專利名稱：生物－合成基質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織改造(tissue engineering)領(lǐng)域，并具體涉及包含適合體內(nèi)使用的水凝膠的生物-合成基質(zhì)(bio-synthetic matrix)。
背景技術(shù)：
組織改造是快速發(fā)展的領(lǐng)域，其包含許多以取代或恢復(fù)組織和器官功能為目的的技術(shù)。組織改造中的重要目的是通過利用可整合到現(xiàn)存組織中的物質(zhì)而使缺陷組織再生，從而恢復(fù)正常組織功能。因此組織改造需要這樣的材料，其可支持細(xì)胞過度生長，向內(nèi)生長(in-growth)或進(jìn)行包裹(encapsulation)，以及在很多情況下支持神經(jīng)再生。
聚合物組合物在組織改造中有廣泛的用途。天然生物-聚合物例如膠原蛋白，纖維蛋白，藻酸鹽(酯)和瓊脂糖已知是非細(xì)胞毒性的并且支持生活細(xì)胞的過度生長，向內(nèi)生長和進(jìn)行包裹。然而來自天然聚合物的基質(zhì)通常不夠堅固(robust)因此不能用于移植。反之，從合成聚合物制備的基質(zhì)可以配制成顯示預(yù)定的物理性質(zhì)例如凝膠強度，以及生物性質(zhì)例如降解能力。關(guān)于天然聚合物的合成類似物例如聚賴氨酸，聚(乙烯亞胺)等能顯示細(xì)胞毒效應(yīng)的報導(dǎo)(Lynn & Langer，J.Amer.Chem.Soc.，12210761-10768(2000))導(dǎo)致了用于組織改造的可選合成共聚物的發(fā)展。
水凝膠是交聯(lián)的，水不溶性的，含水的聚合物，其提供了良好的生物相容性并且誘導(dǎo)血栓，結(jié)殼以及炎癥的傾向降低，并由此為用于組織改造的理想候選物。水凝膠在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用是已知的(見例如，A.Atala和R.P.Lanza編輯，“Methods in Tissue Engineering”Academic Press，San Diego，2002)。已經(jīng)描述了各種用于體內(nèi)的水凝膠(見例如Jeong等，Adv.Drug Deliv.Rev.，5437-51(2002)的綜述)。例如，基于N-異丙基丙烯酰胺(NiPAAm)的水凝膠以及其特定共聚物是非毒性的并能夠在體外支持所包裹的細(xì)胞的生長(Vernon等，Macromol.Symp.，109155-167(1996)；Stile等，Macromolecules，327370-9(1999)；Stile等，Biomacromolecules 3591-600(2002)；Stile等，Biomacromolecules 2185-194(2001)；Webb等，MUSC Orthopaedic J.，318-21(2000)；An等，美國專利6,103,528)。已描述將溫度敏感的NiPAAm聚合物用于免疫分析中(美國專利4,780,409)。然而，盡管對合成條件進(jìn)行操縱和增強對生物相容性的改善，仍然難以獲得密合的宿主植入物界面并實現(xiàn)將水凝膠植入物整合入宿主(Hicks等，SurvOphthalmol.42175-189(1997)；Trinkaus Randall和Nugent，J.ControlledRelease 53205-214(1998))。
已有關(guān)于利用第二天然衍生的聚合物修飾合成聚合物凝膠以產(chǎn)生互相貫穿的聚合物網(wǎng)絡(luò)(“IPN”)結(jié)構(gòu)的報道(例如，見Gutowska等，Macromelecules，27；4167(1994))；Yoshida等，Nature 374240(1995)；Wu&Jiang，美國專利6,030,634；Park等，美國專利6,271,278)。然而，這些結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性通常在通過培養(yǎng)基和通過生理液進(jìn)行天然衍生成分的提取時被破壞。天然衍生聚合物在體內(nèi)也傾向于快速發(fā)生生物降解從而導(dǎo)致體內(nèi)植入物的穩(wěn)定性被破壞。
也描述了包含交聯(lián)的聚合物組合物的更穩(wěn)定的水凝膠。例如美國專利6,388,047描述了含有親水大分子單體和親水聚合物的組合物，其中的組分通過自由基聚合反應(yīng)相互交聯(lián)而形成水凝膠。美國專利6,323,278描述了一種交聯(lián)的聚合物組合物，其可在原位形成并包含兩種合成聚合物，一種含有多個親電子的基團(tuán)而另一個含有多個親核基團(tuán)。美國專利6,388,047和6,384,105都描述了必須通過自由基化學(xué)法進(jìn)行交聯(lián)的系統(tǒng)，這需要利用已知為細(xì)胞毒性的引發(fā)劑(偶氮化合物，過硫酸鹽(酯))，如果所述水凝膠用于組織或用于包裹細(xì)胞則可產(chǎn)生副作用。
美國專利6,384,105描述了可注射的、可生物降解的聚合物合成物，其包含聚(丙烯延胡索酸酯)和聚(乙二醇)-二甲基丙烯酸酯，其可以進(jìn)行原位交聯(lián)。本專利中所述的水凝膠主要基于具有聚環(huán)氧乙烷骨架聚合物的聚合物。雖然這些聚合物已知是生物相容的，其支持細(xì)胞生長的能力是不確定的。
美國專利6,566,406描述了生物相容的交聯(lián)水凝膠，其從具有能在原位進(jìn)行反應(yīng)和交聯(lián)的親電子和親核基團(tuán)的水可溶性前體形成。所述前體被描述為聚烯化氧(polyalkylene oxide)和交聯(lián)物。如上所述，聚烯化氧骨架聚合物支持細(xì)胞生長的能力是不確定的。
因此仍需要改良的基質(zhì)，其是生物相容的、足夠堅固以作為植入物起作用，并可在體內(nèi)支持細(xì)胞生長。
提供該背景技術(shù)是為了公開本申請人認(rèn)為與本發(fā)明可能有關(guān)的信息。無需承認(rèn)或不應(yīng)理解為任何前述信息構(gòu)成與本發(fā)明相抵觸的現(xiàn)有技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供生物-合成基質(zhì)及其用途。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了適合制備生物-合成基質(zhì)的合成共聚物，其包含一或多種N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體，一或多種親水性共聚單體以及經(jīng)衍生含有能交聯(lián)生物活性分子的側(cè)(pendant)活性部分的一或多種丙烯酰基-或甲基丙烯?；?羧酸共聚單體，所述合成共聚物的數(shù)均分子量為約2,000-約1,000,000。
本發(fā)明另一方面涉及生物-合成基質(zhì)，其包含合成共聚物，生物-聚合物和含水溶劑，其中所述合成共聚物和生物-聚合物相互交聯(lián)而形成水凝膠。
本發(fā)明另一方面涉及所述生物-合成基質(zhì)作為組織再生中的支架的用途，其可用于取代動物中破壞的或去除的組織或包裹手術(shù)植入物。
本發(fā)明另一方面涉及一種組合物，其包含一或多種生物活性劑或多個細(xì)胞；本發(fā)明的合成共聚物；生物-聚合物；和含水溶劑。
本發(fā)明另一方面涉及用于組織改造中的包含預(yù)形成的生物-合成基質(zhì)的植入物，所述基質(zhì)包含含水溶劑和與本發(fā)明的合成共聚物交聯(lián)的生物-聚合物。
本發(fā)明另一方面涉及所述植入物作為人工角膜的用途。
本發(fā)明另一方面涉及制備合成共聚物的方法，包括(a)在引發(fā)劑存在的條件下，將一或多種N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體，一或多種親水性共聚單體以及經(jīng)衍生含有側(cè)(pendant)交聯(lián)部分的一或多種丙烯酰基-或甲基丙烯?；?羧酸共聚單體分散在溶劑中；(b)使得所述N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體，親水性共聚單體以及丙烯?；?或甲基丙烯?；?羧酸共聚單體發(fā)生聚合以形成合成共聚物，和(c)可選地純化所述合成共聚物；制備生物-合成基質(zhì)的方法，包括制備合成共聚物，將所述合成共聚物以及生物共聚物分散到含水培養(yǎng)基中，并使得所述合成共聚物和生物聚合物發(fā)生交聯(lián)以提供生物-合成基質(zhì)。
附圖簡述

圖1描述了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的三元共聚物的一般結(jié)構(gòu)，所述三元共聚物包含N-異丙基丙烯酰胺(NiPAAm)，丙烯酸(AAc)和N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(ASI)。
圖2表示根據(jù)本發(fā)明一個實施方案將從生物-合成基質(zhì)制備的人工角膜移植到豬中的臨床后果。
圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案從生物-合成基質(zhì)制備人工角膜并將其移植到豬中后6周時，體內(nèi)共聚焦顯微鏡檢的結(jié)果。
圖4顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案從生物-合成基質(zhì)制備人工角膜并將其移植到豬中后，在體內(nèi)檢測角膜敏感性的結(jié)果。
圖5，6和7顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案從生物-合成基質(zhì)制備人工角膜并將其移植到豬中后，對所述人工角膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)評估的結(jié)果。
圖8顯示(A)根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，含有交聯(lián)的生物活性的三元共聚物的結(jié)構(gòu)，(B)由交聯(lián)的膠原蛋白和(A)中所示的三元共聚物組成的角膜支架；和(C)僅顯示由熱敏凝膠化的膠原蛋白組成的角膜支架。
圖9和10顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案將含有膠原蛋白和三元共聚物-生物活性劑的水凝膠遞送到小鼠和大鼠腦中的結(jié)果。
圖11顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，來自縫合拉開測驗的模量(modulus)(A)和破裂應(yīng)力(B)與水凝膠基質(zhì)中N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺與膠原蛋白胺基之濃度比的函數(shù)關(guān)系。
圖12顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在可見光區(qū)的光的透射(A)和反向散射(back scattering)(B)與水凝膠基質(zhì)中N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺與膠原蛋白胺基基團(tuán)之濃度比的函數(shù)關(guān)系。
圖13顯示根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，在可見光區(qū)的光的透射(A)和反向散射(B)與水凝膠基質(zhì)中N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺與膠原蛋白胺基基團(tuán)之濃度比的函數(shù)關(guān)系。
圖14顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案包含水凝膠的豬角膜植入物的觸覺敏感性恢復(fù)。
圖15顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，通過薄層角膜成形術(shù)(lamellarkeratoplasty)進(jìn)行豬角膜移植手術(shù)和包含水凝膠的6周植入物的臨床體內(nèi)共聚焦顯微鏡圖像。D-F中的條(bar)＝25μm，G-O中的條＝15μm。
圖16顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，接受含水凝膠的角膜植入物的豬的術(shù)后角膜再生。A-F，G-I，J-L，M-O，P-R的條分別為100μm，40μm，200nm，20μm，30μm。
圖17顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，接受包含水凝膠的角膜植入物的豬在手術(shù)后6周的植入物-宿主術(shù)后整合。在各種情況下條均＝100μm。
圖18顯示根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，接受含水凝膠的角膜植入物的豬中的植入物的角膜觸覺敏感性。
圖19顯示對各種水凝膠基質(zhì)的神經(jīng)支配相容性檢測的結(jié)果。
圖20顯示各種水凝膠的上皮細(xì)胞生長和分層。(A)水凝膠上的上皮生長的低倍放大圖像(插入圖像為高倍放大圖像)和(B)在水凝膠上生長的上皮的細(xì)胞厚度計數(shù)。
發(fā)明內(nèi)容應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文公開的具體處理步驟和材料，而是擴展到本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到的其相當(dāng)物。應(yīng)理解所用術(shù)語是只為了描述具體實施例而非用于限定。
定義除非另有定義，本發(fā)明所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。
本文所用的術(shù)語“水凝膠”指交聯(lián)的聚合物質(zhì)，其顯示在水或含水溶液中膨脹而不溶解的能力，并在其結(jié)構(gòu)內(nèi)保持顯著部分的水或含水溶液。
本文所用的術(shù)語“聚合物”指由連接在一起的各個單體組成的分子。在本發(fā)明中，聚合物可包含“尾對尾”連接形成線形分子的單體，或可包括互相連接形成分支結(jié)構(gòu)的單體。
本文所用的術(shù)語“單體”指簡單的有機分子，其能單獨或與其它類似的有機分子一起形成長鏈，從而得到聚合物。
本文所用的術(shù)語“共聚物”指包含兩種或多種不同單體的聚合物。共聚物可以是規(guī)則的，無規(guī)的，嵌段的或接枝的。規(guī)則的共聚物指其中的單體以規(guī)則的形式重復(fù)的共聚物(例如對于單體A和B，規(guī)則共聚物具有序列ABABABAB)。無規(guī)的共聚物是其中每個單獨的聚合物分子中不同單體以隨機或統(tǒng)計的方式排列的共聚物(例如對于單體A和B，無規(guī)共聚物可具有序列AABABBABBBAAB)。反之，嵌段共聚物是其中在每個單獨的聚合物分子中不同單體分成離散的區(qū)的共聚物(例如對于單體A和B，嵌段共聚物具有序列AAABBBAAABBB)。接枝的共聚物指通過將聚合物或一種類型的聚合物連接到組成不同的另一種類型的聚合物分子上而形成的共聚物。
本文所用的術(shù)語“三元共聚物”指含有三種不同單體的共聚物。
本文所用的術(shù)語“生物-聚合物”指天然存在的聚合物。天然存在的聚合物包括，但不限于蛋白質(zhì)和碳水化合物。術(shù)語“生物-聚合物”還包括天然存在的聚合物的衍生形式，其經(jīng)過修飾以便于交聯(lián)到本發(fā)明的合成聚合物上。
本文所用的術(shù)語“合成聚合物”指非天然存在、可通過化學(xué)或重組合成產(chǎn)生的聚合物。
本文所用的術(shù)語“烷基”和“低級烷基”可互換使用，指1-8個碳原子的直鏈或支鏈烷基基團(tuán)或3-8個碳原子的環(huán)烷基基團(tuán)。這些術(shù)語的實例還包括甲基，乙基，正-丙基，異-丙基，正-丁基，叔-丁基，1-丁基(或2-甲基丙基)，異-戊基，正-戊基，己基，環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基等。
本文所用的術(shù)語“生物活性劑”指在體內(nèi)顯示生理、治療或診斷效應(yīng)的分子或化合物。生物活性劑可以是有機或無機的。代表性的實例包括蛋白，肽，碳水化合物，核酸及其片段，抗腫瘤和抗贅生物(anti-neoplastic)化合物，抗病毒化合物，抗炎化合物，抗生素化合物例如抗真菌和抗細(xì)菌化合物，降膽固醇化合物，止痛劑，醫(yī)用診斷顯像用的造影劑，酶，細(xì)胞因子，局部麻醉藥，激素，抗血管生成劑，神經(jīng)遞質(zhì)，治療性寡核苷酸，病毒顆粒，載體，生長因子，類視色素(retinoids)，細(xì)胞粘附因子，細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白(例如層粘連蛋白)，激素，成骨因子，抗體和抗原。
本文所用的術(shù)語“生物相容性”指摻入生物系統(tǒng)例如動物的器官或組織，而不刺激免疫和/或炎癥反應(yīng)、纖維化或其它不良組織反應(yīng)的能力。
本文所用的術(shù)語“約”指與所示值偏差+/-10％。應(yīng)理解無論具體說明與否，這種偏差總包括在本文提供的給定值中。
1.生物-合成基質(zhì)本發(fā)明提供了包含水凝膠的生物-合成基質(zhì)，其通過使合成聚合物與生物-聚合物交聯(lián)而形成。生物-聚合物可以是天然存在的形式，或者可以經(jīng)過衍生而便于交聯(lián)到合成聚合物上。基質(zhì)是堅固的、生物相容的且是非細(xì)胞毒性的?；|(zhì)可以在中性pH在含水溶液中形成，并可經(jīng)過修飾以進(jìn)一步包含一或多種生物活性劑，例如生長因子，類視色素，細(xì)胞粘附因子，酶，肽，蛋白質(zhì)，核苷酸，藥物等。生物活性因子可與合成聚合物共價結(jié)合，或者可根據(jù)該基質(zhì)的最終用途的需要而被包裹并分散在最終基質(zhì)中?；|(zhì)還可包含包裹并分散于其中的細(xì)胞，所述細(xì)胞可在將該基質(zhì)置于體內(nèi)時增殖和/或分化。
在本發(fā)明的一個實施方案中，生物-合成基質(zhì)支持細(xì)胞生長。這種細(xì)胞生長可以是上皮和/或內(nèi)皮表面的覆蓋(即二維，2D，生長)和/或包括向基質(zhì)本身內(nèi)部生長的三維(3D)細(xì)胞生長。
在本發(fā)明的另一實施方案中，生物-合成基質(zhì)支持神經(jīng)向內(nèi)生長。本領(lǐng)域已知，神經(jīng)向移植的組織內(nèi)部的生長在較長的時間內(nèi)發(fā)生，通常是數(shù)月或數(shù)年。神經(jīng)向基質(zhì)內(nèi)部的生長可能比神經(jīng)向移植的組織內(nèi)生長快得多，從而導(dǎo)致功能組織的快速再生，例如神經(jīng)向內(nèi)生長可在數(shù)周內(nèi)發(fā)生。
生物-合成基質(zhì)可經(jīng)改造用于具體用途。例如，基質(zhì)可用于組織改造應(yīng)用，并為此目的預(yù)形成為具體的形狀。該基質(zhì)可用作藥物遞送載體以在動物機體的具體位點持續(xù)釋放治療或診斷化合物。
為了適合用于組織改造的體內(nèi)移植，生物-合成基質(zhì)必須在生理溫度下保持其形狀，在水中基本不溶，足夠堅固并支持細(xì)胞生長。該基質(zhì)支持神經(jīng)的生長也是合乎需要的。
1.1合成聚合物根據(jù)本發(fā)明，可摻入生物-合成基質(zhì)中的合成聚合物是這樣的共聚物，其包含一或多種丙烯酰胺衍生物，一或多種親水性共聚單體和含有側(cè)可交聯(lián)部分的一或多種衍生型(derivatised)羧酸共聚單體。
本文所用的“丙烯酰胺衍生物”指N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。適合用于本發(fā)明的合成聚合物中的丙烯酰胺衍生物包括，但不限于N-甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺(NiPAAm)、N-辛基丙烯酰胺、N-環(huán)己基丙烯酰胺、N-甲基-N-乙基丙烯酰胺、N-甲基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N-異丙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二環(huán)己基丙烯酰胺、N-甲基-N-環(huán)己基丙烯酰胺、N-丙烯酰吡咯烷、N-乙烯基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)、N-甲基丙烯酰吡咯烷及其混合物。
本文的“親水性共聚單體”指能夠與丙烯酰胺衍生物和合成聚合物的衍生型羧酸組分發(fā)生共聚的親水單體。選擇親水共聚單體以提供聚合用的適當(dāng)溶解性、共聚物的水溶性并且最終的共聚物和水凝膠無需相轉(zhuǎn)變。適宜的親水性共聚單體例如親水的丙烯酰基-或甲基丙烯?；?化合物例如羧酸，包括丙烯酸、甲基丙烯酸及其衍生物、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、親水的丙烯酰胺衍生物、親水的甲基丙烯酰胺衍生物、親水的丙烯酸酯、親水的甲基丙烯酸酯、乙烯基乙醇及其衍生物和乙二醇。所述羧酸和衍生物可以是例如丙烯酸、甲基丙烯酸、2-羥乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)或其組合物。親水性丙烯酰胺衍生物的實例包括但不限于N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲基氨基)乙基丙烯酰胺、2-(N，N-二乙基氨基)乙基丙烯酰胺、N，N-二乙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二乙基氨基)乙基甲基丙烯酰胺、N-乙烯基-2-吡咯酮或其混合物。親水性丙烯酸酯的實例包括但不限于2-(N，N-二乙基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(N，N-二甲基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(N，N-二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、2-(N，N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯或其混合物。
本文所用的“衍生型羧酸共聚單體”指親水的丙烯酰基-或甲基丙烯?；?羧酸，例如，丙烯酸、甲基丙烯酸或其取代的形式，其經(jīng)化學(xué)衍生以含有一或多種交聯(lián)的部分，例如琥珀酰亞胺基團(tuán)、咪唑、苯并三唑和對硝基苯酚。術(shù)語“琥珀酰亞胺基團(tuán)”意圖包括各種種類的琥珀酰亞胺基團(tuán)，例如磺基琥珀酰亞胺基團(tuán)。其它類似的結(jié)構(gòu)例如2-(N-嗎啉代)乙磺酸對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員也是顯而易見的。本發(fā)明中，選作交聯(lián)部分的基團(tuán)用于增加與之相連的羧酸基團(tuán)對伯胺(即-NH2基團(tuán))和巰基(即-SH基團(tuán))的反應(yīng)性。對用于合成聚合物中的羧酸共聚單體進(jìn)行衍生的適宜基團(tuán)的實例包括但不限于N-琥珀酰亞胺、N-琥珀酰亞胺-3-磺酸、N-苯并三唑、N-咪唑和對硝基苯酚。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述合成聚合物包括(a)通式I的一或多種丙烯酰胺衍生物
其中R1，R2，R3，R4和R5獨立地選自H或低級烷基；(b)具有通式II的一或多種親水性共聚單體(可以和(a)相同或不同) 其中Y是O或不存在；R6，和R7獨立地選自H或低級烷基；R8是H，低級烷基或-OR’，其中R’是H或低級烷基；且R9是H，低級烷基或-C(O)R10，且R10是-NR4R5或-OR”，其中R”是H或CH2CH2OH；和(c)具有通式III的一或多種衍生的羧酸 其中R11，R12和R13獨立地選自H或低級烷基；且Q是N-琥珀酰亞胺基、3-磺基-琥珀酰亞胺(鈉鹽)、N-苯并三唑基，N-咪唑基或?qū)?硝基苯基。
一個實施方案中，合成聚合物包含通式I的一或多種丙烯酰胺衍生物，通式II的一或多種親水性共聚單體和通式III的一或多種衍生的羧酸，如上所述，其中術(shù)語“低級烷基”指具有1-8個碳原子的支鏈或直鏈烷基基團(tuán)。
在另一實施方案中，合成聚合物包含通式I的一或多種丙烯酰胺衍生物，通式II的一或多種親水性共聚單體和通式III的一或多種衍生的羧酸，如上所述，其中術(shù)語“低級烷基”指具有3-8個碳原子的環(huán)烷基基團(tuán)，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
共聚物可以是線形或分支的，規(guī)則，無規(guī)或嵌段的。根據(jù)本發(fā)明，最終合成聚合物包含許多可用于適當(dāng)?shù)纳锓肿拥慕宦?lián)或接枝的側(cè)反應(yīng)性部分。
本領(lǐng)域技術(shù)人員理解術(shù)語“丙烯酰胺衍生物”包括的化合物組和術(shù)語“親水性共聚單體”包括的化合物組基本上重疊，并且可選擇單個單體以實現(xiàn)所述共聚物中這些組分的功能。因此，例如當(dāng)選擇具有充分親水性的丙烯酰胺衍生物使得合成共聚物具有所需的性質(zhì)時，可選擇與所選丙烯酰胺衍生物相同的親水性共聚單體成分，得到只含有兩種不同的單體的共聚物(即，所述丙烯酰胺衍生物/親水性共聚單體和衍生的羧酸共聚單體)。另一方面，當(dāng)需要高于所選的丙烯酰胺衍生物的親水性時，可選擇一種或多種不同的親水性共聚單體，得到包含至少三種不同的單體的共聚物。
本發(fā)明一個實施方案中，用于制備合成聚合物的丙烯酰胺衍生物和親水性共聚單體是相同的。另一實施方案中，用于制備合成聚合物的丙烯酰胺衍生物和親水性共聚單體是不同的。
控制共聚物的總體親水性以便使其在0℃到生理溫度具有水溶性而不發(fā)生沉淀或相轉(zhuǎn)變。在本發(fā)明一個實施方案中，共聚物在約0℃-約37℃是水溶性的。
共聚物應(yīng)當(dāng)在含水溶液中具有充分的溶解度以促進(jìn)水凝膠的形成。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，術(shù)語“水溶性”指共聚物的水溶性為至少約0.5重量/體積(w/v)％。在另一實施方案中，共聚物的水溶性為約1.0w/v％-約50w/v％。在另一實施方案中，共聚物的水溶性為約5w/v％和約45w/v％并在約10％w/v-約35％w/v之間。
本領(lǐng)域已知大多數(shù)合成聚合物具有分子量分布，且分子量的各種不同平均值通常不同，例如數(shù)均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)。合成聚合物的分子量通常通過其數(shù)均分子量(Mn)定義，數(shù)均分子量又由niMi之和除以ni之和定義，其中ni是質(zhì)量Mi分布中的分子數(shù)。用于本發(fā)明的基質(zhì)中的合成聚合物通常具有的數(shù)均分子量(Mn)為2,000-1,000,000。在本發(fā)明一個實施方案中，聚合物的Mn為約5,000-約90,000。本發(fā)明另一實施方案中，聚合物的Mn為約25,000-約80,000。另一實施方案中，聚合物的Mn為約30,000-約50,000。另一實施方案中，聚合物的Mn為約50,000-約60,000。
本領(lǐng)域還已知特定水溶性聚合物顯示較低的臨界溶解溫度(LCST)或“濁點”。聚合物的LCST是相分離發(fā)生時的溫度(即，聚合物開始從周圍含水介質(zhì)中分離)。通常，對于那些透明的聚合物或水凝膠，LCST還對應(yīng)開始喪失透明性的點。很明顯對于特定的組織改造應(yīng)用，最終水凝膠中相分離的存在與否可能無關(guān)，條件是水凝膠仍支持細(xì)胞生長。但對于其他用途，最終水凝膠中缺乏相分離可能是重要的。例如，對于光學(xué)應(yīng)用，透明性(且因此缺乏任何相轉(zhuǎn)變)是重要的。
因此，根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，選擇LCST在約35℃-約60℃的共聚物用于水凝膠中。在另一實施方案中，選擇LCST在約42℃-約60℃的共聚物用于水凝膠中。本領(lǐng)域還已知聚合物的LCST可受存在的多種溶質(zhì)例如離子或蛋白質(zhì)的影響，并受交聯(lián)或附著到該聚合物的化合物的性質(zhì)的影響。這種影響可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過經(jīng)驗確定，并且選擇具有合適的LCST的合成聚合物用于特定應(yīng)用中是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
為了使合成聚合物適當(dāng)堅固和熱穩(wěn)定，重要的是當(dāng)將不同單體用于這些組分中時，一或多種丙烯酰胺衍生物與一或多種親水性共聚單體的比例的優(yōu)化。相應(yīng)地，一或多種丙烯酰胺衍生物以最高的摩爾比存在于合成聚合物中。此外，最終聚合物中的一或多種衍生型羧酸共聚單體的數(shù)目將決定合成凝膠與生物合成基質(zhì)中的生物聚合物形成交聯(lián)的能力。選擇各種組分的適宜摩爾比以提供具有所需性質(zhì)的最終合成聚合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，當(dāng)不同單體用作丙烯酰胺衍生物和親水性共聚單體組分時，聚合物中丙烯酰胺衍生物的量為50％-90％，親水性共聚單體的量為5％-50％，衍生型羧酸共聚單體的量為0.1％-15％，其中丙烯酰胺衍生物、親水性共聚單體和衍生型羧酸共聚單體的總量為100％，其中％值代表摩爾比。
本發(fā)明另一實施方案中，合成聚合物利用與丙烯酰胺衍生物以及親水性共聚單體相同的單體制備，且丙烯酰胺衍生物/親水性共聚單體的摩爾比為約50％-約99.5％，且衍生型羧酸共聚單體的摩爾比為約0.5％-約50％。
根據(jù)另一實施方案，丙烯酰胺衍生物和親水性共聚單體的總摩爾比為約80％-約99％且衍生型羧酸共聚單體的摩爾比為約1％-約20％。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解合成聚合物中組分的選擇和比例將在不同程度上取決于所述生物合成基質(zhì)的最終用途。例如，對于眼科用途，重要的是最終基質(zhì)是透明的，而對于組織改造用途，基質(zhì)的透明度可能不是重要的因素。
本發(fā)明另一實施方案中，合成聚合物是無規(guī)或嵌段共聚物，其包含一種丙烯酰胺衍生物、一種親水性共聚單體和一種衍生型羧酸共聚單體(“三元共聚物”)。在另一實施方案中，合成聚合物是三元共聚物，其包含NiPAAm單體、丙烯酸(AAc)單體和衍生型丙烯酸單體。另一實施方案中，合成聚合物是三元共聚物，其包含NiPAAm單體、丙烯酰胺(AAm)單體和衍生型丙烯酸單體。另一實施方案中，所述衍生型丙烯酸單體是N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺。另一實施方案中，三元共聚物是通過以約85∶10∶5摩爾％的進(jìn)料比例包含NiPAAm單體、AAc單體和N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺而制備的。
本發(fā)明另一實施方案中，所述合成聚合物是無規(guī)或嵌段共聚物，其包含一種丙烯酰胺衍生物/親水性共聚單體和一種羧酸共聚單體。另一實施方案中，合成聚合物包含DMAA單體和衍生型丙烯酸單體。另一實施方案中，所述衍生型丙烯酸單體是N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺。另一實施方案中，合成聚合物是通過以約95∶5摩爾％的進(jìn)料比例包含DMAA單體和N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺而制備的。
1.2生物-聚合物生物-聚合物是天然存在的聚合物例如蛋白質(zhì)和碳水化合物。根據(jù)本發(fā)明，生物-合成基質(zhì)包含生物-聚合物或其衍生形式，后者通過其中的側(cè)交聯(lián)部分與所述合成聚合物交聯(lián)。因此，本發(fā)明的生物-聚合物含有一或多種能夠與交聯(lián)部分(例如伯胺或巰基)反應(yīng)，或能經(jīng)衍生化以包含這類基團(tuán)的基團(tuán)。本發(fā)明所用的適宜生物-聚合物的實例包括但不限于膠原蛋白(包括I，II，III，IV和V型)、變性的膠原蛋白(或凝膠)、重組膠原蛋白、纖維蛋白-纖維蛋白原、彈性蛋白、糖蛋白、藻酸鹽(酯)、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素和粘多糖(或蛋白聚糖)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，需要對一些這樣的生物-聚合物進(jìn)行衍生化以使其含有上述適宜的反應(yīng)性基團(tuán)，例如葡糖胺聚糖需要被脫乙?；蛎摿蛩嵋员憔哂胁坊鶊F(tuán)。這種衍生化可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實現(xiàn)并被認(rèn)為是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
適宜用于本發(fā)明的生物-聚合物可購自各種來源或可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從天然來源制備。
1.3生物活性劑如上所述，將包括在本發(fā)明的生物-合成基質(zhì)之內(nèi)的合成聚合物含有大量側(cè)交聯(lián)部分。明顯地，可使合成和生物-聚合物發(fā)生充分的交聯(lián)以獲得適當(dāng)堅固的基質(zhì)，并且所有自由交聯(lián)的基團(tuán)不會發(fā)生發(fā)應(yīng)。過量的基團(tuán)因此可選地用于將所需生物活性劑與基質(zhì)共價連接?？赏ㄟ^交聯(lián)摻入基質(zhì)中的生物活性劑的非限制性實例包括，例如，生長因子，類視色素，酶，細(xì)胞粘附因子，細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白(例如層粘連蛋白，纖連蛋白，腱生蛋白等)，激素，成骨因子，細(xì)胞因子，抗體，抗原和其它生物活性蛋白，某些藥物化合物以及肽，源自生物活性蛋白質(zhì)的片段或基序(motifs)。
本發(fā)明一個實施方案中，交聯(lián)基團(tuán)為琥珀酰亞胺基團(tuán)且用于接枝到聚合物上的適宜的生物活性劑含有伯胺或巰基，或者可容易被衍生化以含有這些基團(tuán)的那些生物活性劑。
2.生物-合成基質(zhì)的制備方法2.1合成聚合物的制備合成聚合物的組分的共聚作用可通過使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(例如，見A.Ravve“Principles of Polymer Chemistry”，Chapter 3，Plenum Press，New York 1995)。通常，適宜量的每種單體在引發(fā)劑的存在下分散在適宜的溶劑中?；旌衔锉３衷谶m宜的溫度下，并使所述共聚作用進(jìn)行預(yù)定的時間?？赏ㄟ^常規(guī)方法例如沉淀從混合物中純化所得的聚合物。
共聚反應(yīng)的溶劑在一或多種單體對水解敏感時可以是非水性溶劑，或可以是含水溶劑。適宜的含水溶劑包括，但不限于水、緩沖液和鹽溶液。適宜的非水性溶劑通常為環(huán)酯(例如二噁烷)，氯化的烴(例如氯仿)或芳香烴(例如苯)。如需要，所述溶劑可以在使用前用氮凈化。在本發(fā)明一個實施方案中，所述溶劑是非水性溶劑。在另一實施方案中，所述溶劑是二噁烷。
適宜的聚合反應(yīng)引發(fā)劑是本領(lǐng)域已知的并通常為自由基引發(fā)劑。適宜的引發(fā)劑的實例包括但不限于，2，2′-偶氮二異丁腈(AIBN)，其它偶氮化合物，例如2，2′-偶氮二-2-乙基丙腈；2，2′-偶氮二-2-環(huán)丙基丙腈；2，2′-偶氮二環(huán)己腈；2，2′-偶氮二環(huán)辛腈，和過氧化物，例如聯(lián)苯甲酰過氧化物及其取代的類似物，以及過硫酸鹽，例如過硫酸鈉、過硫酸鉀等。
一旦制備了聚合物并在需要時進(jìn)行純化，可通過各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)表征所述聚合物。例如，所述聚合物的摩爾比組成可通過核磁共振譜(質(zhì)子和/或碳-13)測定，而鍵結(jié)構(gòu)可通過紅外光譜確定。分子量可通過凝膠滲透色譜和/或高壓液相色譜確定。如需要，也可對所述聚合物進(jìn)行熱定性，可例如利用差示掃描熱分析通過測定熔點和玻璃轉(zhuǎn)變溫度(glass transition temperature)進(jìn)行。含水溶液性質(zhì)例如膠束和凝膠形成，以及LCST可利用肉眼觀察、熒光光譜、UV-可見光譜以及激光散射儀器測定。
本發(fā)明的一個實施方案中，合成聚合物通過在引發(fā)劑AIBN存在的條件下將單體分散在氮-凈化的二噁烷中，并使得聚合反應(yīng)在約60℃-70℃進(jìn)行來制備。通過重復(fù)沉淀來純化所得的聚合物。
2.2水凝膠的制備合成聚合物與生物-聚合物的交聯(lián)可通過將適量的每種聚合物在室溫、適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行混合來實現(xiàn)。通常，所述溶劑是含水溶劑，例如鹽溶液、緩沖溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基，或其稀釋或修飾形式。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，為保持聚合物例如膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)并防止水凝膠的原纖維形成和/或渾濁化，交聯(lián)反應(yīng)應(yīng)在含水介質(zhì)并嚴(yán)格控制pH和溫度的情況下進(jìn)行。用于細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中的較高水平的氨基酸可能引起其與合成聚合物的交聯(lián)部分發(fā)生副反應(yīng)，從而導(dǎo)致這些基團(tuán)不能進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。利用不含氨基酸和其它蛋白質(zhì)物質(zhì)的培養(yǎng)基可有助于防止這些副反應(yīng)，并由此增加在合成聚合物和生物-聚合物之間形成交聯(lián)的數(shù)目。在含水溶液中在室溫或生理溫度下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)使得發(fā)生交聯(lián)和任何剩余交聯(lián)基團(tuán)的極為緩慢的水解。
可供選擇的是，可包括終止步驟以使基質(zhì)中任何剩余的交聯(lián)基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。例如，在含有甘氨酸的適宜緩沖液中進(jìn)行一或多步洗滌可終止(terminate)任何剩余的交聯(lián)基團(tuán)并去除任何在交聯(lián)反應(yīng)期間產(chǎn)生的副產(chǎn)物。未反應(yīng)的交聯(lián)基團(tuán)也可用多官能胺例如賴氨酸或三亞乙基四胺終止，導(dǎo)致形成額外的短鏈間交聯(lián)。如需要，也可僅使用緩沖液進(jìn)行洗滌步驟以便去除任何來自交聯(lián)反應(yīng)的副產(chǎn)物。如果必要，在交聯(lián)步驟以后，可升高交聯(lián)的聚合物懸液的溫度以使得水凝膠充分形成。
根據(jù)本發(fā)明，水凝膠的組分用化學(xué)方法進(jìn)行交聯(lián)以使其基本上不能被提取，即生物-聚合物和合成聚合物在生理條件下不從凝膠中滲出。根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，在生理條件下，24小時之內(nèi)可從基質(zhì)中提取到含水介質(zhì)中的生物-聚合物或合成聚合物的量低于每種組分的重量的5％。另一實施方案中，在生理條件下，24小時之內(nèi)可從基質(zhì)中提取到含水介質(zhì)中的生物-聚合物或合成聚合物的量低于每種組分的重量的2％。另一實施方案中，24小時之內(nèi)可提取的量低于每種組分的重量的1％，低于0.5％重量，和低于0.2％重量。
可從所述基質(zhì)提取到含水介質(zhì)中的生物-聚合物和/或合成聚合物的量可在體外利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如USP Basket法)測定。通常，基質(zhì)置于預(yù)定pH例如約pH 7.4的含水溶液中以模擬生理條件。懸液可被攪拌或不被攪拌。含水溶液的樣品可在預(yù)定的時間間隔取出并通過標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)測定聚合物含量。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，水凝膠中包含的每種聚合物的量取決于所選的聚合物以及水凝膠的預(yù)期用途。通常，使用較高起始量的每種聚合物將導(dǎo)致形成更堅固的凝膠，這是由于水含量較低并且存在較大量的交聯(lián)的聚合物。大量水或含水溶劑將導(dǎo)致水凝膠較軟。根據(jù)本發(fā)明，最終水凝膠包含約20-99.6％重量的水或含水溶劑，約0.1-30％重量的合成聚合物，和約0.3-50％重量的生物-聚合物。
本發(fā)明一個實施方案中，最終水凝膠包含約40-99.6％重量的水或含水溶劑，約0.1-30％重量的合成聚合物以及約0.3-30％重量的生物-聚合物。另一實施方案中，最終水凝膠包含約60-99.6％重量的水或含水溶劑，約0.1-10％重量的合成聚合物和約0.3-30％重量的生物-聚合物。另一實施方案中，最終水凝膠包含約80-98.5％重量的水或含水溶劑，約0.5-5％重量的合成聚合物和約1-15％重量的生物-聚合物。其它實施方案中，最終水凝膠含有約95-97％重量的水或含水溶劑，約1-2％重量的合成聚合物和約2-3％重量的生物-聚合物；以及約94-98％重量的水或含水溶劑，約1-3％重量的合成聚合物和約1-3％重量的生物-聚合物。
類似地，包含在水凝膠中的每種聚合物的相對量取決于所用的合成聚合物和和生物-聚合物的類型以及水凝膠的預(yù)期用途。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，生物-聚合物和合成聚合物的相對量將在各方面影響最終凝膠的性質(zhì)，例如較高量的生物-聚合物將產(chǎn)生很硬的水凝膠。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解最終基質(zhì)中每種聚合物的相對量可用生物-聚合物∶合成聚合物的重量重量比值或反應(yīng)性基團(tuán)的重量重量比描述。本發(fā)明中生物-聚合物∶合成聚合物的重量重量比為約1∶0.07～約1∶14。一種實施方案中，生物-聚合物∶合成聚合物的w/w比是1∶1.3～1∶7。另一實施方案中，生物-聚合物∶合成聚合物的w/w比是1∶1～1∶3。另一實施方案中，生物-聚合物∶合成聚合物的w/w比是1∶0.7～1∶2。
本發(fā)明另一可選實施方案中，基質(zhì)包括蛋白型生物-聚合物和含有N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺側(cè)基的合成聚合物。本發(fā)明該實施方案中，生物-聚合物∶合成聚合物之比描述為生物-聚合物中的游離胺基團(tuán)與N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺基團(tuán)摩爾當(dāng)量之比，所述比值為1∶0.5～1∶20。另一實施方案中，所述比值是1∶1.8～1∶10。另一實施方案中，所述比值是1∶1～1∶5，和1∶1～1∶3。
2.3將生物活性劑摻入生物-合成基質(zhì)中如需要，可通過側(cè)交聯(lián)部分將生物活性劑與合成聚合物共價結(jié)合(或“接枝”)，或者將其包裹在所述基質(zhì)中，將生物活性劑摻入基質(zhì)中?？膳c基質(zhì)的合成聚合物組分共價連接的生物活性劑的實例在上文描述。如有必要，生物活性劑可首先通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行衍生化以提供可與交聯(lián)基團(tuán)反應(yīng)的適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性基團(tuán)。為與生物活性劑共價結(jié)合，首先將合成聚合物與生物活性劑反應(yīng)，然后將這種修飾后的合成聚合物如上述與生物-聚合物進(jìn)行交聯(lián)。生物活性劑與合成聚合物的反應(yīng)可在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行，例如通過將生物活性劑和合成聚合物一起混合在非水性溶劑中，所述溶劑例如N，N-二甲基甲酰胺，二噁烷，二甲基亞砜和N，N-二甲基丙烯酰胺。使用非水性溶劑避免了在摻入生物活性劑的過程中反應(yīng)性基團(tuán)的水解?？晒┻x擇的是，所述反應(yīng)可如上述在用于交聯(lián)反應(yīng)的含水溶液中進(jìn)行。
不適合接枝到聚合物的生物活性劑可包埋(entrap)在最終基質(zhì)中，所述生物活性劑例如不含有和合成聚合物中的可交聯(lián)基團(tuán)反應(yīng)的伯胺或游離巰基基團(tuán)，或者不被衍生為具有這種基團(tuán)的那些生物活性劑?？砂裨诨|(zhì)中的生物活性劑的實例包括但不限于藥物、診斷試劑、病毒載體、核酸等。為進(jìn)行包埋，在混合所述合成聚合物和生物-聚合物以形成交聯(lián)的水凝膠之前，將生物活性劑加入適當(dāng)?shù)娜軇┲械暮铣删酆衔锶芤褐小？晒┻x擇的是，生物活性劑可在交聯(lián)步驟之前加入含有合成和生物-聚合物的溶液中。將生物活性劑混合到聚合物溶液中，使得它基本上均勻分散于其中，并且隨后如上述形成水凝膠。用于生物活性劑的適當(dāng)溶劑取決于所述試劑的性質(zhì)，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定。
2.4細(xì)胞在生物-合成基質(zhì)中的包埋本發(fā)明的生物-合成基質(zhì)還可包含包埋于其中的細(xì)胞，并使得將所述細(xì)胞遞送到體內(nèi)的組織或器官。多種不同細(xì)胞類型可利用所述生物基質(zhì)遞送，例如肌細(xì)胞，視覺細(xì)胞(例如來自不同角膜層)，脂肪細(xì)胞，纖維肌肉母細(xì)胞，外胚層細(xì)胞，肌肉細(xì)胞，成骨細(xì)胞(即骨細(xì)胞)，軟骨細(xì)胞(即軟骨的細(xì)胞)，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，胰腺的細(xì)胞，肝細(xì)胞，膽管的細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，生殖泌尿細(xì)胞(包括腎細(xì)胞)，或其組和?；|(zhì)還可用于將全能干細(xì)胞，多能或定向的祖細(xì)胞或重新定向(reprogrammed)(去分化的)的細(xì)胞遞送到體內(nèi)位點，使得與組織類型相同的細(xì)胞得以產(chǎn)生。間充質(zhì)干細(xì)胞的實例包括可發(fā)生多樣化以產(chǎn)生成骨細(xì)胞(以產(chǎn)生新的骨組織)，軟骨細(xì)胞(以產(chǎn)生新的軟骨組織)和成纖維細(xì)胞(以產(chǎn)生新的結(jié)締組織)的那些細(xì)胞?？晒┻x擇的是，可使用這樣的定向祖細(xì)胞，其能夠增殖以提供和體內(nèi)位點存在的細(xì)胞同一類型的細(xì)胞，所述祖細(xì)胞例如成肌細(xì)胞，成骨細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等。
可在將合成聚合物與生物-聚合物進(jìn)行混合以前，通過將細(xì)胞加入合成聚合物的溶液中而將細(xì)胞包埋于最終基質(zhì)內(nèi)?？晒┻x擇的是，可在交聯(lián)步驟之前，將所述細(xì)胞加入含有合成聚合物和生物-聚合物的溶液中。如需要，可在與細(xì)胞混合之前，將合成聚合物和生物活性劑反應(yīng)。通常，為將細(xì)胞包埋在基質(zhì)中，將各種成分(細(xì)胞，合成聚合物和生物-聚合物)分散在含水培養(yǎng)基中，例如細(xì)胞培養(yǎng)基或其稀釋或修飾的形式。細(xì)胞懸液可溫和地混合到聚合物溶液中，直到所述細(xì)胞基本均勻地分散到所述溶液中，隨后如上述形成水凝膠。
2.5其它要素本發(fā)明還考慮在生物-合成基質(zhì)中可選包含一或多種增強材料以改善所述基質(zhì)的機械性質(zhì)，例如強度，彈性，柔性和/或抗撕性。因此，基質(zhì)可以用柔性或剛性纖維，纖維網(wǎng)，纖維布等加強。這種增強材料的使用是本領(lǐng)域已知的，例如將由膠原蛋白原纖維、氧化的纖維素或聚合物諸如聚乳酸，聚乙醇酸，或聚四氟乙烯等制成的纖維、布或薄片用在可移植的醫(yī)療用途中是已知的。
所述增強材料可以使用標(biāo)準(zhǔn)方案摻入所述基質(zhì)中。例如，可將合成聚合物和生物聚合物在適當(dāng)緩沖液中的含水溶液加入纖維布或網(wǎng)，例如Interceed(EthiconInc.，New Brunswick，N.J.)。所述含水溶液將在進(jìn)行交聯(lián)前流入所述布或網(wǎng)的空隙中，并由此將形成其中包埋有布或網(wǎng)的水凝膠?？墒褂眠m當(dāng)?shù)哪＞咭员ＷC在需要的時候纖維或纖維網(wǎng)整個包含在水凝膠中。這種合成結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步被洗滌以去除在交聯(lián)反應(yīng)中形成的任何副產(chǎn)物。通常，所用纖維在性質(zhì)上是親水的，以保證其被聚合物的含水溶液完全濕潤。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將理解，對于需要高光學(xué)透明度的用途，應(yīng)當(dāng)選擇所述增強材料的結(jié)構(gòu)以防止光從最終合成基質(zhì)中散射的那些，例如通過使用納米-纖維和/或小心使增強材料與水凝膠的折射率匹配。
3.檢測生物-合成基質(zhì)根據(jù)本發(fā)明，生物-合成基質(zhì)包含加入或沒有加入生物活性劑和/或包裹的細(xì)胞的水凝膠。為了適合用于組織改造目的的體內(nèi)植入，生物-合成基質(zhì)必須在生理溫度保持其形式，充分堅固，并基本上不溶于水，并支持細(xì)胞的生長?；|(zhì)能支持神經(jīng)的生長也是合乎需要的?？扇菀桌斫鈱τ谀承┚唧w的用途，所述基質(zhì)可能需要其它特性。例如，對于外科目的，基質(zhì)可能需要是相對柔性并且其強度足以支持外科手術(shù)中縫線和針的操作，且對于眼科應(yīng)用諸如角膜修復(fù)或置換，基質(zhì)的光學(xué)透明度將是重要的。
3.1物理/化學(xué)檢測當(dāng)用于組織改造時，生物-合成基質(zhì)需要滿足必要的機械參數(shù)，從而防止基質(zhì)用于外科手術(shù)時被撕裂或破裂，并適當(dāng)支持細(xì)胞在該位置生長。基質(zhì)抵抗撕裂的能力與其內(nèi)在機械強度，基質(zhì)的形成和厚度以及所用的壓力有關(guān)。
生物合成基質(zhì)耐受剪切力或撕裂的能力可通過利用兩對鑷子以相反的方向?qū)υ嚇邮┝泶执_定?？晒┻x擇的是，可使用適當(dāng)?shù)墓ぞ邅矶繙y定基質(zhì)耐受剪切力的能力。用于該目的的張力計可從市場上購得，例如購自MTS，Instron和Cole Parmer。
為進(jìn)行檢測，基質(zhì)可形成薄片并切成大小適宜的條?？晒┻x擇的是，基質(zhì)可制成組織改造所需的形狀并且可檢測整個成形的基質(zhì)。為計算可拉伸強度，用該基質(zhì)在破裂時的力或“破裂(failure)力”除以檢測樣品的橫截面積，得到以力(N)/單位面積表示的值?；|(zhì)的硬度(模量)可從應(yīng)力/應(yīng)變(stess/strain)曲線的線性部分的斜率算出。應(yīng)變是在實驗中長度的實時變化除以檢驗開始前待測樣品的初始長度。破裂時的強度是檢測樣品在破裂時的最終長度減去初始檢測樣品的長度，除以該初始長度。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，由于水凝膠的柔軟性以及含水組分在受夾時滲出，難以從水凝膠獲得有意義的拉伸數(shù)據(jù)。例如，可通過對成型的基質(zhì)樣品進(jìn)行縫合拉開測定獲得水凝膠拉伸強度的定量表征。通常，使縫合在離測試樣品邊緣約2mm處，并測量為扯裂樣品上的縫合而需要施加的峰值力。例如，對于用于眼科用途的基質(zhì)的測試樣品，其成型為人角膜的形狀和厚度，將兩個正相反的縫合插入基質(zhì)，這也是眼部植入手術(shù)所需的第一步。這兩處縫合可隨后以約10mm/min在適宜的儀器例如Instron TensileTester上拉開。計算基質(zhì)破裂時的強度，以及在斷裂時的伸長率和彈性模量(見例如，Zeng等人，J.Biomech.，34533-537(2001))。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，對于用于手術(shù)用途的那些生物合成基質(zhì)，基質(zhì)無需與哺乳動物組織強度一樣(即具有相同的抗撕裂能力)。在這種用途中，基質(zhì)強度的決定因素是它是否是由有經(jīng)驗的醫(yī)師仔細(xì)地在該位置進(jìn)行縫合。
如需要，生物合成水凝膠基質(zhì)的LCST可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定。例如，LCST可通過以約0.2℃每分鐘加熱基質(zhì)樣品并目測濁點來計算(見例如H.Uludag，等人，J.Appl.Polym.Sci.75583-592(2000))。
生物合成基質(zhì)的滲透性可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如PBS滲透性評估使用滲透性小室(permeability cell)和/或原子力顯微鏡通過評估基質(zhì)的葡萄糖滲透性系數(shù)和/或平均孔徑來測定。根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，生物合成基質(zhì)的平均孔徑為約90nm-約500nm。另一實施方案中，所述基質(zhì)的孔徑為約100nm-約300nm。
也可利用可測定透射和散射的定制的儀器測定眼科用途的基質(zhì)的光透射和光散射(見例如，Priest and Munger，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.39S352(1998))。
3.2體外檢測容易理解，生物合成基質(zhì)必須是非細(xì)胞毒性的并是生物相容的以適于體內(nèi)應(yīng)用。所述生物合成基質(zhì)的細(xì)胞毒性可利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來評估，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如用于篩選誘變活性的Ames檢測，用于篩選基質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞系中誘導(dǎo)基因突變的能力的小鼠淋巴瘤檢測，以及體外染色體異常檢測，其利用例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)來篩選基質(zhì)誘導(dǎo)的任何DNA重排或損傷。其它檢測包括姊妹染色單體檢測，其測定基質(zhì)誘導(dǎo)的任何染色體臂之間的交換；以及體外小鼠微核檢測，其測定對染色體或有絲分裂紡錘體的任何損害。這些以及其它標(biāo)準(zhǔn)檢測的方案是本領(lǐng)域已知的，例如見OECDGuidelines for the Testing of Chemicals和ISO開發(fā)的方案。
基質(zhì)支持細(xì)胞生長的能力可在體外通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評估。例如，來自適當(dāng)?shù)募?xì)胞系的細(xì)胞，如人上皮細(xì)胞，可直接接種在基質(zhì)上或基質(zhì)周圍的適當(dāng)材料上。在適當(dāng)培養(yǎng)基中生長適當(dāng)時間段后，對基質(zhì)進(jìn)行共聚焦顯微鏡和組織學(xué)檢測以確定細(xì)胞是否在基質(zhì)表面和/或其內(nèi)部生長。
基質(zhì)支持神經(jīng)細(xì)胞向內(nèi)生長的能力也可在體外評估。例如，諸如背根神經(jīng)節(jié)這樣的神經(jīng)源可包埋在基質(zhì)周圍的適當(dāng)材料中或直接插入基質(zhì)中。適當(dāng)?shù)牟牧系膶嵗梢允腔谲浤z原蛋白的凝膠。來自適當(dāng)細(xì)胞系的細(xì)胞可直接種植于基質(zhì)上或基質(zhì)周圍的適當(dāng)材料上，而且基質(zhì)可在適當(dāng)培養(yǎng)基的存在下保溫預(yù)定的時間長度。檢測基質(zhì)的神經(jīng)生長將表明基質(zhì)支持神經(jīng)細(xì)胞向內(nèi)生長的能力，所述檢測可以是直接和/或在神經(jīng)特異性標(biāo)記物的存在下進(jìn)行，例如通過免疫熒光法使用神經(jīng)特異性熒光標(biāo)記物和共聚焦顯微鏡進(jìn)行。
在測定基質(zhì)支持細(xì)胞生長能力的實驗中，可將生長添加劑(growthsupplements)加入培養(yǎng)基和/或基質(zhì)中。所用的具體生長添加劑取決于被評估的細(xì)胞的類型，并可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員容易測定。神經(jīng)細(xì)胞的適當(dāng)添加劑例如包括層粘連蛋白、視黃基乙酸酯、視黃酸和神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)生長因子。
3.3體內(nèi)實驗為檢測生物合成基質(zhì)的生物相容性以及其支持細(xì)胞在體內(nèi)生長的能力，可將基質(zhì)移植到用于免疫原性、炎癥、釋放和降解研究的適當(dāng)哺乳動物模型中并測定細(xì)胞生長。適宜的對照動物可包括在評估中。適宜的對照包括，例如，沒有經(jīng)過手術(shù)的動物，接受了來自供體動物的類似大小的同種異體移植物的動物和/或接受了與標(biāo)準(zhǔn)的、被接受的植入材料類似大小的植入物的動物。
移植后的各個階段，可取活檢來評估細(xì)胞在植入物表面和/或其中的生長，并可用組織學(xué)檢測和免疫組織化學(xué)技術(shù)來確定神經(jīng)向內(nèi)生長是否出現(xiàn)以及炎性或免疫細(xì)胞是否存在于植入位點。例如，可使用本領(lǐng)域已知的各種細(xì)胞特異性染色來評估存在的多種類型的細(xì)胞以及各種細(xì)胞特異性抗體，例如可用來表明神經(jīng)細(xì)胞的存在或不存在的抗神經(jīng)絲抗體。此外，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定神經(jīng)作用電位將表明神經(jīng)是否有功能。體內(nèi)共聚焦顯微鏡檢可用來在選定的術(shù)后時間監(jiān)測動物中的細(xì)胞和神經(jīng)生長。適當(dāng)?shù)臅r候，可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如使用觸覺測量計(esthesiometer)測定觸覺敏感性。觸覺敏感性恢復(fù)表明有功能神經(jīng)的再生。
4.應(yīng)用本發(fā)明提供了一種生物合成基質(zhì)，其是堅固的、生物相容的和非細(xì)胞毒性的，且由此適合用作體內(nèi)組織再生的支架。例如，生物合成基質(zhì)可植入患者體內(nèi)來取代已經(jīng)被破壞或去除的組織，例如傷口覆蓋，作為組織封閉劑或粘合劑，作為皮膚代替品或角膜代替品，或者作為角膜護(hù)片?；|(zhì)可在移植前制成適合的形狀，例如其可被預(yù)成型以填滿組織被破壞或去除而留下的空間?？晒┻x擇的是，當(dāng)用作植入物時，可通過將其組分注入破壞的組織并使聚合物在生理溫度進(jìn)行交聯(lián)并形成凝膠而在原位形成基質(zhì)。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述基質(zhì)被預(yù)制成用于組織改造目的的適當(dāng)形狀。在另一實施方案中，所述基質(zhì)被預(yù)制成整體厚度人工角膜或者適合作為角膜護(hù)片的部分厚度的基質(zhì)。
生物-合成基質(zhì)可單獨使用，并可支持新細(xì)胞在原位的向內(nèi)生長?？晒┻x擇的是，基質(zhì)可在移植前接種細(xì)胞，并支持這些細(xì)胞在體內(nèi)向外生長以修復(fù)和/或取代周圍組織。所述細(xì)胞可來自患者，或者可以在來源上是同種異體或異種的。例如，可從患者收獲細(xì)胞(在修復(fù)組織的手術(shù)前或期間)并在無菌條件下處理以提供具體的細(xì)胞類型例如多能干細(xì)胞，干細(xì)胞或前體細(xì)胞。這些細(xì)胞可如上述接種到基質(zhì)中，并且基質(zhì)可隨后移植到患者體內(nèi)。
基質(zhì)可用來包衣外科植入物以幫助密封組織或者幫助將植入物粘附于組織表面，所述用途例如可通過使水凝膠的合成聚合物組分上的未反應(yīng)的交聯(lián)基團(tuán)和組織中存在的伯胺或巰基形成交聯(lián)來實現(xiàn)。例如，可利用基質(zhì)層來填補角膜穿孔，或用于導(dǎo)管或乳腺植入物來減少纖維化?；|(zhì)也可用于血管移植物或支架，以使血液或血清流體滲漏最小化，用作人工補丁或網(wǎng)以使纖維化最輕，并用于幫助植入物粘附于組織表面。
基質(zhì)也可用作遞送系統(tǒng)，來將生物活性劑遞送到患者體內(nèi)的特定區(qū)域。生物活性劑可作為溶液和合成聚合物及生物聚合物一起遞送，使得含有生物活性劑的基質(zhì)可在原位形成，或者含有生物活性劑的基質(zhì)可預(yù)形成并被植入。一旦進(jìn)入體內(nèi)，生物活性劑可例如通過擴散控制的工藝從基質(zhì)中釋放出來，或如果所述生物活性劑與基質(zhì)共價結(jié)合，其通過酶的作用從基質(zhì)裂解下來并隨后通過擴散控制的工藝釋放出來。可供選擇的是，生物活性劑可在基質(zhì)內(nèi)顯示其作用。
本發(fā)明一個實施方案中，生物合成基質(zhì)用作人工角膜。對于這種用途，所述基質(zhì)可預(yù)制成整體厚度的人工角膜或者作為適用于角膜護(hù)片的部分厚度基質(zhì)。根據(jù)該實施方案，設(shè)計水凝膠以使其具有高的透光度和低光散射性。例如，包含與膠原蛋白交聯(lián)的合成p(NiPAAm-共-AAc-共-ASI)三元共聚物或p(DMAA-共-ASI)共聚物的水凝膠具有高透光性，低光散射性，并能夠在高達(dá)55℃的溫度下保持透明。
5.試劑盒本發(fā)明還涉及包含生物合成基質(zhì)的試劑盒。試劑盒包含“成品”形式的基質(zhì)，并且它們可包含制備基質(zhì)所需的適當(dāng)比例的各種組分(即合成聚合物和生物聚合物)。試劑盒可選還包含一或多種生物活性劑，其可與合成聚合物預(yù)連接或者作為可在基質(zhì)制備過程中連接于合成聚合物的單獨組分。試劑盒還可包含使用說明，一或多種適宜的溶劑，一或多種用于輔助將最終基質(zhì)組分注入或置于動物體內(nèi)的工具(例如注射器，吸液管，鑷子，滴眼器(eye dropper)或類似的可醫(yī)用遞送載體)，或其組合。試劑盒的各個成分可包裝在分開的容器中。試劑盒還可包含管理生物產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)要求的形式的注意事項，其反映了政府機構(gòu)對用于人或動物用途的工業(yè)生產(chǎn)、使用或銷售的許可。
為更好理解本發(fā)明，給出以下實施例。應(yīng)理解這些實施例僅用于說明。因此，它們不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例

實施例中所述所有凝膠基質(zhì)都使用無菌膠原蛋白I，例如端膠原蛋白(大鼠尾腱，RTT)或非末端膠原蛋白(atelocollagen)(?；蜇i)，其可在實驗室中制備并更方便地可購得(例如，牛和豬膠原蛋白可購自Becton Dickinson，濃度為3.0-3.5mg/ml，在0.02N乙酸和0.012N鹽酸中)。這種膠原蛋白可在4℃保存許多月。此外，可小心地濃縮這種膠原蛋白溶液以產(chǎn)生光學(xué)透明的、非常粘的溶液，其含有3-30wt/vol％膠原蛋白，并適合制備更堅固的基質(zhì)。
可通過使用氫氧化鈉水溶液在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)存在的條件下，將膠原蛋白溶液調(diào)節(jié)到生理條件，即鹽水離子強度和pH 7.2-7.4。使用不含氨基酸和其它營養(yǎng)物質(zhì)的PBS，來防止通過與含有-NH2的分子發(fā)生副反應(yīng)而消耗交聯(lián)反應(yīng)性，使得可利用最小濃度的交聯(lián)基團(tuán)并使細(xì)胞毒性的任何危險最小化。
pNiPAAm均聚物粉末可購買(例如，購自Polyscience)。所有其它聚合物如下合成。
實施例1制備pNiPAAm-膠原蛋白水凝膠制備pNiPAAm-膠原蛋白水凝膠以提供備選的水凝膠，可將該備選水凝膠與本發(fā)明的水凝膠的性質(zhì)進(jìn)行比較。
將ddH2O中的1wt/vol％pNiPAAm均聚物溶液通過高壓滅菌來消毒。在無菌試管中，于4℃將該溶液與無菌RTT膠原蛋白溶液(3.0-3.5mg/ml(w/v)，乙酸水溶液(0.02N)中)(1∶1 vol/vol)通過注射器泵入以在無氣泡形成的條件下進(jìn)行徹底混合。冷混合可避免膠原蛋白形成任何預(yù)成熟的凝膠或原纖維。膠原蛋白-pNiPAAm可隨后傾到入塑料盤(未處理的培養(yǎng)皿)或模具(例如接觸透鏡模具)，并在層流通風(fēng)柜中，于室溫在無菌條件下在空氣中干燥至少2-3天。干燥至恒重后(約7％水剩余)，將形成的基質(zhì)從模具中取出。將基質(zhì)從模具中取出可通過將所述模具在室溫在無菌PBS中浸泡而方便地進(jìn)行。繼續(xù)在該溶液中浸泡游離樣品得到在生理溫度，pH和離子強度下的凝膠，并可隨后進(jìn)行細(xì)胞生長檢測和體內(nèi)動物檢測(見實施例6和7)。
實施例2制備合成三元共聚物膠原蛋白-反應(yīng)性三元共聚物，聚(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)(圖1)是通過將以下三種單體進(jìn)行共聚反應(yīng)合成的N-異丙基丙烯酰胺(NiPAAm，0.85摩爾)、丙烯酸(AAc，0.10摩爾)和N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(ASI，0.05摩爾)。進(jìn)料摩爾比為85∶10∶5(NiPAAm∶AAc∶ASI)，自由基引發(fā)劑為AIBN(0.007摩爾/單體總摩爾數(shù))，溶劑為二噁烷(100ml)，在加入AIBN前用氮凈化。反應(yīng)在65℃進(jìn)行24小時。
通過反復(fù)沉淀去除微量均聚物進(jìn)行純化以后，通過THF-D8中的質(zhì)子NMR發(fā)現(xiàn)所述合成的三元共聚物(82％產(chǎn)量)的組成為84.2∶9.8∶6.0(摩爾比)。通過含水GPC測定三元共聚物的Mn和Mw分別為5.6×104Da和9.0×104Da。
D-PBS中的2mg/ml的三元共聚物溶液直到55℃仍保持澄清，這與高LCST一致。D-PBS中的10mg/ml的溶液在43℃僅變得略有混濁。不從三元共聚物中去除分批聚合反應(yīng)中形成的均聚物(由于NiPAAm的反應(yīng)性系數(shù)高于AAc或ASI)導(dǎo)致水溶液和水凝膠在-32℃及以上變混濁。
實施例3制備含有生物活性劑的合成聚合物通過將實施例2中制備的三元共聚物(1.0g)與2.8μg層粘連蛋白五肽(YIGSR，得自Novabiochem)在N，N-二甲基甲酰胺中混合來合成含有五肽YIGSR(神經(jīng)細(xì)胞附著基序)的三元共聚物。在室溫(21℃)反應(yīng)48小時后，將聚合物產(chǎn)物從二乙醚中沉淀出并在真空條件下干燥。在與五肽反應(yīng)后保持的ASI基團(tuán)可用于隨后與膠原蛋白進(jìn)行反應(yīng)。該聚合物的結(jié)構(gòu)顯示于圖8A。
實施例4制備膠原蛋白-三元共聚物水凝膠交聯(lián)的三元共聚物-膠原蛋白水凝膠是通過用注射器將中和后的4％牛非端膠原蛋白(1.2ml)與實施例2中制備的三元共聚物(0.34ml(100mg/ml，D-PBS中))在4℃進(jìn)行混合(膠原蛋白∶三元共聚物為1.4∶1 w/w)來制備。小心用注射器泵入以產(chǎn)生均質(zhì)、無氣泡的溶液以后，將等分試樣注入塑料的接觸透鏡模具，并在室溫(21℃)保溫24小時，以使得膠原蛋白的-NH2基團(tuán)與ASI基團(tuán)反應(yīng)并使剩余的ASI基團(tuán)緩慢水解成AAc基團(tuán)。成型的樣品隨后在37℃、100％濕度的環(huán)境下保溫24小時，以得到最終水凝膠。所述水凝膠含有95.4±0.1％的水，2.3％的膠原蛋白和1.6％的三元共聚物。將基質(zhì)進(jìn)行成型為最終厚度為150-200μm或500-600μm。每種生成的水凝膠基質(zhì)均可在PBS溶液中從其模具中取出，并隨后浸入含有1％氯仿和0.5％甘氨酸的PBS中。該洗滌步驟去除了交聯(lián)反應(yīng)中產(chǎn)生的N-羥基琥珀酰亞胺，通過轉(zhuǎn)化成丙烯酸基團(tuán)終止了該基質(zhì)中任何未反應(yīng)的ASI基團(tuán)，并對該水凝膠基質(zhì)進(jìn)行滅菌。作為選擇，成型的凝膠也可用含水甘氨酸處理以保證所有的ASI在接觸細(xì)胞前被終止。
留在從膠原蛋白和三元共聚物制備的凝膠中的琥珀酰亞胺殘基在洗滌后均低于IR檢測限。
實施例5制備包含生物活性劑的水凝膠包含YIGSR細(xì)胞粘附因子的膠原蛋白-三元共聚物的交聯(lián)水凝膠是通過將粘性的、中和后的4％牛膠原蛋白(1.2ml)與和層粘連蛋白五肽(YIGSR)共價結(jié)合的三元共聚物(來自實施例3；0.34ml，100mg/ml)在4℃、按實施例4所述的步驟進(jìn)行徹底混合而制備。
充分洗滌的凝膠的YIGSR含量為4.3×10-11摩爾/ml(2.6×10-8g/ml)含水凝膠，所述含水凝膠通過用Iodogen法利用125I標(biāo)記酪氨酸(帶有伯胺)基團(tuán)并用標(biāo)準(zhǔn)化的γ-計數(shù)器(Beckman，Gamma 5500)測定放射活性來定量。每種含水的、PBS-平衡的水凝膠中的最終總聚合物濃度為3.4w/v％(包含的膠原蛋白和YIGSR三元共聚物分別為2.0和1.4w/v％)。
實施例6水凝膠基質(zhì)的物理性質(zhì)比較膠原蛋白熱敏凝膠(thermogel)是脆的并容易坍陷和斷裂，并明顯是不透明的(見圖8C)。膠原蛋白熱敏凝膠通過中和膠原蛋白并在如實施例4和5所述的相同模具中成型。然后將成型的膠原蛋白保溫，先在21℃保溫24小時，然后在37℃保溫，以自發(fā)形成透明的熱敏凝膠(通過膠原蛋白三螺旋自結(jié)合成微原纖維來制備)。
PBS(pH 7.4)中的葡萄糖對實施例5制備的水凝膠的滲透性系數(shù)是通過在滲透小室中如下進(jìn)行測定來計算間斷性取出透過物等分試樣，加入三磷酸腺苷并利用己糖激酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖-6-磷酸酯。后者和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在脫氫酶的存在下反應(yīng)，并通過測定所得還原的二核苷酸溶液在340nm的UV吸收來測定其量(Bondar，R.J.& Mead，D.C.(1974)ClinChem 20，586-90)。完全浸在PBS溶液中的水凝膠表面特征通過原子力顯微鏡(Molecular Image Co.，USA)以“接觸”模式來檢測。將該技術(shù)產(chǎn)生的孔徑與根據(jù)從前述水凝膠的PBS滲透性計算的平均孔直徑進(jìn)行比較(Bellamkonda，R.，Ranieri，J.P.& Aebischer，P.(1995)J Neurosci Res 41，501-9)。所述水凝膠的折射率為(1.343±0.003)，而人眼的淚膜折射率為(1.336-1.357)(Patel，S.，Marshall，J.& Fitzke，F(xiàn).W.3rd(1995)J Refract Surg11，100-5)。它們與只含有膠原蛋白的基質(zhì)相比顯示高光學(xué)透明度(圖8B和C)。所述水凝膠的孔徑為140-190nm(來自原子力顯微鏡和PBS滲透性)，且其葡萄糖擴散滲透性系數(shù)為2.7×10-6cm2/s，該值高于天然基質(zhì)的葡萄糖擴散滲透性系數(shù)(約0.7×10-6cm2/s，由公開的擴散(2.4×10-6cm2/s)和溶解度(0.3)系數(shù)計算(McCarey，B.E.& Schmidt，F(xiàn).H.(1990)Curr Eye Res 9，1025-39))。
實施例4和5中制備的水凝膠的如下性質(zhì)表明它們是交聯(lián)的●不溶于水，●強度足以支持利用縫線和針的手術(shù)操作，并附著于人角膜環(huán)●處理時相對柔韌●在拉伸測試中顯示破裂應(yīng)力和表觀模量增加超過x2，來自ASI/-NH2的當(dāng)量比為0.5-5。
如上制備所述基質(zhì)，但合成聚合物中膠原蛋白胺基與ASI基團(tuán)的比例不同的基質(zhì)在可見光區(qū)域具有高透光性和低散射(圖8B，12和13)。相反，從上述膠原蛋白制備的膠原蛋白熱敏凝膠具有低透光性和高散射性，這與其不透明的外觀一致(圖8C，12)。這種具有高至3wt/vol膠原蛋白的熱敏凝膠基質(zhì)很脆弱而不能進(jìn)行縫合拉開實驗。
所述水凝膠的定量表征通過在制成人角膜形狀和厚度的樣品上進(jìn)行縫合拉開測定來進(jìn)行。這涉及插入兩個正相反的縫合(這也是眼部植入所需的第一步)，然后在Instron Tensile Tester上以10mm/min拉開這兩處縫合(這是用于評估心臟瓣膜成分的良好確定的方法)。所用縫合為10-0尼龍縫線。計算凝膠的破裂強度以及斷裂伸長率和彈性模量。來自縫線拉開測定的模量和斷裂應(yīng)力在特定膠原蛋白胺與ASI基團(tuán)之比時達(dá)最大(圖11)。
利用測定透射和散射的定制儀器進(jìn)行測定顯示，與人角膜相比，實施例4和5中制備的水凝膠具有高透射性和非常低的光散射(Priest and Munger，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.39S352-S361(1998))。在可見光區(qū)光在實施例4制備的水凝膠的反向散射(back scattering)和透射顯示極好的性能，但高三元共聚物濃度時除外(高膠原蛋白胺與三元共聚物ASI比，圖12)。類似地，熱敏凝膠(無交聯(lián)的合成聚合物)具有非常低的透射率和高反向散射(圖12)。實施例5中的水凝膠在該分析中也顯示極好的性能，如圖12所示(1∶1的膠原蛋白∶三元共聚物-五肽用實心方塊表示)。
反之，膠原蛋白-pNiPAAm均聚物凝膠(實施例1所述；1.0∶0.7-1.0∶2.0wt/wt)在37℃是不透明的。此外，將膠原蛋白和pNiPAAm從該水凝膠中提取到PBS中(48小時內(nèi)超過50wt％損失)。
實施例7不同生物合成基質(zhì)的體內(nèi)檢測將實施例1，4和5中形成的水凝膠成型以制成人工角膜并植入豬的眼睛(圖2)。
作為體內(nèi)角膜植入物，實施例1的凝膠在植入豬眼5-6天后滲出了白色殘留物。
如實施例5所述從4％的膠原蛋白和五肽-三元共聚物制備的水凝膠顯示出較好的生物相容性，正如實施例4所述制備的膠原蛋白-三元共聚物水凝膠那樣。當(dāng)使用前一種水凝膠時出現(xiàn)了完整上皮細(xì)胞過度生長并形成多層，而膠原蛋白-三元共聚物水凝膠則顯示較慢的、連續(xù)性較差的上皮細(xì)胞生長并沒有形成多層。
在體內(nèi)，從膠原蛋白和五肽-三元共聚物(來自實施例5；最終濃度膠原蛋白2.3wt％；三元共聚物+五肽1.6wt％)制備并植入豬眼的整體厚度水凝膠的共聚焦顯微鏡圖像顯示，在該基質(zhì)上上皮細(xì)胞的生長以及分層。基底膜(basement membrane)和半橋粒(hemidesmosomes)都得以再生，表明存在穩(wěn)定固定的上皮。發(fā)現(xiàn)僅在3周后基質(zhì)細(xì)胞就分散在所述基質(zhì)內(nèi)。在植入3周內(nèi)，所述植入物變得對觸覺敏感(Cochet-Bonnet Aesthesiometer)，表明有功能的神經(jīng)長入(圖4和14)。神經(jīng)長入也可通過共聚焦顯微鏡和組織學(xué)直接觀察。在植入后8周內(nèi)沒有觀察到不良炎癥或免疫反應(yīng)的臨床癥狀。見圖2，3和5-7。
更詳細(xì)的描述圖5顯示移植后3周豬角膜的切片的形態(tài)和生化評估。(A)膠原蛋白的picro-sirius染色，和(B)細(xì)胞的H & E染色。圖7顯示(A)用picro-sirius red染色的移植后3周豬角膜的切片，其顯示基質(zhì)-植入物界面(箭頭)。植入物界面已經(jīng)被分層的上皮再覆蓋(re-covered)。(B)移植后8周的類似切片?；|(zhì)細(xì)胞進(jìn)入植入物，且所述植入物顯示被上皮下組織取代(箭頭)。(C)上皮(H&E染色)高倍放大圖像，顯示再生的基底膜(箭頭)。(D)用抗VII型膠原蛋白抗體染色的對應(yīng)切片，所述抗體識別附著于基底膜的半橋粒(箭頭)。(E)附著于下方基底膜的半橋粒(箭頭)通過透射電子顯微鏡(TEM)清楚地顯示。(F)豬角膜平埋切片(flat mount)，顯示植入物中的神經(jīng)(箭頭)，所述切片用抗神經(jīng)絲抗體染色。
圖3顯示術(shù)后6周的豬角膜的全層共聚焦顯微鏡圖像，其顯示植入物表面上再生的角膜上皮和基底膜。顯示了膠原蛋白-三元共聚物合成物中、其下方的宿主基質(zhì)中以及向內(nèi)生長的基質(zhì)細(xì)胞中的體外神經(jīng)生長模式。
觸覺敏感性的恢復(fù)很快(＜術(shù)后14天)，而相同時間段內(nèi)對于接受了類似大小的供體豬角膜的同種異體移植物的另外6只動物而言，移植后的同種異體移植物中的觸覺敏感性恢復(fù)得最慢(圖14)。
實施例8將膠原蛋白-三元共聚物基質(zhì)的放置在嚙齒動物腦中麻醉后，切下所用每只小鼠或大鼠的全腦并置于sterotaxic框架中。將2毫升(2ml)或3毫升(3ml)含有膠原蛋白、三元共聚物-五肽(0.33％膠原蛋白-0.23％三元共聚物或0.63％膠原蛋白-0.44％三元共聚物)的水凝膠分別在6-10分鐘內(nèi)注入每只小鼠的腦內(nèi)，在如下位置進(jìn)行離前囟0.3mm，3.0mm深且離中線2.0mm。對于大鼠，將4-6毫升的水凝膠在10分鐘內(nèi)注入各自的腦，位置在離前囟0.7-0.8mm，6mm深且離中線4mm。水凝膠樣品和考馬斯藍(lán)染料混合用于顯色。
這些樣品中的結(jié)果顯示成功地直接且精確地將少量水凝膠遞送到腦的各層中(圖9和10)。這表明可利用水凝膠作為遞送系統(tǒng)將很小體積的細(xì)胞或藥物遞送到具體位置。
實施例9包含生物活性劑的水凝膠如實施例5所述制備的無菌水凝膠在移植前用PBS徹底沖洗。根據(jù)Research in Vision and Ophthalmology協(xié)會對于在動物中使用的指南，將每種組織改造的(TE)角膜基質(zhì)(直徑5.5mm，厚度為200±50μm)植入Yucatanmicro-豬(Charles River Wiga，Sulzbach，Germany)的右角膜中(見圖15A-C)。對側(cè)未接受手術(shù)的角膜作為對照。在普通的麻醉下，利用Barraquer trephine(Geuder，Heidelberg，Germany)作部分厚度的、直徑5.0mm的環(huán)形切口。去除宿主角膜組織并用比其直徑大0.50mm的植入物取而代之，所述植入物允許適當(dāng)?shù)靥钛a在植入物和宿主組織之間的切口。手術(shù)后，將羊膜縫合在整個角膜表面并保持一周，以便使植入物保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｔ诳p合的樣品中，用8根不連續(xù)10-0尼龍縫線將植入物縫合到宿主組織內(nèi)。術(shù)后給藥包括給予地塞米送松(qid)和慶大霉素(qid)21天。n＝3只豬接受縫合和3只豬沒有接受縫合。
每天對每只豬進(jìn)行隨診直到術(shù)后7天，并隨后每周進(jìn)行一次隨診。檢查包括裂隙燈(slit-lamp)檢查以保證角膜在光學(xué)上透明，熒光素鈉染色以評估上皮完整性和屏障功能(Josephson，J.E.& Caffery，B.E.(1988)InvestOphthalmol Vis Sci 29，1096-9)，眼內(nèi)壓測定以保證角膜不阻擋房水流動，以及體內(nèi)共聚焦顯微鏡檢(ConfoScan3，Nidek，Erlangen，Germany)以評估細(xì)胞和神經(jīng)向內(nèi)生長。角膜觸覺敏感性用Cochet-Bonnet觸覺計(Handaya Co.，Tokyo，Japan)在每個角膜的植入?yún)^(qū)內(nèi)的5個點(4個在周圍，1個在中心)如前述(Millodot，M.(1984)Ophthalmic Physiol Opt 4，305-18)檢測。也對接受豬供體角膜的同種異體移植物的動物進(jìn)行類似評估。
對于免疫組織化學(xué)和組織病理學(xué)檢測，將組織和構(gòu)建體固定在0.1MPBS中的4％PFA中。對于神經(jīng)免疫定位，用清潔劑混合物(Brugge，J.S.&Erikson，R.L.(1977)Nature 269，346-8)(150mM NaCl，1mM乙二胺四乙酸，50mM Tris，1％Nonidet P-40，0.5％去氧膽酸鈉，0.1％十二烷基硫酸鈉)使平埋切片可通透化，用PBS中的4％胎牛血清進(jìn)行非特異性染色而封閉并在抗神經(jīng)絲(anti-neurofilament)200抗體(Sigma，Oakville，Canada)中保溫。然后將它們用FITC或Cy3-結(jié)合的二抗(分別來自Sigma；Amersham，Baie D’Urfe，Canada)中保溫，并通過共聚焦顯微鏡觀察。
對于組織學(xué)和進(jìn)一步的免疫組化，將樣品加工，用石蠟包埋并切片。用蘇木精和伊紅(H & E)對切片進(jìn)行染色，以進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(Jumblatt，M.M.& Neufeld，A.H.(1983)Invest Ophthalmol Vis Sci 24，1139-43)。如上述對脫石蠟的切片進(jìn)行免疫熒光實驗，以檢測半橋粒標(biāo)記物(Gipson，I.K.，Spurr-Michaud，S.J.& Tisdale，A.S.(1988)Dev Biol 126，253-62)VII型膠原蛋白(Sigma，Munich，Germany)的表達(dá)。利用過氧化物酶-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色用如下物質(zhì)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色作為上皮標(biāo)記物的AE1/AE3抗體(Chemicon，Temecula，CA，USA)，用于基質(zhì)成纖維細(xì)胞的抗-波形蛋白(antivimentin)抗體(Roche，Laval，Canada)，用于活化基質(zhì)成纖維細(xì)胞(肌肉成纖維細(xì)胞)的抗平滑肌肌動蛋白抗體，1A4(Cell Marque，Austin，TX)，和用于原膠原蛋白1合成的SP1-D8抗體(DHSB，Iowa，USA)(用于定位重新合成膠原蛋白的位點)。利用ARK過氧化物酶試劑盒(DAKO，Mississauga，Canada)進(jìn)行免疫細(xì)胞的CD15和CD45染色(Becton-Dickinson，Oakville，Canada)以將一級抗體預(yù)結(jié)合于它們各自的二級抗體和過氧化物酶上以顯示。對于抗波形蛋白，抗平滑肌肌動蛋白和SP8-D1抗體，在一級抗體中保溫之前通過用蛋白酶-K(2mg/ml)在37℃預(yù)處理30分鐘進(jìn)行抗原募集(antigen retrieval)。利用Ulex europaeus血凝素(UEA)凝集素染色顯示淚膜粘蛋白沉積(Shatos，M.A.，Rios，J.D.，Tepavcevic，V.，Kano，H.，Hodges，R.& Dartt，D.A.(2001)Invest Ophthalmol Vis Sci 42，1455-64)。將樣品與生物素化的UEA(Sigma)一同保溫，并隨后與抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶反應(yīng)，并用DAB顯示。對于透射電子顯微鏡(TEM)，所有樣品用傳統(tǒng)的固定劑，染色劑和填充(potting)樹脂處理(Kamovsky’s，OsO4，尿烷乙酸酯(uranyl acetate)，環(huán)氧樹脂)。
植入生物合成基質(zhì)或者豬角膜以后，臨床檢查沒有觀察到不良的炎癥或免疫反應(yīng)。上皮細(xì)胞向整個植入物內(nèi)的生長在術(shù)后4天完成。到1周時，再生的上皮顯示熒光素鈉染料的排出，表明所述上皮是完整的并具有重新建立的屏障性質(zhì)。眼內(nèi)壓在術(shù)前為10-14mm汞柱(Hg)，并在整個高達(dá)6周的術(shù)后研究中保持在10-16mm Hg，表明所述植入物不阻擋房水在眼中的流動。植入物保持光學(xué)透明(窄縫-燈活組織顯微鏡)且在術(shù)后3周所有動物中觀察到上皮再分層。植入的基質(zhì)在術(shù)后3周的臨床體內(nèi)共聚焦顯微鏡檢中顯示再生的上皮(圖15D)，新長入的神經(jīng)(圖15G)，和基質(zhì)(圖15J)以及上皮細(xì)胞(圖15M)，所述細(xì)胞的形態(tài)與未接受手術(shù)的對照的細(xì)胞形態(tài)相似(圖15F，I，L，O)。同種異體移植物中的上皮和內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)(圖15E，N)與對照中的相似。手術(shù)后3周，在同種異體移植物中沒有觀察到上皮下和基質(zhì)神經(jīng)(圖15H，K)。
更具體地，圖15顯示(A-C)對Yucatan micro-豬進(jìn)行層狀角膜成形術(shù)(LKP)。(A)用圓鋸在角膜上切出預(yù)定深度(250μm)的環(huán)形切口。去除現(xiàn)有的角膜層，(B)并用生物-合成基質(zhì)植入物(箭頭，250μm厚)置換，縫合所述植入物(C)?？p合用箭頭表示。
(D-O)植入的生物-合成基質(zhì)的體內(nèi)共聚焦顯微鏡檢。(D)共聚焦圖像，顯示植入物表面再生的角膜上皮。相應(yīng)的同種異體移植物對照(E)含有供體上皮，而未接受手術(shù)的對照(F)具有完整的上皮。(G)再生的神經(jīng)(箭頭)存在于植入物和其上覆蓋的再生上皮之間的界面處。這些對應(yīng)未接受手術(shù)的對照中的上皮下神經(jīng)(I)。但在同種異體移植物(H)中，不存在上皮下神經(jīng)。(J-L)具有植入物、同種異體移植物(K)的角膜下方的基質(zhì)深處以及對照(L)的相應(yīng)區(qū)域中的基質(zhì)細(xì)胞和分支的神經(jīng)束(箭頭)。(M-O)具有植入物(M)，同種異體移植物(N)以及未接受手術(shù)的對照(O)的角膜的內(nèi)皮是完整的并顯示相似的形態(tài)。
具有移植物的角膜的組織切片顯示明顯的但平滑的植入物-宿主界面(圖16A)，這與接受同種異體移植物的對照角膜類似(圖16B)。在具有植入物或同種異體移植物的角膜中，再生的上皮都分層。詳細(xì)檢測顯示完全分化的上皮，其被AE1/AE3抗體標(biāo)記物(圖16D，E)染色是陽性的，所述上皮細(xì)胞覆蓋在VII型膠原蛋白陽性的再生基底膜上，其中所述VII型膠原蛋白是位于基底膜-上皮界面的半橋粒的標(biāo)記物(圖16G，H)。TEM觀察顯示與半橋粒存在相一致的形態(tài)(圖16J，K)。在植入物中，神經(jīng)絲-陽性的內(nèi)向生長神經(jīng)已經(jīng)開始再建立上皮下網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并顯示延伸到上皮細(xì)胞中(圖16M)。然而，在同種異體移植的角膜中沒有上皮下神經(jīng)(圖16N)。在具有移植物的角膜中恢復(fù)了淚膜(圖16P)，具有同種異體移植物的角膜也如此(圖16Q)。
更具體地，圖16顯示術(shù)后角膜再生。
(A-F)顯示了H & E染色的切片?；|(zhì)細(xì)胞存在于植入物(A)和同種異體移植物對照(B)中，并均顯示與宿主之間的整合沒有縫隙。(標(biāo)志如下e，上皮；i，植入物；g，同種異體移植物；s，基質(zhì))。(C)未接受手術(shù)的對照。植入物(D)的再生上皮和同種異體移植物對照(E)的供體上皮表達(dá)細(xì)胞角蛋白分化標(biāo)記物，這與未接受手術(shù)的對照(F)相似。
(G-1)半橋粒標(biāo)記物VII型膠原蛋白在植入物(G)，同種異體移植物(H)和對照(I)的上皮-植入物界面(箭頭)處的免疫定位。
(J-L)上皮-植入物界面的TEM。半橋粒斑(箭頭)和錨定型原纖維(箭頭)在生物-合成基質(zhì)中上皮細(xì)胞和下方的植入物(J)之間形成，這與同種異體移植物(K)和對照(L)中所示通常在上皮-基質(zhì)界面上所見的結(jié)構(gòu)相似。
將顯示神經(jīng)纖維(箭頭)的角膜平埋于植入物(M)，未接受手術(shù)的對照(O)中，但不存在于同種異體移植物(N)中，用抗神經(jīng)絲抗體染色。UEA與植入物(P)，和同種異體移植物(Q)上的上皮表面結(jié)合(箭頭)表明所有情況中淚膜的恢復(fù)。未接受手術(shù)的對照(R)免疫組織化學(xué)結(jié)果表明植入物和同種異體移植物中的細(xì)胞可合成I型原膠原蛋白。然而，更多的原膠原蛋白合成出現(xiàn)在同種異體移植物中，這可由同種異體移植物的染色比植入物的染色更深顯示(圖17G，H)。同種異體移植物和植入物都具有波形蛋白陽性的基質(zhì)細(xì)胞(圖17A，B)，表明其為成纖維型表型。這兩種植入物還顯示平滑肌肌動蛋白染色并因此存在活化的基質(zhì)成纖維細(xì)胞，但植入物的陽性細(xì)胞少于同種異體移植物的陽性細(xì)胞(圖17D，E)。
更具體地，圖17顯示術(shù)后6周時的植入物-宿主整合。
(A-C)I型原膠原蛋白染色。在植入的生物合成基質(zhì)(A)和同種異體移植物對照(B)的基質(zhì)中觀察到陽性染色，顯示出新的膠原蛋白沉積位點。未接受手術(shù)的對照(C)沒有新膠原蛋白合成。
(D-F)在整個基質(zhì)中進(jìn)行波形蛋白染色鑒別了基質(zhì)成纖維細(xì)胞。對整個植入的生物合成基質(zhì)(D)染色顯示細(xì)胞浸入。細(xì)胞也可見于植入的同種異體移植物(E)和整個未接受手術(shù)的對照(F)中。
(G-I)平滑肌肌動蛋白染色顯示活化的肌成纖維細(xì)胞以及疤痕形成的可能性。在生物合成基質(zhì)植入物(G)中，染色偶然見于生物合成基質(zhì)中，但不見于宿主基質(zhì)以及宿主和移植物之間的過渡區(qū)中。植入角膜的同種異體移植物中的陽性染色(H)見于同種異體移植物和過渡區(qū)中，但不存在于宿主基質(zhì)中。(I)未接受手術(shù)的對照。
利用Cochet-Bonnet觸覺測量計在手術(shù)前和手術(shù)后的3只豬的角膜植入物中的5個點測定的角膜觸覺敏感性顯示手術(shù)后觸覺敏感性急劇降低。然而，在術(shù)后7-14天之間出現(xiàn)恢復(fù)，且到術(shù)后21天時，敏感性回到手術(shù)前水平(圖18；所有組，n＝3。通過用Tukey雙向比較反復(fù)測定ANOVA得到*P＜0.01)。在植入物上檢測的所有周圍和中心點的觸覺敏感性回到相同速率和相同的平臺水平。但在接受供體角膜同種異體移植物的對照動物中，角膜在6周之內(nèi)保持感覺缺失態(tài)(圖18)。
6周后在體內(nèi)回收的植入物通過紅外線分光鏡(Midac M，F(xiàn)TIR分光計，ZnSe聚光鏡和金剛石池(diamond cell))檢測并明確顯示三元共聚物的存在。
實施例10制備合成共聚物聚(DMAA-co-ASI)共聚物通過單體N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺(ASI)的共聚反應(yīng)合成。加料摩爾比為95∶5(DMAA∶ASI)。自由基引發(fā)劑AIBN和溶劑二噁烷在使用前用氮凈化并在70℃進(jìn)行聚合反應(yīng)24小時。
通過反復(fù)沉淀以去除微量均聚物來進(jìn)行純化以后，通過質(zhì)子NMR發(fā)現(xiàn)合成共聚物的組成(70％產(chǎn)量)為94.8∶5.2(摩爾比)。通過含水GPC測定分子量(Mn)為4.3×104。多分散性(PD；Mw/Mn)＝1.70也通過GPC確定。
實施例11制備膠原蛋白-共聚物水凝膠交聯(lián)的膠原蛋白-共聚物水凝膠通過用注射器將中和過的5％牛膠原蛋白(1.0ml)與實施例9中制備的合成共聚物(0.2ml(200mg/ml，D-PBS中))進(jìn)行混合來制備。小心用注射器泵入以產(chǎn)生均質(zhì)的、無氣泡的溶液以后，將等分試樣注入塑料的、接觸透鏡模具中，并在室溫下保溫24小時以使膠原蛋白-NH2基團(tuán)與所述共聚物中的ASI基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，并允許剩余的ASI基團(tuán)緩慢水解成AAc基團(tuán)。
然后將成型的樣品在100％濕度的環(huán)境中、在37℃保溫24小時以產(chǎn)生最終水凝膠。凝膠化時，水凝膠合有94.8％的水、2.9％的膠原蛋白和2.3％的合成共聚物。將基質(zhì)成型以使其最終厚度為150-200μm或500-600μm。每種產(chǎn)生的水凝膠基質(zhì)都在PBS溶液中從其模具中取出，并隨后浸入含有1％氯仿和0.5％甘氨酸的PBS中。該洗滌步驟去除了交聯(lián)反應(yīng)中產(chǎn)生的N-羥基琥珀酰亞胺，并通過將ASI基團(tuán)轉(zhuǎn)化成丙烯酸基團(tuán)而終止了基質(zhì)中任何剩余的ASI基團(tuán)。
由膠原蛋白和共聚物制備的凝膠中剩余的琥珀酰亞胺殘基在洗滌后低于IR檢測限。
實施例12膠原蛋白-共聚物水凝膠的物理性質(zhì)圖13A和B中示出了可見光和白光在實施例10中制備的水凝膠中的光反向散射和光透射和膠原蛋白胺與共聚物ASI比例的函數(shù)關(guān)系。
實施例10的共聚物及其水凝膠在60℃沒有檢測到濁點(LCST)。
實施例13各種水凝膠的生物性質(zhì)11.1生物相容性將三個直徑12mm、厚650μm的圓盤在PBS中浸泡30分鐘，所述圓盤分別由膠原蛋白-聚(DMAA-co-ASI)，膠原蛋白-聚(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-五肽和3％膠原蛋白水凝膠制成。它們分別置于12mm的可購得的培養(yǎng)皿用的膜插入物上，并通過薄層凝膠附著于該膜。干燥10分鐘以后，將懸在含有上皮生長因子的無血清培養(yǎng)基(角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(KSFM；Life Technologies，Burlington，Canada))中的1×104人角膜上皮細(xì)胞(HCEC)加到凝膠頂上，并將不含細(xì)胞的KSFM加入下方的孔中。在5％CO2存在的條件下，在37℃保溫所述培養(yǎng)物。
在12小時內(nèi)，在所有樣品中，細(xì)胞都附著于基質(zhì)表面。每兩天換培養(yǎng)基，同時將KSFM加入插入物和外部的孔中。HCEC在凝膠上生長至滿底，并在同一天達(dá)到滿底(5天)。插入物和周圍的孔中的培養(yǎng)基用含血清的培養(yǎng)基(改良的SHEM培養(yǎng)基(Jumblatt，M.M.& Neufeld，A.H.(1983)InvestOphthalmol Vis Sci 24，1139-43))置換。再過2天后，從插入物中除去培養(yǎng)基，并將下方的孔中的SHEM的體積減少到0.5ml。再放置7天使上皮分層并觀察各個細(xì)胞層。
7天以后，在4℃在含4％多聚甲醛的PBS中固定所述膜30分鐘。通過在含30％蔗糖的PBS中平衡，然后按含30％蔗糖的PBS與OCT為1∶1混合物的比例進(jìn)行急驟凍結(jié)，由此制備樣品用于低溫切片(cryosectioning)。樣品在低溫切成13μm的切片，并通過HandE染色顯示其結(jié)構(gòu)。分層上皮中的細(xì)胞層數(shù)通過計數(shù)細(xì)胞核和鑒定細(xì)胞邊界來確定。膠原蛋白熱敏凝膠中的上皮厚度為約2層細(xì)胞，這與人角膜上皮中含有的5-7層細(xì)胞相比而言很少。但培養(yǎng)HCEC并誘導(dǎo)其在膠原蛋白-p(DMAA-co-ASI)和膠原蛋白-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-五肽上分層得到的上皮厚度為4.5層細(xì)胞，其中包括明顯角質(zhì)化的外層，這表明上皮出現(xiàn)適當(dāng)?shù)姆只?圖20)。
11.2.水凝膠的神經(jīng)分布(innervation)直徑12mm、厚650μm的圓盤分別由膠原蛋白-p(DMAA-co-ASI)，膠原蛋白-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-五肽和3％膠原蛋白熱敏凝膠制成，將其浸于PBS中30分鐘。將所述圓盤置于6cm的培養(yǎng)皿上，并在每個圓盤上鉆4個1mm的孔。所述孔的1/3用與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)的0.3％膠原蛋白填充并用甘氨酸驟冷。10分鐘后，將E8小雞的背根神經(jīng)節(jié)浸入同種膠原蛋白混合物，并置于所述孔中。所述孔余下的部分用交聯(lián)的膠原蛋白填充，并在37℃放置30分鐘。將培養(yǎng)物在補充了B27，N2，和1nM視黃酸的KSFM中生長4天，并通過明視野顯微鏡監(jiān)測神經(jīng)突的延長。含神經(jīng)分布(innervated)的圓盤在含4％多聚甲醛的PBS中在室溫固定30分鐘，染色以測定NF200免疫反應(yīng)性，并通過免疫熒光顯色。在聚合物圓盤的表面和中心觀察有定位。雖然一些神經(jīng)突在膠原蛋白熱敏凝膠表面延伸，沒有神經(jīng)突延伸到熱敏凝膠本身中。在水凝膠中，可看見神經(jīng)突延伸到基質(zhì)中。此外，在兩種水凝膠中，可看到在基質(zhì)表面上大量的神經(jīng)分布，表明其表面的神經(jīng)分布比膠原蛋白熱敏凝膠中出現(xiàn)的神經(jīng)分布好(圖19；A表示膠原蛋白熱敏凝膠，B表示膠原蛋白-p(NiPAAm-co-AAc-co-ASI)-五肽水凝膠且C表示膠原蛋白-p(DMAA-co-ASI)水凝膠)。左側(cè)一列的小圖表示用神經(jīng)絲標(biāo)記物-NF200進(jìn)行染色，在聚合物的中間部分觀察到的免疫熒光。中間一列的小圖顯示了聚合物表面的明視野圖，其中神經(jīng)突從神經(jīng)節(jié)源延伸出。右側(cè)一列小圖顯示了進(jìn)行NF200免疫-反應(yīng)性染色的聚合物的相同表面視圖的免疫熒光顯示。箭頭表示在聚合物中間延伸的神經(jīng)突。完整的人角膜顯示上皮表面和深部神經(jīng)，表明這些基質(zhì)既與神經(jīng)生物相容，又可效仿角膜基質(zhì)。
已經(jīng)描述了本發(fā)明，但顯然本發(fā)明可在許多方面變化。這種變化不應(yīng)認(rèn)為背離了本發(fā)明的精神和范圍，且所有這種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都是明顯的并包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種合成共聚物，其包含一或多種N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體，一或多種親水性共聚單體和經(jīng)衍生而含有側(cè)可交聯(lián)部分的一或多種丙烯?；?或甲基丙烯?；?羧酸共聚單體，所述合成共聚物的數(shù)均分子量為約2,000-約1,000,000。
2.權(quán)利要求1的合成共聚物，其中(a)所述N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體具有式I的結(jié)構(gòu) 其中R1，R2，R3，R4和R5獨立地選自H或低級烷基；(b)所述親水性共聚單體具有式II的結(jié)構(gòu) 其中Y是O或不存在；R6，和R7獨立地選自H或低級烷基；R8是H，低級烷基或-OR’，其中R’是H或低級烷基；且R9是H，低級烷基或-C(O)R10，且R10是-NR4R5或-OR”，其中R”是H或CH2CH2OH；和(c)所述丙烯?；?或甲基丙烯?；?羧酸共聚單體具有式III的結(jié)構(gòu)； 其中R11，R12和R13獨立地選自H或低級烷基；且Q是N-琥珀酰亞胺基，3-磺基-琥珀酰亞胺(鈉鹽)，N-苯并三唑基，N-咪唑基或?qū)?硝基苯基。
3.權(quán)利要求1或2的合成共聚物，其中所述一或多種N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體和所述一或多種親水性共聚單體是相同的。
4.權(quán)利要求1或2的合成共聚物，其中所述一或多種N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體和所述一或多種親水性共聚單體是不同的。
5.權(quán)利要求1-4之一的合成共聚物，其中所述烷基或低級烷基是具有1-8個碳原子的直鏈或直鏈烷基基團(tuán)；權(quán)利要求1-4之一的合成共聚物，其中所述烷基或低級烷基是具有3-6個碳原子的環(huán)烷基基團(tuán)。
6.權(quán)利要求2的合成共聚物，其中N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體和親水性共聚單體的總摩爾比為約50％-約99.5％，且衍生的丙烯?；蚣谆；?羧酸共聚單體的摩爾比為約0.5％-約50％，其中所述摩爾比的總和是100％。
7.權(quán)利要求3的合成共聚物，其中N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體的摩爾比為約50％-約90％，且親水性共聚單體的摩爾比為約5％-50％，且衍生的丙烯酰基或甲基丙烯?；?羧酸共聚單體的摩爾比為約0.1％-約15％，其中所述摩爾比的總和是100％。
8.權(quán)利要求1-8之一的合成共聚物，其中所述一或多種N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體選自N-甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺(NiPAAm)、N-辛基丙烯酰胺、N-環(huán)己基丙烯酰胺、N-甲基-N-乙基丙烯酰胺、N-甲基甲基丙烯酰胺、N-乙基甲基丙烯酰胺、N-異丙基甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基甲基丙烯酰胺、N，N-二環(huán)己基丙烯酰胺、N-甲基-N-環(huán)己基丙烯酰胺、N-丙烯酰吡咯烷、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-甲基丙烯酰吡咯烷及其混合物。
9.權(quán)利要求1-9之一的合成共聚物，其中所述一或多種親水性共聚單體選自丙烯酸、甲基丙烯酸、2-羥乙基異丁烯酸酯(HEMA)、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲基氨基)乙基丙烯酰胺、2-(N，N-二乙基氨基)乙基丙烯酰胺、N，N-二乙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酰胺、2-(N，N-二乙基氨基)乙基甲基丙烯酰胺、2-乙烯基-N-吡咯烷酮、2-(N，N-二乙基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(N，N-二甲基氨基)乙基丙烯酸酯、2-(N，N-二乙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、2-(N，N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯及其混合物。
10.權(quán)利要求1-10之一的合成共聚物，其中所述一或多種丙烯?；?或甲基丙烯?；?羧酸共聚單體選自丙烯酸、甲基丙烯酸、或其取代后的形式，且所述可交聯(lián)的部分是琥珀酰亞胺基團(tuán)、咪唑、苯并三唑、對硝基苯酚或2-(N-嗎啉代)乙磺酸。
11.權(quán)利要求2的合成共聚物，其包含N，N-二甲基丙烯酰胺和N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺。
12.權(quán)利要求3的合成共聚物，其包含N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酸和N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺。
13.一種生物-合成基質(zhì)，其包含(a)權(quán)利要求1-13之一的合成共聚物；(b)生物聚合物；和(c)含水溶劑，其中所述合成共聚物和所述生物聚合物通過所述側(cè)可交聯(lián)部分進(jìn)行交聯(lián)而形成水凝膠。
14.權(quán)利要求14的生物-合成基質(zhì)，其中合成共聚物的量為約0.1％-約30％重量，生物聚合物的量為約0.3％-約50％重量，且含水溶劑的量為約20％-約99.6％重量。
15.權(quán)利要求14或15的生物-合成基質(zhì)，其中所述生物聚合物選自膠原蛋白、變性的膠原蛋白、重組膠原蛋白、凝膠、纖維蛋白-纖維蛋白原、彈性蛋白、糖蛋白、藻酸鹽(酯)、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、粘多糖(蛋白聚糖)及其衍生物。
16.權(quán)利要求14-16之一的生物-合成基質(zhì)，其進(jìn)一步包含一或多種生物活性劑。
17.權(quán)利要求17的生物-合成基質(zhì)，其中所述一或多種生物活性劑通過所述側(cè)可交聯(lián)部分與所述合成共聚物共價結(jié)合。
18.權(quán)利要求18的生物-合成基質(zhì)，其中所述生物活性劑包含具有YIGSR序列的五肽。
19.權(quán)利要求17的生物-合成基質(zhì)，其中所述一或多種生物活性劑分散于所述基質(zhì)中。
20.權(quán)利要求14-20之一的生物-合成基質(zhì)，其還包含許多分散在所述基質(zhì)中的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求14-21之一的生物-合成基質(zhì)在需要的動物中作為組織再生的支架的用途。
22.權(quán)利要求14-21之一的生物-合成基質(zhì)在需要的動物中取代損壞的或去除的組織中的用途。
23.權(quán)利要求23的用途，其中所述組織是皮膚或器官的一部分。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述組織是角膜或角膜的一部分。
25.權(quán)利要求14-21之一的生物-合成基質(zhì)在包衣手術(shù)植入物中的用途。
26.一種組合物，其包含(a)一或多種生物活性劑；(b)權(quán)利要求1-13之一的合成共聚物；(c)生物聚合物；和(d)含水溶劑。
27.一種組合物，其包含(a)多個細(xì)胞；(b)權(quán)利要求1-13之一的合成共聚物；(c)生物聚合物；和(d)含水溶劑。
28.權(quán)利要求27或28的組合物，其中合成聚合物的量為約0.1％-約30％重量，生物聚合物的量為約0.3％-約50％重量，且含水溶劑的量為約20％-約99.6％重量。
29.權(quán)利要求27-29之一的組合物，其中所述生物聚合物選自膠原蛋白、變性的膠原蛋白、重組膠原蛋白、凝膠、纖維蛋白-纖維蛋白原、彈性蛋白、糖蛋白、藻酸鹽(酯)、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、粘多糖(蛋白聚糖)及其衍生物。
30.權(quán)利要求27-30之一的組合物，其中所述合成共聚物和所述生物聚合物是交聯(lián)的。
31.權(quán)利要求27-31之一的組合物，其中所述生物活性劑通過所述側(cè)可交聯(lián)部分與所述合成共聚物共價結(jié)合。
32.權(quán)利要求27-30或32之一的組合物，其被配制成可注射的溶液，其中所述合成共聚物和所述生物-聚合物能進(jìn)行交聯(lián)而在體內(nèi)形成水凝膠。
33.權(quán)利要求27-32之一的組合物，其是預(yù)形成的水凝膠。
34.用于組織改造的植入物，其包含預(yù)形成的生物-合成基質(zhì)，所述基質(zhì)包含含水溶劑和與權(quán)利要求1-13之一的合成共聚物交聯(lián)的生物聚合物。
35.權(quán)利要求35的植入物，其中所述生物-聚合物選自膠原蛋白、變性的膠原蛋白、重組膠原蛋白、凝膠、纖維蛋白-纖維蛋白原、彈性蛋白、糖蛋白、藻酸鹽(酯)、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、粘多糖(蛋白聚糖)及其衍生物。
36.權(quán)利要求35或36的植入物，其中合成聚合物的量為約0.1％-30％重量，生物-聚合物的量為約0.3％-50％重量，且含水溶劑的量為約20％-99.6％重量。
37.權(quán)利要求35-37之一的植入物，其中所述生物-合成基質(zhì)支持神經(jīng)向其內(nèi)生長。
38.權(quán)利要求35-38之一的植入物，還包含一或多種生物活性劑。
39.權(quán)利要求39的植入物，其中所述生物活性劑通過所述側(cè)可交聯(lián)部分與所述合成共聚物共價結(jié)合。
40.權(quán)利要求35-40之一的植入物，還包含許多分散在所述基質(zhì)中的細(xì)胞。
41.權(quán)利要求41的植入物，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞或前體細(xì)胞。
42.權(quán)利要求35-40之一的植入物作為人工角膜的用途。
43.制備合成共聚物的方法，包括(a)在引發(fā)劑存在的條件下，將一或多種N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體、一或多種親水性共聚單體以及經(jīng)衍生含有側(cè)可交聯(lián)部分的一或多種丙烯酰基-或甲基丙烯?；?羧酸共聚單體分散在溶劑中；(b)使所述一或多種N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體、一或多種親水性共聚單體以及一或多種丙烯?；?或甲基丙烯酰基-羧酸共聚單體發(fā)生聚合以形成合成共聚物，和(c)可選地純化所述合成共聚物。
44.制備生物合成基質(zhì)的方法，包括以下步驟(a)通過權(quán)利要求44的方法制備合成共聚物；(b)將所述合成共聚物和生物-聚合物分散到含水培養(yǎng)基中；和(c)使得所述合成共聚物和所述生物-聚合物交聯(lián)以提供所述生物-合成基質(zhì)。
45.權(quán)利要求44或45的方法，其中所述N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體和親水性共聚單體是相同的。
46.權(quán)利要求44或45的方法，其中所述N-烷基或N，N-二烷基取代的丙烯酰胺共聚單體和親水性共聚單體是不同的。
47.權(quán)利要求45的方法，還包括在步驟(b)之前混合所述合成共聚物與一或多種生物活性劑，并使得所述生物活性劑通過所述側(cè)可交聯(lián)部分與所述合成共聚物發(fā)生交聯(lián)。
48.權(quán)利要求45的方法，還包括將所述合成共聚物和所述生物聚合物與步驟(b)的許多細(xì)胞混合。
49.通過權(quán)利要求44的方法制備的合成共聚物。
50.通過權(quán)利要求45的方法制備的生物-合成基質(zhì)。
全文摘要
一種包含水凝膠的生物－合成基質(zhì)，其通過將合成聚合物與生物－聚合物進(jìn)行交聯(lián)而形成。所述基質(zhì)是堅固、生物相容且是非細(xì)胞毒性的，并且能夠在體內(nèi)支持細(xì)胞向內(nèi)生長。所述基質(zhì)還可經(jīng)改造以進(jìn)一步包含一或多種生物活性劑。所述基質(zhì)還包含包裹或分散于其中的細(xì)胞，所述細(xì)胞能在將所述基質(zhì)置于體內(nèi)時增殖。還提供了制備所述生物合成的基質(zhì)的方法以及所述基質(zhì)在體內(nèi)組織改造或藥物遞送中的用途。
文檔編號A61L27/34GK1688622SQ03824050
公開日2005年10月26日 申請日期2003年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月9日
發(fā)明者梅·格里菲斯, 戴維·J·卡爾森, 李鳳富 申請人:渥太華健康研究所, 加拿大國立研究院