhì)B的所有組分均遞送至傷口部位，則該基質(zhì)迅速膠凝，由可見的消除和接觸可知，沒有基質(zhì)泄漏到敷料外。該基質(zhì)保留在傷口床局部，目測觀察未擴展到周圍組織。當4天后處死動物時，傷口呈現(xiàn)干狀態(tài)并且動物似乎耐受基質(zhì)B，沒有肉眼可見的不良作用。在傷口部位周圍沒有觀察到炎癥或任何其它不良作用，并且顯示基質(zhì)保持在局部傷口部位?；|(zhì)位于傷口表面并且比最初注射時量少。見圖13A-13B。
3)使用各種型號的針將基質(zhì)A和B注射到PVA海綿中制備含有少量染料的基質(zhì)A并通過22G針將其吸入1cc注射器中。將約200μL基質(zhì)注射到PVA海綿中，使其停留數(shù)分鐘，然后將動物打開進行檢查。在對海綿進行檢查時，該基質(zhì)仍保留在局部，具有最低程度的向周圍區(qū)域的分散。
制備基質(zhì)B，將其與少量染料混合，然后用22G針將其吸入1cc注射器中。用更短的23G針(1英寸)代替22G針(11/2英寸)。將約200μL基質(zhì)注射到PVA海綿中，使其停留數(shù)分鐘，然后將動物打開進行檢查。在對海綿進行進一步檢查時，顯示該基質(zhì)仍保留在局部，具有最低程度的向周圍區(qū)域的分散。
結(jié)論基質(zhì)A和基質(zhì)B均十分迅速地膠凝并且非常粘稠。盡管可以將基質(zhì)皮下注射和將其注射到PVA海綿中，但最容易的遞送方法是將基質(zhì)的各組分單獨地(用小空氣袋分離開)吸入射器中，然后用23G針通過覆蓋的皮膚沖孔將其直接注射。在這種方法中，第二個更小號的針可以幫助將過量空氣從傷口敷料下排出。
實施例30已經(jīng)表明血小板衍生的生長因子B(PDGF-B)可以刺激成纖維細胞增殖和胞外基質(zhì)合成。在大鼠PVA海綿模型中通過RT-PCR比較環(huán)糊精和膠原基質(zhì)的PDGF-B表達。

方法造成六個小切口(0.5cm)并將聚乙烯醇(PVA，M-PACT)海綿皮下植入雄性Harlan Sprague-Dawley大鼠的腹側(cè)。植入后4天，如上所述將供試材料和對照材料用vPBS和液體膠原(Cohesion Technologies)或58kD環(huán)糊精(CD)-金剛烷基質(zhì)稀釋并將其注射到PVA海綿中。最終的膠原制劑為1.8mg/mL，用NaOH調(diào)pH，并用vPBS補充至所需體積。最終的58kD環(huán)糊精(CD)-金剛烷基質(zhì)制劑為100mg/mL。向每個海綿中遞送200μL總體積的供試試劑。注射后2天將動物處死并取出海綿。將海綿切成三塊，將大部分海綿(～70-80％)冷凍在液氮中并貯存在-80℃下以進行QPCR和QRT-PCR分析。將小部分海綿在4％PFA中于4℃下固定18小時、石蠟包埋并切片(5μm)。將切片用Masson′s Trichrome(細胞＝黑色，脈管系統(tǒng)＝紅色，膠原＝藍色)和蘇木精-伊紅法染色。由兩名獨立的研究人員用顯微鏡法對組織切片進行粗略(gross)組織學(xué)分析。
結(jié)果用膠原、環(huán)糊精基質(zhì)(CD)、在膠原中的2×1010PN PGCB、在CD中的2×1010PN PGCB、在CD中的50μg pCTK-PD+L-PEI或在CD中的50μg pCTK-PD+CD咪唑處理植入的PVA海綿。處理后48小時取出海綿，分別用QRT-PCR和QPCR方法對人PDGF-B RNA和病毒DNA進行分析。還將每個海綿的一部分固定、包埋、切片并用Masson′s Trichrome染色以進行粗略形態(tài)學(xué)檢查。
用于人PDGF-B RNA表達的QRT-PCR(定量RT-PCR)分析表明用在CD中的2×1010PN PGCB處理的海綿具有最高的平均RNA含量，為7.0×108MEQ PDGF-B/分析的海綿(圖14)。用在膠原中的2×1010PN PGCB處理的海綿具有相似的PDGF-B RNA平均水平，為3.2×108MEQPDGF-B/分析的海綿。用在CD中的50μg pCTK-PD+L-PEI和在CD中的50μg pCTK-PD CD咪唑處理的海綿分別具有6.8×105和9.1×104MEQPDGF-B/分析的海綿的PDGF-B RNA水平。最后，用膠原或環(huán)糊精處理的海綿沒有表現(xiàn)出可檢測到的PDGF-B RNA水平(圖14，表3)。t檢驗分析表明除了在膠原中的2×1010PN PGCB和在CD中的2×1010PN PGCB之間的海綿比較外，所有的海綿處理組均有統(tǒng)計學(xué)差異(p≤0.05)。還進行了GAPDH QRT-PCR對照分析以監(jiān)測每個樣品的RNA性質(zhì)和總RNA。對于所有處理組，結(jié)果顯示出一致的RNA量，為1.9×107至6.9×107MEQGAPDH/分析的海綿(圖15)。
表3hPDGF-B RNA檢測的QRT-PCR結(jié)果

BQL＝低于定量水平(＜2×103MEQ PDGF-B/分析的海綿)MEQ＝分子當量是根據(jù)陽性對照的稀釋因子隨意給定的數(shù)。
表4處理組之間的hPDGF-B RNA統(tǒng)計學(xué)分析

注不能進行膠原和58kD CD處理組的統(tǒng)計學(xué)分析。
人PDGF-B DNA的QPCR(定量PCR)分析表明用在CD中的50μgpCTK-PD+L-PEI和在CD中的50μg pCTK-PD+CD咪唑處理的海綿具有最高的平均水平，分別為2.4×1012和1.7×1012MEQ PDGF-B/分析的海綿(圖16，表5)。用在膠原中的2×1010PN PGCB和在CD中的2×1010PNPGCB處理的海綿具有分別為4.5×1010和4.1×1010MEQ PDGF-B/分析的海綿的平均人PDGF-B DNA水平。但是，用膠原或環(huán)糊精處理的海綿也具有陽性PDGF-B DNA水平，分別為9.8×108和1.3×108MEQPDGF-B/分析的海綿。t-檢驗分析表明除膠原和環(huán)糊精的處理組之間以及在膠原中的2×1010PN PGCB和在CD中的2×1010PN PGCB的處理組之間的海綿比較外，所有組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(p≤0.05)(表6)。進行小鼠GAPDH定量以確證DNA性質(zhì)和等量的DNA輸入，結(jié)果為9.4×108至2.8×109MEQ GAPDH/分析的海綿(圖17)。
表5海綿內(nèi)病毒PDGF-B檢測的PCR結(jié)果

表6海綿內(nèi)人PDGF-B DNA含量的統(tǒng)計學(xué)分析

QPCR結(jié)果表明在膠原和環(huán)糊精對照海綿中檢測到顯著水平的PDGF-B DNA。還沒有完全確定造成這種觀察結(jié)果的原因；但是，六鄰體QPCR結(jié)果(僅檢測包含在腺病毒中的六鄰體序列)表明對照海綿中檢測到的DNA來自PCTK-PD質(zhì)粒(圖18)。因為在對照海綿中沒有檢測到PDGF-B RNA，所以這表明在收集海綿時或者在收集海綿后最可能發(fā)生污染。
表7PVA海綿形態(tài)學(xué)分析概述

由兩名獨立的觀察人員對5μm、Masson′s Trichrome染色的石蠟切片進行分析。除囊大小外，用以下標準對所有類型的海綿特性進行定量評估最?。驾p微＜中等＜嚴重＜重度。用以下標準對囊大小進行評估?。贾械龋己瘢挤浅：瘛?br> 進行海綿形態(tài)學(xué)分析以評價主體的免疫反應(yīng)。雖然該研究被設(shè)計為用基因表達和炎癥作為主要終點，但是當存在時也對肉芽組織形成、膠原沉積和新血管形成進行分析。在收獲時，用在CD中的2×1010PN PGCB處理的海綿在海綿中和海綿周圍具有可觀察到的和數(shù)量增多的滲出物(表7，圖19)。這些海綿在尺寸上也比其它組更大。粗略組織學(xué)檢查表明用在CD中的2×1010PN PGCB處理的海綿具有重度的免疫反應(yīng)，特征為厚的囊和存在細胞浸潤。也對肉芽組織、膠原和新血管形成進行了觀察。用在膠原中的2×1010PN PGCB處理的海綿也表現(xiàn)出肉芽組織形成、膠原沉積和新血管形成；但是，其免疫反應(yīng)不象用在CD中的PGCB處理的海綿那樣嚴重。用單獨的環(huán)糊精、在CD中的50μg pCTK-PD+L-PEI或在CD中的50μg pCTK-PD+CD咪唑處理的海綿均具有有最小量肉芽組織的相似結(jié)果。在這些處理組中發(fā)現(xiàn)的全部免疫反應(yīng)與用在膠原中的PGCB處理的海綿相似。最后，發(fā)現(xiàn)僅用膠原處理的海綿具有最小量的組織、膠原或脈管系統(tǒng)以及最小的免疫反應(yīng)。
在此將以上引用的所有參考文獻和公開物引入作為參考。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到或者能夠僅使用常規(guī)實驗來確定本文中所述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等同方案。該類等同方案也應(yīng)包括在以下的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種聚合物組合物，其包含含有多個包合主體的線性生物相容性聚合物和連接分子，每個連接分子包含至少兩個與該包合主體形成包合絡(luò)合物的部分，其中所述的連接分子與所述的聚合物進行交聯(lián)。
2.權(quán)利要求1的聚合物組合物，其中所述的包合主體是環(huán)糊精部分。
3.權(quán)利要求1的聚合物組合物，其還包含至少一種生物學(xué)活性化合物或其前體藥物形式。
4.權(quán)利要求3的聚合物組合物，其中所述的生物學(xué)活性化合物是核酸。
5.權(quán)利要求4的聚合物組合物，其中所述的核酸在選自病毒、聚合物和脂質(zhì)體的遞送系統(tǒng)中被提供。
6.用核酸轉(zhuǎn)染細胞的方法，其包括使細胞與權(quán)利要求4的聚合物組合物接觸。
7.權(quán)利要求3的聚合物組合物，其中所述的化合物是多肽或有機小分子。
8.將生物學(xué)活性化合物施用于患者的方法，其包括對患者施用權(quán)利要求3的聚合物組合物。
9.權(quán)利要求3的聚合物組合物，其中所述的化合物是蛋白質(zhì)或多肽。
10.權(quán)利要求3的聚合物組合物，其中所述的生物學(xué)活性化合物或其前體藥物形式在遞送系統(tǒng)中被提供。
11.權(quán)利要求10的聚合物組合物，其中所述的遞送系統(tǒng)選自微粒和脂質(zhì)體。
12.權(quán)利要求3的聚合物組合物，其中所述的生物學(xué)活性化合物共價連接到與所述的包合主體形成包合絡(luò)合物的部分上。
13.權(quán)利要求1的聚合物組合物，其還包含至少一種輔劑。
14.權(quán)利要求3的聚合物組合物，其還包含增加所述生物學(xué)活性劑功效的輔劑。
15.一種聚合物組合物，其包含含有多個包合主體的生物相容性的、生物可降解的聚合物和連接分子，每個連接分子包含至少兩個與該包合主體形成包合絡(luò)合物的部分，其中所述的連接分子與所述的聚合物進行交聯(lián)。
16.一種聚合物組合物，其包含含有多個包合主體的生物相容性聚合物和連接分子，每個連接分子包含至少三個與該包合主體形成包合絡(luò)合物的部分，其中所述的連接分子與所述的聚合物進行交聯(lián)。
17.一種聚合物組合物，其包含含有多個環(huán)糊精部分的生物相容性聚合物和連接分子，每個連接分子包含至少兩個與該環(huán)糊精部分形成包合絡(luò)合物的部分，其中每個環(huán)糊精部分具有不超過兩個與該聚合物主鏈相連接的鍵，并且所述的連接分子與所述的聚合物進行交聯(lián)。
18.一種治療組合物，其包含a)含有多個包合主體的生物相容性聚合物，b)連接分子，每個連接分子包含至少兩個與該包合主體形成包合絡(luò)合物的部分，和c)治療劑，其中所述的連接分子與所述的聚合物進行交聯(lián)。
19.一種制備交聯(lián)聚合物的方法，其包括將含有包合主體的線性生物相容性聚合物與連接分子相結(jié)合，每個連接分子包含至少兩個與該包合主體形成包合絡(luò)合物的部分。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的包合主體是環(huán)糊精。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述的聚合物和所述的連接分子于生物學(xué)活性劑存在下相結(jié)合。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的生物學(xué)活性劑被共價連接到與所述的包合主體形成包合絡(luò)合物的部分上。
23.一種制備交聯(lián)聚合物的方法，其包括將含有包合客體的聚合物與連接分子相結(jié)合，每個連接分子包含至少兩個與該包合客體形成包合絡(luò)合物的包合主體。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述的包合主體是環(huán)糊精。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述的聚合物和所述的連接分子于生物學(xué)活性劑存在下相結(jié)合。
26.一種治療疾病的方法，其包括對患者施用適于治療該疾病的物質(zhì)和與之結(jié)合的權(quán)利要求1的聚合物組合物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述的疾病是癌癥。
28.一種處理傷口的方法，其包括將權(quán)利要求1的聚合物組合物應(yīng)用于傷口。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的組合物還包含治療劑。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的治療劑是編碼PDGF-B的核酸。
全文摘要
本申請公開了用于攜帶藥物和其它活性劑如核酸的環(huán)糊精修飾的材料。還公開了在控制條件下可釋放所述活性劑的環(huán)糊精修飾的材料的組合物。本發(fā)明還公開了與用于幫助將藥物遞送至其作用部位的生物識別分子相結(jié)合的環(huán)糊精修飾的聚合物載體的組合物。
文檔編號A61L31/16GK1717209SQ200380104567
公開日2006年1月4日 申請日期2003年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月9日
發(fā)明者N·C·貝洛克, M·E·戴維斯, S·H·普 申請人:植入療法公司