專利名稱：載脂蛋白a－i在制備抗內(nèi)毒素與抑制細胞因子釋放藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬制藥領域，涉及載脂蛋白A-I在制藥中的用途，具體涉及載脂蛋白A-I的抗內(nèi)毒素與抑制細胞因子釋放的新用途。
背景技術：
載脂蛋白A-I(簡稱Apo A-I)作為血漿高密度脂蛋白(HDL)的主要成分，其抗動脈粥樣硬化功能已為國內(nèi)外研究所確認。有報道，在機體急性相反應(acutephase response，APR)時，如微生物和寄生蟲感染性炎癥；內(nèi)毒素血癥；急性胰腺炎、心腦梗塞、燒傷等非感染性炎癥引起組織壞死，血清C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)和血清淀粉樣蛋白(serum amyloid A，SAA)急劇升高(Morley JJ et alAnn.N.Y.Acad.Sci.1982389406)，SAA與血漿HDL相互作用(Gabanan VG et alJ.Lipid Res.19893039；Shephard EGet alBiochem.J.1987248919；Goetzee GA et alJ.Biol.Chem.19862619644)，SAA取代Apo A-I成為HDL中的主要載脂蛋白。
90年代中后期，國外對非特異性免疫細胞，如中性粒細胞、巨噬細胞等的功能有了新的認識，它們不僅僅被認為是炎癥反應效應細胞，也可能作為體內(nèi)細胞因子(cytokines，如腫瘤壞死因子TNF-α，白細胞介素系列IL等)的重要來源(Gabrilovich Etd“NeutrolphilsNew outlook for old cells”ImperialCollege Press England.1999)，細胞因子集中大量釋放形成細胞因子風暴(cytokines stom)會造成機體極大傷害，直至組織壞死，休克死亡。內(nèi)毒素(LPS)是G-菌細胞壁上的一種組分，本質(zhì)是脂多糖，LPS在體內(nèi)大量釋放導致機體發(fā)熱、低血壓、休克、彌漫性血管內(nèi)凝血、多器官衰竭甚至死亡。其直接誘因是LPS引發(fā)的細胞因子風暴(Breyer I et alMedicina(B Aires)199858(1)61-4)。SARS患者死亡的重要誘因是肺功能衰竭，其重要原因是免疫系統(tǒng)過度激活，細胞因子及彈性蛋白酶大量釋放，至今臨床上仍無直接對抗LPS及抑制細胞因子釋放的有效藥物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供Apo A-I在制藥中的新用途，具體涉及Apo A-I的抗內(nèi)毒素與抑制細胞因子釋放的新用途。
本發(fā)明通過常規(guī)方法制備Apo A-I，并經(jīng)動物實驗和細胞實驗證實Apo A-I具有抗內(nèi)毒素與抑制細胞因子釋放的新用途。
本發(fā)明Apo A-I能保護機體免受內(nèi)毒素和細胞因子大量釋放而導致對機體的嚴重損傷。為機體急性相反應時直接對抗內(nèi)毒素和抑制細胞因子釋放提供一條新的特效治療途徑。
具體實施例方式
實施例1制備及純化Apo A-I(1)常規(guī)超速離心法分離人血漿(HDL)收集d 1.063-1.21g/cm3的HDL部分，收集d＞1.21的無脂蛋白血漿部分(LFF)。
(2)制備與純化Apo A-I濃縮后的HDL經(jīng)乙醇/乙醚脫脂，收集蛋白部分(Apo HDL)，經(jīng)Bio CADWorkstation POROS HQ陰離子交換柱分離，獲純化Apo A-I。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，僅有一條Apo A-I條帶。
實施例2 Apo A-I的抗內(nèi)毒素(LPS)功能實驗(1)整體動物實驗Apo A-I保護小鼠免受LPS損傷實驗實驗分四組，每組10只昆明種小鼠，尾靜脈注射LPS，注射量為0.18ml/10g，LPS劑量為4mg/kg，Apo A-I劑量為49mg/kg，LFF劑量為49mg/kg，連續(xù)觀察48小時。結果表明，Apo A-I具有對抗LPS對小鼠的致死作用，LFF存在增強Apo A-I的作用。預試驗結果顯示LFF無對抗LPS的毒性作用。
(2)Apo A-I抑制內(nèi)毒素激活的小鼠腹腔巨噬細胞釋放細胞因子對L929細胞的殺傷作用(MTT法)按常規(guī)方法取小鼠腹腔巨噬細胞，調(diào)節(jié)密度4×106/ml，細胞培養(yǎng)板預培養(yǎng)24小時。實驗分三組，n＝5，培養(yǎng)液中LPS濃度0.2μg，Apo A-I 0.2mg/ml，LFF0.1mg/ml，L929細胞5×105/ml。共培養(yǎng)16小時，以常規(guī)MTT法測定L929存活率。結果表明，Apo A-I能對抗LPS刺激巨噬細胞釋放細胞因子對L929細胞的殺傷作用，LFF存在能增強Apo A-I的作用。
(3)Apo A-I體外結合LPS實驗采用熒光酶標法，Apo A-I+LPS組，將Apo A-I包板，洗滌后用BSA封閉，再洗滌，加入FITC-LPS，洗滌后用熒光分光光度儀測熒光結合量。Apo A-I+LFF+LPS組，BSA封閉后加入LFF，洗滌后加入FITC-LPS，再洗滌后用熒光分光光度儀測熒光結合量。結果表明，Apo A-I能直接結合LPS，LFF存在能增強Apo A-I的作用。
本發(fā)明實驗所用L929細胞購自中科院上海細胞所，所述巨噬細胞按常規(guī)方法取自昆明種小鼠腹腔，所用LPS購自Sigma公司。
表1是Apo A-I對抗LPS對小鼠的殺傷作用。
表2是Apo A-I對抗LPS刺激巨噬細胞釋放細胞因子對L929細胞的殺傷作用。
表3是Apo A-I體外結合LPS試驗結果。
表1
*P＜0.05**P＜0.01表2
*P＜0.05**P＜0.01其中，數(shù)據(jù)負值表示細胞不但沒有死亡，而且還有增長。
表3組別(n＝4)Apo A-I+LPSApo A-I+LFF+LPS熒光強度 24.35±3.7 64.47±8.06**P＜0.01實施例3 Apo A-I對中性粒細胞功能的調(diào)節(jié)作用實驗(1)Apo A-I對激活中性粒細胞粘附功能抑制作用采用體外細胞培養(yǎng)法，常規(guī)由肝素抗凝兔血分離中性粒細胞，以fMLP激活，同時與不同濃度的Apo A-I共培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細胞密度至2×106/ml，接種至纖維結合蛋白包被的細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)30min，以PBS洗滌，結晶紫染色，酶標儀測定光吸收度。結果表明，Apo A-I具有抑制fMLP激活的中性粒細胞粘附于纖維結合蛋白的作用，其抑制作用隨Apo A-I濃度增加而增強。
(2)Apo A-I抑制激活中性粒細胞釋放細胞因子(TNF-α等)對L929細胞殺傷作用實驗(MTT法)采用體外細胞培養(yǎng)法，常規(guī)由肝素抗凝兔血分離中性粒細胞，以fMLP激活，同時與不同濃度的Apo A-I共培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細胞密度至2×106/ml，37℃培養(yǎng)30min，離心，棄上清液，調(diào)細胞密度至2×106/ml，加至L929細胞共培養(yǎng)12h，MTT法測定L929細胞存活率。結果表明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒細胞釋放細胞因子如TNF-α殺傷L929細胞的作用。
(3)Apo A-I抑制激活中性粒細胞釋放超氧陰離子作用(NBT法)采用體外細胞培養(yǎng)法，常規(guī)由肝素抗凝兔血分離中性粒細胞，以fMLP激活，同時與不同濃度的Apo A-I共培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細胞密度至2×106/ml，37℃培養(yǎng)30min，NBT染色，酶標儀測定光吸收度。結果表明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒細胞產(chǎn)生超氧陰離子的功能，其抑制功能隨著Apo A-I濃度增加而增強。
(4)Apo A-I對中性粒細胞脫粒功能抑制作用采用體外細胞培養(yǎng)法，常規(guī)由肝素抗凝兔血分離中性粒細胞，以fMLP激活，同時與不同濃度的Apo A-I共培養(yǎng)，調(diào)節(jié)細胞密度至2×106/ml，37℃培養(yǎng)30min，離心收集上清液，分別測定上清液中的彈性蛋白酶及髓過氧化物酶活性。結果表明，Apo A-I具有抑制激活的中性粒細胞脫顆粒的作用，其抑制作用隨著Apo A-I濃度增加而增強。
本發(fā)明實驗所用fMLP、纖維結合蛋白購自Sigma公司表4是Apo A-I抑制激活中性粒細胞粘附到纖維結合蛋白的結果。
表5是Apo A-I抑制激活的中性粒細胞釋放細胞因子殺傷L929細胞的作用。
表6是Apo A-I抑制激活的中性粒細胞產(chǎn)生超氧陰離子作用的結果。
表7是Apo A-I抑制激活的中性粒細胞釋放彈性蛋白酶的結果。
表8是Apo A-I抑制激活的中性粒細胞釋放髓過氧化物酶的結果。
表4中性粒細胞粘附率ApoA-I(μg/ml) 0 2.55101、中性粒細胞 17.3±0.7％17.1±0.2％17.3±0.0％ 17.3±0.0％2、中性粒細胞+fMLP 24.1±1.6％**22.2±2.1％**，Δ15.7±0.3％ΔΔ10.6±1.0％**，ΔΔ與1組比較**P＜0.01，n＝3；與2/0組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01表5 n＝3與1組比較**P＜0.01，與2/0組比較ΔP＜0.05，
表6A570nmApoA-I(μg/ml) 02.55 101、中性粒細胞 0.16±0.02、中性粒細胞+fMLP 0.20±0.0**0.15±0.0ΔΔ0.13±0.0**，ΔΔ0.12±0.0**，ΔΔn＝3與1組比較**P＜0.01，與2/0組比ΔΔP＜0.01，表7彈性蛋白酶產(chǎn)物(μM)ApoA-I(μg/ml) 0 2.51、中性粒細胞 29.6±1.42、中性粒細胞+fMLP 42.2±0.7**21.5±0.5％**，ΔΔn＝3，與1組比較**P＜0.01，與2/0組比ΔΔP＜0.01表8 Apo A-I抑制激活中性粒細胞釋放髓過氧化酶(MPO)的作用釋放MPO占細胞總MPO活性％ApoA-I(μg/ml) 0 2.5 5101、中性粒細胞 50.4±0.5％2、中性粒細胞+fMLP 93.0±1.0％**58.7±0.9％*’ΔΔ50.8±0.3％ΔΔ46.1±0.6％*’ΔΔn＝3與1組比較*P＜0.05，**P＜0.01與2/0組比ΔΔP＜0.0權利要求
1.載脂蛋白A-I在制備抗內(nèi)毒素藥物中應用。
2.載脂蛋白A-I在制備抑制中性粒細胞、巨噬細胞功能的藥物中應用。
3.載脂蛋白A-I在制備抑制激活中性粒細胞粘附到纖維結合蛋白的藥物中應用。
4.載脂蛋白A-I在制備抑制激活中性粒細胞釋放細胞因子的藥物中應用。
5.載脂蛋白A-I在制備抑制激活中性粒細胞釋放超氧陰離子的藥物中應用。
6.載脂蛋白A-I在制備抑制激活中性粒細胞釋放髓過氧化酶的藥物中應用。
7.載脂蛋白A-I在制備抑制激活中性粒細胞釋放彈性蛋白酶的藥物中應用。
8.載脂蛋白A-I在制備抑制激活巨噬細胞釋放細胞因子的藥物中應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于制藥領域，涉及載脂蛋白A－I在制藥中的新用途。本發(fā)明經(jīng)動物實驗和細胞實驗證實，Apo A－I在機體急性相反應如微生物和寄生蟲感染性炎癥；內(nèi)毒素休克；急性胰腺炎、心腦梗塞、燒傷等非感染性炎癥引起組織壞死等時，具有直接抗內(nèi)毒素、抑制非特異性免疫細胞功能作用。本發(fā)明Apo A－I能保護機體免受內(nèi)毒素和細胞因子大量釋放而導致對機體的嚴重損傷，為機體急性相反應時直接對抗內(nèi)毒素和抑制細胞因子釋放提供一條新的特效治療途徑。
文檔編號A61P7/00GK1544086SQ200310108689
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月19日 優(yōu)先權日2003年11月19日
發(fā)明者吳滿平, 馬娟, 廖雪玲 申請人:復旦大學