專利名稱：：寡核苷酸組合物及其在調節(jié)免疫應答中的應用的制作方法寡核苷酸組合物及其在調節(jié)免疫應答中的應用發(fā)明領域本發(fā)明涉及包括含3'-OH、5'-OH硫代磷酸酯和磷酸二酯多核苷酸的組合物及其調節(jié)免疫應答的用途。發(fā)明背景樹突細胞(DC)是參與引發(fā)初次免疫應答的抗原呈遞細胞(APC)。它們的功能隨成熟而變化。未成熟DC能非常有效地加工天然蛋白質抗原，但缺乏足夠用于抗原呈遞的細胞表面II類MHC和共同刺激分子。成熟DC較少能為呈遞而捕獲新蛋白質，但是能更有效地刺激靜息的CD4和CD8T淋巴細胞。從形態(tài)學上講，成熟DC增加細胞大小和顆粒性。成熟DC提高了細胞表面分子II類MHC、CD40、CD83和共同刺激分子CD80和CD86的水平。成熟DC的激活導致高水平IL-12的合成，從而既增強先天免疫又增強獲得性免疫。合成的寡核苷酸是聚陰離子序列。據(jù)報道合成寡核苷酸選擇性結合核酸、特異性細胞蛋白、特異性核蛋白或特異性細胞表面受體。含有至少一個未曱基化的CpG二核苷酸的8-100個堿基的合成硫代磷酸酯寡核苷酸，已顯示能刺激免疫系統(tǒng)(美國專利笫6,239,116號)。具體地說，已發(fā)現(xiàn)包含一個CpG基序(5'噤呤-噪呤-胞嗜啶-鳥噪呤-嗜啶-嘧啶3')的合成硫代磷酸酯寡核苷酸，能刺激細胞因子例如IL-6、IL-12、IFN-y、TNF-a及GM-CSF的合成、天然殺傷細胞的裂解活性和B淋巴細胞的增殖(Krieg,Annu.Rev.Immunol.2002，20:709-760)。已報道包括一個CpG基序、其中tt數(shù)目多于14個的合成硫代磷酸酯寡核香酸，能觸發(fā)樹突細胞的成熟和活化增加細胞大小和顆粒性；合成IL-12;增加細胞內吞作用；以及正調節(jié)細胞表面分子II類MHC、CD40、CD80、CD83和CD86(Sparwasser等，Eur.J.Immunol.1998,28:2045-205;Hartman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999，96:9305-9310;Askew等，J.Immunol.2000，165:6889-6895)。已報道包括一個CpG基序、其中堿基數(shù)目是30個的合成磷酸二酯寡核苦酸，能刺激合成IFN和正調節(jié)DC前體上CD80和CD86的表達(Kadowaski等，J.Immunol.2001166:2291-2295)。我們先前已描述了一種包含2-20個堿基的3'-OH、5'-0H合成寡核苷酸并且選自以下的組合物(GxTy)n、(TyGA、a(GxTy)n、a(TyG丄、(GxTy)nb、(TyGJnb、a(GxTy)nb和a(TyG丄b,其中x和y為1-7的整數(shù)，N為1-12的整數(shù)，a和b為一個或多個As、Cs、Gs或Ts，其中寡核苷酸介于2-20個堿基之間。這些組合物誘導一種選自以下的應答誘導細胞周期停滯、抑制增殖、誘導胱冬蛋白酶(caspase)激活、誘導細胞凋亡和刺激單核細胞和外周血單核細胞合成細胞因子等(參見PCT公布號WO01/44465)。所需的是新的寡核苷酸組合物和利用這些組合物調節(jié)免疫細胞(包括樹突細胞)功能的方法。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供一種包含六堿基3'-OH、5'-OH多核苷酸的寡核苷酸組合物滿足了這種需要。在一個實施方案中，所述多核苷酸的磷酸酯主鏈是磷酸二酯主鏈。在另一個實施方案中，所述多核苷酸的磷酸酯主鏈是硫代磷酸酯主鏈。優(yōu)選該3'-OH、5'-OH多核苷酸是合成的，更優(yōu)選該3'-OH、5'-OH多核苷酸選自5'GTGTGT3'(SEQIDNO:l)、5'GGTGGG3'(SEQIDNO:2)、5'GGGTGG3'(SEQIDNO:3)、5'GGGCGG3'(SEQIDNO:4)、5'GGGAGG3'(SEQIDNO:5)、5'GGGGGG3'(SEQIDNO:6)和5'GGCCGG3'(SEQIDNO:7)。當將所述3'-OH、5'-OH多核苷酸給予人或動物時，能刺激免疫應答。該免疫應答可能是全身的或局部的。在一個實施方案中，所述3'-OH、5'-OH多核苦酸刺激已給予該多核苦酸的人或動物體內的APC。所述3'-OH、5'-OH多核苷酸也可在體外直接給予APC以刺激該APC。然后，可以將經刺激的APC給予人或動物，以激活所述人或動物的免疫應答。如果給予DC，本發(fā)明的3'-OH、5'-OH多核苷酸通過誘導選自以下的應答刺激所述DC:增加IL-ip、IL-12或IFN-y的產生，增加細胞大小和顆粒性，增加內吞作用，增加細胞表面CD80、CD83、CD86或II類MHC的表達以及減少細胞表面OX-2的表達。本發(fā)明還提供一種將包含有效量的3'-OH、5'-OH多核苷酸和藥學上可接受的載體的組合物給予動物或人的方法，以誘導刺激所述動物或人的免疫應答，更優(yōu)選刺激所述動物或人的一種或多種APC。優(yōu)選的APC是DC。在另一個實施方案中，給予動物或人除所述3'-OH、5'-OH多核苷酸組合物外的抗原，能使所述動物或人產生抗原特異性免疫應答。優(yōu)選的抗原是腫瘤抗原和肝炎表面抗原。在某些實施方案中，刺激一種或多種APC使動物或人產生全身免疫應答。在其它實施方案中，所述免疫應答是局部的。本發(fā)明也包括將包含有效量的3'-OH、5'-OH多核苷酸和免疫調節(jié)劑或其形式的組合物給予動物或人的方法，以-秀導刺激所述動物或人的免疫應答。本發(fā)明也提供一種方法，所述方法包括將包含3'-OH、5'-OH多核香酸和藥學上可接受的載體的組合物體外給予含有抗原(包括肺瘤抗原)的APC、更優(yōu)選DC,其中這種給予導致刺激所述APC。所述方法還可以包括將經刺激的APC引入到動物或人體內，以刺激所述動物或人的免疫應答。短六堿基3'-OH、5'-OH多核苷酸刺激APC(例如DC)的意想不到的和令人驚奇的能力為動物和人提供了重大益處。本文描述的方法可用于治療例如腫瘤等疾病、治療變態(tài)反應、免疫動物或人以抵抗多種病原體、治療自身免疫病和預防移植排斥。在某些實施方案中，本發(fā)明通過增加IL-12的合成達到了治療自身免疫病和預防移植排斥的目的。合成的IL-12能抑制自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)和變態(tài)反應(參見例如Bagenstose等,J.Immunol,1998;160:1612(DownregulationofautoantibodyproductioninautoimmunitybyIL-12(在自身免疫中IL-12負調節(jié)自身抗體的產生))；Vogel等，Eur.J.Immunol.,1996;26:219(InhibitionofBllymphocyte,aBlymphocytesubsetimplicatedinthedevelopmentofautoimmunity,byIL-12(IL-12對涉及自身免疫發(fā)生的B淋巴細胞亞群Bl'淋巴細胞的抑制));Dey等，Blood,1998;91:3315(Inhibitionofgraft畫versus國hostdisease(GVHD)byIL-12(IL-12移才直物4元宿主疾病(GVHD)的抑制))；Smits等，Int.ArchAllergyImmunol,,2001;126-102(ModificationofthepathogenicTh2immuneprofiletowardaThlprofilebyIL-12inthetreatmentofallergies(在變態(tài)反應治療中IL-12改善針對Thl分布型的致病Th2免疫分布型)))。在其它實施方案中，本發(fā)明通過免疫接種達到了治療自身免疫病和預防移植排斥的目的(參見例如Zhang等，J.Mol.Med.1996;74:653(VaccinationagainstautoreactiveBorTlymphocytesresponsibleforautoreactivediseases(針Vignes等,Eur.J.Immunol.,2000;30:2460(VaccinationagainstalloreactiveTlymphocytesresponsibleforgraftrejection(4十^f引起移才直排斥的同種異體反應性T淋巴細胞的疫苗接種))；Liu等，J.Exp.Med.,2002;196:1013(InductionofimmunetolerancebydeliveryofdyingcellstoactivatedDCcellsinsitu(通過將瀕死細胞原4立傳遞到活4匕DC細月包而誘導免疫耐受性)))。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種有效治療動物(包括人)的疾病的組合物和方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種有效給動物或人進行免疫接種的組合物和方法。本發(fā)明的又一個目的是提供一種有效治療動物或人的癌癥的組合物和方法。本發(fā)明還有一個目的是提供一種有效刺激動物或人的免疫應答本發(fā)明更進一步的目的是提供一種有效誘導動物或人的APC、優(yōu)選DC成熟和/或激活的組合物和方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種有效誘導體外刺激含有抗原的本發(fā)明的又一個目的是提供一種有效增加DC產生IL-ip、IL-12和/或IFNy的組合物和方法。本發(fā)明還有一個目的是提供一種有效增加DC的細胞大小和/或顆津立性的組合物和方法。本發(fā)明更進一步的目的是提供一種有效增加DC內吞作用的組合物和方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種有效增加DC細胞表面的CD40、CD80、CD8G和/或II類MHC水平的組令物和方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種有效減少DC細胞表面0X-2水平的組合物和方法。本發(fā)明的又一個目的是提供一種增強其它治療劑或免疫調節(jié)劑的效能的組合物和方法。本發(fā)明還有一個目的是提供一種增強APC、優(yōu)選DC上一種或多種細胞因子的效能的組合物和方法。本發(fā)明更進一步的目的是提供一種增強DC上GM-CSF的效能的纟且合物和方法。在參閱下面公開實施方案的詳細描述和所附權利要求書后，本發(fā)明這些和其它目的、特征和優(yōu)勢將會是顯而易見的。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種包括含六堿基的分離的3'-OH、5'-OH多核普酸序列的組合物，其中至少50%的所述堿基是鳥噤呤，所述5'堿基是鳥嘌呤，其應答。本發(fā)明也提供一種方法，所述方法包括將包含有效量的3'-OH、5'-OH多核苷酸和藥學上可接受的載體的組合物給予動物或人，以刺激所述動物或人體內的一種或多種抗原呈遞細胞(APC),或優(yōu)選一種或多種DC。刺激所述動物或人體內的一種或多種APC可產生全身免疫應答或局部免疫應答。本發(fā)明也提供一種方法，所述方法將包含有效量的3'-OH、5'-OH多核苦酸的組合物體外給予含有抗原的APC,以刺激所述APC。然后，可以將這些APC與藥學上可接受的載體一起給予動物或人，以刺激免疫應答?？梢韵蜻@些給予動物或人的任一組合物中加入免疫調節(jié)劑、賦形劑、稀釋劑和/或載體。本發(fā)明也包括所述3'-OH、5'-OH多核苷酸在制備用于刺激動物或人的免疫應答和體外刺激抗原呈遞細胞的藥物中的用途。合成的六堿基3'-OH、5'-OH磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸誘導刺激APC(例如DC)的意想不到的和令人驚奇的能力為動物和人提供了重大益處。本文所用的術語"3'-OH、5'-OH多核苷酸"是指在其3'端和5'端均具有羥基部分的多核苷酸。更具體地講，本發(fā)明的3'-OH、5'-OH多核苷酸在多核苷酸3'端糖的3'碳處包含一個羥基部分并且在多核香酸5'端糖的5'碳處包含一個輕基部分。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述3'-OH、5'-OH多核苷酸由6個核香酸堿基組成。優(yōu)選所述3'-OH、5'-OH多核苷酸包含6個核苦酸堿基，其中這些核苷酸堿基中至少50%是烏。票呤(G),并且其中5'核苷酸堿基是G。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述3'-OH、5'-OH多核苷酸包含5'GGNNGG3'(SEQIDNO:8)序列或5'GGGNGG3'(SEQIDNO:9)序列或者由所述序列組成，其中N為G、C、A或T。所述3'-OH、5'-OH多核苷酸可具體包含選自以下的序列或者由所述序列組成5'GTGTGT3'(SEQIDNO:l)、5'GGTGGG3'(SEQIDNO:2)、5'GGGTGG3'(SEQIDNO:3)、5'GGCCGG3'(SEQEDNO:4)、5'GGGGGG3'(SEQIDNO:5)、5'GGGAGG3'(SEQIDNO:6)和5'GGGCGG3'(SEQIDNO:7)。在一個實施方案中，將載體中的所述3'-OH、5'-OH多核苷酸給予APC、DC、人或動物。這些3'-OH、5'-OH多核苦酸可包含磷酸二酯主鏈或修飾磷酸酯主鏈，例如硫代磷酸酯主鏈。含有磷酸二酯主鏈并且對應于上述序列號的3'-OH、5'-OH多核苷酸在下文如下稱謂5'GTGTGT3'(SEQK)NO:l)(N1A)、5'GGTGGG3'(SEQIDNO:2)(N2A)、5'GGGTGG3'(SEQE)NO:3)(N3A)、5'GGCCGG3'(SEQIDNO:4)(N4A)、5'GGGGGG3'(SEQIDNO:5)(N5A)、5'GGGAGG3'(SEQIDNO:6)(N6A)和5'GGGCGG3'(SEQIDNO:7)(N7A)。在這些實施方案中，所述多核普酸鏈中的每個核苷酸都是磷酸二酯核苷酸。含有硫代磷酸酯主鏈并且對應于上述序列號的3'-OH、5'-OH多核苷酸在下文如下稱謂5言GTGTGT3'(SEQE)NO:l)(N1B)、5'GGTGGG3'(SEQIDNO:2)(N2B)、5'GGGTGG3'(SEQIDNO:3)(N3B)、5'GGCCGG3'(SEQIDNO:4)(N4B)、5'GGGGGG3'(SEQIDNO:5)(N5B)、5'GGGAGG3'(SEQIDNO:6)(N6B)和5'GGGCGG3'(SEQIDNO:7)(N7B)。在這些實施方案中，所述多核苷酸鏈中的每個核苷酸都是硫代磷酸酯核苷酸。本發(fā)明也包括含一個或多個;粦酸二酯核苷酸和一個或多個辟d戈磷酸酯核苷酸的3'-OH、5'-OH多核苷酸。所述3'-OH、5'-OH多核苷酸優(yōu)選是N1A、N2B、N3B或N5B，更優(yōu)選是N3B或N5B。另外，本文所用的術語"刺激"是指各種各樣的DC或APC的激活或成熟，或者免疫應答的激活或增加，這取決于該術語的使用范圍。DC的刺激可由以下證據(jù)獲得證實細胞大小和/或顆粒性增力口；IL-1(3、IL-12和/或IFN-y的產生增加；內吞作用增加；CD80、CD83、CD86、II類MHC或其任何組合的細胞表面表達增加；OX-2的細胞表面表達減少；或它們的任何組合。因此，"樹突細胞應答"包括但不限于細胞大小和/或顆粒性增加；IL-ip、IL-12和/或IFN-y的產生增加；內吞作用增加；CD80、CD83、CD86或II類MHC的細胞表面表達增加；OX-2的細胞表面表達減少；或它們的任何組合。術語"樹突細胞"和"DC"包括但不限于間質DC、朗格漢斯細胞衍生的DC、漿細胞樣DC和前述細胞的任何祖細胞。本文所用的術語"產生"是指分子的合成和/或分泌。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述樹突細胞是間質DC。相信本文描述的3'-OH、5'-OH多核苷酸不僅能刺激DC，而且能刺激其它APC，包括專職APC，例如但不限于單核細胞、巨噬細胞、郎格漢斯細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、肝巨噬細胞、小膠質細胞、神經膜細胞和內皮細胞；和非專職APC,例如但不限于上皮細胞、成纖維細胞、黑素細胞、神經細胞、平滑肌細胞、肌細胞、肝細胞、星形膠質細胞和角化細胞。因此，本發(fā)明包括用于激活APC的纟且合物和方法。如果涉及免疫應答，術語"刺激"通常是指以抗原非特異性方式激活免疫系統(tǒng)或者激活免疫系統(tǒng)的組分，除非另有說明。個體免疫應答的刺激可由以下但不限于以下的證據(jù)獲得證實細胞增殖、克隆擴充、新蛋白質合成、分化成效應細胞、分化成記憶細胞、抗體類型的水平或數(shù)量增加、抗體類別轉換、產抗體B淋巴細胞中的體細胞高變、免疫細胞類型的水平或數(shù)量增加、免疫細胞在特定部位的募集(游動和遷移)、個體細胞因子的水平或數(shù)量增加、個體趨化因子的水平或數(shù)量增加、抗原呈遞增加、內吞作用增加、共同刺激分子(輔助分子)增加或獲得、粘著分子增加或獲得、細胞因子受體增加或獲得、趨化因子受體增加或獲得、細胞介導的細胞毒性增加、形態(tài)改變、免疫細胞記憶建立、活性氧中間體的水平或數(shù)量增加、一氧化氮的水平或數(shù)量增加、神經內分泌分子(如激素、神經遞質等)的水平或數(shù)量增加以及免疫耐受性或免疫抑制破壞。免疫細胞包括但不限于淋巴細胞，例如B細胞、T細胞，包括CD4+細胞和CD8+細胞和NK細胞；單核吞噬細胞；粒細胞，例如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜44性粒細胞；如本文所描述的樹突細力包；和前述細月包的任何祖細胞。抗體類型包括IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和IgY。在一個實施方案中，所述免疫應答是全身免疫應答。術語"全身免疫應答"在本文中是指不限于機體特定部位的免疫應答。全身免疫應答的一個實例是給予個體抗原和免疫刺激分子后所述個體循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)中的抗體循環(huán)水平增加。另一個實例是給予個體免疫刺激分子后所述個體循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)中的細胞因子和/或趨化因子水平增加。另一個實例是在血液或淋巴循環(huán)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)器官例如脾臟、淋巴結或肝臟中存在能夠響應致敏抗原攻擊的敏化免疫效應細胞如T細胞、B細胞或漿細胞。在其它實施方案中，所述免疫應答是局部免疫應答。術語"局部免疫應答"是指主要但不一定完全限于機體具體部位的免疫應答。局部免疫應答可由局部肺脹或發(fā)紅和/或免疫細胞募集(游動和遷移)到機體具體部位獲得證實。例如，粘膜免疫應答可在粘膜給予抗原和/或免疫刺激分子例如本文描述的3'-OH、5'-OH多核香酸后出現(xiàn)。粘膜應答可以包括但不限于抗體類型的水平或數(shù)量增加、IgA抗體的水平或數(shù)量增加、y/S陽性T淋巴細胞活化、誘導局部免疫耐受性和誘導全身免疫耐受性。在本發(fā)明的幾個實施方案中，將所述3'-OH、5'-OH多核苷酸給予個體(即動物或人)，以治療或預防疾病。本文所用的術語"疾病"是指其中身體健康受損的病癥，包括但不限于癌癥、病原體(包括病毒、細菌或寄生蟲)感染、變態(tài)反應、自身免疫病和對移植器官的自身免疫應答。在某些實施方案中，所述疾病與DC功能失常相關，包括但不限于賽塞利綜合征(Sezarysyndrome)(患者具有循環(huán)DC深度缺乏)(Wysocka等，Blood2002,100:3287)、唐氏綜合征(Down'ssyndrome)(患者具有樹突萎縮)(Takashima等,J.Intellect.Disabil.Res.1994，38:265)、涉及DC不適當激活的自身免疫病(例如DC呈遞自體抗原延長)(Erikson等，J.Exp.Med.2003,197:323和Ludewig等，Curr.Opin.Immunol.2001,13:657)、脊髓損傷(患者具有樹突萎縮)(Iversen等，Blood2000,96:208l)和格雷夫斯病(Graves'disease)(所述疾病中甲狀腺樹突細胞纏結)(Quadbeck等，Scand.J.Immunol.2002,55:612)。術語"治療"是指疾病癥狀減輕并不需要治愈所述疾病。另外，本文所用的術語"有效量"是指有效誘導免疫應答的3'-OH、5'-OH多核苷酸的量?？梢酝ㄟ^包括但不限于以下的方法來增強3'-OH、5'-OH多核香酸的治療功效化學修飾堿基、糖或磷酸酯主鏈，利用含有適當序列的細菌質?；瘜W補充或生物技術擴增所述序列，使所述序列與生物學或化學載體復合；或者使所述序列與針對細胞類型的配體或抗體偶聯(lián)。本發(fā)明的3'-OH、5'-OH多核苷酸可與藥學上可接受的載體混合，作為組合物在體外或體內給予細胞，優(yōu)選APC,更優(yōu)選DC。在本發(fā)明的一個實施方案中，將包含有效刺激DC量的3'-OH、5'-OH多核苷酸的組合物在體外給予DC。然后，將所迷DC與藥學上可接受的栽體一起給予動物或人，以刺激所述動物或人的免疫應答。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述樹突細胞是未成熟DC，其特征包括但不限于下列各項高胞內水平的II類MHC;高內吞活性；高水平的特異性趨化因子受體CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6和CXRC1;低水平的CCR7;高水平的CD36、CD68、CD47和CD91分子；低水平的共同刺激分子CD40、CD54、CD58、CD80和CD83;缺乏DC-LAMP(LAMP;溶酶體相關膜蛋白)；細胞表面存在的DCIR(DC免疫受體)、CLEC-1(C-凝集素受體)、DC-ASGPR(DC-脫唾液酸糖蛋白)、畫(甘露糖受體)、TLR-2和TLR-3(Toll樣受體)、FC丫R、FceR、整聯(lián)蛋白otv(35和avp3。未成熟DC可存在于外周血。在一個更優(yōu)選的實施方案中，未成熟DC在將3'-OH、5'-OH多核苷酸給予DC之前就含有抗原或者接觸了抗原。非限制性獲得含有抗原的DC的方法包括抗原脈沖和利用經遺傳修飾的DC表達一種或數(shù)種抗原。人們將會理解，可以將有效量的一種或多種3'-OH、5'-OH多核苷酸在體外單獨給予DC或者與其它影響含有抗原(包括腫瘤抗原)的DC的免疫調節(jié)劑聯(lián)合給予DC，以有效誘導刺激設計用以再注射到動物或人的DC，從而刺激免疫應答。免疫調節(jié)劑包括但不限于下列各項氫氧化鋁；磷酸鋁；磷酸鈣；聚合物；共聚物，例如聚氧乙稀-聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物；聚合物P1005;弗氏完全佐劑(用于動物)；弗氏不完全佐劑；失水山梨糖醇一油酸酯；角鯊烯；CRL-8300佐劑；QS21;皂苷；ISCOM;胞壁酰二肽；葡糖胺胞壁酰二肽；海藻糖；細菌提取物，包括分枝桿菌提取物；細菌完整細胞，包括分枝桿菌完整細胞；解毒內毒素；膜脂；從原核生物分離的DNA;CpG合成寡核苦酸；非CpG合成寡核香酸；適體(apatamer);質粒免疫刺激分子；聚(I:C)分子；細胞因子；趨化因子；脫乙酰殼多糖及其衍生物；透明質酸及其衍生物；霍亂毒素；百日咳毒素和匙孔蜮血藍蛋白；或它們的組合。3'-OH、5'-OH多核苷酸或3'-OH、5'-OH多核苷酸加上免疫調節(jié)劑可以在單次治療或多次治療中任選以不同濃度并且在適合剌激DC的時間段內加入到DC中。所述3'-OH、5'-OH多核苷酸可以在給予所述免疫調節(jié)劑之前、同時或之后加入。此外，所述3'-OH、5'-OH多核苷酸可以在給予所述抗原之前、同時或之后力口入。本發(fā)明也包括給予動物或人3'-OH、5'-OH多核苷酸和未包含在DC中的抗原的方法，其中這種給予使動物或人產生免疫應答，更優(yōu)選產生抗原特異性免疫應答。所述抗原可以在給予3'-OH、5'-OH多核苷酸之前、同時或之后給予動物或人。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗原與所述3'-OH、5'-OH多核苷酸同時給予。本文所描述的抗原并不限于任何具體的抗原或抗原類型。在一個實施方案中，所述抗原是腫瘤抗原，例如源自腫瘤細胞裂解物的腫瘤抗原。在另一個實施方案中，所述抗原是源自病原體的抗原，更優(yōu)選在病原體表面表達的抗原。一個源自病原體的表面抗原實例是肝炎表面抗原。如果將所述抗原(未包含在DC中)給予動物或人，則所述抗原可作為蛋白質、肽或多肽給予，或者可以給予編碼所述抗原的多核苦酸。編碼所述抗原的多核苷酸可包含在含有其它元件的載體中，使得其可以在動物或人體內表達所述抗原多肽。在一個實施方案中，所述抗原和3'-OH、5'-OH多核苷酸包含在不同的載體中。將經3'-OH、5'-OH多核苷酸刺激的、含有抗原的DC給予動物或人，或者將3'-OH、5'-OH多核苷酸和抗原給予動物或人，導致刺激所述動物或人的免疫應答。在優(yōu)選的實施方案中，這種給予導致刺激所述動物或人的免疫系統(tǒng)以及抗原特異性免疫應答。術語"抗原特異性免疫應答"是指主要直接針對所述抗原的免疫應答?？乖禺愋悦庖邞鸢ㄒ韵路矫婊蛘哂梢韵路矫娼M成抗體量(抗體效價)增加、抗體類別轉換、產抗體B淋巴細胞的體細胞高變、免疫細胞記憶建立、在給予所述抗原的人和動物體內帶有針對所述抗原的特異性B細胞受體或T細胞受體的細胞量增加。當抗體以足夠親和力和親合力結合特定抗原并導致產生抗原-抗體復合物時，所述抗體對所述抗原是"特異性"的給藥形式包括但不限于注射劑、溶液劑、乳膏劑、凝膠劑、植入物、泵、軟膏劑、乳劑、混懸劑、微球、顆粒劑、微粒、納米粒、脂質體、糊劑、貼劑、片劑、透皮遞藥裝置、噴霧劑、氣霧劑或其它本領域普通人員熟悉的劑型。本發(fā)明的藥用制劑可通過本領域已知的方法并使用熟知的和容易獲得的成分來制備。例如，所述化合物可以與常用賦形劑、稀釋劑或載體一起配制成片劑、膠嚢劑、混懸劑、粉劑等。適用于所述制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的實例包括下列各項填充劑和增量劑(例如淀粉、糖、甘露糖醇和硅衍生物)；粘合劑(例如羧曱基纖維素及其它纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮)；濕潤劑(例如甘油)；崩解劑(例如碳酸鈣和碳酸氫鈉)；溶液型阻滯劑(例如石蠟)；吸收加速劑(例如季銨化合物)；表面活性劑(例如鯨蠟醇、甘油一硬脂酸酯)；吸附載體(例如高嶺土和膨潤土)；乳化劑；防腐劑；甜味劑；穩(wěn)定劑；著色劑；芳香劑；矯味劑；潤滑劑(例如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂)；固態(tài)聚乙二醇；和它們的混合物。所述制劑也可這樣建立使它們僅在或優(yōu)選在特定部位釋放活性成分，并可在一段時間內釋放活性成分(即緩釋制劑)。這樣的組合還提供進一步控制釋放動力學的機制。包衣、被膜和保護骨架可以用聚合物和蠟制備。可以通過將所述3'-OH、5'-OH多核苷酸和藥學上可接受的載體均勻地混合，來制備包含一種或多種3'-OH、5'-OH多核苷酸和藥學上可接受的載體的組合物。藥學上可接受的載體包括液體載體、固體載體或它們兩者。液體載體是水性載體、非水性載體或它們兩者，并且包括但不限于水性懸浮劑、油乳劑、油包水乳劑、水包油包水型乳劑、位點特異性乳劑、長滯留乳劑、粘性乳劑、微乳劑和納米乳劑。固體載體是生物學載體、化學載體或它們兩者，并且包括但不限于病毒載體系統(tǒng)、顆粒、微粒、納米粒、微球、納米球、微型泵、細菌細胞壁提取物和生物可降解或生物不可降解天然或合成聚合物，使得可以持續(xù)釋放所述寡核苷酸組合物?？梢詫⑷閯?、微型泵和聚合物植入需要遞藥的附近(Brem等，J.Neurosurg.74:441,1991)。用于使3'-OH、5'-OH多核香酸與固體載體復合的方法包括但不限于直接吸附到固體載體表面、直接或通過連接部分共價偶聯(lián)到固體載體表面和共價偶聯(lián)到用于制備所述固體載體的聚合物上。可以任選通過加入非離子型或離子型聚合物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(TWEEN)或透明質酸，使序列穩(wěn)定。優(yōu)選的水性載體包括但不限于水、鹽水和藥學上可接受的緩沖液。優(yōu)選的非水性載體包括但不限于礦物油或中性油，包括但不限于甘油二脂、甘油三脂、磷脂、脂質、油和它們的混合物，其中所述油含有合適的多不飽和和飽和的脂肪酸的混合物。實例包括但不限于豆油、低芥酸茱子油、椋櫚油、橄欖油和myglyol,其中所述脂肪酸可能是飽和的或不飽和的。所述藥學上可接受的載體無論是否用來將3'-OH、5'-OH多核苷酸組合物呈遞給細胞，都可以任選包括賦形劑。這些賦形劑包括但不限于抗氧化劑、緩沖劑和抑菌劑，并且可以包括懸浮劑和增稠劑?？梢詫⒁环N或多種3'-OH、5'-OH多核苷酸單獨給予人或動物，或者將其與其它免疫調節(jié)劑聯(lián)合給予人和動物，所述免疫調節(jié)劑包括但不限于以下各項氫氧化鋁；磷酸鋁；磷酸鉤；聚合物；共聚物如聚氧乙稀-聚氧丙烯共聚物，包括嵌段共聚物；聚合物P1005;弗氏完全佐劑(用于動物)；弗氏不完全佐劑；失水山梨糖醇一油酸酯；角鯊烯；CRL-8300佐劑；QS21;皂苷；ISCOM.;胞壁酰二肽；葡糖胺胞壁酰二肽；海藻糖；細菌提取物，包括分枝桿菌提取物；細菌完整細胞，包括分枝桿菌完整細胞；解毒內毒素；膜脂；從原核生物分離的DNA;CpG合成寡核苷酸；非CpG合成寡核苷酸；適體；編碼免疫刺激分子的質粒；聚(I:C)分子；細胞因子；趨化因子；脫乙酰殼多糖及其衍生物；透明質酸及其衍生物；霍亂毒素；百日咳毒素和匙孔蜮血藍蛋白；或它們的組合。另外，可以將一種或多種3'-OH、5'-OH多核苷酸單獨給予，或與其它治療劑聯(lián)合給予，所述治療劑包括但不限于化療劑、抗菌劑或抗病毒劑。化療劑包括但不限于抗代謝劑、DNA損傷劑、微管去穩(wěn)定劑、微管穩(wěn)定劑、肌動蛋白解聚劑、生長抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、HMG-CoA抑制^j、噤呤抑制劑、嘧啶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、CDK抑制劑、血管生成抑制劑和分化增強劑。這些其它治療劑的給藥劑量和方法是本領域普通技術人員已知的。本發(fā)明的3'-OH、5'-OH多核苷酸、含有所述3'-OH、5'-OH多核苷酸的APC或DC細胞、或包含3'-OH、5'-OH多核苷酸及其它特別適合各種劑型的材料如本發(fā)明載體的組合物等的給藥方法包括但不限于下列給藥類型口服(如口腔或舌下)給藥、肛門給藥、直腸給藥(如栓劑)、局部給藥、胃腸外給藥、鼻腔給藥(如氣霧劑)、吸入給藥、鞘內給藥、腹腔內給藥、靜脈內給藥、動脈內給藥、經皮給藥、皮內給藥、真皮下給藥、皮下給藥、肌內給藥、組織內(組織或腺體)給藥、子宮內給藥、陰道給藥、機體腔內給藥、肺瘤或內傷部位手術給藥、肺瘤內直接給藥、器官的腔內或軟組織內給藥、骨髓內給藥以及胃腸道、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和泌尿生殖器系統(tǒng)的任何粘膜表面給藥。在一個優(yōu)選的實施方案中，將本發(fā)明的3'-OH、5'-OH多核苷酸給予選自以下的粘膜表面膀胱內、眼、口、鼻、直腸和陰道表面。以上提及的各種給藥形式中所用的技術包括但不限于局部施用、攝入、外科手術給藥、注射、噴霧、透皮遞藥裝置、滲透泵、直接在所需部位電淀積或其它本領域普通技術人員熟悉的技術手段。施用部位可以是外部，如表皮上，或是內部，例如胃潰瘍，手術部位，或是其它部位。本發(fā)明組合物可以適用于以下形式乳膏劑、凝膠劑、溶液劑、混懸劑、脂質體、微?；蚱渌鼘χ苿┗蚪M合物給藥領域技術人員已知的形式。超細顆粒大小可用于治療劑的吸入給藥。某些合適的皮下給藥用制劑的實例包括但不限于植入物、貯庫型制劑、針劑、膠嚢劑和滲透泵。某些合適的陰道給藥用制劑的實例包括但不限于乳膏劑和環(huán)形物。某些合適的口服給藥用制劑的實例包括但不限于丸劑、液體制劑、糖漿劑和混懸劑。某些合適的透皮給藥用制劑的實例包括但不限于凝膠劑、乳膏劑、糊劑、貼劑、噴霧劑和凝膠劑。某些合適的皮下給藥遞送裝置的實例包括但不限于植入物、貯庫型制劑、針劑、膠嚢劑和滲透泵。適合胃腸外給藥的制劑包括但不限于水性和非水性無菌注射液，所述注射液可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使所述制劑與預期受體血液等滲的溶質；以及水性和非水性無菌混懸劑，所述混懸劑可以包括懸浮劑和增稠劑?？梢杂帽绢I域普通技術人員常規(guī)使用的無菌粉針劑、顆粒劑和片劑來制備臨時用的注射液和注射用混懸劑?？梢詫⒈景l(fā)明組合物與例如一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合的實施方案可以便利存在于單位劑型中，并且可通過常規(guī)的制藥技術制備。這些技術包括將含有活性成分的組合物和藥用載體或賦形劑混合在一起的步驟。一般而言，通過將活性成分與液體載體均勻地混合在一起來制備所述制劑。優(yōu)選的單位劑量制劑是那些含有給藥成分的一個劑量或單位或合適部分的制劑。人們應理解，除以上具體提及的成分之外，包含本發(fā)明組合物的制劑可以包括本領域普通技術人員通常使用的其它藥劑。給藥體積將會根據(jù)給藥途徑而變化。這樣的體積是將組合物給予動物或人的領域的普通技術人員已知的。根據(jù)給藥途徑，每劑體積優(yōu)選約0.001-100ml/劑，更優(yōu)選約0.01-50ml/劑，最優(yōu)選約0.1-30m1/劑。例如，肌內注射的體積范圍可以為約O.lml至l.Oml。單獨給予或者與其它治療劑聯(lián)合給予的寡核苷酸組合物可以在單劑量治療中給予、在多劑量治療中給予或按療程和適合待治療疾病、受體病癥和給藥途徑的時段內連續(xù)輸注。此外，其它治療劑可在給予所述寡核苷酸組合物之前、同時或之后給予。每劑給予的3'-OH、5'-OH多核苷酸的量為優(yōu)選約0.0001-100mg/kg體重，更優(yōu)選約0.001-10mg/kg體重，最優(yōu)選約0.01-5mg/kg體重。給予的具體3'-OH、5'-OH多核普酸和具體治療劑、每劑的量、給藥時間表和給藥途徑應該由主治醫(yī)師使用本領域技術人員已知的方法并且根據(jù)以下因素來決定疾病類型、疾病的嚴重程度、疾病部位和其它臨床因素，例如受體的體型、體重和身體一般狀況。另外，體外實驗可任選用于幫助鑒定最佳的給予次序和次序加上治療劑的范圍。下面的實施例將用來進一步地說明本發(fā)明，然而，同時該實施例并不構成對本發(fā)明的任何限制。相反，需清楚地了解，在閱讀本發(fā)明說明書之后，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領域技術人員可以采取各種各樣的其它實施方案、修改及其等同實施方案。實施例13'-OH、5'-OH多核苷酸的制備3'畫OH、5'-OH多核苷酸序列由Sigma-Genosys(Woodlands,TX)用算盤片斷合成技術(AbacusSegmentedSynthesisTechnique)制備。除非另有說明，臨用前將所述序列分散于高壓滅菌的去離子水中或者分散于藥學上可接受的緩沖液(例如但不限于鹽7JC)中。可以使用下列序列N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A和N7B。實施例2樹突細胞人樹突細胞得自Clonetics(SanDiego，CA,USA),并在由Clonetics推薦的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。DC得自三個不同的個體(參見表1)。對這些個體的每一個進行主要組織相容性分型，并且顯示幾個HLA(人白細胞抗原)型。表l.DC特征<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例3與3'-OH、5'-OH多核苷酸一起培養(yǎng)的DC的細胞大小和顆粒性增加將1.0mlDC按1.0X105細胞/ml與100嗎的六堿基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。利用FACSCalibur流式細胞儀測定細胞大小(FCS:前向側散射)和顆粒性(SSC:側向光散射)，并用CELLQuestPro軟件(兩者均得自Becton-Dickinson,SanDiego，CA,USA)進4亍分才斤。乂人三個不同個體分離的DC在用3'-OH、5'-OH多核苷酸處理后，測定顯示FCS>500單位和SSO400單位的DC百分率。表2用3'-OH、5'-OH多核香酸處理后，顯示FCS〉500單位和SSC〉400單位的DC百分率。該百分率以FACS測定的每組DC的總群體為基準。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表2所示，根據(jù)細胞大小(FCS)和顆粒性(SSC)增加測定，許多序列誘導刺激/成熟DC。實施例4誘導IL-1(3的產生將1.0mlDC按1.0X105細胞/ml與IOO嗎的六堿基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一^4矣種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，利用商業(yè)ELISA(BioSource,Camarillo,CA,USA)測定100^1培養(yǎng)上清液中IL-lp的產生。結果表示為經處理的DC產生的IL-1(3與對照細胞產生的IL-1(3之比值即"倍數(shù)"(x)。表3DC產生的IL-ip(相對于未處理的DC的倍數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>如表3所示，多核苷酸N3B和多核苷酸N5B誘導來源于三個測試個體細胞中IL-ip的產生。頁實施例5誘導IL-12的產生將1.0mlDC按1.0X105細胞/ml與lOOjug的六堿基N1A、NIB、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，利用商業(yè)ELISA(BioSource)測定100^1培養(yǎng)上清液中IL-12的產生。結果表示為經處理的DC產生的IL-12與對照細胞產生的IL-12之比值即"倍數(shù)"(x)。表4DC產生的IL-12(相對于未處理的DC的倍數(shù))序列從個體中分離的DCABCN1A15.917.82.1NIB1.51.31.1N2A7.96.81.6N2B1.36.02,5N3A1.01.01.0N3B5.217.314.4N4A1.2n.d.1.0N4B1.3n.d.2.6N5A0.91.11.0N5B7.517.815.0N6A1.01.01.0N6B1.31.44.1N7A1.0n.d.0.9N7B1.8n.d.1.0如表4所示，許多序列誘導產生IL-12。實施例6誘導IFN-y的產生將1.0mlDC按1.0X105個細胞/ml與lOOjig的六堿基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，利用商業(yè)ELISA(BioSource,Camarillo,CA,USA)測定100^1培養(yǎng)上清液中IFN-y的產生。結果表示為經處理的DC產生的IFN-y與對照細胞產生的IFN-y之比值即"倍數(shù)"(x)。表5DC產生的IFN-y(相對于未處理的DC的倍數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>如表5所示，多核苷酸N3B和多核苦酸N5B誘導三個測試個體的細胞中IFN-y的產生。實施例7序列加GM-CSF誘導IL-12將1.0ml來自個體B的DC按1.0X105個細胞/ml與500單位人重組GM-CSF(Clonetics)和IOO昭的六堿基N1A多核苷酸或N7A多核苷酸一起接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，利用商業(yè)ELISA(BioSource)測定lOOfil培養(yǎng)上清液中IL-12的產生。結果表示為在不存在或存在重組GM-CSF的情況下，經處理的DC產生的IL-12與對照細胞產生的IL-12之比值即"倍"(x)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表6所示，可觀察到GM-CSF與多核普酸NlA或多核苷酸N7A對DC產生IL-12的協(xié)同作用。實施例8增加DC細胞表面的CD40水平將1.0ml來自個體B和個體C的DC按1.0X105個細胞/ml與lOOpg的六石錄N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起^妄種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，用FITC-綴合的抗CD40單克隆抗體通過流式細胞儀(FACSCalibur系統(tǒng))測定所述細胞表面CD40的水平，并用CELLQuestPro(都來自BectonDickinson)進行分析。結果表示為處理后的CD40hiDC百分率。術語"CD401是指流式細胞儀鑒定的、高于CD40基線表達的細胞群體。表7處理后的CD40hiDC百分率序列從個體中分離的DCBC未處理的88N1A2124**NIB3廣18N2A27"17N2B2237"N3A36**20N3B33**14N4An.d.16N4Bn.d.16N5A40**30**N5B2115N6A35**15N6B28**15N7An.d.23N7Bn.d.18如表7所示，許多序列具有明顯正調節(jié)DC細胞表面CD40表達的能力。**/<0.001Kolmogorov-Smirnov(D>0.20)。實施例9增加DC細胞表面CD80水平將1.0ml來自個體B和個體C的DC按1.0X105個細胞/ml與一起lOO)iig的六堿基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，用FITC-綴合的抗CDSO(Serotec，Oxford,U.K.)單克隆抗體通過流式細胞儀測定所述細胞表面CD80的水平，并用CELLQuest進行分析。結果表示為處理后的CD8QhiDC百分率。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>如表8所示，許多序列明顯正調節(jié)DC細胞表面CD80的表達。**/<0.001Kolmogorov-Smirnov(D>0.20)。實施例10增加DC細胞表面CD86水平將1.0ml來自個體B和個體C的DC4妄1.0X105個細胞/ml與一起100|Lig的六堿基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核香酸接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，用PE-綴合的抗CD86(Serotec)單克隆抗體通過流式細胞儀測定所述細胞表面CD86的水平，并用CELLQuestPro進行分析。結果表示為處理后的CD86hiDC百分率。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表10所示，許多序列明顯正調節(jié)DC細胞表面CD86表達。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>實施例11增加DC細胞表面MHC-II水平將1.0ml來自個體B的DC按1.0X105個細胞/ml與100pg的六堿基N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸一起接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，用FITC-綴合的抗MHCII(Serotec)單克隆抗體通過流式細胞儀測定所述細胞表面的MHCII水平，并用CELLQuestPro進行分析。結果表示為處理后的MHCIIhiDC百分率。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>如表10所示，多核苦酸N1A、N2A和N7B明顯正調節(jié)DC細胞表面固CII的表達。**pO.001Kolmogorov國Smirnov(D>0.12)。實施例12減少DC細胞表面OX-2水平將1.0ml來自個體A的DC按1.0X105個細胞/ml與l)iig、IO嗎或lOO]Lig的六堿基N3A或N6A多核苷酸一起接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育48小時。孵育48小時后，用FITC-綴合的抗OX-2(BioSPARK,Greenwich,CT,USA)單克隆抗體通過流式細胞儀測定所述細胞表面的OX-2水平，并用CELLQuestPro進行分析。已發(fā)現(xiàn)一種DC表面抗原OX-2可抑制刺激Thl細胞因子產生并提供免疫細胞耐受信號(Gorczynski等，J.Immunol.1999162:774-781)。結果表示為處理后的OX-2hiDC百分率。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>如表12所示，多核苷酸N3A明顯負調節(jié)DC細胞表面OX-2的表達。<0.001Kolmogorov-Smirnov(D>0.20)。實施例13增加DC的內吞作用在不存在或存在100lag的六堿基N:2A、N2B、N3A、N3B、N5A、N5B和N6B多核苷酸的情況下，將1.0ml來自個體B的DC按1.0X105個細胞/ml與lmg/mlFITC-葡聚糖(20kDa;Sigma國Aldrich)—起在4°C(對照細胞表面FITC-葡聚糖的結合)和37°C(評價內吞作用)接種到6孔平底組織培養(yǎng)板中并孵育24小時。用冰冷卻的磷酸緩沖鹽溶液洗滌細胞三次，并通過流式細胞儀用CELLQuestPro進行分析。結果表示為相對內吞率(標準化A平均熒光值(AMFV))。AMFV=在"。C暴露于FITC-葡聚糖的DC的MFV_在4。C暴露于FITC-葡聚糖的DC的MFV。AMFV=(序列AMFV/對照AMFV)x100。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>如表12所示，N2A、N2B、N3A、N5A和N5B多核香酸增加DC的內吞率。實施例14癌癥免疫接種抗原脈沖的DC給來自B-16黑素瘤細胞的肺瘤細胞裂解物在體外加載從C57BL/6小鼠分離的DC。在抗原脈沖期間包括N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核苷酸。給75只C57BL/6小鼠皮下注射約2x106個8-16黑素瘤細胞。肺瘤接種后7天，將小鼠分成15組，每組5只小鼠。第1組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC免疫接種；笫2組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100嗎N1A多核苷酸免疫接種；笫3組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100昭NIB多核苷酸免疫接種；笫4組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100jugN2A多核苷酸免疫接種；笫5組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100pgN2B多核苷酸免疫接種；笫6組小鼠用2x104B-16胂瘤裂解物脈沖的DC+100嗎N3A多核苷酸免疫接種；第7組小鼠用2x104B-16肺瘤裂解物脈沖的DC+100pgN3B多核苷酸免疫接種；第8組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100jigN4A多核苷酸免疫接種；笫9組小鼠用2xlO"B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100嗎N4B多核苷酸免疫接種；笫10組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100|agN5A多核苷酸免疫接種；笫11組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100貼N5B多核苷酸免疫接種；笫12組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100昭N6A多核苷酸免疫接種；笫13組小鼠用2x104B-16肺瘤裂解物脈沖的DC+100昭N6B多核苷酸免疫接種；笫14組小鼠用2x104B-16腫瘤裂解物脈沖的DC+100嗎N7A多核苷酸免疫接種；笫15組小鼠用2x104B-16肺瘤裂解物脈沖的DC+100pgN7B多核香酸免疫接種。1周后重復前面描述的免疫接種。2周后，分析腫瘤的體積和重量。第2-15組小鼠的腫瘤質量比笫1組小鼠的胂瘤質量小。通過IFN-YELISPOT，利用注射腫瘤裂解物脈沖的DC之前和之后的小鼠外周血單核細胞，分析特異性針對B-16抗原的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。笫2-15組小鼠中針對B-16的CTL的頻率比笫1組小鼠中的高。實施例15免疫4妄種百日咳博4急特氏菌(萬0^^^//0^^^^'力月永沖的DC給107個熱滅活的百日咳博德特氏菌在體外加載從C57BL/6小鼠分離的DC。在抗原脈沖期間包括N1A、N1B、N2A、N2B、N3A、N3B、N4A、N4B、N5A、N5B、N6A、N6B、N7A或N7B多核香酸。將70只C"BL/6小鼠分成15組，每組5只。第1組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC;第2組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N1A多核苷酸；第3組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的NlB多核苷酸；第4組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N2A多核苷酸；第5組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N2B多核苷酸；笫6組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N3A多核苷酸；第7組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N3B多核苷酸；笫8組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N4A多核苷酸；第9組小鼠免疫接種107個熱滅活的百曰咳博德特氏菌脈沖的DC+100ng的N4B多核苷酸；第10組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N5A多核苷酸；笫11組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100ng的N5B多核苷酸；笫12組小鼠免疫接種107個熱滅活的百曰咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N6A多核苷酸；第l3組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N6B多核普酸；笫14組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100pg的N7A多核苷酸；笫15組小鼠免疫接種107個熱滅活的百日咳博德特氏菌脈沖的DC+100ng的N7B多核苷酸。以上所述的免疫接種每間隔一周重復二次。最后一次給予DC后2周，小鼠用5乂106的百日咳博德特氏菌(鼻內給予)進行攻擊。攻擊后殺死動物，并測定血清中的百日咳博德特氏菌特異性IgG水平、肺中細菌負荷量和肺中百日咳博德特氏菌特異性抗體分泌細胞量。笫2-l5組小鼠顯示比第1組小鼠高的百曰咳博德特氏菌特異性IgG水平。笫2-"組小鼠顯示比第1組小鼠少的肺中百曰咳博德特氏菌負荷量。笫2-l5組小鼠顯示比第1組小鼠高的肺中百日咳博德特氏菌特異性抗體分泌細胞水平。實施例16免疫接種肝炎表面抗原用重組乙型肝炎表面抗原(HbsAg;CortexBiochemical,SanLeandro，CA，USA)并結合氬氧4匕鋁(Alum;SuperFosBiosector,Vedback,Denmark)和/或N3A、N6A或N6B多核苦酸，免疫6-8周齡的雌性BALB/C小鼠(CharlesRiver,St-Constant,Qc,Canada)。每只小鼠(每組5只小鼠)第0天和笫21天接受總量為50^L的單次脛骨月幾肉肌內注射，所用注射液含有鹽水(笫l組)、l貼HbsAg(第2組)、l貼HbsAg+10pgAlum(笫3組)、lpgHbsAg+10pgAlum+10ngN3A(笫4組)、lpgHbsAg+10figAlum+lOOpgN3A(笫5組)、lpgHbsAg+lOpgAlum+10pgN3B(第6組)、lpgHbsAg+lO^gAlum+100ngN3B(第7組)、lngHbsAg+10貼Alum+10ngN6A(第8組)、l貼HbsAg+10pgAlum+100ngN6A(笫9組)、1嗎HbsAg+10pgAlum+lO^gN6B(笫10組)和lngHbsAg+10ngAlum+100ngNB(第11組)。笫31天回收小鼠血漿。通過終點稀釋實驗法ELISA檢測和量化HbsAg特異性抗體。簡而言之，用一固相HbsAg蛋白(每孔O.lpg，4'C過夜)捕獲血漿中的抗HbsAg抗體(37。C1小時)，然后，按照生產商(Clonetypingsystem,SouthernBiotechnologyInc.，Birmingham,AL,USA)的使用{兌明書，用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(總IgG)、IgGl和IgG2a進行檢測。產生比對照組(笫1組)高兩倍的吸收值(OD450)的血漿最高稀釋度定義為終點效價。數(shù)據(jù)按每組5只小鼠的平均值士SD表示并示于表13中。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>如表13所示，N3A(笫4組lpgHbsAg+10貼Alum十10pgN3A和第5組lpgHbsAg+10ngAlum+100pgN3A)和N6A(第9組lpgHbsAg十10(igAlum+100嗎N6A)具有通過增加抗HbsAg的IgG、IgGl和IgG2a的效價，顯著刺激抗HbsAg免疫應答的能力。實施例17口服免疫接種肝炎表面抗原用重組乙型肝炎表面抗原結合N6A或N6B多核苷酸，免疫6-8周齡的雌性BALB/C小鼠(CharlesRiver，St-Constant，Qc,Canada)。每只小鼠(每組5只小鼠)第0天、笫7天和笫14天接受50pL總體積的口服溶液，所述溶液含有鹽水(笫1組)、lO)igHbsAg(笫2組)、IO嗎HbsAg十lpgN6A(第3組)、腳gHbsAg+腳gN6A(笫4組)、10pgHbsAg十100pgN6A(笫5組)、10pgHbsAg+lpgN6B(笫6組)、lOpgHbsAg+10pgN6B(第7組)和10pgHbsAg+100pgN6B(笫8組)。第21天回收小鼠血漿和洗腸液。洗腸液(用于IgA測定)通過輕輕地吸取0.2ml含有蛋白酶抑制劑(10pg胃蛋白酶抑制劑、lOpg亮抑蛋白酶肽、1(Hig抗蛋白酶和50ng苯甲脒)的PBS獲得。通過ELISA檢測和量化抗HbsAg特異性抗體。簡而言之，用一固相HbsAg蛋白(每孔l.Ong，4。C過夜)捕獲血漿或洗腸液中的抗HbsAg抗體(37。C1小時)，然后，按照生產商(Clonetypingsystem,SouthernBiotechnologyInc.)的使用i兌明書，用,束才艮過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgA(用于洗腸液)和山羊抗小鼠總IgG(用于血漿)進行檢測。數(shù)據(jù)4務爭組5只小鼠的OD(450nm)用平均值士SD表示并示于表14中。IgA的OD按1:2洗腸液稀釋度獲得，同時總IgG的OD按1:16血清稀釋度獲得。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>如表14所示，N6A(第3組lOpgHbsAg+lpgN6A;笫4組10|agHbsAg+10ngN6A和第5組10嗎HbsAg+100pgN6A)和N6B(第8組10ngHbsAg+100jigN6B)在口服給藥后，顯著刺激抗HbsAg的免疫應答。以上引用的所有專利、出版物和文摘均通過引用全文結合到本文中。人們應該理解上述僅涉及本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，在所附權利要求書的定義范圍內，可以對本發(fā)明進行各種修改或改變。權利要求1.一種包括含六個堿基的分離的3′-OH、5′-OH多核苷酸序列的組合物，其中a)至少50％的所述堿基是鳥嘌呤；b)所述5′堿基是鳥嘌呤；且c)所述組合物刺激給予所述組合物的動物或人的免疫應答，或者所述組合物刺激體外給予所述組合物的抗原呈遞細胞。2.權利要求1的組合物，其中所述多核苦酸序列包含5'GGNNGG3'，其中N為G、C、A或T。3.權利要求1的組合物，其中所述多核苷酸序列包含5'GGGNGG3'，其中N為G、C、A或T。4.權利要求1的組合物，其中所述多核苷酸序列是5'GTGTGT3'、5'GGTGGG3'、5'GGGTGG3'、5'GGGCGG3'、5'GGGAGG3'或5'GGGGGG3'。5.權利要求l的組合物，其中所述多核苷酸序列是5'GGGTGG3'或5'GGGAGG3'。6.權利要求1的組合物，其中所述多核苷酸序列包含磷酸二酯主鏈。7.權利要求1的組合物，其中所述多核苷酸序列包含硫代磷酸酯主鏈。8.權利要求1的組合物，其中所述組合物刺激所迷動物或人體內的一種或多種抗原呈遞細胞。9.權利要求1或8的組合物，其中所述抗原.呈遞細胞是樹突細胞。10.權利要求l的組合物，其中刺激的免疫應答包括選自以下的一種或多種樹突細胞應答細胞大小和/或顆粒性增加，IL-ip、IL-12或IFNy的產生增加，CD40、CD80、CD86或MHCII細胞表面表達增加，OX-2細胞表面表達減少以及內吞作用增加。11.權利要求l的組合物，其中所述免疫應答是全身免疫應答或粘膜免疫應答。12.權利要求l的組合物，所述組合物還包含抗原多肽。13.權利要求l的組合物，所述組合物還包含編碼抗原的多核苷酸。14.權利要求1的組合物，所述組合物還包含免疫調節(jié)劑。15.權利要求l的組合物，其中所述組合物刺激給予所述組合物的抗原呈遞細胞，并且其中將所述經刺激的抗原呈遞細胞給予動物或人。16.前述權利要求中任一項的組合物在制備用于刺激動物或人的免疫應答的藥物中的用途。17.權利要求1-15中任一項的組合物在體外刺激抗原呈遞細胞中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及3′-OH、5′-OH多核苷酸序列組合物以及激活個體的免疫應答、更優(yōu)選激活個體的r抗原呈遞細胞的方法。在一個實施方案中，所述抗原呈遞細胞是樹突細胞。本發(fā)明也包括體外激活樹突細胞的組合物和方法。然后可以將這些樹突細胞給予個體。優(yōu)選的3′-OH、5′-OH多核苷酸序列包含六個堿基，其中至少50％的所述堿基是鳥嘌呤并且所述5′堿基是鳥嘌呤。所述組合物可以包含磷酸二酯主鏈或硫代磷酸酯主鏈。文檔編號A61K45/06GK101160399SQ03814355公開日2008年4月9日申請日期2003年4月22日優(yōu)先權日2002年4月22日發(fā)明者M·C·菲利安,N·C·菲利普斯申請人:拜奧尼茨生命科學公司