專利名稱：：油類的治療特性的制作方法
背景技術(shù)：
：免疫系統(tǒng)在疾病預(yù)防和健康維護(hù)中扮演著重要角色。年老者，兩歲以下的兒童，和燒傷患者，以及正在接受化療或移植的患者中出現(xiàn)的免疫功能降低會(huì)增加患病的危險(xiǎn)。另一方面，免疫系統(tǒng)對傳染源或各種應(yīng)激原不適當(dāng)或過度應(yīng)答會(huì)導(dǎo)致組織損傷。因此，自身免疫和過敏性炎性疾病將繼續(xù)成為社會(huì)的一個(gè)主要負(fù)擔(dān)。這些疾病源于對免疫系統(tǒng)白細(xì)胞的不適當(dāng)刺激，其包括淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。例如，慢性免疫系統(tǒng)激活會(huì)增加患例如關(guān)節(jié)炎，囊性纖維化，腸炎疾病，Crohn氏病，移植物抗宿主病，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，過敏性接觸性皮炎，牛皮癬和糖尿病的危險(xiǎn)Crohn氏病。治療這些疾病的主要方法是通過抑制白細(xì)胞的各種應(yīng)答來抑制免疫反應(yīng)(1)。很多報(bào)告表明動(dòng)物和植物脂肪及油類因?yàn)樗鼈冋{(diào)節(jié)免疫功能的能力而具有治療特性；如魚油，亞麻子油，亞麻仁油，琉璃苣油，鴯鹋油和月見草油。澳大利亞土著使用的外敷鴯鹋油治療疼痛為該油的抗炎特性提供了軼事一樣的證據(jù)(2，3)。但是，鴯鹋油在體內(nèi)的抗炎效果缺乏明確的科學(xué)證據(jù)，迄今只在嚙齒類中進(jìn)行了有限的關(guān)于實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的研究(4，5)。令人欣慰的是在鴯鹋油工業(yè)中，不同鴯鹋油制備物的抗炎效果顯著不同。這種變異大大妨礙了該油的治療應(yīng)用，從而妨礙了它的商業(yè)價(jià)值。目前還沒有關(guān)于飼養(yǎng)或獲得鴯鹋，從鳥的何部分獲得油，以及制備或儲存鴯鹋油的方法(7)的標(biāo)準(zhǔn)方案。事實(shí)上，不同鴯鹋和其它油類的治療效果的數(shù)據(jù)矛盾，并而對此至少有兩個(gè)解釋。首先，大多數(shù)動(dòng)物脂肪和油類是化學(xué)組成變化很大的復(fù)雜混合物。單個(gè)成分對免疫功能幾乎肯定具有不同的作用，而且另外可以抑制其它成分的活性或甚至彼此協(xié)同作用。其次，免疫系統(tǒng)由許多不同細(xì)胞類型組成，每種都具有非常特異的功能，而且不是都以同樣的方式對脂肪和油類應(yīng)答。因此一種油的最優(yōu)活性取決于處理的條件，因?yàn)槊糠N細(xì)胞類型都有明確的功能。此外，目前對油類功效進(jìn)行的科學(xué)檢測和測驗(yàn)的結(jié)果也是相矛盾的。不能對具有抗炎特性的油進(jìn)行質(zhì)量控制并使其標(biāo)準(zhǔn)化成為對鴯鹋油用作治療藥劑的主要局限。這些因素的變異，部分地，會(huì)導(dǎo)致油功效的變異，并已經(jīng)阻礙了其用作人類藥劑的應(yīng)用，尤其是治療炎性疾病，不適或反應(yīng)。在治療應(yīng)用之前進(jìn)行免疫抑制活性的準(zhǔn)確評估將大大提高用特定油進(jìn)行治療的一致性和重復(fù)性，同時(shí)也提供了一種增強(qiáng)其治療活性的方法。不幸的是，以前的文獻(xiàn)缺乏評估一種油樣品可能治療活性的方法。本發(fā)明提供了一種測定油抑制人類和動(dòng)物免疫系統(tǒng)內(nèi)在能力的方法。所述方法也可以測試油的治療活性水平，因此也可以區(qū)分具有低和高治療活性的油樣品，并能根據(jù)它們的治療活性對油進(jìn)行分級。發(fā)明概述一方面，通過提供一種準(zhǔn)確測定化合物是否具有抗炎活性的新的科學(xué)方法，本發(fā)明克服了或減輕了至少一些上述的問題。尤其是，在治療或改善哺乳動(dòng)物中T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)疾病的癥狀中，新測定方法可以篩選用于預(yù)防和治療用途的化合物。尤其是，本發(fā)明是基于一種油或脂肪，一種油或脂肪的醇提取物，一種油或脂肪的生物活性成分，或含有油類或脂肪的制備物抑制人類或動(dòng)物T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞對能激活這些細(xì)胞類型的化學(xué)和/或生物試劑應(yīng)答能力的測定。測定可在小鼠(即體內(nèi))或在人分離自血液的T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞中進(jìn)行。所述方法能用于定量每單位質(zhì)量或體積的任何油或脂肪對總的T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和/或嗜中性粒細(xì)胞的抑制活性，以及一種油或脂肪抑制T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答的程度。使用一種代表慢性炎癥反應(yīng)(遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng))的模型，發(fā)現(xiàn)鴯鹋油能抑制T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集到炎癥位點(diǎn)。也發(fā)現(xiàn)鴯鹋油能顯著抑制由角叉菜聚糖反應(yīng)誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)鴯鹋的醇尤其是乙醇的可溶性級分能抑制嗜中性粒細(xì)胞附著到內(nèi)皮細(xì)胞上，尤其發(fā)現(xiàn)其能基本上抑制嗜中性粒細(xì)胞的趨化反應(yīng)。鴯鹋油及其乙醇可溶性成分對T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的趨化性和聚集的影響表明鴯鹋油及其乙醇可溶性成分對治療急性和慢性炎癥反應(yīng)是有用的。鴯鹋油溶于乙醇后，發(fā)現(xiàn)鴯鹋油的可溶性級分(主要含有甘油三酯)具有抗炎特性并與較早認(rèn)為鴯鹋油自身沒有抗炎特性的觀點(diǎn)相矛盾。發(fā)明人最后表明鴯鹋油的乙醇可溶性級分抑制了T淋巴細(xì)胞的活性，因?yàn)樗粌H抑制了淋巴細(xì)胞增殖也抑制了促炎和促DTH細(xì)胞因子諸如白介素-2，淋巴毒素和γ-干擾素的產(chǎn)生。T淋巴細(xì)胞的這些活性在炎癥中起著根本作用。乙醇可溶性級分的進(jìn)一步分級分離顯示某些成分導(dǎo)致了抗炎活性，而其它成分則抑制抗炎活性。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)鴯鹋油的抗炎特性的功效取決于從鴯鹋脂肪中煉油時(shí)的溫度。發(fā)現(xiàn)在溫度為60℃和80℃時(shí)煉的油具有活性，而且在100℃煉的油活性更好。但是，在40℃制備的制備物活性最小。本發(fā)明的第一方面提供了一種測試物質(zhì)(如鴯鹋油和其它油類)樣品的分析系統(tǒng)，從而以標(biāo)準(zhǔn)方式評估每個(gè)樣品的抗炎活性，并能根據(jù)抗炎活性(如果有的話)對不同樣品進(jìn)行分級。所述分析系統(tǒng)可以包括給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠)施用連續(xù)遞減量的試驗(yàn)物質(zhì)(如在乙醇中系列稀釋)?？梢酝ㄟ^注射(如注射到爪墊中)，或腹膜內(nèi)，體表或口服進(jìn)行給藥。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，分析系統(tǒng)包括評估一種這里稱作試驗(yàn)物質(zhì)的化合物或組合物的抗炎活性，所述過程包括(i)注射一種合適的抗原到哺乳動(dòng)物如小鼠的適當(dāng)身體部位(如爪墊)中；(ii)注射預(yù)定量的所述試驗(yàn)物質(zhì)到相同的身體部位，或者用預(yù)定量的所述物質(zhì)局部施用到所述哺乳動(dòng)物；(iii)測定由于所述抗原的注射減少或減輕腫脹的程度，例如在爪墊或在免疫系統(tǒng)器官(如淋巴結(jié))；和(iv)比較步驟(iii)中測定的所述試驗(yàn)物質(zhì)的活性與一個(gè)具有已知抗炎特性的標(biāo)準(zhǔn)化合物的活性，所述標(biāo)準(zhǔn)化合物的活性通過(i)到(iii)步驟的相同分析系統(tǒng)進(jìn)行測定，并用于產(chǎn)生一個(gè)分級系統(tǒng)來比較各個(gè)試驗(yàn)物質(zhì)的功效?？乖梢允?，例如角叉菜聚糖或綿羊紅細(xì)胞(SRBC)，并且試驗(yàn)物質(zhì)可以是被認(rèn)為具有抗炎活性的鴯鹋油或其它油。在步驟(i)中，抗原優(yōu)選腹膜內(nèi)注射或注射到小鼠的爪墊或耳朵內(nèi)。在步驟(ii)中，試驗(yàn)物質(zhì)優(yōu)選腹膜內(nèi)注射或施用到體表。在注射試驗(yàn)物質(zhì)(步驟(ii))之后，優(yōu)選進(jìn)行一段時(shí)間的步驟(iii)的測定，尤其是約24小時(shí)?；蛘?，用于測試一種物質(zhì)的體外分析系統(tǒng)以便以標(biāo)準(zhǔn)方式評估其抗炎活性，所述過程包括(i)檢測T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞，或由它們衍生的細(xì)胞系的體外制備物制備物的活性；(ii)添加所述物質(zhì)到所述T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞，或由它們衍生的所述細(xì)胞系的所述制備物中；(iii)在步驟(ii)添加所述物質(zhì)后，測定T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞，或由它們此衍生的所述細(xì)胞系的所述制備物的活性變化；和(iv)比較所述物質(zhì)的活性變化(步驟(iii)中測定的)與已知具有抗炎特性的標(biāo)準(zhǔn)化合物的活性變化，標(biāo)準(zhǔn)化合物的活性變化通過步驟(i)到(iii)的相同分析系統(tǒng)進(jìn)行測定并用于產(chǎn)生分級系統(tǒng)來比較各種試驗(yàn)物質(zhì)的功效。所述體外分析系統(tǒng)包括用連續(xù)遞減量的試驗(yàn)物質(zhì)如用乙醇系列稀釋處理T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或者嗜中性粒細(xì)胞，或由它們衍生的所述細(xì)胞系的制備物。該分析系統(tǒng)是一種評估被測試的油對由抗原引發(fā)的細(xì)胞(如T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響，從而評估其抗炎活性的方法。以下是可以根據(jù)該分析系統(tǒng)進(jìn)行體外檢測的典型例子(a)使用T淋巴細(xì)胞制備物，并測定淋巴細(xì)胞增殖；(b)使用T淋巴細(xì)胞制備物，并測定細(xì)胞因子諸如白細(xì)胞介素-2(IL-2)，腫瘤壞死因子(如TNFα和淋巴細(xì)胞毒素(TNFβ))和γ干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)量；(c)使用嗜中性粒細(xì)胞的制備物，并測定它們的趨化活性；和(d)使用嗜中性粒細(xì)胞的制備物，并測定它們對內(nèi)皮細(xì)胞的附著。在多種疾病中，T細(xì)胞主要通過產(chǎn)生細(xì)胞因子在組織損傷中扮演重要角色。T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子(如TNFα和IL-2)應(yīng)該能促進(jìn)由于異常免疫功能引起的組織損傷。使用治療藥劑，優(yōu)選無毒的藥劑抑制T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子在組織損傷尤其是那些T細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷中尤其有用?，F(xiàn)有技術(shù)中用于治療T細(xì)胞介導(dǎo)疾病的藥劑或者是有毒的或者具有相當(dāng)?shù)南到y(tǒng)效應(yīng)。本發(fā)明開發(fā)了一種使用(尤其是)由鴯鹋的脂肪組織產(chǎn)生的無毒物質(zhì)鴯鹋油治療或預(yù)防組織損傷的方法。發(fā)明人也開發(fā)了一種增強(qiáng)用于該目的的鴯鹋油的活性，從而保證產(chǎn)物的可靠性和一致性的方法，而且發(fā)現(xiàn)該活性不需要透膜劑(用于增強(qiáng)化學(xué)物質(zhì)透過皮膚運(yùn)動(dòng)的物質(zhì))。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)這樣生產(chǎn)的鴯鹋油的醇提物對治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病也是有效的。本發(fā)明同樣依賴于鴯鹋油，鴯鹋和其它油類的醇提物能抑制T細(xì)胞活性的發(fā)現(xiàn)，所述T細(xì)胞是在多種人類疾病中促進(jìn)組織損傷的細(xì)胞類型。本發(fā)明包括使用鴯鹋和其它油類，及其提取物通過預(yù)防或者減輕由T細(xì)胞引起的損傷來治療這些不同的疾病。使用鴯鹋油還有一個(gè)另外的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗材軠p輕其它重要的免疫細(xì)胞類型，嗜中性粒細(xì)胞引起的組織損傷。因此，本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種含有鴯鹋油，或者其生物活性提取物或成分的組合物，任選的連同載體賦形劑來治療或者改善哺乳動(dòng)物中T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或不適或者嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或不適的癥狀。這些疾病或不適的例子包括免疫復(fù)合疾病，腎臟疾病，腎炎，關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或膿毒性關(guān)節(jié)炎)，腎小球炎，血管炎，痛風(fēng)，蕁麻疹，血管性水腫，心血管疾病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，乳房疼痛/經(jīng)前綜合征，哮喘，神經(jīng)疾病，注意力缺陷障礙(ADD)，牛皮癬，視網(wǎng)膜疾病，痤瘡，膿毒癥(敗血病)，肉芽腫病，炎癥，再灌注損傷，囊性纖維化，成人呼吸窘迫綜合征，生熱，糖尿病，腸炎，Crohn氏病，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，骨關(guān)節(jié)炎，遺傳過敏性皮炎，過敏接觸性皮炎，移植物排斥(移植物抗宿主病)或植入。組合物可以是口服，注射或體表組合物的形式。生物活性提取物或成分包括至少以下的一種甘油三酯級分或甘油三酯級分成分，固醇級分或固醇級分成分，酚級分或酚級分成分，堿穩(wěn)定級分或堿穩(wěn)定級分成分，其有機(jī)溶劑提取物(如鴯鹋油的)或成分。在優(yōu)選形式中，有機(jī)溶劑為乙醇。本發(fā)明的第三方面提供了一種治療或者改善哺乳動(dòng)物中T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或不適或者嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或不適的癥狀的方法，所述方法包括施用有效劑量的含有鴯鹋油，或其生物活性提取物或成分(如上舉例說明)的組合物。該組合物可口服，腸胃外(如通過注射)或體表給藥。所述組合物的所述有效劑量給藥優(yōu)選在T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或不適，嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或不適或炎癥反應(yīng)發(fā)生之前進(jìn)行。在本發(fā)明的第四方面，使用醇(如乙醇)從鴯鹋油或其它生物活性油或脂肪中提取具有抗炎活性的化合物?；蛘?，能執(zhí)行同樣從油中溶解和提取有效化合物功能的有機(jī)溶劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。雖然對鴯鹋油進(jìn)行了具體舉例說明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解本發(fā)明的檢測，方法和組合物也能用于任何物質(zhì)或油，鴯鹋油只是其中的一個(gè)例子。其它合適的油類有，例如其它動(dòng)物油類；植物油，如茶樹油，亞麻子油，亞麻仁油，琉璃苣油或月見草油；魚油；以及藻，微生物和真菌油類。本發(fā)明的第五方面提供了一種制備或提煉鴯鹋油用于哺乳動(dòng)物治療用途的方法，包括加熱鴯鹋油，或從中可分離鴯鹋油的組織到至少40℃的步驟。在本發(fā)明的整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“生物活性”指引發(fā)抗炎應(yīng)答的能力。發(fā)明詳述還沒有鑒定出鴯鹋油中負(fù)責(zé)所報(bào)道的抗炎活性的活性成分。鴯鹋油主要由含有不同含量脂肪酸的甘油三酯組成(表1)。關(guān)于鴯鹋油組成的有限資料表明澄清油的油抗氧化劑(類胡蘿卜素，黃酮類化合物)，皮膚滲透劑增強(qiáng)因子和α-亞油酸(18:3ω3)(從0-20％)(4)的含量顯著不同。油中不富含ω3脂肪酸的發(fā)現(xiàn)使得油的抗炎作用與廣泛認(rèn)為具有抗炎作用的ω3脂肪酸不可能相關(guān)。一個(gè)以前未公開結(jié)果的研究報(bào)道作為抗炎藥的鴯鹋油的功效與油中ω3脂肪酸的含量(0.2-19.7％)不相關(guān)(4)。表1.鴯鹋油的脂肪酸組成成分含量油酸(18:1mω9)47-58％軟脂酸(16:0)19-24％硬脂酸(18:0)8-11％亞油酸(18:2ω6)5.5-17％十六碳烯酸(16:1ω7)3-6％薄層層析(TLC)，氣相色譜(GC)以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的組合分析證實(shí)鴯鹋油制品中廣泛脂肪酸，固醇和酚類的存在。從薄層層析可證明甘油三酯是主要成分并且應(yīng)該被認(rèn)為是油的抗炎成分之一，因?yàn)橐郧暗难芯恳呀?jīng)表明脂肪酸能抑制發(fā)炎。關(guān)于它的酚含量，發(fā)現(xiàn)Makin鴯鹋油中含有25μmol/l的酚，其比橄欖油酚類水平低約20倍。因此，它不可能是鴯鹋油的活性抗炎成分，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道橄欖油不具備抗炎特性(7)(我們未發(fā)表的觀察報(bào)告也表明)。固醇分析揭示，鴯鹋油與金槍魚油類似，但與橄欖油基本不同，膽固醇是鴯鹋油固醇的主要成分。還沒有評估出這些物質(zhì)在鴯鹋油的抗炎特性中所起的作用。通過使用三個(gè)不同組的GC-MS，MS和GC獨(dú)立地分析了油的脂肪酸組成。從這些研究發(fā)現(xiàn)主要的脂肪酸為油酸(約50％)，軟脂酸(約20％)，硬脂酸(約10％)，亞油酸(約10％)和棕櫚油酸(約5％)。這些可認(rèn)為是澳大利亞鴯鹋油類的主要脂肪酸成分。從不同地理位置的鴯鹋而且可能用不同方法制備的油類的組合物根據(jù)脂肪酸含量分析是難以區(qū)分的。使用標(biāo)準(zhǔn)鴯鹋油(Makin)進(jìn)行的深入研究證實(shí)當(dāng)施用給小鼠，油能自始至終地抑制慢性和急性炎癥。對于慢性炎癥而言，使用了由SRBC抗原誘導(dǎo)和引發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。通過監(jiān)控由抗原攻擊所引起的后足墊腫脹來測定反應(yīng)。Makin鴯鹋油顯著地抑制了這種炎癥反應(yīng)的引發(fā)。由于參與的細(xì)胞主要為T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，對這些細(xì)胞類型聚集的直接或間接影響肯定是由施用鴯鹋油引起的。鴯鹋油的作用不局限于慢性炎癥，因?yàn)樗鼉H僅在抑制角叉菜聚糖誘導(dǎo)的炎癥中是有效的，所述角叉菜聚糖誘導(dǎo)的炎癥被當(dāng)作測試急性炎癥的模型并主要參與嗜中性粒細(xì)胞在注射位點(diǎn)的積累。使用DTH慢性炎癥模型，檢驗(yàn)不同鴯鹋油制品對這種應(yīng)答的作用用于解釋不同制品功效差異的原因。在檢驗(yàn)的鴯鹋油樣品中，Makin鴯鹋油是最有效的。Toowoomba和LittleMeadow顯示了一些抗炎活性，鴯鹋油A2-100G具有較小的抗炎活性，而鴯鹋油G53沒有抗炎活性。這不能用鴯鹋油樣品的脂肪酸組合物進(jìn)行解釋，因?yàn)檫@些基本上是相似的(第29到30頁的表5和6)。鴯鹋油對炎癥的抑制作用特性的檢驗(yàn)表明在接近抗原攻擊時(shí)或抗原攻擊之后施用油是最有效的。這可以通過在激發(fā)1h之前而不是5h之前施用油時(shí)鴯鹋油的功效最強(qiáng)的事實(shí)來表明。使用角叉菜聚糖誘導(dǎo)的炎癥模型顯示了類似的作用。還發(fā)現(xiàn)當(dāng)延至炎癥反應(yīng)發(fā)生3h之后進(jìn)行鴯鹋油處理時(shí)，鴯鹋油的功效顯著比在激發(fā)之前1h進(jìn)行治療更有效。第一，這表明油對免疫系統(tǒng)的成分作用很快；第二，這顯示甚至在個(gè)體開始經(jīng)歷炎癥之后使用適當(dāng)制備的鴯鹋油也能控制炎癥。發(fā)現(xiàn)煉油溫度能控制生產(chǎn)的油類的功效和/或類型，因?yàn)樵?0℃提取的鴯鹋油的活性低于在60℃，80℃或100℃提取的油的活性。通過GC分析沒有發(fā)現(xiàn)在后三個(gè)不同溫度生產(chǎn)的油類之間脂肪酸組成不同的證據(jù)，因?yàn)檫@些脂肪酸含量，包括亞油酸的水平很相似(18:2ω6)(見如第40頁的表11)。為了確定鴯鹋油中負(fù)責(zé)抗炎作用的成分，把鴯鹋油直接添加到培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中，以便發(fā)現(xiàn)這些白細(xì)胞的活性是否被改變。由于該油的溶解問題研究沒有成功。為了克服所述問題，把油溶于乙醇中，并接著進(jìn)行分級分離，鑒定了具有抗炎活性的成分(見圖28)?？扇苄约壏志哂酗@著的抗T淋巴細(xì)胞活性。因?yàn)門淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)DTH反應(yīng)和慢性炎癥的主要細(xì)胞，這些結(jié)果顯示鴯鹋油能抑制DTH活性。通過GC對乙醇級分進(jìn)行化學(xué)分析沒有顯示特定脂肪酸的富集，但是18:2ω6的比例輕微增加。因此，乙醇可溶性級分可能是用于治療炎癥的活性成分的一個(gè)來源。有趣地是，在40℃，60℃和80℃提煉的鴯鹋油制品對抑制淋巴細(xì)胞增殖的抗T細(xì)胞活性與它們抑制DTH活性的體內(nèi)活性相關(guān)。發(fā)明人表明兩個(gè)例子中，60℃＜T≤100℃的提煉溫度比在40℃提煉產(chǎn)生更有功效的油類(圖15cf，圖17)。通過檢驗(yàn)乙醇可溶性鴯鹋油級分對由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子產(chǎn)物IL-2，淋巴毒素，TNFβ和IFN-γ的作用的進(jìn)一步的證據(jù)證實(shí)對T細(xì)胞應(yīng)答的影響。用可溶鴯鹋油級分對T淋巴細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理能抑制這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生。該作用可延伸到抑制經(jīng)LPS刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF。但是很明顯T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子比單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF的過程對鴯鹋油更敏感，這表明乙醇可溶性鴯鹋油級分對T淋巴細(xì)胞應(yīng)答具有優(yōu)選的影響，顯示了T細(xì)胞是鴯鹋油治療的主要靶。發(fā)現(xiàn)Makin鴯鹋油的可溶性級分能抑制嗜中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的趨化性遷移和附著。這兩個(gè)特性都是嗜中性粒細(xì)胞滲透到炎癥位點(diǎn)的關(guān)鍵功能所必需的。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞用可溶性級分進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，也影響嗜中性粒細(xì)胞的附著。可溶性級分對嗜中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的作用的組合將抑制體內(nèi)白細(xì)胞附著到內(nèi)皮細(xì)胞。雖然對嗜中性粒細(xì)胞的影響與DTH不相關(guān)，但是與角叉菜聚糖誘導(dǎo)的或急性炎癥高度相關(guān)，其中嗜中性粒細(xì)胞被認(rèn)為是起關(guān)鍵作用(9)。發(fā)現(xiàn)鴯鹋油乙醇可溶性級分中富含游離脂肪酸(見第45頁表13)。因此，對T淋巴細(xì)胞的作用之一可能包括脂肪酸如18:2ω6。發(fā)明人的研究確立了血清脂肪酸結(jié)合蛋白如白蛋白通過與它們結(jié)合降低游離脂肪酸的活性。進(jìn)行了進(jìn)一步的研究以便確定血清是否能消除40℃提煉的Makin鴯鹋油乙醇提取物的作用。發(fā)現(xiàn)添加血清能阻斷這個(gè)油級分的大部分抗T細(xì)胞活性，這可以解釋在鴯鹋油類治療炎癥的功效中存在的矛盾和變異。在乙醇可溶性級分的TLC分離中(見圖27)，可看見幾條清晰的條帶并且至少一條對應(yīng)于負(fù)責(zé)主要抗T細(xì)胞活性的18:2ω6的遷移。但是，其它級分也有活性，這顯示所述活性可能是由幾種鴯鹋油成分負(fù)責(zé)。下面實(shí)驗(yàn)部分的數(shù)據(jù)揭示了能用于標(biāo)準(zhǔn)化鴯鹋油尤其是其抗炎活性的方法。結(jié)果顯示，小鼠可用作試驗(yàn)慢性(DTH)和急性(角叉菜聚糖)炎癥疾病系統(tǒng)的模型。這些代表了可以很容易對炎癥進(jìn)行定量的簡單系統(tǒng)。為了減少變異，使用了ip途徑而非體表施用鴯鹋油。已經(jīng)確定了可以通過建立在失去抗炎活性之前該制品能被稀釋的程度來測定鴯鹋油制品的功效。在該標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)中，一種已確定的活性鴯鹋油可被用作標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)可以測試其它的鴯鹋油類。然后可以建立接受或否決鴯鹋油制備物的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)可以是基于最佳的提煉條件，以及油類的儲存，鴯鹋的飼養(yǎng)，鴯鹋的繁殖等(表2)。發(fā)現(xiàn)在100℃制備的油具有最高的抗炎活性，而在40℃制備的油則具有最低的活性。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在炎癥發(fā)生之后施用鴯鹋油的抗炎活性最強(qiáng)。發(fā)明人還方發(fā)現(xiàn)，在發(fā)炎之前1h進(jìn)行鴯鹋油給藥，比發(fā)炎之前3h施用油具有更好的抗炎功效。表2鴯鹋油的制備(變異的可能原因)收集脂肪動(dòng)物年齡飲食遺傳學(xué)性別動(dòng)物死亡后的時(shí)間收集的脂肪的儲存條件脂酶/磷脂酶/脂肪氧化酶活性非酶氧化提煉提煉的溫度使用的容器類型水量表面積提煉時(shí)間長度過濾過濾溫度過濾器類型濾液中的水金屬含量蛋白含量可變的結(jié)晶處理鴯鹋脂肪的過程中形成的可能的產(chǎn)物脂肪酸的氧化產(chǎn)物游離脂肪酸溶血磷脂結(jié)合的亞油酸反式異構(gòu)體甘油二酯單甘油酯膽固醇的氧化產(chǎn)物優(yōu)選通過進(jìn)行體外分析的延伸測試來支持得自體內(nèi)慢性和急性炎癥反應(yīng)的數(shù)據(jù)。這在油類商業(yè)應(yīng)用前尤為重要。因此，可利用其對T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞對慢性炎癥，以及嗜中性粒細(xì)胞對急性炎癥的功能的影響。圖2中舉例說明了一模型。對DTH和角叉菜聚糖炎癥應(yīng)答，都可以建立油量對炎癥抑制程度的關(guān)系。從圖1能推導(dǎo)出要達(dá)到抑制25％(ID25)炎癥應(yīng)答所需的鴯鹋油的濃度。從該值可以確定油的抗炎能力。可以計(jì)算急性和慢性炎癥的值，何處它們不同?？梢酝ㄟ^使用油的乙醇可溶性級分，檢驗(yàn)對T淋巴細(xì)胞功能和嗜中性粒細(xì)胞功能的作用的數(shù)據(jù)證實(shí)上述抗炎功效值，。兩個(gè)有用的參數(shù)分別為針對慢性和急性炎癥的T淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖和嗜中性粒細(xì)胞的趨化性。根據(jù)這些參數(shù)可以如上述所討論的計(jì)算相似的ID25和最大的抑制值。基于鴯鹋油對T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞應(yīng)答以及嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答的影響，其對表3中概述的疾病/不適的治療潛能是顯而易見的。其中列出了這些炎癥疾病的治療靶點(diǎn)，尤其是那些關(guān)鍵的和被鴯鹋油當(dāng)作靶點(diǎn)的靶。鴯鹋油的靶點(diǎn)進(jìn)一步在圖2中進(jìn)行說明，其顯示了導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)損傷的事件。T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞被作為靶點(diǎn)并被阻止轉(zhuǎn)移到組織中和/或被阻止激活而產(chǎn)生組織破壞介導(dǎo)的細(xì)胞因子。表3鴯鹋油的治療靶點(diǎn)和相應(yīng)的疾病總之，這里的數(shù)據(jù)顯示了鴯鹋油組成的復(fù)雜性，其中對脂肪酸含量進(jìn)行了詳細(xì)研究。在地理位置，飼養(yǎng)，提煉和儲存方面顯然不同的制品中，各種脂肪酸種類的水平?jīng)]有大的差異。但是，在抑制炎癥的能力上存在顯著差異。使用一種新制備的標(biāo)準(zhǔn)化的鴯鹋油制品(Makin)，在慢性和急性體內(nèi)和體外炎癥模型中測試了鴯鹋油的抗炎特性。一些證據(jù)指出至少部分活性是由于一種不飽和脂肪酸18:2ω6所導(dǎo)致的，但是該研究證實(shí)了難以確定抗炎特性是由什么所引起的。不管怎么樣，開發(fā)的炎癥模型可用于使鴯鹋油的抗炎活性標(biāo)準(zhǔn)化，其看上去是使用控制質(zhì)量的澳大利亞油來開發(fā)一有前途工業(yè)的先決條件。材料和方法鴯鹋油該研究中具體使用的鴯鹋油列于表4。鴯鹋油類等分冷凍保存于-20℃。表4.本研究中使用的鴯鹋油類不同制品的描述1.乙醇可溶性/不溶性級分的制備為了獲得乙醇可溶性級分，將2ml的鴯鹋油與1ml乙醇混合，于2,500g/3min/4℃離心，并收集上層相。對下層相重復(fù)三次提取程序。集合這些乙醇可溶性級分，離心并于N2氣流中干燥。最后，2ml體積的原液用于實(shí)驗(yàn)，剩下的乙醇不溶性級分(EIF)留作甘油三酯的豐富來源。2.脂肪酸分析2.1薄層層析溶于20-40μl氯仿-甲醇(4:1)中的1mg鴯鹋油用作離TLC平板邊緣1cm的條帶。亞油酸(18:2)用作標(biāo)準(zhǔn)為離試驗(yàn)物質(zhì)的一邊0.5cm的條帶。在己烷-醚-乙酸(80:20:1)中展開層析圖，并在通風(fēng)廚中進(jìn)行干燥。通過曝露于I2蒸氣或用1gNH2SO4輕輕噴灑并于150℃灼燒觀看區(qū)帶。更大量的Makin鴯鹋油溶于氯仿-甲醇(4:1)中，并將等分溶液(相當(dāng)于5mg油)用作硅薄層平板的一個(gè)6-7cm條帶。溶于同樣溶劑混合物的等量橄欖油上樣到TLC板上成為6-7cm條帶，并作為對照。一種未酯化脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)上樣到板的邊緣。在己烷-醚-乙酸(80:20:1)展開層析圖并且干燥后，將平板曝露于碘蒸氣。2.2NMR分析這由FlinderUniversity的N.Trout博士進(jìn)行的操作。添加100-120mg的解凍鴯鹋油(充分搖晃)到一個(gè)干燥燒瓶(5ml)中，所述鴯鹋油溶于干甲苯中(1-1.2ml)。在N2條件下向其中添加新制備的甲氧基鈉(75mg鈉的甲醇溶液(2ml))。得到的混合物在冷卻并添加乙酸(100μl)和水(2.5ml)之前回流90分鐘。在板層經(jīng)Na2SO4干燥之前，白色混合物用己烷提取2次，過濾并于真空中除去揮發(fā)物。用VarianGeminiFT300MHz多核光譜儀記錄13C和1HNMR測定，分別在75.46MHz和300.75MHz操作。所有樣品都溶于氘化氯仿中，13C的中心峰(77.0ppm)和1HNMR的CHCl3(7.26ppm)用作參照。接著氘化CDCl3(0.8ml)后添加75-100mg的鴯鹋油到NMR管中。得到的溶液通過NMR進(jìn)行分析。在脈沖一個(gè)小時(shí)后，打印圖譜以顯示所有指示甘油三酯的信號。2.3GC分析兒童衛(wèi)生研究中心(Dr.R.Gibson/Mr.M.Neumann)l滴鴯鹋油5ml1％硫酸(36N)的甲醇溶液中于70℃甲基化2小時(shí)。冷卻后，得到的甲酯提取到2mln-庚烷中，并轉(zhuǎn)移到含有無水硫酸鈉的管形瓶中作為脫水劑。分離鴯鹋油脂肪酸甲酯，并使用Hewlett-Packard6890氣相色譜儀進(jìn)行定量，所述氣相色譜儀裝配有涂有BPX-70(25μm的薄膜厚度-SGEPtyLtd，Victoria，Australia)的50cm毛細(xì)管柱(0.33mmID)。注射器溫度設(shè)在250℃，火焰電離探測器設(shè)在300℃。開始烤箱溫度為140℃，并編程以每分鐘5℃上升至220℃。氦用作速度為每秒35cm的載體氣體。基于來自NuchekPrepInc(Elysian，MN)的可靠脂類標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間對脂肪酸甲酯進(jìn)行定量。RMIT(Prof.A.Sinclair/Ms.K.Murphy)分析雙份樣品。取一份全脂類，并使用氮蒸氣進(jìn)行干燥。利用7.9％KOH(UNIVAR，AJAXCHEMICALS，Australia)的甲醇(Merck，Germany)溶液把樣品水解成游離脂肪酸。冷卻樣品，并利用溶于甲醇復(fù)合物的20％硼苯丁酰脲(BF3)轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯(FAME)。利用裝配有火焰電離探測器(FID)的ShimadzuGC17AGC進(jìn)行氣相色譜分析。利用BPX-7050m交聯(lián)的帶有0.32mmID和0.25μm厚薄膜的70％氰丙基硅亞苯基-硅氧烷毛細(xì)管柱進(jìn)行FAME分析。在125℃注射樣品并保持1.0分鐘?？鞠錅囟仍O(shè)定為以5℃/分鐘升高至170℃并保持4分鐘，然后以0.5℃/分鐘升至175℃，再以4℃/分鐘n升至終溫度220℃并保持3分鐘。注射器和探測器保持在260℃，并使用氦作為載氣。峰面積和濃度使用Shimadzu軟件(Japan)在IBM兼容計(jì)算機(jī)上進(jìn)行定量。2.4GC-MS在帶有J&WDB5％苯基甲基聚硅氧烷柱(30m×0.25mmid)的VarianStaturn4D儀器上進(jìn)行GC-MS分析。2.5MS婦女和兒童醫(yī)院(Dr.D.Johnson)用苯/甲醇/乙酰氯于100℃處理1mg鴯鹋油90min。冷卻后，用己烷提取中和溶液，樣品提取物注射到PerkinElmerTurbomass質(zhì)譜儀中。3.固醇分析這些實(shí)驗(yàn)由RoyalMelbourneInstituteofTechnology的A.Sinclair教授實(shí)驗(yàn)室的MsKMurphy進(jìn)行。通過用溶于甲醇/水(80∶20，v/v)的5％KOH堿皂化，從兩個(gè)鴯鹋油樣品(MakinandG53)中獲得了富含固醇的級分，接著用2ml的己烷∶氯仿(4∶1，v/v)提取3次。然后用BSTFA(N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺于70℃在15分鐘內(nèi)把固醇轉(zhuǎn)化成它們相應(yīng)的三甲基硅烷基醚(OTMSi)。使用裝配FID和帶有0.32mmID和0.25μm厚膜的BPX-550m(5％苯基-聚硅亞苯基-硅氧烷)的ShimazuGC17AGC進(jìn)行氣相色譜分析。于200℃注射樣品并保持1分鐘。烤箱溫度設(shè)定為以20℃/min升高至340℃并保持30分鐘。注射器和探測器保持在280℃并使用氦作為載氣。峰面積和濃度使用Shimadzu軟件(Japan)在IBM兼容計(jì)算機(jī)上進(jìn)行定量。4.酚的分析在UniversityofSouthAustraliaPHayball博士的實(shí)驗(yàn)室，在Makin鴯鹋油樣品中，兩種其它鴯鹋油類中，和一些其它脂肪和油類中進(jìn)行酚的分析。使用Folin-Ciocalteau的改良方法測定總酚含量并且結(jié)果表達(dá)為沒食子酸當(dāng)量。5.炎癥模型5.1遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)如前所述誘導(dǎo)12周齡的雌性BALB/c小鼠(AnimalResourceCentre，Perth)的DTH應(yīng)答(8)。簡而言之，用綿羊紅細(xì)胞(100μl的10％血球比容)(SRBC；SigmaChemicalCo.)注射小鼠。5天后，用SRBC(25μlof40％血球比容)皮內(nèi)注射后右足墊或用稀釋液(25μl)注射到左邊足墊攻擊動(dòng)物。攻擊24h后，測定DTH應(yīng)答并通過比較稀釋液和用SRBC注射的足墊的厚度進(jìn)行計(jì)算。足墊厚度用刻度測徑器測定。5.2角叉菜聚糖誘導(dǎo)的腳爪反應(yīng)如前所述(9，10)誘導(dǎo)角叉菜聚糖誘導(dǎo)的腳爪反應(yīng)。把角叉菜聚糖(1ml/kg的1％溶液)(TypeIVSigmaChemicalCo.)接種到小鼠的右后腳爪。通過以指定的次數(shù)測定后腳爪的厚度來檢測反應(yīng)。6.白細(xì)胞分離通過快速單步分離方法(11)分離單核白細(xì)胞(MNL)和嗜中性粒細(xì)胞。簡而言之，全血在密度為1.114的Hypaque-Ficoll培養(yǎng)基上分層，然后以400g/30min離心。離心后，白細(xì)胞解析成兩個(gè)不同條帶，上面的條帶含有MNL，下面的條帶含有嗜中性粒細(xì)胞。7.淋巴細(xì)胞增生通過半自動(dòng)顯微技術(shù)測定淋巴細(xì)胞的增生(12)。把人單核細(xì)胞接種到微滴定板(50μl)的u形底的孔中，并用50μl的乙醇鴯鹋油級分進(jìn)行處理。培養(yǎng)30min后，加入2μg/μlPHA以刺激T淋巴細(xì)胞。細(xì)胞在一個(gè)5％CO2-空氣的氣氛以及高濕度的條件下于37℃培養(yǎng)72h。在收集前6h，培養(yǎng)物用1μCi的3H-TdR進(jìn)行脈沖。收集細(xì)胞并用液體閃爍計(jì)數(shù)器測定結(jié)合的輻射量。8.細(xì)胞因子的產(chǎn)生如淋巴細(xì)胞增殖中所描述的用PHA刺激的MNL測定T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2，IFN-γ和淋巴細(xì)胞毒素(TNFβ)。收集細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，并使用如前所述的細(xì)胞因子特異性單克隆抗體通過ELISA測定細(xì)胞因子的量(13)。測定用LPS刺激的MNL中單細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子TNFα。簡而言之，100μl體積中的2×105MNL被添加到微滴定板的平底孔中，然后通過添加100μl的200ng/ml細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激細(xì)胞。在37℃培養(yǎng)48h后，收集上清液，并使用ELISA和前述的TNFα特異性單克隆抗體進(jìn)行TNFα測定(13)。9.嗜中性粒細(xì)胞的附著9.1附著到血漿涂敷的表面在用TNFα刺激后，通過用鴯鹋油提取物處理的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合到涂有血漿的平板的能力來檢測附著。沖洗涂敷有自體血漿的平板(1:10)，并干燥得到的50μl嗜中性粒細(xì)胞(5×106/ml)，所述嗜中性粒細(xì)胞在37℃/5％CO2中處理了30min。嗜中性粒細(xì)胞用TNFα(103單位/ml)在37℃/5％CO2中刺激30min，用HBSS沖洗，然后用100μl玫瑰紅(0.25％w/vPBS)于室溫下染色。通過用HBSS沖洗除去未附著的細(xì)胞，然后加入200μl的乙醇∶PBS(1∶1)并在平板讀數(shù)計(jì)上于570nm處讀數(shù)之前在室溫下展開30min。9.2嗜中性粒細(xì)胞對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的附著(HUVEC)如前所述從儲存在4℃的分娩后臍帶分離HUVEC(15)，除了用0.2％(w/v)凝膠(Cytosystems)涂敷所有組織培養(yǎng)物培養(yǎng)瓶和平板，用0.07％(w/v)膠原蛋白酶(來自溶組織梭狀芽孢桿菌，II型，Worthington)消化臍靜脈內(nèi)部，并且培養(yǎng)基含有由40mmol/lTES，15mmol/lD-葡萄糖，80U/ml青霉素(Flow)，80μg/ml鏈霉素(Flow)和3.2mmol/lL-谷氨酰胺組成的RPMI1640(ICN-FLOW)，在加入20％(V/V)混合的熱滅活(56℃，30分鐘)人AB組血清之前，培養(yǎng)基達(dá)到260到300mOsm/l。通過它們的特異性抑制接觸的圓石形態(tài)以及使用過氧化物酶結(jié)合的抗兔IgG對人vonWillebrand因子(Dako)和3，3’-二氨基聯(lián)苯對因子VIII相關(guān)抗原的陽性染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。在曝露于胰島素(0.05％[v/v]，F(xiàn)low)-EDTA(0.02％[w/v])2到5分鐘后，將平鋪培養(yǎng)物進(jìn)行繼代培養(yǎng)。為了實(shí)驗(yàn)用途，將第二代細(xì)胞以每0.2ml培養(yǎng)基每孔2×106細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板上鋪板。用鴯鹋油乙醇可溶性級分處理HUVEC，然后用TNFα處理，在37℃缺乏或存在溶于E-SFM(終體積100μl)的5×105嗜中性粒細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)30分鐘之前，用RPMI1640沖洗單層1次。輕輕抽吸除去未吸附的細(xì)胞，并在用玫瑰紅染色前，用含有0.1％(w/v)μM卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)的HBSS沖洗這些孔2次，以刺激細(xì)胞的BSA。在用50％乙醇釋放染料后，用ELISA平板讀數(shù)計(jì)測定每個(gè)孔的吸收值(570nm)。測試和空白孔重復(fù)3次。從每個(gè)測試值(加有白細(xì)胞)減去平均空白值(沒有白細(xì)胞)后計(jì)算結(jié)果(15)。10.嗜中性粒細(xì)胞趨化性通過前述的瓊脂糖方法中的遷移來測定趨化性(16)。6毫升1％融化的瓊脂糖的含有5％胎牛血清的199培養(yǎng)基倒入到培養(yǎng)皿中。在瓊脂糖凝固后，在瓊脂糖層中穿多組3洞/孔。分別添加5μl1×10-7MfMLP，5μl嗜中性粒細(xì)胞(2.5×105)和5μl199培養(yǎng)基到內(nèi)、中間和外孔中，帶有這些3孔組的平板用于測定在趨化性梯度中白細(xì)胞的遷移。2個(gè)孔組用于測定隨機(jī)遷移，一個(gè)孔中加入細(xì)胞，另一個(gè)孔中加入培養(yǎng)基。平板于37℃培育，90min后在相差顯微鏡下直接測定細(xì)胞遷移距離。我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的分析中，在存在和缺乏fMLP時(shí)嗜中性粒細(xì)胞的大致遷移距離分別為2.2mm和0.7mm。11.結(jié)果11.1鴯鹋油的化學(xué)組成在很多不同的中心進(jìn)行鴯鹋油分析，以便更好地評估油的不同組成。在Adelaide的婦女和兒童醫(yī)院，F(xiàn)lindersUniversity以及Victoria的RoyalMelbourneInstituteofTechnology(RMIT)，進(jìn)行了鴯鹋油的脂肪酸分析。在UniversityofSouthAustralia進(jìn)行了油的酚含量分析，并在RMIT進(jìn)行了固醇分析。給出了所有結(jié)果，在一些例子中，列出了同樣的油在不同的中心之間進(jìn)行分析的比較。11.2鴯鹋油的脂肪酸組成通過鴯鹋油薄層色譜分析的試驗(yàn)，表明鴯鹋油的主要成分為甘油三酯。但是檢測到了較少量(約1-2％)的至少7種其它次要成分(圖3)。其中的三種暫定為非酯化脂肪酸，甘油二酯和固醇。其它成分的鑒定沒有公開。其中的一些與橄欖油中的化合物有相似的色譜遷移。這些實(shí)驗(yàn)表明鴯鹋油是一種比以前所認(rèn)為的更為復(fù)雜的混合物。由于橄欖油中許多的次要成分被認(rèn)為導(dǎo)致了它的特性，尤其是它的保健方面的益處，鴯鹋油中的次要成分可能也有類似的作用。除了橄欖油中接近溶劑并暫定為碳?xì)浠衔锝酋徬┑?個(gè)條帶外，鴯鹋油的層析圖譜與橄欖油的沒有顯示大的差別，盡管某些成分對每種油來說可能是獨(dú)特的。在FlindersUniversity由DrNeilTrout(有機(jī)化學(xué)家)通過GC-MS分析的9種鴯鹋油的脂肪酸組成如表5所示。主要的脂肪酸是油酸(18:1ω9)。在9種油類中其占脂肪酸的49％-58％。下一個(gè)最突出的脂肪酸是軟脂酸(16:0)，其范圍為19-22％。其它突出的脂肪酸為硬脂酸(18:0)，范圍為9-11％，亞油酸(18:2ω6)范圍為5.5-17％，以及透明質(zhì)酸(16:1ω7)范圍為3-6％。典型的GC-MS痕量脂肪酸分析見圖4。表5鴯鹋油9種制備物的GC-MS分析。GC-MS分析在一個(gè)具有J&WDB5/苯甲基聚硅氧烷柱(30m×0.25mm)的VarianSaturn4D裝置中進(jìn)行。在FlindersUniversity(表6)的BobGibson博士的試驗(yàn)時(shí)也進(jìn)行了這些油類的分析(表6)。9個(gè)鴯鹋油樣品通過該方法進(jìn)行分析。GC痕量檢測顯示，脂肪酸組成比想象的要復(fù)雜得多，并確定了多達(dá)24種的不同脂肪酸。這些組分中的許多僅以痕量存在(＜0.1％)。鴯鹋油主要含有直鏈偶數(shù)碳鏈脂肪酸，主要飽和脂肪酸為軟脂酸(16:0)和硬脂酸(18:0)，只有少量的較短(14:0)和較長(20:0和22:0)鏈的飽和脂肪酸(表6)。表6主要脂肪酸的范圍為18:1ω9(47-53％)，16:0(20-24％)，18:0(8-11％)，18:2ω6(8-12％)和16:1ω7(3-5％)。而最大的變異見18:2ω6和18:0。主要單烯酸為油酸(18:1ω9)。檢測到了痕量的較短(16:1ω9)和較長鏈(20:1ω9，22:1ω9)單烯酸。ω7系列單烯脂肪酸也存在，主要的一種是16:1ω7，其以顯著量存在(約3％)。只檢測到了痕量的奇數(shù)碳鏈脂肪酸。主要的聚不飽和脂肪酸為亞油酸(18:2ω6)。存在痕量的其它ω6系列聚不飽和脂肪酸，并且包括γ亞油酸(18:3ω6)，花生四烯酸(20:4ω6)以及二十二碳四烯酸(22:4ω6)。ω3聚不飽和脂肪酸為次要成分，主要的一種是α亞油酸(18:3ω3)，僅僅為痕量的是16，20，22碳化合物。也檢測到了共軛的亞油酸(9，11異構(gòu)體)，但是僅僅很少的量(＜0.1％)存在。也在RMIT的AnderwSinclair教授的實(shí)驗(yàn)室由K.Murphy小姐進(jìn)行了脂肪酸分析。在鴯鹋油類中大約鑒定了21種不同的脂肪酸(表7)。主要脂肪酸類別為單不飽和脂肪酸(大約54-57％)，接著是飽和脂肪酸(31-34％)。ω-6脂肪酸是鑒定的主要聚不飽和脂肪酸，范圍為8-12％，而ω-3脂肪酸以低于總PUFA的2％的量存在。油酸(18:1ω9)是鴯鹋油類中主要的脂肪酸(表7)，范圍為從在G53鴯鹋油中的48.2％到在Makin鴯鹋油中為49.2％。軟脂酸(16:0)是次突出的脂肪酸(大約19-23％)，接著是硬脂酸(18:0)(10-11％)，亞油酸(18:2ω6)(8-12％)和透明質(zhì)酸(順式16:1ω7)(3-4％)。金槍魚油中主要是DHA，接著16:0，18:1ω9，18:0，EPA和順式16:1ω7。橄欖油中主要為18:1ω9(78％)，和較少百分比含量的16:0(1％)和18:0(3％)。表7在RMIT對鴯鹋，金槍魚和橄欖油類的脂肪酸進(jìn)行GC分析所有數(shù)據(jù)都為油中存在的總脂肪酸的百分比。D.Johnson博士在婦女和兒童醫(yī)院進(jìn)行的鴯鹋油脂肪酸的氣(相層析)-質(zhì)(譜)分析試驗(yàn)證實(shí)鴯鹋油的主要脂肪酸成分為14:0，16:1，16:0，18:1，18:2，18:0，20:0和20:1(見圖4)。但是，也檢測到了兩個(gè)其它的成分，標(biāo)記為峰1和2。在其它兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的分析中不存在。兩個(gè)峰都沒有肯定確認(rèn)為脂肪酸，即使在兩者中都檢測到了指示脂肪酸酯類存在的74質(zhì)量的離子，尤其是在峰2中尤為顯著。根據(jù)與其它脂肪酸峰的峰高的比較，在一個(gè)分析的鴯鹋油樣品(Makin)中峰2構(gòu)成了大約總脂肪酸的3-4％，而另一個(gè)樣品(A2-100G)中為6-7％。為了探究這兩種成分為羥脂肪酸的可能性，用苯/甲醇/1％硫酸于100℃水解鴯鹋油樣品2小時(shí)。在提取到己烷中后，水解產(chǎn)物樣品在TLC平板上于己烷-醚-乙酸(80:20:1)中進(jìn)行色譜分析并曝露于碘蒸氣來檢測區(qū)帶。雖然在這些條件下，鴯鹋油幾乎完全水解，但是沒有羥脂肪酸存在的證據(jù)。檢測到的成分只有標(biāo)準(zhǔn)(非羥基化的)脂肪酸酯以及少量的堿穩(wěn)定脂類。另一種可能性是，峰1和2是由甘油二酯的乙?；饔眯纬傻摹４蠖鄶?shù)動(dòng)物和植物脂肪，包括鴯鹋油，含有少量的通常由甘油三酯的分解形成的甘油二酯。沒有對這種可能性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。11.3固醇分析鴯鹋油和金槍魚油中大約存在30種固醇，而橄欖油中存在28種固醇(表8)。其中，鴯鹋油類中的15種固醇，和橄欖油中的19種用未練和質(zhì)譜的氣相色譜不能確定。給出的數(shù)據(jù)為占總固醇的百分比。膽固醇是兩種Adelaide鴯鹋油樣品中固醇級分的主要成分。它分別占有Makin和G53鴯鹋油固醇的70％和55％。另外鑒定了14種固醇。以顯著量存在的其它成分僅為4，23，24-三甲基-5α-膽甾-22E-烯-3β-醇(3.7和7.1％)。表8鴯鹋，a和橄欖油的固醇分析所有數(shù)據(jù)都是油中存在的總固醇的百分比許多其它成分，諸如谷固醇，二氫膽固醇和谷固醇是植物固醇，因此能從膳食中得到。另外的15種成分，其中的許多被認(rèn)為是固醇，也檢測到了但沒有確定。這些數(shù)據(jù)為鴯鹋油的復(fù)雜性及其組成的可變性提供了進(jìn)一步的證據(jù)。植物固醇的存在表明飲食可影響次要成分的濃度和組成。Makin和G53鴯鹋油類中存在的其它固醇是在膽固醇之前洗脫出來未確定的固醇(UI)(分別為5和13％)，4，23，24-三甲基-5α-膽甾-22E-烯-3β-醇之前洗脫出來的UI固醇(分別為5和5％)，以及二氫膽固醇(分別為2和1％)。未確定峰在所有試驗(yàn)樣品中存在并且直到使用氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜儀才能進(jìn)行鑒定。也存在幾種痕量的其它固醇，包括5α-膽甾烷，24-降脫氫膽固醇，C26固醇，patinosterol，反式-22脫氫膽固醇，二氫膽固醇，24-脫氫膽固醇，24-亞甲基膽固醇，24-甲基膽固醇，豆甾醇，β-谷固醇和isofucosterol(都≤1％)。β-谷固醇是橄欖油樣品中主要的固醇(21％)。橄欖油樣品中確定為膽固醇的峰值不可能是膽固醇。它可能是一種遷移很靠近膽固醇的長鏈醇(28:0)。金槍魚油主要含有膽固醇(85％)。11.4多酚分析在橄欖油中發(fā)現(xiàn)了最高濃度的酚類，其值高達(dá)每升708μmol(表9)。許多其它植物油類(向日葵，蕓苔，大豆油)中的水平較低。Makin鴯鹋油中酚類的水平與在蕓苔和花生油中檢測到的相當(dāng)(每升25.0對21.7和25，0和27.1和30.0μmol)(表9)。由于酚類在植物中是常見的，從飲食來源得到鴯鹋油酚類是可能的。橄欖油和其它食用油的總酚級分通常含有簡單和復(fù)雜酚的混合物。雖然鴯鹋油酚類沒有確定，但它們包括化合物的混合物是可能的。它們的存在進(jìn)一步表明了鴯鹋油的復(fù)雜性。考慮到它們的強(qiáng)抗氧化劑特性和它們調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的能力(17)，它們直接的或與油中存在的其它成分協(xié)同導(dǎo)致鴯鹋油的抗炎活性是可能的。表9植物和動(dòng)物油類/脂肪范圍內(nèi)酚的含量樣品酚濃度(μmol/l)菜籽油(NoFrills)0.0液體石蠟BP0.0水0.0向日葵油(Sunbeam)1.4菜籽油(NoFrills)1.4水1.7向日葵油(Sunbeam)5.7液體石蠟BP8.3大豆油8.6大豆油8.6牛酪油15.7鴯鹋油(EmuFire)18.3蓖麻油BP21.7蓖麻油BP25.0花生油27.1花生油30.0橄欖油(J.laforgiaYoungTrees2000)690.0橄欖油(J.laforgiaYoungTrees2000)708.6Makin鴯鹋油25.012.鴯鹋油的抗炎特性12.1鴯鹋油對慢性炎癥反應(yīng)的作用在這些實(shí)驗(yàn)中，首先使用的是Makin鴯鹋油制品，因?yàn)樗窃凇爸笇?dǎo)”的條件下制備的。通過遲發(fā)型超敏反應(yīng)測定慢性炎癥應(yīng)答。該反應(yīng)由一種抗原起始并由接著的不同位點(diǎn)的抗原攻擊誘出。該應(yīng)答是致敏T淋巴細(xì)胞特異性的，其遷移并在抗原攻擊位點(diǎn)積累。然后這種細(xì)胞導(dǎo)致其它淋巴細(xì)胞的非特異性積累和巨噬細(xì)胞的大量募集。這代表在發(fā)生組織損傷的炎癥疾病中所看到的反應(yīng)的顯著模式。在這些研究中，我們使用了綿羊紅細(xì)胞(SRBC)作為遲發(fā)型超敏反應(yīng)的抗原。小鼠用SRBC進(jìn)行皮下預(yù)處理，5天后用SRBC在足墊進(jìn)行攻擊，24h后測定腫脹的量。這些研究中，通過在抗原攻擊前3小時(shí)進(jìn)行腹膜內(nèi)注射50μlMakin鴯鹋油以評估鴯鹋油對抗炎應(yīng)答的作用。圖5中所示的數(shù)據(jù)顯示用鴯鹋油預(yù)處理的小鼠產(chǎn)生了顯著被抑制的DTH應(yīng)答，這表明鴯鹋油具有抗炎活性。發(fā)現(xiàn)鴯鹋油的這種活性由于注射的鴯鹋油的量的降低而成比例的降低(圖6)。因此，當(dāng)注射120μl時(shí)，大約抑制了70％的DTH應(yīng)答，相比較的注射30μl鴯鹋油時(shí)為25％。進(jìn)行了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證Makin鴯鹋油對DTH炎癥的作用的可重復(fù)性。用50μl油進(jìn)行ip給藥。表10中的結(jié)果顯示，在所有情況中，鴯鹋油在抑制炎癥應(yīng)答上是有活性的。表10驗(yàn)證Makin鴯鹋油對DTH應(yīng)答的作用的實(shí)驗(yàn)總結(jié)實(shí)驗(yàn)號抑制DTH應(yīng)答(平均值±SEM)的％142.9246.7338.8443.5525.2656.0(平均值±SEM)42±4.1小鼠用SRBC進(jìn)行皮下免疫，5天后用SRBC在后足墊進(jìn)行皮下攻擊。在攻擊前3小時(shí)，用50μl鴯鹋油通過ip處理小鼠。通過測定足墊腫脹的厚度來評估DTH反應(yīng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中每組使用5只小鼠。測試了來自命名為CI的鴯鹋油治療(EOT)市售來源的鴯鹋油乳膏。軟膏用于局部施用，并含有少量的桉樹和熏衣草油。在用SRBC攻擊前1h將乳膏施用于小鼠的足墊。圖7中顯示的結(jié)果表明，CI被高度免疫抑制，導(dǎo)致足墊腫脹減少了60％。12.2不同鴯鹋油制品的抗炎特性比較對進(jìn)行了化學(xué)分析的各種鴯鹋油制品，也比較它們降低炎癥應(yīng)答的能力。用SRBC致敏的小鼠組并在抗原激發(fā)前3h，通過腹膜內(nèi)途徑接受了一種類型鴯鹋油。從圖8中顯示的結(jié)果可以證實(shí)Makin鴯鹋油是最有效的。其它的鴯鹋油則顯示了較差的抗炎活性。12.3用鴯鹋油進(jìn)行抗原攻擊處理之前和之后的比較可以根據(jù)甚至已經(jīng)發(fā)炎之后其阻止發(fā)炎的能力，來評估一種物質(zhì)治療炎癥反應(yīng)的功效。這通過使用DTH模型對鴯鹋油進(jìn)行檢測。在起始的研究中，進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中鴯鹋油預(yù)處理的時(shí)間是從攻擊前1h到5h。這樣，SRBC預(yù)處理小鼠在SRBC攻擊前1，3和5h，用50μlMakin鴯鹋油通過腹膜內(nèi)途徑進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)果顯示，該油如果在激發(fā)前1h給予時(shí)是最有效的(圖9)。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，檢測了直到用SRBC激發(fā)3h后才用鴯鹋油對小鼠進(jìn)行的延遲處理對DTH反應(yīng)發(fā)生的影響。該研究用于比較抗原攻擊前3h預(yù)處理與3h后處理的影響。結(jié)果表明，如果處理延遲Makin鴯鹋油也是有效的，而且實(shí)際上，延遲處理顯著地比激發(fā)前進(jìn)行處理的抑制性更強(qiáng)(圖10)。12.4鴯鹋油對急性炎癥的作用急性炎癥由嗜中性粒細(xì)胞而不是T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞控制，雖然后面兩種細(xì)胞類型也可能起了一定的作用。這可以使用一個(gè)已建立的角叉菜聚糖誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答模型來進(jìn)行測試。該模型用于檢測鴯鹋油對急性炎癥的作用。在接受角叉菜聚糖到后足墊中前3h，用Makin鴯鹋油通過腹膜內(nèi)途徑處理小鼠。然后在注射角叉菜聚糖24h后測定腫脹。數(shù)據(jù)表明所述油在抑制角叉菜聚糖誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答中是很有效的(圖11)。每個(gè)DTH反應(yīng)中，預(yù)處理小鼠1h，3h，5h的比較顯示1h是最有效的(圖12)。鴯鹋油后處理對急性炎癥和角叉菜聚糖誘導(dǎo)炎癥作用的檢測顯示，用該模型延遲處理在抑制炎癥方面是有效的(圖13)。使用慢性炎癥，觀察到了對炎癥更大程度的抑制。12.5提煉溫度對鴯鹋油化學(xué)組成和抗炎活性的影響對Makin鴯鹋脂肪(EF)于40℃加熱2h，除去油，對剩下的脂肪于60℃加熱2h。收集油之后，于80℃加熱脂肪，并收集在該溫度下產(chǎn)生的油。通過GC分析在3種不同提煉條件下制備的油。結(jié)果如表11所示。表11不同提煉溫度制備的鴯鹋油的脂肪酸GC分析結(jié)果顯示，3種制品的主要和次要脂肪酸組成幾乎相同。與其它的鴯鹋油制品相比，脂肪組成相似。然后測試3種油對角叉菜聚糖誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答的影響。用120μl的每種鴯鹋油制品(40℃，60℃或80℃)預(yù)處理小鼠3h，然后在后腳爪用角叉菜聚糖進(jìn)行處理。結(jié)果顯示，雖然3種都抑制炎癥反應(yīng)，但是60℃提煉的產(chǎn)生了最大效力的油，接著是80℃的(圖14)。提煉溫度的影響在DTH反應(yīng)中也觀察到了，80℃和100℃油制品抗炎效果最好(圖15)。12.6鴯鹋油乙醇可溶性級分的活性制備Makin鴯鹋油的乙醇可溶性成分，并使用幾種炎癥的體外參數(shù)檢測其抗炎特性。測試乙醇可溶性級分抑制T淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞應(yīng)答的能力。12.6.1T淋巴細(xì)胞應(yīng)答將Makin鴯鹋油溶于乙醇中。然后測試該乙醇可溶性油級分抑制有絲分裂原刺激的人淋巴細(xì)胞增殖的能力。從外周血分離單核細(xì)胞，并用該級分的稀釋液預(yù)處理30min，然后用植物血細(xì)胞凝集素(PHA)攻擊。48小時(shí)后使用3H-TdR結(jié)合作為DNA合成的標(biāo)記檢測淋巴細(xì)胞的增殖。用鴯鹋油乙醇可溶性級分預(yù)處理的淋巴細(xì)胞顯示了對PHA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖的顯著抑制(圖16)。這方面已經(jīng)重復(fù)了幾次并重復(fù)獲得了類似的結(jié)果。表12顯示了來自檢測Makin鴯鹋油乙醇提取物對淋巴細(xì)胞增殖的影響的多個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用所述分析系統(tǒng)，測試了在40℃，60℃和80℃提煉的油類的乙醇級分。有趣的是，60℃和80℃的油類比40℃的更有活性(圖17)。表12檢測Makin鴯鹋油的各種乙醇提取物對用PHA刺激的人T淋巴細(xì)胞中淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答的影響的實(shí)驗(yàn)總結(jié)。50μl體積的純化T淋巴細(xì)胞(4×106/ml)置于U形底的孔中，等體積的乙醇或Makin鴯鹋油乙醇提取物(最終為1％總鴯鹋油體積)被加入到該孔中。在100μl5％AB血清或2μg/μlPHA(5％AB血清中)加入到該孔中之前，細(xì)胞于37℃/5％CO2/濕度大氣壓下培養(yǎng)30min。然后將所述孔在37℃/5％CO2/濕度大氣壓下培育48小時(shí)。在收集前6小時(shí)，細(xì)胞用1μCi的甲基-3H-胸腺嘧啶核苷進(jìn)行脈沖。使用β計(jì)數(shù)器測定結(jié)合的輻射強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)號淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答抑制％184.3±1.5284.2±5.5385.0±8.5499.9±0.14599.75±0.045平均值±sem90.63±3.76考慮到發(fā)現(xiàn)Makin鴯鹋油在抑制DTH中比G53鴯鹋油具有更高的活性，因此這兩種油制品的乙醇級分用于比較它們抑制PHA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的能力。圖18中的數(shù)據(jù)顯示，Makin鴯鹋油抑制了＞90％的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，G53鴯鹋油僅抑制了50％的這種應(yīng)答。12.6.2單核細(xì)胞功能進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)檢測了鴯鹋油對T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響。在每個(gè)淋巴細(xì)胞增殖檢測中，單核白細(xì)胞級分用Makin鴯鹋油乙醇級分進(jìn)行預(yù)處理，然后用PHA刺激。培養(yǎng)48小時(shí)后，檢測上清液的細(xì)胞因子，IFN-γ，TFN-β和IL-2的水平(圖19)。結(jié)果顯示，這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，尤其是IFN-γ被抑制。作為單核白細(xì)胞附著級分而制備的單核細(xì)胞用Makin鴯鹋油乙醇級分預(yù)處理，然后用細(xì)菌脂多糖(LPS)進(jìn)行刺激。通過測定培養(yǎng)的處理或未處理單核細(xì)胞中的細(xì)胞因子來評估對TNF-α產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，鴯鹋油的Makin乙醇級分是LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生的一種較差抑制劑(圖20)。12.6.3嗜中性粒細(xì)胞附著由于嗜中性粒細(xì)胞是急性炎癥的主要支持物，所以進(jìn)行了關(guān)于乙醇可溶性鴯鹋油級分是否對嗜中性粒細(xì)胞的功能性應(yīng)答的影響對嗜中性粒細(xì)胞組織的匯集是必要的，以及嗜中性粒細(xì)胞在炎癥位點(diǎn)的聚集是否需要嗜中性粒細(xì)胞附著到血管內(nèi)皮?？梢酝ㄟ^上調(diào)嗜中性粒細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白以及內(nèi)皮組織上的吸附分子來促進(jìn)這種附著。在第一組研究中，嗜中性粒細(xì)胞曝露于Makin鴯鹋油乙醇級分中，然后用佛波醇肉豆蔻酸乙酯(PMA)進(jìn)行刺激。結(jié)果顯示，可通過用油的這種級分進(jìn)行預(yù)處理來抑制PMA誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞對塑料表面附著的上調(diào)(圖21)。第二組研究中，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞曝露于Makin鴯鹋油乙醇級分。沖洗細(xì)胞，然后用腫瘤壞死因子(TNF)進(jìn)行刺激來上調(diào)吸附分子。添加新鮮的嗜中性粒細(xì)胞到內(nèi)皮細(xì)胞單層，并對嗜中性粒細(xì)胞附著程度進(jìn)行定量。(TNF)刺激的內(nèi)皮細(xì)胞顯示了增強(qiáng)的嗜中性粒細(xì)胞附著并且其在用鴯鹋油預(yù)處理的嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)物中顯著降低(圖22)。12.6.4嗜中性粒細(xì)胞的趨化性嗜中性粒細(xì)胞遷移到感染位點(diǎn)的能力依賴于它們的趨化應(yīng)答。在該研究中，通過測定嗜中性粒細(xì)胞向趨化劑，三肽fMLP的遷移程度來對嗜中性粒細(xì)胞的趨化應(yīng)答進(jìn)行定量。圖23中所示的數(shù)據(jù)顯示，已經(jīng)用Makin鴯鹋油乙醇級分預(yù)處理的嗜中性粒細(xì)胞顯示了較差的趨化應(yīng)答。12.7鴯鹋油抗T細(xì)胞活性的進(jìn)一步鑒定最初的研究顯示了鴯鹋油中發(fā)現(xiàn)的某些不飽和脂肪酸中能抑制T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞應(yīng)答。因此，我們的結(jié)果顯示與18:1ω9，18:0和18:2相比，18:2ω6具有更強(qiáng)的抑制性(圖24)。由于想象長鏈脂肪酸諸如18:2ω6負(fù)責(zé)抗T細(xì)胞作用，令人關(guān)注的是發(fā)現(xiàn)血清中的脂肪酸結(jié)合蛋白是否能阻止乙醇級分中存在的這種活性。用Makin鴯鹋油乙醇級分在存在和缺乏5％人全血組AB血清的條件下預(yù)處理淋巴細(xì)胞，然后用PHA刺激。圖25中的數(shù)據(jù)顯示，血清能阻止鴯鹋油乙醇級分對T淋巴細(xì)胞的抑制作用。通過GC對Makin鴯鹋油乙醇級分進(jìn)行的化學(xué)分析顯示全油中脂肪酸以相似的比例存在(表13)。但是18:2ω6有較小的增加。表13對乙醇可溶性鴯鹋油級分也進(jìn)行了TLC分析(分析)。顯示出7條帶(圖26)。令人感興趣的是，條帶3對應(yīng)18:2ω6。也進(jìn)行了一個(gè)預(yù)電泳，如圖27所示，顯示了8個(gè)級分。然后測試這些級分抑制淋巴細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果表明，主要活性與級分3，4和6相關(guān)，與級分3相當(dāng)(圖28)。其它的級分具有較低的活性。令人感興趣的是，級分3對應(yīng)于18:2ω6遷移。12.8鴯鹋油甘油三酯級分的抗炎特性乙醇不溶性級分主要含有油的甘油三酯成分。測試了其對DTH反應(yīng)的抑制活性。在這些實(shí)驗(yàn)中，用鴯鹋油的甘油三酯級分在抗原激發(fā)前3h或者在激發(fā)后3h處理小鼠。當(dāng)甘油三酯級分在抗原激發(fā)之前或之后施用時(shí)，DTH應(yīng)答顯著降低到與全油相似的程度(圖29)。參考文獻(xiàn)1.Kresina，T.F.(ED)免疫調(diào)節(jié)劑(ImmuenModulatingAgents).MarcelDekker，NewYork，pp1-557，(1997)。2.Craig-Schmidt，M.鴯鹋重要的油鳥(Emupremieroilbird).IFORM8，245-252(1997)。3.Bennett，G.主要針對新南威爾士動(dòng)物和植物產(chǎn)物的觀察；匯集澳大利亞的博物學(xué)者(ObservationprincipallyontheAnimalandVegetableProductsofNewSouthWales；GatheringsofaNaturalistinAustralia.)London.JohnVanVoorst，PaternosterRow；1860。4.Snowden，J.M.和Whitehouse，M.W.鴯鹋油對大鼠的抗炎Anti-inflammatoryofemuoilsinrats.Inflammopharmacology，5，127-132(1997)。5.Lopez，A.，Sims，D.E.，Ablett，R.F.，SKinner，R.E.，Leger，L.W.，Lariviere，C.M.，Jamieson，L.A.，Martinez-Burnes，J.A.和Zawadzka，G.G.，鴯鹋油對小鼠巴豆油誘導(dǎo)的耳炎的效果(Effectofemuoilonauricularinflammationinducedwithcrotonoilinmice).Am.J.Vet.Res.60(12)1558-1561(1999)。6.Fein，E.，Caputo，J.和Nagal，K.鴯鹋油的治療用途(Therapeuticusesofemuoil).1995年提交的美國專利5,472,713。7.WhitehouseM.W.，TurnerA.G.，DavisC.K.C.和RobertsM.S.鴯鹋油土著醫(yī)藥中無毒透皮抗炎藥的來源(Emuoil(s)Asourceofnon-toxictransdermalanti-inflammatoryagentsinaboriginalmedicine).Inflammopharmacology，6，1-8(1997)。8.Ferrante，A，Rowan-Kelly，B.&THONG，Y.H.通過兩性霉素處理抑制小鼠的免疫應(yīng)答(SuppressionoftheimmunologicalresponsesinmicebytreatmentwithamphotericinB).Clin.&Exp.Immunol.38，70-76(1979)。9.Costabile，M.，Hii，C.S.T.，Robinson，B.S.，Rathjen，D.A.，Pitt，M.J.，Easton，C.，Miller，R.C.，Poulos，A.，Murray，A.W.，和，A.(一種長鏈聚不飽和脂肪酸，β-氧代213n-3，抑制T淋巴細(xì)胞增殖，細(xì)胞因子產(chǎn)生，遲發(fā)型超敏，角叉菜聚糖誘導(dǎo)的腳爪水腫反應(yīng)以及選擇性靶定細(xì)胞內(nèi)信號(ANovelLongChainpolyunsaturatedfattyacid，β-oxa213n-3，inhibitsTlymphocyteproliferation，cytokineproduction，delayedtypehypersensitivity，carrageenan-inducedpawoedemareactionandselectivelytargetsintracellularsignals).J.Immunol.1673980-3987(2001)。10.Fletcher，D.，Kayser，V.，&Guilbaud，G.給藥時(shí)間對fbupivacaine滲透注射角叉菜聚糖大鼠止痛效果的影響(Influenceoftimingofadministrationontheanalgesiceffectoffbupivacaineinfiltrationincarrageenan-injectedrats).Anesthesiology84，1129-1137(1996)。11.Ferrante，A.&Thong，Y.H.從人血液通過hypaque-ficoll方法同時(shí)純化單核和多形核白細(xì)胞的最佳條件(Optimalconditionsforthesimultaneouspurificationofmononuclearandpolymorphonuclearleukocytefromhumanbloodbythehypaque-ficollmethod).J.Immun.Methods36，109-117(1980)。12.Ferrante，A.，Rowan-Kelly，B.&Thong，Y.H.由多粘菌素抗生素抑制有絲分裂原誘導(dǎo)的人白細(xì)胞應(yīng)答(Inhibitionofmitogeninducedhumanlymphocyteresponsivenessbypolymixinantibiotics).Int.Arch.Allerg.&Appl.Immunol.69，279-281(1982)。13.Staugas，R.E.M.，Harvey，D.P.，F(xiàn)errante，A.，Nandoskar，M.和Allison，A.C由銅綠假單胞菌誘導(dǎo)腫瘤壞死因子和白介素-1，外毒素A誘導(dǎo)的對淋巴細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞增殖，TNF，淋巴毒素，γ干擾素和白介素-1的抑制(Inductionoftumournecrosisfactorandinterleukin-1byPseudomonasaeruginosaandexotoxinA-inducedsuppressionoflymphoproliferation，TNF，lymphotoxin，interferongammaandinterleukin-1inhumanleukocytes).Infect.Immun.60，3162-3168(1992)。14.Bates，E.J.，F(xiàn)errante，A.，Robinson，B.，Smithers，L.和Poulos，A.脂肪酸結(jié)構(gòu)對嗜中性粒細(xì)胞附著，脫粒和對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響(Effectoffattyacidstructureonneutrophiladhesion，degranulationanddamagetoendothelialcells).Atherosclerosis.116，247-259(195)。15.Huang，Z.H.，Bates，E.J.，F(xiàn)errante，J.V.，Poulos，A.，Robinson，B.S.和Ferrante，A.由花生四烯酸及其羥化和氫過氧衍生物抑制刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間粘附分子-1，E-選擇蛋白內(nèi)血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)(Inhibitionofstimuli-inducedendothelialcellintercellularadhesionmolecule-1，E-selectinandvascularcellularadhesionmolecule-1expressionbyarachidonicacidanditshydroxy-andhydroperoxy-derivatives)，CirculationResearch.80，149-158(1997)。16.Ferrate，A.，Goh，D.H.B.，Harvey，D.P.，Robinson，B.S.，Hii，C.S.T.，Bates，E.J.，Hardy，S.J.，Johnson，D.W.和Poulos，A.聚不飽和脂肪酸對嗜中性粒細(xì)胞的遷移抑制特性脂肪酸結(jié)構(gòu)，代謝和可能第二信使系統(tǒng)的作用(Neutrophilmigrationinhibitorypropertiesofpolyunsaturatedfattyacidstheroleoffattyacidstructure，metabolismandpossiblesecondmessengersystems).J.Clin.Invest.93，1063-1070(1994)。17.Visioli，F(xiàn).和Galli，C.橄欖油的次要組分對心血管疾病的效果新發(fā)現(xiàn)(Theeffectsofminorconstituentsofoliveoiloncardiovasculardiseasenewfindings)，NutritionReview56，142-147(1998)。權(quán)利要求1.一種用于對物質(zhì)進(jìn)行分級，以便以標(biāo)準(zhǔn)方式評估其抗炎活性的分析系統(tǒng)，所述分析系統(tǒng)包括(i)注射合適抗原到哺乳動(dòng)物的適當(dāng)身體部位；(ii)注射預(yù)定量的所述試驗(yàn)物質(zhì)到相同的身體部位，或者用預(yù)定量的所述物質(zhì)局部施用到所述哺乳動(dòng)物；(iii)測定由于注射所述抗原減少或減輕腫脹的程度；和(iv)比較步驟(iii)中測定的所述試驗(yàn)物質(zhì)的活性與一個(gè)具有已知抗炎特性的標(biāo)準(zhǔn)化合物的活性，所述標(biāo)準(zhǔn)化合物的活性通過步驟(i)到(iii)的相同分析系統(tǒng)進(jìn)行測定，并已被用于產(chǎn)生一個(gè)分級系統(tǒng)以比較各種評估物質(zhì)的功效。2.一種用于對物質(zhì)進(jìn)行分級，以便以標(biāo)準(zhǔn)方式評估其抗炎活性的分析系統(tǒng)，所述的分析系統(tǒng)包括(i)測定T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞，或由其衍生的細(xì)胞系的體外制備物的活性；(ii)添加所述物質(zhì)到所述的T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞，或由其衍生的所述細(xì)胞系的制備物中；(iii)在步驟(ii)中添加所述物質(zhì)后，測定T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞，或由其衍生的所述細(xì)胞系的所述制備物的活性變化；和(iv)比較所述物質(zhì)的活性變化(如步驟(iii)中所測定的)與具有已知抗炎特性的標(biāo)準(zhǔn)化合物的活性變化，標(biāo)準(zhǔn)化合物的活性變化通過步驟(i)到(iii)的相同分析系統(tǒng)進(jìn)行測定并已用于產(chǎn)生分級系統(tǒng)以比較各種評估物質(zhì)的功效。3.權(quán)利要求1或2的分析系統(tǒng)，其中所述物質(zhì)是一種油或脂肪，一種油或脂肪的有機(jī)溶劑提取物，一種含有油或脂肪的制備物，或者一種油或脂肪的生物活性成分。4.權(quán)利要求3的分析系統(tǒng)，其中所述的物質(zhì)選自動(dòng)物油，植物油，諸如茶樹油，亞麻籽油，亞麻仁油，琉璃油和月見草油；魚油；以及藻類，微生物和真菌油。5.權(quán)利要求3或4的分析系統(tǒng)，其中所述的物質(zhì)是鴯鹋油或鴯鹋油的乙醇提取物。6.權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其中在步驟(i)中，所述的抗原通過腹膜內(nèi)注射或注射到所述哺乳動(dòng)物的足墊或耳中。7.權(quán)利要求1或6的分析系統(tǒng)，其中所述的抗原是角叉菜聚糖或綿羊紅細(xì)胞。8.權(quán)利要求1的分析系統(tǒng)，其中在步驟(ii)中，所述的物質(zhì)是通過腹膜內(nèi)注射或局部施用。9.權(quán)利要求2的分析系統(tǒng)，其中所述的制備物是T淋巴細(xì)胞制備物并且所述活性是淋巴細(xì)胞增殖。10.權(quán)利要求2的分析系統(tǒng)，其中所述的制備物是T淋巴細(xì)胞制備物并且所述活性是細(xì)胞因子的產(chǎn)生。11.權(quán)利要求10的分析系統(tǒng)，其中所述的細(xì)胞因子選自白介素-2，腫瘤壞死因子和γ-干擾素。12.權(quán)利要求2的分析系統(tǒng)，其中所述的制備物是嗜中性粒細(xì)胞制備物并且所述活性是趨化性。13.權(quán)利要求2的分析系統(tǒng)，其中所述的制備物是嗜中性粒細(xì)胞制備物并且所述的活性是對內(nèi)皮細(xì)胞的附著。14.權(quán)利要求1或2的分析系統(tǒng)，使用連續(xù)減少量的所述物質(zhì)重復(fù)其中的步驟(i)到(iv)。15.權(quán)利要求14的分析系統(tǒng)，其中所述物質(zhì)連續(xù)稀釋在乙醇中。16.一種治療或緩解哺乳動(dòng)物T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或病癥或者嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或病癥癥狀的藥用組合物，所述的藥用組合物含有鴯鹋油，或其生物活性提取物或組分，任選地含有一種載體賦形劑。17.權(quán)利要求16的藥用組合物，其中的疾病或病癥是免疫復(fù)合物疾病，腎臟疾病，腎炎，關(guān)節(jié)炎，腎小球炎，血管炎，痛風(fēng)，蕁麻疹，血管性水腫，心血管疾病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，乳房疼痛/經(jīng)前綜合征，哮喘，神經(jīng)疾病，注意力缺陷障礙(ADD)，牛皮癬，視網(wǎng)膜疾病，痤瘡，膿毒癥，肉芽腫病，炎癥，再灌注損傷，囊性纖維化，成人呼吸窘迫綜合征，生熱，糖尿病，腸炎，Crohn氏病，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，骨關(guān)節(jié)炎，遺傳過敏性皮炎，過敏接觸性皮炎，移植物排斥(移植物抗宿主病)或植入。18.權(quán)利要求16或17的藥用組合物，其中所述生物活性提取物或組分選自甘油三酯級分或甘油三酯級分成分，固醇級分，固醇級分成分，酚級分，酚級分成分，堿穩(wěn)定級分，堿穩(wěn)定級分成分，有機(jī)溶劑提取物，有機(jī)溶劑提取物成分及其混合物。19.權(quán)利要求16到18任一項(xiàng)的藥用組合物，為口服，注射或者局部組合物。20.權(quán)利要求19的藥用組合物，為可注射的組合物。21.一種治療或緩解哺乳動(dòng)物T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或病癥或者嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或病癥癥狀的方法，所述的方法包括施用有效劑量的含有鴯鹋油或其生物活性提取物或組分的組合物。22.權(quán)利要求21的方法，其中的疾病或病癥是免疫復(fù)合物疾病，腎臟疾病，腎炎，關(guān)節(jié)炎，腎小球炎，血管炎，痛風(fēng)，蕁麻疹，血管性水腫，心血管疾病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，乳房疼痛/經(jīng)前綜合征，哮喘，神經(jīng)疾病，注意力缺陷障礙(ADD)，牛皮癬，視網(wǎng)膜疾病，痤瘡，膿毒癥，肉芽腫病，炎癥，再灌注損傷，囊性纖維化，成人呼吸窘迫綜合征，生熱，糖尿病，腸炎，Crohn氏病，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，骨關(guān)節(jié)炎，遺傳過敏性皮炎，過敏接觸性皮炎，移植物排斥(移植物抗宿主病)或植入。23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述生物活性提取物或組分選自甘油三酯級分或甘油三酯級分成分，固醇級分，固醇級分成分，酚級分，酚級分成分，堿穩(wěn)定級分，堿穩(wěn)定級分成分，有機(jī)溶劑提取物，有機(jī)溶劑提取物成分及其混合物。24.權(quán)利要求21到23任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物通過口服，腸胃外或局部進(jìn)行施用。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述組合物通過注射進(jìn)行給藥。26.有機(jī)溶劑在從生物活性油或脂肪中提取具有抗炎活性化合物中的應(yīng)用。27.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中所述的生物活性油是鴯鹋油。28.權(quán)利要求26或27的應(yīng)用，其中所述有機(jī)溶劑是一種醇。29.權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中所述醇是乙醇。30.一種用于制備治療用途鴯鹋油的方法，所述方法包括將鴯鹋油，或從中可獲得鴯鹋油的組織加熱到至少40℃溫度的步驟。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述的溫度約為60℃，約80℃或約100℃。全文摘要本發(fā)明提供了確定一種化合物是否具有抗炎活性的新的科學(xué)方法。尤其是，新的分析方法能夠篩選治療或者緩解哺乳動(dòng)物T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或病癥或者嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的疾病或病癥癥狀的預(yù)防和治療用目的化合物。尤其是，本發(fā)明是基于作為一種油或脂肪，一種油或脂肪的醇提取物，一種油或脂肪的生物活性成分，或含有油類或脂肪的制備物的物質(zhì)抑制人類或動(dòng)物T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞對能激活這些細(xì)胞類型的化學(xué)和/或生物試劑應(yīng)答能力的測定。測定可在體內(nèi)(例如小鼠)或在人T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞或者其衍生的細(xì)胞系的體外制備物中進(jìn)行。所述物質(zhì)為尤其是鴯鹋油或鴯鹋油的乙醇提取物。本發(fā)明還公開了治療組合物和方法。文檔編號A61K49/00GK1639566SQ03805080公開日2005年7月13日申請日期2003年3月3日優(yōu)先權(quán)日2002年3月1日發(fā)明者安東尼奧·費(fèi)蘭特申請人:婦女和兒童醫(yī)院,農(nóng)業(yè)工業(yè)研究和發(fā)展公司,澳大利亞鴯鹋工業(yè)聯(lián)盟公司