專利名稱：用于治療或預(yù)防血管生成－依賴性癥狀的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用通過在特定的條件下如在肌肉內(nèi)增加的壓力或高壓氧經(jīng)肌肉內(nèi)注射裸質(zhì)粒DNA用于治療和/或預(yù)防血管生成-依賴性癥狀的方法。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)的最近進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致發(fā)展基因治療作為一種新的心血管疾病治療策略。目標(biāo)疾病從單基因缺陷疾病到更復(fù)雜的成人疾病，如外周動脈疾病。例如，據(jù)估計嚴(yán)重的肢體缺血(critical limb ischemia)每年以500～1000/百萬個體發(fā)作(“Second European Consensus Document on ChronicCritical Leg Ischemia.”，Circulation 84(4 Suppl.)IV 1-26(1991))。在嚴(yán)重的肢體缺血病人中，截肢，盡管有其相關(guān)的不健全、死亡率以及功能性牽連，通常仍被推薦為對抗殘廢癥狀的解決方案(M.R.Tyrrell等，Br.J.Surg.80177-180(1993)；M.Eneroth等，Int.Orthop.16383-387(1992))。目前還沒有針對嚴(yán)重的肢體缺血的最佳醫(yī)學(xué)治療(Circulation 84(4 Suppl.)IV1-26(1991))。
最近，最近已經(jīng)報道了經(jīng)基因轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的治療性血管生成功效對患有嚴(yán)重的肢體缺血(I.Baumgartner等，Circulation 971114-1123(1998)；J.M.Isner等，J.Vasc.Surg.28964-973(1998)；I.Baumgartner等，Ann.Intern.Med.132880-884(2000))以及心肌缺血(D.W.Losordo等，Circulation 982800-2804(1998)；P.R.Vale等，Circulation 102965-974(2000)；T.K.Rosengart等，Circulation 100468-474(1999)；T.K.Rosengart等，Ann.Surg.230466-470(1999))的病人有效。除了VEGF以外，其他血管生成生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)以及缺氧(hypoxia)-可誘導(dǎo)的因子(HIF)的基因轉(zhuǎn)移，也已經(jīng)報道能刺激側(cè)支形成(Y.Taniyama等，Gene Ther.8181-189(2000)；H.Tabata等，Cardiovasc.Res.35470-479(1997)；H.Ueno等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.172453-2460(1997)；K.A.Vincent等，Circulation 1022255-2261(2000)；F.J.Giordano等，Nat.Med.2534-539(1996)；M.Aoki等，Gene Ther.7417-427(2000)；H.Ueda等，Ann.Thorac.Surg.671726-1731(1999)；E.R.Schwarz等，J.Am.Coll.Cardiol.351323-1330(2000))。
利用血管生成生長因子的基因治療進(jìn)行治療外周動脈疾病的可行性似乎優(yōu)于重組蛋白治療。例如，通過基因治療，可能潛在地維持長時間的最佳的高以及局部的濃度。因此，在治療性血管生成的情形下，為了避免副作用，有利地在數(shù)天或更長的期間內(nèi)通過動脈中積極地表達(dá)的轉(zhuǎn)基因輸送較低劑量的蛋白，代替施用單或多次推注劑量的重組蛋白。有趣地，大多數(shù)成功的利用血管生成生長因子治療外周動脈疾病的臨床實驗涉及肌肉內(nèi)轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA(I.Baumgartner等，Circulation 971114-1123(1998)；J.M.Isner等，J.Vasc.Surg.28964-973(1998)；I.Baumgartner等，Ann.Intern.Med.132880-884(2000)；D.W.Losordo等，Circulation 982800-2804(1998)；P.R.Vale等，Circulation 102965-974(2000))。但是，這種通過直接注射“裸”質(zhì)粒DNA進(jìn)入骨骼肌肉的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，已經(jīng)知道是低效率的。
因此，本領(lǐng)域需要更有效的基因轉(zhuǎn)移方法用于治療應(yīng)用。因此，許多研究者著眼于替代性的方法，如腺病毒基因轉(zhuǎn)移方法(H.Ueno等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.172453-2460(1997)；F.J.Giordano等，Nat.Med.2534-539(1996)；D.F.Lazarous等，Cardiovasc.Res.44294-302(1999)；L.Y.Lee等，Ann.Thorac.Surg.6914-23(2000)；L.H.Gowdak等，Circulation 102565-571(2000)；O.Varenne等，Hum.Gene Ther.101105-1115(1999)；E.Barr等，Gene Ther.151-58(1994))。盡管腺病毒載體是有效的(H.Ueno等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.172453-2460(1997)；F.J.Giordano等，Nat.Med.2534-539(1996)；D.F.Lazarous等，Cardiovasc.Res.44294-302(1999)；L.Y.Lee等，Ann.Thorac.Surg.6914-23(2000)；L.H.Gowdak等，Circulation102565-571(2000)；O.Varenne等，Hum.Gene Ther.101105-1115(1999)；E.Barr等，Gene Ther.151-58(1994))，也存在一些理論上缺點，如在宿主中導(dǎo)入強(qiáng)的免疫原性(V.J.Dzau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311421-11425(1996))。除了效率以外，安全性也是基因轉(zhuǎn)移方法中必須考量的一個重要議題。最近已經(jīng)報道病毒的輸注引起有害的副作用(E.Marshall，Science 2862244-2245(1999))。因此，從安全性的角度考慮，更需要制備更有效地實現(xiàn)外周動脈疾病的理想治療的非病毒介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA?；谫|(zhì)粒DNA-基因轉(zhuǎn)移的這些創(chuàng)新將提供具有高轉(zhuǎn)染效率且無嚴(yán)重副作用的方法。
為了增加裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率，本發(fā)明者先前檢測了利用超聲以及超聲造影(echo contrast)微氣泡(Optison(FS069)；Molecular Biosystems)。結(jié)果，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)利用超聲造影微氣泡進(jìn)行的超聲介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染可以實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率(Y.Taniyama等，Circulation 1051233-1239(2002)；Y.Taniyama等，Gene Ther.9372-380(2002))。在微氣泡超聲造影劑存在下利用超聲暴露，報道了在體外實驗中在裸DNA轉(zhuǎn)染后有約300-倍轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增加(A.Lawrie等，Gene Ther.9372-380(2002))。此外，本發(fā)明者證實用Optison進(jìn)行超聲-介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入大鼠骨骼肌肌肉以及大鼠頸動脈的有效性(Y.Taniyama等，Circulation 1051233-1239(2002)；Y.Taniyama等，GeneTher.9372-380(2002))。由于通過氣泡的擴(kuò)展在細(xì)胞膜中出現(xiàn)了瞬時的微孔，這種方法增加了轉(zhuǎn)染效率。
發(fā)明公開盡管通過經(jīng)肌肉內(nèi)注射裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染血管生成生長因子刺激血管生成的臨床實驗已經(jīng)成功，在人基因治療中仍然存在未解決的問題，包括低轉(zhuǎn)染效率和安全性。從這個角度而言，能實現(xiàn)裸質(zhì)粒DNA較高的轉(zhuǎn)染效率的方法是本技術(shù)領(lǐng)域中需要的。
本發(fā)明的目的在于提供一種治療和/或預(yù)防血管生成-依賴性癥狀的方法，通過高轉(zhuǎn)染效率地施用裸質(zhì)粒DNA。如上所述，本發(fā)明者先前考察了利用超聲造影微氣泡進(jìn)行的超聲介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染?；诶迷摲椒▽崿F(xiàn)的有效轉(zhuǎn)染，本發(fā)明者認(rèn)為通過高的滲透壓去穩(wěn)化細(xì)胞膜可能增加裸質(zhì)粒DNA方法的轉(zhuǎn)染效率。因此，本發(fā)明者考察了多種試劑以及對注射部位的壓力對裸質(zhì)粒DNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的影響。
首先，本發(fā)明者考察了注射體積對裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入骨骼肌肉細(xì)胞的效率的影響。溶解在多種體積的溶劑中的螢光素酶質(zhì)粒DNA經(jīng)肌肉內(nèi)注射進(jìn)入大鼠后肢中。根據(jù)目前的數(shù)據(jù)，裸質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率似乎由質(zhì)粒DNA的量以及注射進(jìn)入骨骼肌肉的溶液注射體積決定，一種似乎由細(xì)胞表面壓力增加引起的現(xiàn)象。但是，從體外對注射部位施加壓力(在后肢上利用血壓測量計袖帶(manchette of sphygmomanometer)，例如)并不增加轉(zhuǎn)染效率。相反，在質(zhì)粒DNA注射30分鐘后注射磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)溶液增加質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率，而5小時之后再注射PBS溶液不增加。這些數(shù)據(jù)清楚地證實肌肉內(nèi)高壓對增加轉(zhuǎn)染效率很關(guān)鍵。
此外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)肌肉內(nèi)注射質(zhì)粒DNA組合高壓氧(HBO)治療增加裸質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率。此外，還確定了用于溶解質(zhì)粒DNA的溶液種類的影響。用鹽水以及PBS可以實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率，但是用水則不能實現(xiàn)。有意思地，蔗糖溶液而不是葡萄糖溶液產(chǎn)生高的螢光素酶活性。
總體上，肌肉內(nèi)注射質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率由注射體積和滲透壓的增加而提高。在沒有病毒載體的情形下，利用血管生成生長因子裸質(zhì)粒DNA的基因治療組合HBO治療可為動脈疾病提供了一種安全的臨床基因治療。
因此，本發(fā)明提供了一種治療和/或預(yù)防血管生成-依賴性癥狀的方法，通過在給藥部位存在增加的壓力條件下或組合HBO治療給予裸質(zhì)粒DNA。更具體地，本發(fā)明提供(1)一種治療或預(yù)防血管生成-依賴性癥狀的方法，包括在其中肌肉內(nèi)壓力增加的條件下注射適當(dāng)?shù)穆阗|(zhì)粒DNA進(jìn)入肌肉的步驟；(2)(1)的方法，其中通過采用大的注射體積增加肌肉內(nèi)壓力；(3)(1)的方法，其中在給予質(zhì)粒DNA后通過注射PBS增加肌肉內(nèi)壓力；(4)(1)的方法，其中裸質(zhì)粒DNA在鹽水、PBS、蔗糖溶液或葡萄糖溶液中稀釋；(5)(1)的方法，其中裸質(zhì)粒DNA編碼血管生成生長因子；(6)(5)的方法，其中血管生成生長因子選自肝細(xì)胞生長因子(HGF)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)；以及氧化氮合酶包括巨噬細(xì)胞衍生的氧化氮合酶、可誘導(dǎo)的氧化氮合酶以及腦衍生的氧化氮合酶；(7)(1)的方法，其中血管生成-依賴性癥狀選自創(chuàng)傷包括褥瘡和皮膚潰瘍；炎性疾病；嚴(yán)重的肢體缺血；缺血性心臟病如心肌梗塞、心絞痛以及心力衰竭；腦梗塞；糖尿病神經(jīng)病變；以及椎管狹窄癥；(8)一種治療或預(yù)防血管生成-依賴性癥狀的方法，通過肌肉內(nèi)注射裸質(zhì)粒DNA組合高壓氧(HBO)治療；(9)(8)的方法，其中HBO治療通過暴露100％氧氣進(jìn)行；
(10)(8)的方法，其中治療的對象在給予質(zhì)粒DNA后立即接受HBO治療；(11)(8)的方法，其中裸質(zhì)粒DNA在鹽水、PBS、蔗糖溶液或葡萄糖溶液中稀釋；(12)(8)的方法，其中裸質(zhì)粒DNA編碼血管生成生長因子；(13)(12)的方法，其中血管生成生長因子選自肝細(xì)胞生長因子(HGF)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)；和氧化氮合酶包括巨噬細(xì)胞衍生的氧化氮合酶、可誘導(dǎo)的氧化氮合酶和腦衍生的氧化氮合酶；以及(14)(8)的方法，其中血管生成-依賴性癥狀選自創(chuàng)傷包括褥瘡和皮膚潰瘍；炎性疾??；嚴(yán)重的肢體缺血；缺血性心臟病如心肌梗塞、心絞痛和心力衰竭；腦梗塞；糖尿病神經(jīng)病變；和椎管狹窄癥。
附圖簡述

圖1描述了顯示以多種注射體積將裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入骨骼肌肉體內(nèi)2天后檢測的螢光素酶活性的比較圖。在100、200、300和400μl PBS中稀釋的裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200或800μg)轉(zhuǎn)染到大鼠中。每組包含6只動物。**p＜0.01vs.100μl。
圖2描述了顯示將裸質(zhì)粒DNA以多種注射體積和在骨骼肌肉的不同部位轉(zhuǎn)染2天后體內(nèi)的螢光素酶活性的比較圖。200ug/100x1用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200ug)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋，在一個部位給予；200ug/25x4用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在25μl PBS中稀釋，在4個部位給予；200ug/12.5x8用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在12.5μl PBS中稀釋，在8個部位給予；以及400ug/25x4用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(400μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在25μl PBS中稀釋，4個部位給予。各組包含10只動物。**p＜0.01vs.200μg/100x1。
圖3顯示了利用袖帶纏繞轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA進(jìn)入骨骼肌肉2天后檢測的螢光素酶活性的比較圖。轉(zhuǎn)染后立即將血壓測量計袖帶纏繞在用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的肌肉上。200/100用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋，無袖帶纏繞；10s/10(300)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在200μl PBS中稀釋，通過袖帶以300mmHg壓10秒，壓10次；10s/30(300)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在200μl PBS中稀釋，通過袖帶以300mmHg壓10秒，壓30次；1m/10(150)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在200μl PBS中稀釋，通過袖帶以1500mmHg壓1分鐘，壓10次；1m/10(300)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在200μl PBS中稀釋，利用護(hù)腕以300mmHg壓1分鐘，壓10次；5m/l(150)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在200μl PBS中稀釋，利用袖帶以150mmHg壓5分鐘，壓1次；以及5m/l(300)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在200μl PBS中稀釋，利用袖帶以300mmHg壓5分鐘，壓1次。各組包含4只動物。*p＜0.05vs.200/100。
圖4a顯示了另外注射PBS溶液轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA(200μg)進(jìn)入骨骼肌肉2天后檢測的螢光素酶的比較圖。轉(zhuǎn)染裸螢光素酶質(zhì)粒DNA之后0.5或5小時，將無質(zhì)粒DNA的PBS溶液另外地經(jīng)肌肉內(nèi)注射進(jìn)入肌肉的同樣部位。200ug/100用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋；200ug/100+300(0.5h)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋，轉(zhuǎn)染后30分鐘注射300μl PBS；200ug/100+300(5h)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋，轉(zhuǎn)染后5小時注射300μl PBS；以及200ug/400用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在400μl PBS中稀釋。各組包含4只動物。**p＜0.01vs.200ug/100。
圖4b顯示將裸質(zhì)粒DNA(800μg)轉(zhuǎn)染進(jìn)入骨骼肌肉中且另外注射PBS溶液2天后檢測的螢光素酶活性的比較圖。在轉(zhuǎn)染裸螢光素酶質(zhì)粒DNA之后0.5或5小時將無質(zhì)粒DNA的PBS溶液另外經(jīng)肌肉內(nèi)注射肌肉的相同部位。800ug/100用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(800μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋；800ug/100+300(0.5h)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(800μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋，轉(zhuǎn)染后30分鐘單獨(dú)注射300μl PBS；800ug/100+300(5h)用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(800μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋，轉(zhuǎn)染后5小時注射300μl PBS；以及800ug/400用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(800μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在400μl PBS中稀釋。各組包含4只動物。**p＜0.01vs.800ug/100。
圖5顯示了HBO治療對轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA(200μg)進(jìn)入骨骼肌肉2天后的螢光素酶活性影響圖。200ug/100用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在100μl PBS中稀釋；以及200ug/300用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)轉(zhuǎn)染的大鼠，在300μl PBS中稀釋。正常正常條件；HBO用100％O2在2atm HBO治療1小時。各組包含3只動物。**p＜0.01vs.200ug/100。
圖6a顯示了多種溶液對轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA(200μg)進(jìn)入骨骼肌肉2天后的螢光素酶活性的影響圖。進(jìn)行肌肉內(nèi)注射在各種溶液(200μl注射體積)中稀釋的螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)。PBS磷酸鹽緩沖生理鹽水；BSS平衡的鹽水溶液；以及TETris-HCl EDTA緩沖液。各組包含6只動物。**p＜0.01vs.水。
圖6b描述了葡萄糖和蔗糖濃度對轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA(200μg)進(jìn)入骨骼肌肉2天后螢光素酶活性的影響圖。利用包含葡萄糖(5、20和50％)或蔗糖(10、30和50％)的溶液(200μl注射體積)進(jìn)行肌肉內(nèi)注射螢光素酶質(zhì)粒DNA(200μg)。各組包含6只動物。**p＜0.01vs.水。
實施本發(fā)明的最佳方式這里使用的術(shù)語“一”、“所述的”意指“至少一個”，除非另有明確的說明。
為了尋找轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA進(jìn)入骨骼肌肉的最佳條件，本發(fā)明者改進(jìn)了質(zhì)粒DNA基因轉(zhuǎn)移方法。首先，本發(fā)明者考察了質(zhì)粒DNA溶液的注射體積對轉(zhuǎn)染效率的影響。其次，考察了溶解質(zhì)粒DNA的溶液種類的影響。此外，考察了高壓氧(HBO)治療和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移的組合應(yīng)用。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裸質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率似乎隨肌肉內(nèi)的高壓而增加。因此，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防血管生成-依賴性癥狀的方法，通過在其中肌肉內(nèi)壓力增加的條件下經(jīng)肌肉內(nèi)注射適當(dāng)?shù)穆阗|(zhì)粒DNA。本發(fā)明提供了一種減輕對象中血管生成-依賴性癥狀、抑制癥狀的發(fā)展或抑制癥狀的方法。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“血管生成-依賴性癥狀”指通過血管生成可預(yù)防、減輕、改善或治療的疾病的癥狀。根據(jù)本發(fā)明可治療或預(yù)防的癥狀包括創(chuàng)傷包括褥瘡和皮膚潰瘍；炎性疾病；嚴(yán)重的肢體缺血；缺血性心臟病如心肌梗塞、心絞痛和心力衰竭；腦梗塞；糖尿病神經(jīng)病變；和椎管狹窄癥。
本發(fā)明可使用任何的質(zhì)粒DNA，只要所述的質(zhì)粒DNA包含在導(dǎo)入宿主后以可表達(dá)的方式編碼血管生成生長因子的基因。編碼血管生成生長因子的本發(fā)明基因不以任何方式進(jìn)行限制并包括那些編碼蛋白、多肽以及其部分的基因，只要其具有減輕、改善或抑制血管生成-依賴性癥狀或預(yù)防癥狀發(fā)展的活性。優(yōu)選的本發(fā)明基因的實例包括但不限于，那些編碼肝細(xì)胞生長因子(HGF)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)如酸性FGF、堿性FGF和FGF-4；氧化氮合酶(NOS)；VEGF-2；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-α；TGF-β；血小板-衍生(PD)-內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGF)；血小板-衍生生長因子(PDGF)；腫瘤壞死因子(TNF)-α；胰島素樣生長因子以及antiopoietin-1的基因。
編碼HGF的基因的核苷酸序列記載在文獻(xiàn)中(Nature 342440(1989)；Japanese Patent No.2577091；Biochem.Biophys.Res.Commun.163967(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.172321(1990))。這些公開的序列的任何一種可用作本發(fā)明的血管生成生長因子-編碼基因。
已經(jīng)報道BRGF基因有四種亞型(VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206；Science 219983(1983)；J.Clin.Invest.841470(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.161851(1989))。其中任一種可用作本發(fā)明的血管生成生長因子-編碼基因。但是，在四種中，已知VEGF165具有最強(qiáng)的生物活性，因此在本發(fā)明中更優(yōu)選。
已經(jīng)分離得到數(shù)種NOS同工型，包括分離自下列組織的NOS腦(nNOS；Bredt和Snyder，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87682-685(1990))；內(nèi)皮細(xì)胞(eNOS；Fostermann等，Biochem.Pharmacol.421849-1857(1991))；巨噬細(xì)胞(iNOS；Hibbs等，Science 235473(1987)；Stuehr等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887773-7777(1991))；肝細(xì)胞(Knowles等，Biochem.J.279833-836(1990))；血管細(xì)胞(Wood等，Biochem.Biophys.Res.Commun.17080-88(1991)；和嗜中性白細(xì)胞(Yui等，J.Biol.Chem.26612544-12547(1991)；Yui等，J.Biol.Chem.2663369-3371(1991))。此外，也從其他的組織中分離出NOS(參見，例如，Hevel等，J.Biol.Chem.26622789-22791(1991)；Ohshima等，Biochem.Biophys.Res.Commun.183238-244(1992)；Hiki等，J.Biochem.111556-558(1992)；Evans等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895361-5365(1992)；Sherman等，Biochemistry 3211600-11605(1993))。因此，上述衍生自不同的器官和組織的編碼NOS的基因可用作本發(fā)明的編碼血管生成生長因子的基因。例如，人eNOS的核苷酸序列和氨基酸序列通過GenBank數(shù)據(jù)庫可以公開得到(分別地GenBank Accession Nos.AF400594和P29474；還參見Janssens等，J.Biol.Chem.267(21)14511-14522(1992)；Marsden等，F(xiàn)EBS Lett.307(3)287-293(1992))。此外，已知eNOS存在同工型(Fischman等，Nat.Struct.Biol.6(3)233-242(1999))；所述的同工型也包括在本發(fā)明的NOS中。可用于本發(fā)明的NOS的其他序列信息包括哺乳動物鈣調(diào)蛋白-依賴性NOS(nNOS；US專利5,268,465)、可誘導(dǎo)的人NOS(iNOS；US專利5,468,630)以及牛內(nèi)皮NOS(eNOS；US專利5,498,539)中的那些。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可得到編碼血管生成生長因子的cDNA，通過例如，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，利用有關(guān)上述基因的公開可得的序列信息構(gòu)建的引物(參見，例如，Molecular Cloning 2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)；PCRa Practical Approach，IRL Press，Oxford(1991))，從包括血管生成生長因子-編碼基因的來源包括cDNA文庫以及任何哺乳動物物種的基因文庫。但是，從免疫原性的角度考慮，優(yōu)選使用與基因治療的動物的來源相同的基因。
用于本發(fā)明的編碼血管生成生長因子的基因不限于上述公開的那些。而且，對于本發(fā)明，只要其編碼具有血管生成活性的蛋白，基因就是適當(dāng)?shù)牟?1)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交上述cDNA之一的核苷酸序列；以及(2)編碼包括上述cDNA編碼的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，其中一個或多個氨基酸被取代、刪除、加入和/或插入。編碼突變體血管生成生長因子的所述核苷酸可利用下述方法很容易地得到定點突變(Ausubel等編輯，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Section 8.1-8.5(1987))；基因擴(kuò)增方法如PCR(Ausubel等編輯，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Section 6.1-6.4(1987)；以及一般的雜交方法(J.Sambrook等，Molecular Cloning 2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，Section9.47-9.58(1989)；Ausubel等編著，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Section 6.3-6.4(1987))?；蛘?，可基于其序列信息利用化學(xué)的方法構(gòu)建基因或其片段。
嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件通常包括“1x SSC，37℃”的洗滌條件。更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件為“0.5x SSC，0.1％SDS，42℃”的洗滌條件，并且更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件為“0.1x SSC，0.1％SDS 65℃”。條件越嚴(yán)謹(jǐn)，得到的聚核苷酸與探針的同源性越高。但是，上述雜交條件僅僅是示例，應(yīng)該理解為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以基于核苷酸序列、探針的濃度和長度；反應(yīng)時間；反應(yīng)溫度；試劑的濃度等的考慮選自適當(dāng)?shù)碾s交條件。
利用上述雜交技術(shù)分離得到的本發(fā)明的編碼血管生成生長因子的基因通常編碼在氨基酸序列水平與用作探針的天然存在的血管生成生長因子高度同源的多肽。這里的“高度同源”指一致性高于50％，優(yōu)選地65％，更優(yōu)選地75％，甚至更優(yōu)選地80％，甚至更優(yōu)選地90％，并且最優(yōu)選地95％或更高。測定聚核苷酸之間的序列同源性的方法是本領(lǐng)域中公知的，并可在進(jìn)行BLAST搜尋算法之后判斷(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877(1993))。
蛋白的突變在自然界也發(fā)生。如上所述，各種血管生成生長因子的多種同工型是本領(lǐng)域中公知的。所述的同工型也包括在可用于本發(fā)明的血管生成生長因子-編碼基因中，只要其保留天然蛋白的血管生成活性。公知在蛋白序列中的一個或多個氨基酸殘基取代、刪除、加入和/或插入修飾的蛋白可保持其初始的生物活性(G.Dalbadie-McFarland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 796409-6413(1982))。
為了保持血管生成生長因子的血管生成活性，優(yōu)選將氨基酸殘基突變成一種氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)保持的氨基酸。氨基酸的性質(zhì)通?？煞譃?1)疏水性氨基酸(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)；(2)親水性氨基酸(精氨酸、天冬酰胺酸、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；(3)具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯基丙氨酸和纈氨酸)；(4)具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸)；(5)具有含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)；(6)具有含羧酸-和酰胺側(cè)鏈的氨基酸(天冬酰胺酸、天門冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺)；(7)具有含堿性基團(tuán)的側(cè)鏈的氨基酸(精氨酸、組氨酸和賴氨酸)；以及(8)具有含芳香基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸(組氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)。
具有加入到其中的一個或多個氨基酸殘基的蛋白或多肽的實例包括但不限于融合蛋白。例如，為了制備編碼融合蛋白的聚核苷酸，編碼血管生成生長因子的第一種DNA和編碼另一種蛋白或多肽的第二種DNA在框架上連接起來?？扇诤涎苌缮L因子的蛋白或多肽不限于任何特定的蛋白或多肽。
突變蛋白的活性可根據(jù)常規(guī)的方法，利用公知的分析進(jìn)行證實。例如，血管生成生長因子的變異的蛋白和多肽的血管生成活性根據(jù)在下述實施例中描述的方法進(jìn)行證實，其中在大鼠缺血性后肢模型中檢測蛋白誘導(dǎo)治療性血管生成的活性?；蛘?，突變NOS的活性根據(jù)在WO97/07824中記載的方法進(jìn)行測量，其中檢測蛋白誘導(dǎo)成血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性。
根據(jù)本發(fā)明，編碼第一種血管生成生長因子的基因可單獨(dú)使用或組合一或多種編碼其他的血管生成生長因子的基因。此外，編碼調(diào)節(jié)血管生成生長因子的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因，如缺氧-可誘導(dǎo)的因子(HIF)-1和Ets-1，也與本發(fā)明的編碼血管生成生長因子的基因組合使用。
本發(fā)明中編碼血管生成生長因子的基因以及根據(jù)需要與血管生成生長因子編碼基因組合使用的其他基因，優(yōu)選插入至載體中，以確保基因的體內(nèi)表達(dá)，并利用“裸”DNA方法對病人給藥進(jìn)入損害或其周圍肌肉部位。為了表達(dá)基因，可使用任何的表達(dá)載體，只要其能夠使目的基因在體內(nèi)表達(dá)。例如，所述的表達(dá)載體包括但不限于pCAGGS(Gene 108193-200(1991))、pBK-CMV(Stratagene)、pcDNA3.1(Invitrogen)、pZeoSV(Invitrogen)等。表達(dá)載體可進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)基因，如啟動子、增強(qiáng)子和/或中止子，這些都是表達(dá)血管生成生長因子基因所需要的。
包括血管生成生長因子基因的表達(dá)載體可配制成藥物組合物，適于通過裸DNA方法的基因治療。例如，對于經(jīng)注射給予，包括基因的載體溶解在適當(dāng)?shù)娜芤褐?。然后，包含載體的溶液根據(jù)具體的需要經(jīng)過濾滅菌，并可裝填到無菌的安瓿等中。根據(jù)需要，常規(guī)使用的載體可加入到用于注射的溶液中。
用于溶解血管生成生長因子-編碼基因的優(yōu)選的溶液包括，緩沖溶液，如磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)、生理鹽水、蔗糖溶液、葡萄糖溶液、無菌水等。這里報告的實驗結(jié)果暗示并證實通過鹽水以及PBS可實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率。此外，與蔗糖溶液相比利用葡萄糖溶液可得到更高的轉(zhuǎn)染效率。因此，特別優(yōu)選的本發(fā)明溶液包括鹽水、PBS和葡萄糖溶液。
根據(jù)本發(fā)明，在其中肌肉內(nèi)壓力增加的條件下，血管生成-依賴性癥狀可通過向肌肉內(nèi)注射適當(dāng)?shù)穆阗|(zhì)粒DNA得到治療或預(yù)防。增加的“肌肉內(nèi)壓力”指在肌肉細(xì)胞表面的壓力增加。所述的壓力的增加可通過注射大體積的溶液實現(xiàn)，即，注射溶于大的體積溶液中的裸質(zhì)粒DNA或與另外的注射溶液一起注射?；蛘撸瑳]有裸質(zhì)粒DNA的其他溶液，在注射裸質(zhì)粒DNA之后的足夠的時間間隔之后施用，只要所述的結(jié)果導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率升高。
此外，根據(jù)本發(fā)明，裸質(zhì)粒DNA導(dǎo)入對象的轉(zhuǎn)染效率也可通過進(jìn)行高壓氧(HBO)治療組合給予裸質(zhì)粒DNA而得到提高。HBO治療涉及將對象暴露于壓縮氧氣(多于1大氣壓，一般地3～數(shù)個大氣壓)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選通過將對象暴露于100％氧氣進(jìn)行HBO治療。
對于HBO治療，可以使用純氧氣壓縮的單艙(monoplace chamber)(適于單人)；或者，對象在帶有壓縮空氣的多艙中可通過面罩、頭套(氧氣套)或氣管呼吸氧氣。已知HBO治療增加血漿、器官以及組織中的氧氣水平。
HBO治療可肌肉內(nèi)注射裸質(zhì)粒DNA一起進(jìn)行，盡管優(yōu)選在注射之后立即啟動治療。
盡管血管生成生長因子-編碼基因的劑量隨病人的體重、年齡、性別和癥狀、施用的基因的種類、給予方法等而變，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員利用常規(guī)的計算方法以及公知的算法很容易地選擇用于治療性或預(yù)防性治療血管生成-依賴性癥狀的基因的適當(dāng)劑量。一般地，對于成人(以60kg體重計算)，每數(shù)天或數(shù)月施用一次0.0001～100mg并優(yōu)選地0.001～10mg基因。對其他的動物給予的時候，基因的量根據(jù)每60kg體重可施用的量進(jìn)行換算。
提供下述實施例以舉例說明本發(fā)明并幫助本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實施和利用。所述的實施例目的不在于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
除非另有定義，這里使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管類似或等同于這里描述的方法以及材料可用于實施或檢驗本發(fā)明，適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧嫌涊d在下面。這里引用的任何專利、專利公開以及公開引入作為參考。
一般方法(1)利用直接的肌肉內(nèi)注射方法的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移將Sprague-Dawley大鼠(400-500g；Charles River Breeding Laboratories)經(jīng)腹膜注射戊巴比妥鈉(0.1ml/100mg)進(jìn)行麻醉。用27G針(Terumo，Atsugi，Japan)將裸螢光素酶基因(500μl/動物)或?qū)φ?500μg/動物)載體小心地直接注射進(jìn)入大鼠右后肢的脛骨前肌肉的中央(Y.Taniyama等，Gene Ther.8181-189(2000)；M.Aoki等，Gene Ther.7417-427(2000)；Y.Taniyama等，Circulation 1042344-2350(2001)；R.Morishita等，Circulation 1051491-1496(2002))。由SV40啟動子啟動的螢光素酶基因表達(dá)載體(PromegaCorporation，Madison，WI)用作裸螢光素酶基因載體。
1)為了增加肌肉內(nèi)壓力，轉(zhuǎn)染之后立即將血壓測量計的袖帶纏繞在用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA注射的肌肉上，2)為了增加注射部位的壓力，轉(zhuǎn)染之后0.5或5小時，在用裸螢光素酶質(zhì)粒DNA注射的肌肉處，肌肉內(nèi)注射其他的沒有質(zhì)粒DNA的PBS溶液。
(2)螢光素酶活性的分析螢火蟲螢光素酶活性利用螢光素酶分析系統(tǒng)(PicaGeneTM；Toyo-Inki，Tokyo，Japan)進(jìn)行測量。通過裸質(zhì)粒直接注射入后肢進(jìn)行的螢光素酶基因轉(zhuǎn)染2天后，處死大鼠。組織樣品(注射部位周圍200mg)在液氮中快速凍結(jié)，并在裂解緩沖液中勻漿。組織勻漿液簡單離心(3000rpm，10分鐘)，并將20μl的上清液與100μl的螢光素酶分析試劑混和。加入樣品5秒后開始發(fā)光反應(yīng)的測量。計數(shù)持續(xù)10秒，并且10秒內(nèi)的計數(shù)用作螢光素酶活性的指標(biāo)(M.Aoki等，J.Mol.Cell.Cardiol.29949-959(1997))。
(3)HBO治療(O2暴露)將大鼠用氯胺酮(100mg/kg)和賽拉嗪(5mg/kg)麻醉。如上方法進(jìn)行肌肉內(nèi)注射質(zhì)粒DNA。在暴露的早晨，將動物放置在高壓艙中。艙中用100％O2充1.5分鐘以增加O2水平至＞99％。轉(zhuǎn)染后立即將動物在2atm 100％O2中暴露1小時。
(4)統(tǒng)計分析所有的數(shù)值表示為平均值±SEM。變異以及隨后的Duncan’s檢驗分析用來檢測多重比較中的差異顯著性。P值小于0.05的差異認(rèn)為顯著。
進(jìn)入大鼠肌肉的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率比較最初，我們考察了注射體積對包括螢光素酶基因的裸質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率的影響。正如預(yù)期，螢光素酶活性對質(zhì)粒DNA以劑量-依賴性的方式增加(圖1；p＜0.01)。有趣地，如圖1中所示，裸質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染的增加與注射體積溶液的增加有關(guān)(PBS)(p＜0.01)。注射體積的增加(100ml在一個部位，而不是分開的注射(25ml在4個部位或12.5ml在8個部位)，提供高的轉(zhuǎn)染效率(圖2，p＜0.01)。因此，裸質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率似乎與滲透壓有關(guān)。
為了闡明該假設(shè)，本發(fā)明者在注射后在后肢上利用血壓測量計的袖帶，以從外部增加壓力。出人意料地，袖帶-介導(dǎo)的150和300mmHg壓力都不增加轉(zhuǎn)染效率(圖3)。此外，轉(zhuǎn)染效率不受袖帶的反復(fù)擠壓影響(圖3)。
因此，為了增加內(nèi)壓，在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的相同部位經(jīng)肌肉內(nèi)注射不帶質(zhì)粒DNA的PBS。如圖4a中所示，在首次注射質(zhì)粒DNA后30分鐘(0.5小時)另外的注射PBS增加螢光素酶活性(p＜0.01)。然而，在初次的轉(zhuǎn)染5小時后單注射類似的添加的PBS注射沒有增加螢光素酶活性。利用800μg的質(zhì)粒DNA，得到類似的結(jié)果(圖4b)。相反，注射速率的變化并不影響轉(zhuǎn)染效率(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了進(jìn)一步的證實，應(yīng)用了HBO治療。在HBO治療中，動物暴露于高壓純的氧氣環(huán)境中。在2atm經(jīng)HBO治療1小時在以100μl和300μl注射體積注射的動物中都實現(xiàn)了顯著的螢光素酶活性的增加(圖5，p＜0.01)。這些結(jié)果證實肌肉內(nèi)注射裸質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率依賴于細(xì)胞表面的壓力。
或者，滲透壓的增加可影響轉(zhuǎn)染效率。因此，考察了使用多種溶液作為質(zhì)粒DNAs的注射溶媒對轉(zhuǎn)染效率的影響。如圖6a中所示，與其他的緩沖液相比，鹽水以及PBS證實了高的轉(zhuǎn)染效率。出人意料地，利用水作為注射溶媒降低了螢光素酶活性。為了增加體內(nèi)的滲透壓，還檢測了葡萄糖和蔗糖溶液的作用。蔗糖和葡萄糖溶液二者都增加了螢光素酶的表達(dá)，并且與水相比蔗糖溶液而不是葡萄糖溶液顯著地增加螢光素酶活性(p＜0.01)。但是，使用30％蔗糖溶液引起肌肉注射部位的損傷，因此并不特別地優(yōu)選。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了基于質(zhì)粒DNA-基因輸送進(jìn)入骨骼肌肉的改進(jìn)方法，與常規(guī)的方法相比更安全并得到更高的轉(zhuǎn)染效率。具體地，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防疾病的方法，通過在肌肉內(nèi)增加的壓力條件下肌肉內(nèi)注射適當(dāng)?shù)穆阗|(zhì)粒DNA。此外，本發(fā)明的方法提供了一種治療或預(yù)防疾病的方法，通過肌肉內(nèi)注射適當(dāng)?shù)穆阗|(zhì)粒DNA組合高壓氧(HBO)治療。
根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠降低施用的質(zhì)粒DNA的量，并因此能將降低裸質(zhì)粒DNA治療的潛在的成本。此外，這些方法在沒有病毒載體如腺病毒載體的情形下實現(xiàn)有效的轉(zhuǎn)染。具體地，與利用病毒載體地方法相比，本發(fā)明的方法更為安全并開啟了對廣泛的疾病進(jìn)行基因治療的可能性。此外，本發(fā)明的給予裸質(zhì)粒DNA與HBO治療的組合可以擴(kuò)展血管生成生長因子在血管生成-依賴性疾病，如傷口愈合、炎性疾病、缺血性心臟病、心肌梗塞和外周動脈疾病的人臨床基因治療中的應(yīng)用。
盡管本發(fā)明已經(jīng)參考具體的實施方案進(jìn)行了詳細(xì)的描述，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前體下，可以進(jìn)行多種變化和修飾。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防血管生成-依賴性癥狀的方法，包括在其中肌肉內(nèi)壓力增加的條件下向肌肉內(nèi)注射編碼血管生成生長因子的裸質(zhì)粒DNA的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過采用大的注射體積增加肌肉內(nèi)壓力。
3.權(quán)利要求1的方法，其中通過在給予質(zhì)粒DNA之后注射PBS增加肌肉內(nèi)壓力。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的裸質(zhì)粒DNA在鹽水、PBS、蔗糖溶液或葡萄糖溶液中稀釋。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的血管生成生長因子選自肝細(xì)胞生長因子(HGF)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)；以及氧化氮合酶。
6.權(quán)利要求5的方法，其中氧化氮合酶選自巨噬細(xì)胞衍生的氧化氮合酶、可誘導(dǎo)的氧化氮合酶以及腦衍生的氧化氮合酶。
7.權(quán)利要求1的方法，其中血管生成-依賴性癥狀選自創(chuàng)傷包括褥瘡和皮膚潰瘍；炎性疾病；嚴(yán)重的肢體缺血；缺血性心臟病包括心肌梗塞、心絞痛和心力衰竭；腦梗塞；糖尿病神經(jīng)病變；和椎管狹窄癥。
8.一種治療或預(yù)防血管生成-依賴性癥狀的方法，包括施用編碼血管生成生長因子的裸質(zhì)粒DNA進(jìn)入肌肉組合高壓氧(HBO)治療的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中HBO治療通過暴露于100％氧氣進(jìn)行。
10.權(quán)利要求8的方法，其中治療對象在給予質(zhì)粒DNA之后立即接受HBO治療。
11.權(quán)利要求8的方法，其中裸質(zhì)粒DNA在生理鹽水、PBS、蔗糖溶液或葡萄糖溶液中稀釋。
12.權(quán)利要求8的方法，其中血管生成生長因子選自肝細(xì)胞生長因子(HGF)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)；合氧化氮合酶。
13.權(quán)利要求12的方法，其中氧化氮合酶選自巨噬細(xì)胞衍生的氧化氮合酶、可誘導(dǎo)的氧化氮合酶以及腦衍生的氧化氮合酶。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述的血管生成-依賴性癥狀選自創(chuàng)傷包括褥瘡和皮膚潰瘍；炎性疾??；嚴(yán)重的肢體缺血；缺血性心臟病包括心肌梗塞、心絞痛和心力衰竭；腦梗塞；糖尿病神經(jīng)病變；和椎管狹窄癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于提高裸質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率用于治療和/或預(yù)防血管生成－依賴性癥狀的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，在肌肉內(nèi)壓力增加或高壓氧條件下經(jīng)肌肉內(nèi)注射適當(dāng)?shù)穆阗|(zhì)粒DNA。可用本發(fā)明的方法治療的血管生成－依賴性癥狀包括創(chuàng)傷、炎性疾病、嚴(yán)重的肢體缺血、缺血性心臟病、腦梗塞、糖尿病神經(jīng)病變、椎管狹窄癥等。
文檔編號A61P9/10GK1717254SQ20038010459
公開日2006年1月4日 申請日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月2日
發(fā)明者平岡和也, 山本誠司, 金田安史, 森下竜一, 荻原俊男 申請人:安增子摩祺株式會社