專利名稱：用于預(yù)防或治療炎癥相關(guān)病癥的醛固酮阻滯劑治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬預(yù)防或治療炎癥相關(guān)病癥，且更具體為與炎癥相關(guān)的心血管病癥的領(lǐng)域。更為具體地，本發(fā)明涉及醛固酮阻滯劑療法在預(yù)防或治療包括動脈粥樣硬化的心血管疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
前列腺素在炎癥過程起主要作用，前列腺素生產(chǎn)，特別是PGG2、PGH2和PGE2的生產(chǎn)的抑制作用是發(fā)現(xiàn)抗炎藥的一個普遍目標(biāo)。但是，具有降低前列腺素誘導(dǎo)的疼痛和與炎癥過程有關(guān)的腫脹的活性的普通非甾族抗炎藥(NSAID)還具有影響與炎癥過程無關(guān)的其它前列腺素調(diào)節(jié)的過程的活性。因此，使用高劑量的最普通NSAID可能產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，包括危及生命的潰瘍，限制了它們的治療潛能。NSAID的一個可替代的選擇是使用皮質(zhì)類固醇，它也產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，特別在涉及長期治療的時候。
已發(fā)現(xiàn)NSAID通過抑制人花生四烯酸/前列腺素途徑，包括酶環(huán)加氧酶(COX)防止前列腺素的產(chǎn)生。最近發(fā)現(xiàn)的與炎癥(稱為“環(huán)加氧酶-2(COX-2)”或“前列腺素G/H合酶II”)有關(guān)的可誘導(dǎo)酶提供了一種活的抑制靶體，更有效地減小炎癥并產(chǎn)生較少和較弱的副作用。
最近，對炎癥在心血管疾病中的作用有了更多的認(rèn)識。Ridker等人，(New Eng.J.Med.，336，973-9(1997))描述血小板破裂和動脈粥樣硬化性炎癥的關(guān)系。
選擇性抑制環(huán)加氧酶-2的化合物已公開在美國專利5,380,738、5,344,991、5,393,790、5,434,178、5,474,995、5,510,368和WO文獻(xiàn)WO96/06840、WO96/03388、WO96/03387、WO96/19469、WO96/25405、WO95/15316、WO94/15932、WO94/27980、WO95/00501、WO94/13635、WO94/20480和WO94/26731。苯磺胺已被描述為環(huán)加氧酶-2抑制劑，并于治療炎癥、關(guān)節(jié)炎和疼痛有前景，在預(yù)臨床和臨床試驗(yàn)中具有最小的副作用。美國專利5,466,823描述它們用于治療血管疾病中的炎癥的應(yīng)用。
附圖的簡要說明

圖1-A表示依匹樂酮晶形H的X射線粉末衍射圖。
圖1-B表示依匹樂酮晶形L的X射線粉末衍射圖。
圖1-C表示依匹樂酮甲基乙基酮溶劑化物的X射線粉末衍射圖。
圖2-A表示從甲基乙基酮中直接結(jié)晶的非研磨晶形L的差示掃描量熱法(DSC)差示熱分析圖。
圖2-B表示通過將從甲基乙基酮結(jié)晶高純度依匹樂酮而獲得的溶劑化物去溶劑化而制得的非研磨晶形L的差示掃描量熱法(DSC)差示熱分析圖。
圖2-C表示通過以下方法制得的晶形L的差示掃描量熱法(DSC)差示熱分析圖從在甲基乙基酮中的高純度依匹樂酮溶液結(jié)晶溶劑化物，去溶劑化溶劑化物得到晶形L，并研磨所得的晶形L。
圖2-D表示通過從適當(dāng)?shù)娜軇┲姓糁蟮图兌纫榔吠@得的溶劑化物去溶劑化而制得的非研磨晶形H的差示掃描量熱法(DSC)差示熱分析圖。
圖2-E表示甲基乙基酮溶劑化物的DSC差示熱分析圖。
圖3-A表示依匹樂酮晶形H的紅外光譜(漫反射，DRIFTS)。
圖3-B表示依匹樂酮晶形L的紅外光譜(漫反射，DRIFTS)。
圖3-C表示依匹樂酮的甲基乙基酮溶劑化物的紅外光譜(漫反射，DRIFTS)。
圖3-D表示在于氯仿溶液中的依匹樂酮的紅外光譜(漫反射，DRIFTS)。
圖4表示依匹樂酮晶形H的13C NMR光譜。
圖5表示依匹樂酮晶形L的13C NMR光譜。
圖6-A表示甲基乙基酮溶劑化物的熱重量分析法分析圖。
圖7表示從甲基乙基酮中分離的7-甲基氫4″，5″9″，11″-二環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-17″-孕烷-7″，21-二羧酸酯，(-內(nèi)酯晶形的X射線粉末衍射圖。
圖8表示從異丙醇中分離的7-甲基氫11″，12″-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-17″-孕-4-烯-7″，21-二羧酸酯，(-內(nèi)酯晶形的X射線粉末衍射圖。
圖9表示從正丁醇中分離的7-甲基氫17-羥基-3-氧代-17″-孕-4，9(11)-二烯-7″，21-二羧酸酯，(-內(nèi)酯晶形的X射線粉末衍射圖。
圖10表示得自摻入了(a)0％、(b)1％、(c)3％和(d)5％二環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶的濕餅(甲基乙基酮溶劑化物)的X射線粉末衍射圖。
圖11表示得自摻入了(a)0％、(b)1％、(c)3％和(d)5％二環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶的干燥固體的X射線粉末衍射圖。
圖12表示從摻入了3％二環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶獲得的干燥固體的X射線粉末衍射圖，其中(a)是干燥前沒有研磨該溶劑化物，而(b)是干燥前研磨了該溶劑化物。
圖13表示得自摻入了(a)0％、(b)1％、(c)5％和(d)10％的11，12-環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶的濕餅(甲基乙基酮溶劑化物)的X射線粉末衍射圖。
圖14表示得自摻入了(a)0％、(b)1％、(c)5％和(d)10％的11，12-環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶的干燥固體的X射線粉末衍射圖。
圖15表示基于表X-7A所報(bào)告的數(shù)據(jù)，產(chǎn)物純度、原料純度、冷卻速度和終點(diǎn)溫度的立方圖。
圖16表示的是，為確定對終產(chǎn)物的純度具有統(tǒng)計(jì)顯著影響的變量，用圖18的立方圖繪制的半標(biāo)準(zhǔn)圖。
圖17是基于表X-7A所報(bào)告的數(shù)據(jù)的相互作用圖，其表示的是原料純度與冷卻速度之間的相互作用對終產(chǎn)物純度的影響。
圖18表示的是基于表X-7A所報(bào)告的數(shù)據(jù)，晶形H重量分?jǐn)?shù)、原料純度、冷卻速度和終點(diǎn)溫度的立方圖。
圖19表示的是，為確定對終產(chǎn)物的純度具有統(tǒng)計(jì)顯著影響的變量，用圖21的立方圖繪制的半標(biāo)準(zhǔn)圖。
圖20是基于表X-7A所報(bào)告的數(shù)據(jù)的相互作用圖，其表示的是原料純度與終點(diǎn)溫度之間的相互作用對終產(chǎn)物純度的影響。
圖21表示無定形依匹樂酮的X射線衍射圖。
圖22表示無定形依匹樂酮的DSC差示熱分析圖。
圖23表示血管緊張素II灌輸大鼠研究中的收縮血壓的變化。
圖24表示依匹樂酮(環(huán)氧美沙樂酮(epoxymexrenone))防止血管緊張素II灌輸大鼠心臟的血管炎癥。
圖25表示在賦形劑(vehicle)灌輸大鼠心臟中缺少環(huán)加氧酶-2(COX-2)表達(dá)。
圖26表示Ang II灌輸大鼠心臟中COX-2表達(dá)的誘導(dǎo)。
圖27表示依匹樂酮防止Ang II灌輸大鼠心臟中COX-2表達(dá)的誘導(dǎo)。
圖28表示賦形劑灌輸大鼠心臟中缺少骨橋蛋白表達(dá)。
圖29表示依匹樂酮防止醛固酮灌輸大鼠心臟中骨橋蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)。
圖30表示依匹樂酮防止醛固酮灌輸大鼠心肌中骨橋蛋白上調(diào)。
圖31表示依匹樂酮防止醛固酮灌輸大鼠心肌中COX-2上調(diào)。
圖32表示依匹樂酮防止醛固酮灌輸大鼠心肌損傷。
圖33表示COX-2和骨橋蛋白在醛固酮灌輸大鼠冠狀動脈中膜中的上調(diào)的共表達(dá)。
圖34表示醛固酮誘導(dǎo)的血管炎癥和損傷的某些機(jī)理。
圖35表示依匹樂酮治療抑制血管緊張素II灌輸、卡托普利治療的有中風(fēng)傾向的自發(fā)性高血壓大鼠尿蛋白排泄增加。
圖36表示依匹樂酮治療降低血管緊張素II灌輸、卡托普利治療的有中風(fēng)傾向的自發(fā)性高血壓大鼠的腎損傷的組織病理分值。
圖37表示依匹樂酮治療增加有中風(fēng)傾向的自發(fā)性高血壓大鼠的存活率并降低腎損傷。
圖38表示依匹樂酮治療減小有中風(fēng)傾向的自發(fā)性高血壓大鼠的腦損傷。
圖39表示用依匹樂酮治療醛固酮灌輸?shù)母哐獕捍笫髮π募OX-2的早期時程表達(dá)的抑制作用。
圖40表示用依匹樂酮治療醛固酮灌輸?shù)母哐獕捍笫髮π募」菢虻鞍椎脑缙跁r程表達(dá)的抑制作用。
圖41表示用依匹樂酮治療醛固酮灌輸?shù)母哐獕捍笫髮π募CP-1的早期時程表達(dá)的抑制作用。
圖42表示用依匹樂酮治療醛固酮灌輸?shù)母哐獕捍笫髮π募CAM-1和VCAM-1的早期時程表達(dá)的抑制作用。
圖43表示醛固酮灌輸升高收縮血壓，而醛固酮灌輸和依匹樂酮治療抑制這種升高。
圖44表示在第28天對照大鼠、用醛固酮灌輸大鼠和用醛固酮灌輸并用依匹樂酮治療的大鼠的心肌組織病理分值，以及用醛固酮灌輸大鼠和用醛固酮灌輸并用依匹樂酮治療的大鼠的心臟重量與體重的比率。
圖45表示對照大鼠、用醛固酮灌輸大鼠和用醛固酮灌輸并用依匹樂酮治療的大鼠的28天循環(huán)骨橋蛋白水平。
圖46表示在第28天對照大鼠、用醛固酮灌輸大鼠和用醛固酮灌輸并用依匹樂酮治療的大鼠的炎性細(xì)胞因子的相對mRNA表達(dá)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及醛固酮阻滯劑用于預(yù)防或治療炎癥相關(guān)病癥的應(yīng)用。更具體而言，本發(fā)明涉及醛固酮阻滯劑在預(yù)防與炎癥相關(guān)的心血管疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療有此需要的受試者的心血管病癥的方法。所述方法包括用治療有效量的醛固酮阻滯劑或者其衍生物或可藥用鹽治療受試者。
以上的方法可以用于但不限于預(yù)防或治療受試者的與炎癥相關(guān)的病，包括但不限于與炎癥相關(guān)的心臟、腎和腦病，特別是與血管炎癥相關(guān)的病癥。所述方法可以用于預(yù)防或治療冠狀動脈疾病、動脈瘤、動脈硬化癥、動脈粥樣硬化包括心臟移植動脈粥樣硬化、心肌梗塞、栓塞、中風(fēng)、心肌炎、心肌癥、血栓形成，包括靜脈血栓形成、絞痛包括不穩(wěn)定心絞痛、鈣化(例如血管鈣化和瓣膜鈣化)、川崎氏病和炎癥(例如冠脈斑塊炎癥、細(xì)菌誘導(dǎo)的炎癥包括衣原體誘導(dǎo)的炎癥、寄生蟲誘導(dǎo)的炎癥和病毒誘導(dǎo)的炎癥)。所述方法通過改變一種或多種直接或間接調(diào)節(jié)炎癥的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)而治療或預(yù)防病癥。與炎癥相關(guān)的心血管病癥可以全部或部分地由一種或多種可能經(jīng)歷表達(dá)增加或減小的表達(dá)產(chǎn)物來調(diào)節(jié)。該表達(dá)產(chǎn)物可以包括但不限于有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、基于DNA或基于RNA的分子、這些產(chǎn)物的網(wǎng)狀物或聚集體，它們共同或單獨(dú)地作用以直接或間接地產(chǎn)生效果。該表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)型式的改變可能順續(xù)或同時發(fā)生，涉及二種或更多種表達(dá)產(chǎn)物。這些產(chǎn)物對受試者的組織或器官可以具有直接或間接的效果，包括誘導(dǎo)或增強(qiáng)其它分子或表達(dá)產(chǎn)物的病理學(xué)效應(yīng)。這些表達(dá)產(chǎn)物可以依賴于它們分別作為前炎癥或抗炎表達(dá)產(chǎn)物的功能，通過增加表達(dá)或減小表達(dá)而產(chǎn)生前炎癥效果。
所述方法通過調(diào)節(jié)在受影響的組織中的前炎癥組分，包括環(huán)加氧酶-2和骨橋蛋白而特別用于治療或預(yù)防病癥。
在以上方法中，心血管病癥包括但不限于已知具有炎癥組分并可以由醛固酮介導(dǎo)的病癥。以上方法還包括用要求緩和環(huán)加氧酶-2或骨橋蛋白表達(dá)上調(diào)的醛固酮阻滯劑對患者進(jìn)行的治療。在包括但不限于腎、心臟、胰和腦的組織中，同工型環(huán)加氧酶-2可以被誘導(dǎo)，而導(dǎo)致前炎癥酶表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致輕微至嚴(yán)重的組織和器官損害。在以上方法中，醛固酮阻滯劑的給藥用于緩和環(huán)加氧酶-2的表達(dá)上調(diào)。在另一個實(shí)施方案中，所述方法通過抑制或阻滯在前炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄中涉及的核因子，例如抑制或阻滯NF-kappaB而緩和細(xì)胞因子表達(dá)。以上方法還用于預(yù)防或治療可能在包括但不限于腎、心臟和腦等組織中發(fā)生的病癥，這些病癥中前炎癥蛋白骨橋蛋白的表達(dá)上調(diào)可能被誘導(dǎo)，導(dǎo)致輕微至嚴(yán)重的組織和器官損害。在以上方法中，醛固酮阻滯劑的給藥用于緩和骨橋蛋白的表達(dá)上調(diào)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明用于預(yù)防或治療組織和器官，包括但不限于腎、心臟和腦的病癥，這些病癥中可能發(fā)生前炎癥表達(dá)產(chǎn)物MCP-1、IL-1、IL-6、IL-8、VCAM-1和ICAM-1中任一種的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致輕微至嚴(yán)重的組織和器官損害。在以上方法中，醛固酮阻滯劑的給藥用于緩和MCP-1、IL-1、IL-6、VCAM-1和ICAM-1中任一種的表達(dá)上調(diào)。
可以通過醛固酮阻滯劑治療來緩和其表達(dá)以減少與炎癥相關(guān)的心血管疾病的表達(dá)產(chǎn)物的非限制性實(shí)例如圖34所示，并包括上調(diào)一種或多種以下物質(zhì)(a)血管緊張素II和內(nèi)皮素受體；(b)單核細(xì)胞活化分子、例如αvβ3(粘附、增殖、遷移)和CD44(遷移)；(c)血管炎癥介質(zhì)、例如干擾素-γ(Inf-γ)、白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和fractalkine；(d)產(chǎn)生組織損害過氧化物基團(tuán)的NADH/NADPH氧化酶；和(e)導(dǎo)致活性組織纖溶酶原激活劑(t-PA)減少的血栓前纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可以通過用醛固酮阻滯劑治療而緩和其表達(dá)以減少與炎癥相關(guān)的心血管疾病的表達(dá)產(chǎn)物的非限制性實(shí)例包括以下一種或多種急性階段反應(yīng)物，例如C-活性蛋白(CRP)，多效性細(xì)胞因子，例如白介素-6(IL-6)，IL-12，可溶的細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(sICAM-1)，肌鈣蛋白T或I，熱休克蛋白65(HSP65)，淀粉樣蛋白，磷脂酶A2，纖維蛋白原，CD40/CD40L信號傳導(dǎo)途徑和粘附介質(zhì)，例如膠原結(jié)合整合素α1β1(間質(zhì)細(xì)胞)和α2β1(上皮細(xì)胞)。
劑量和治療方案醛固酮阻滯劑的施用量和用于本發(fā)明方法的劑量方案取決于多個因素，包括受試者的年齡、體重、性別和健康狀況，致病作用的嚴(yán)重程度，給藥途徑和頻率，和所用的特定醛固酮阻滯劑，因此可寬泛地變化。大約0.001-30mg/kg體重，優(yōu)選大約0.005至大約20mg/kg體重，更優(yōu)選大約0.01至大約15mg/kg體重，甚至更優(yōu)選大約0.05至大約10mg/kg體重，并最優(yōu)選大約0.01至5mg/kg體重的受試者的日劑量可以是合適的。對人受試者給藥的醛固酮拮抗劑的數(shù)量范圍一般為大約0.1至大約2000mg。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.5至大約500mg。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，劑量范圍為大約0.75至大約250mg。在本發(fā)明的進(jìn)一步的另一個實(shí)施方案中，劑量范圍為大約1至大約100mg。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，劑量范圍為大約10-100mg。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，劑量范圍為大約25至大約100mg。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，劑量范圍為大約25至大約75mg。對受試者不產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性利尿和/或抗高血壓效果的醛固酮阻滯劑的日劑量特別包括在本發(fā)明方法中。日劑理可以是施用1-4次劑量/天。
醛固酮阻滯劑的服藥劑量可以基于血壓或適宜的替代標(biāo)記物(例如促尿鈉排泄肽、內(nèi)皮素和下述的其它替代標(biāo)記物)的測定來確定和調(diào)整?？梢詫⑷┕掏铚┙o藥后的血壓和/或替代標(biāo)記物水平與對應(yīng)的醛固酮阻滯劑給藥前的基線水平比較以確定本發(fā)明方法的效力并按需要調(diào)節(jié)。用于所述方法的替代標(biāo)記物的非限制性實(shí)例是用于腎和心血管疾病的替代標(biāo)記物。
預(yù)防服藥在診斷該與炎癥相關(guān)的心血管病癥之前進(jìn)行預(yù)防性醛固酮阻滯劑給藥和在患者易患與炎癥相關(guān)的心血管病癥期間持續(xù)進(jìn)行醛固酮阻滯劑給藥是有利的。因此可以使無顯著的臨床表現(xiàn)但易患受致病作用影響的個體接觸預(yù)防劑量的醛固酮阻滯化合物。醛固酮阻滯劑的這種預(yù)防劑量可以但不必低于用于治療特定目的致病作用的劑量。
心血管病理學(xué)服藥治療心血管功能病理的服藥可以基于促尿鈉排泄肽的血液濃度的測定來確定和調(diào)整。促尿鈉排泄肽是一組結(jié)構(gòu)類似但在遺傳學(xué)上不同的肽，它們在心血管、腎和內(nèi)分泌內(nèi)環(huán)境平衡中起不同的作用。心房促尿鈉排泄肽(″ANP″)和腦促尿鈉排泄肽(″BNP″)來源于心肌細(xì)胞，而C型促尿鈉排泄肽(″CNP″)來源于內(nèi)皮。ANP和BNP通過3′，5′-環(huán)鳥苷酸(cGMP)與促尿鈉排泄肽-A受體(″NPR-A″)結(jié)合，調(diào)節(jié)尿鈉排泄、血管舒張、腎素抑制、抗致有絲分裂和松馳性能。在有血液體積膨脹癥狀和血管損傷，例如急性心肌梗塞之后的受試者中觀察到血液促尿鈉排泄肽水平，特別是血液BNP水平升高，且在梗塞后長期保持升高(Uusimaa等人，Int.J.Cardiol 1999；695-14)。
促尿鈉排泄肽水平相對于醛固酮阻滯劑給藥前測定的基線水平降低表明醛固酮病理效應(yīng)減小，因此提供與病理效應(yīng)抑制的相關(guān)性。
因此可以將理想促尿鈉排泄肽的血液水平與對應(yīng)的醛固酮阻滯劑給藥前的基線水平比較以確定本發(fā)明方法治療病理效應(yīng)的效力。根據(jù)這種促尿鈉排泄肽水平測定，可以調(diào)整醛固酮阻滯劑的服藥以減小心血管病理效應(yīng)。
類似地，還可以根據(jù)循環(huán)和尿cGMP水平來鑒定心臟病理，并確定適宜的服藥。cGMP血漿水平升高與平均動脈壓降低并行。cGMP的尿排泄減少與尿鈉排泄相關(guān)。
心臟病理還可由射血分?jǐn)?shù)減小或心肌梗塞或心衰或左心室肥大存在來鑒定。左心室肥大可以由超聲心動圖或磁共振成像鑒定，并用于監(jiān)測治療進(jìn)展和服藥的適當(dāng)性。
因此，在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可能用于降低促尿鈉排泄肽水平，特別是BNP水平，從而還治療相關(guān)的心血管病理。
腎病理學(xué)服藥治療腎功能病理的服藥可以根據(jù)蛋白尿、微白蛋白尿、腎小球?yàn)V過率(GFR)減小或肌酸酐清除率減小的測定來確定和調(diào)整。蛋白尿通過在24小時尿收集中大于0.3g的尿蛋白的存在來鑒定。微白蛋白尿通過可免疫分析的尿白蛋白升高來鑒定。根據(jù)這些測定，可以調(diào)整醛固酮阻滯劑的服藥以減小腎病理效應(yīng)。
神經(jīng)病理學(xué)服藥可以感覺缺損或感覺運(yùn)動能力的神經(jīng)檢查來鑒定神經(jīng)病，特別是外周神經(jīng)病，并根據(jù)它調(diào)整服藥。
視網(wǎng)膜病理學(xué)服藥可以通過眼科學(xué)檢查來鑒定視網(wǎng)膜病，并根據(jù)它調(diào)整服藥。
炎癥標(biāo)記物某些標(biāo)記物可以代表或造成炎癥或者炎癥前癥狀。這些標(biāo)記物的測定可以用于確定待給藥的醛固酮阻滯劑的適宜的劑量，或者確定給藥后醛固酮阻滯劑的有效劑量。這些標(biāo)記物的非限制性實(shí)例為骨橋蛋白；急性期反應(yīng)物，例如C活性蛋白(CRP)、纖維蛋白原、因子VIII、血清銅(載體蛋白血漿銅藍(lán)蛋白)、血清鐵(載體蛋白鐵蛋白)、纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-I)和脂蛋白(a)；促尿鈉排泄肽；內(nèi)皮素；VCAM-1；ICAM-1；IL-1β；TNF-α；IL-6；IL-8、COX-2；fractalkine；MCP-1；和甘油三酸酯。
聯(lián)合治療本發(fā)明的方法還可以包括其它活性成分或治療劑的給藥與醛固酮阻滯劑給藥聯(lián)合。
例如，用于本發(fā)明方法的醛固酮阻滯劑可以與其它用于治療高血壓和心血管和腎癥狀和病癥的活性藥物一起對受試者聯(lián)合給藥。例如，與醛固酮阻滯劑一起給藥的活性藥物可以包括選自以下的藥物腎素抑制劑、血管緊張素II拮抗劑、ACE抑制劑、無實(shí)質(zhì)性醛固酮阻滯作用的利尿劑和視黃酸。關(guān)于藥物組合所述的短語“聯(lián)合治療”(或“共同治療”)意在包括在提供藥物組合的有益效果的方案中以連續(xù)的方式對每種試劑給藥，并意在包括以基本上同時的方式，例如在這些活性試劑比率固定的單一膠囊或注射劑中或者在多個單獨(dú)的每種試劑的膠囊或注射劑中對這些試劑進(jìn)行共同給藥。
例如，短語“血管緊張素II拮抗劑”包括WO96/40257所述的血管緊張素II拮抗劑。
短語“血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(″ACE抑制劑″)包括一種試劑或化合物，或者二種或多種試劑或化合物的組合，其具有部分或完全阻滯十肽形式的血管緊張素(″血管緊張素I″)酶轉(zhuǎn)化成血管收縮性八肽形式的血管緊張素(血管緊張素II″)的能力。血管緊張素II形成的阻滯可以通過除去血管緊張素II的主要作用而影響體液和電解質(zhì)平衡、血壓和血液體積的調(diào)節(jié)。血管緊張素II的這些主要作用包括刺激腎上腺皮質(zhì)合成和分泌醛固酮受體以及通過直接收縮小動脈平滑肌而升高血壓。
可以用于聯(lián)合治療的ACE抑制劑的實(shí)例包括但不限于以下化合物AB-103、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽、貝那普利拉、BRL-36378、BW-A575C、CGS-13928C、CL-242817、CV-5975、Equaten、EU-4865、EU-4867、EU-5476、foroxymithine、FPL 66564、FR-900456、Hoe-065、15B2、吲哚普利、ketomethylureas、KRI-1177、KRI-1230、L-681176、賴苯普利、MCD、MDL-27088、MDL-27467A、莫維普利、MS-41、nicotianamine、噴托普利、phenacein、匹伏普利、倫唑普利、RG-5975、RG-6134、RG-6027、RGH-0399、ROO-911、RS-10085-197、RS-2039、RS 5139、RS 86127、RU-44403、S-8308、SA-291、螺普利拉、SQ-26900、SQ-28084、SQ-28370、SQ-28940、SQ-31440、烏替普利、utibapril、WF-10129、Wy-44221、Wy-44655、Y-23785、Yissum P-0154、扎普利、Asahi Brewery AB-47、alatriopril、BMS 182657、Asahi Chemical C-111、Asahi ChemcalC-112、Dainippon DU-1777、mixanpril、Prentyl、佐芬普利拉、1-(-(1-羧基-6-(4-哌啶基)己基)氨基)-1-氧代丙基八氫-1H-吲哚-2-羧酸、Bioproject BP1.137、Chiesi CHF 1514、Fisons FPL-66564、伊屈普利、Marion Merrell Dow MDL-100240、培哚普利拉和Servier S-5590、阿拉普利、貝那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、福辛普利拉、咪達(dá)普利、賴諾普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、乙酸沙拉新、tempocapril、群多普利、ceranapril、meoxipril、喹那普利拉和螺普利。
一組特別有價值的ACE抑制劑為阿拉普利、貝那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、福辛普利拉、咪達(dá)普利、賴諾普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、乙酸沙拉新、替莫普利、群多普利、ceranapril、莫昔普利、喹那普利拉和螺普利。
這些ACE抑制劑中的許多可商購得到。例如，特別優(yōu)選的ACE抑制劑、卡托普利由E.R Squibb & Sons，Inc.，Princeton，N.J.，現(xiàn)Bristol-Meyers-Squibb的部分出售，其商標(biāo)″CAPOTEN″，該劑型每片劑量為12.5mg、50mg和200mg。依那普利或馬來酸依那普利馬和賴諾普利是兩種更加非常優(yōu)選的ACE抑制劑，Merck和Co.，West Point，Pa.有售。依那普利銷售商標(biāo)為″VASOTEC″，該劑型每片劑量為2.5mg、5mg、10mg和20mg。賴諾普利銷售商標(biāo)為″PRINIVIL″，該劑型每片劑量為5mg、10mg、20mg和40mg。
利尿劑可以選自多種已知種類，例如噻嗪和相關(guān)的磺胺、保鉀利尿劑、袢利尿劑和有機(jī)化學(xué)利尿劑。噻嗪類的非限制性實(shí)例為芐氟噻嗪、芐噻嗪、氯噻嗪、環(huán)噻嗪、氫氯噻嗪、氫氟噻嗪、甲基環(huán)噻嗪、多噻嗪和三氯甲噻嗪。與噻嗪相關(guān)的磺胺的非限制性實(shí)例為氯噻酮、喹乙宗和美托拉宗。保鉀利尿劑的非限制實(shí)例為triameterene和阿米洛利。袢利尿劑，即作用于腎亨勒袢升支的利尿劑的非限制性實(shí)例為速尿和乙炔丙烯酸。有機(jī)汞利尿劑的非限制性實(shí)例為硫汞林鈉、乙氧汞林、普魯卡因和含茶堿的汞撒利。
在一個實(shí)施方案中，聯(lián)合治療包括施用ACE抑制劑、作為醛固酮受體拮抗劑的環(huán)氧-甾族化合物和對人受試者基本上不具有醛固酮拮抗活性的襻利尿劑。
這種聯(lián)合治療將用于，例如預(yù)防或治療哺乳動物受試者的與炎癥相關(guān)的心血管病癥。基本上不具有醛固酮拮抗活性的利尿劑也可以與ACE抑制劑和環(huán)氧甾族化合物結(jié)合使用。
可選擇地，聯(lián)合治療可以包括對人受試者施用治療有效量的ACE抑制劑、治療有效量的環(huán)氧甾族化合物、治療有效量的基本上不具有醛固酮拮抗活性的袢利尿劑和治療有效量的地高辛，以治療或預(yù)防與炎癥相關(guān)的心血管病癥。
用于預(yù)防心血管病癥的花生四烯酸代謝中的環(huán)加氧酶途徑抑制劑可以通過不同的機(jī)理抑制酶活性。例如，用于本文所述方法的抑制劑可以抑制酶活性的表達(dá)。使用醛固酮阻滯劑在炎癥損害部位阻滯環(huán)加氧酶-2的表達(dá)非常有利，因?yàn)樗鼘⑹褂梅沁x擇性NSAID時發(fā)生的胃副作用最小化，特別是在期望進(jìn)行長期治療的時候。
用于本發(fā)明方法的醛固酮受體拮抗劑一般為螺甾內(nèi)酯型甾族化合物。術(shù)語“螺甾內(nèi)酯型”意在表征包含通常在甾族“D”環(huán)處通過螺鍵構(gòu)型與甾核相連的內(nèi)酯部分的結(jié)構(gòu)。螺甾內(nèi)酯型醛固酮拮抗劑化合物的一個小組由環(huán)氧甾族醛固酮拮抗劑化合物，例如依匹樂酮組成。螺甾內(nèi)酯型拮抗劑化合物的另一小組由非環(huán)氧甾族醛固酮拮抗劑化合物，例如螺內(nèi)酯組成。
用于本發(fā)明方法的環(huán)氧甾族醛固酮拮抗劑化合物通常具有被環(huán)氧類型部分取代的甾核。術(shù)語“環(huán)氧類型”部分意在包含任何特征為在二個碳原子之間具有一個作為橋的氧原子的部分，其實(shí)例包括以下部分 環(huán)氧乙基 1，3-環(huán)氧丙基 1，2-環(huán)氧丙基用于短語“環(huán)氧甾族”中的術(shù)語“甾族”指由具有常規(guī)“A”、“B”、“C”和“D”環(huán)的環(huán)戊烯-菲部分。環(huán)氧類型部分可以在任何可連接或取代位置與環(huán)戊烯菲核連接，即與甾核的一個環(huán)稠合，或者該部分可以在環(huán)系統(tǒng)的環(huán)成員處被取代。短語“環(huán)氧甾族”意在包括其上連接一個或多個環(huán)氧類型部分的甾核。
適用于本發(fā)明方法的環(huán)氧甾族醛固酮拮抗劑包括具有與甾核的“C”環(huán)稠合的環(huán)氧部分的化合物家族。特別優(yōu)選20-螺烷化合物，其特征在于存在9″，11″-取代的環(huán)氧部分。下表1中的化合物1-1 1表示可以用于本發(fā)明方法的9″，11″-環(huán)氧甾族化合物。這些環(huán)氧甾族化合物可以通過Grob等人，美國專利4,559,332所述的方法制備。用于制備9，11-環(huán)氧鹵族化合物及其鹽的其它方法公開在Ng等人，WO97/21720和Ng等人，WO98/25948。




特別感興趣的是化合物依匹樂酮(還已知為環(huán)氧美沙樂酮)，它是如上所示的化合物1。依匹樂酮為醛固酮受體拮抗劑，并且例如與螺內(nèi)酯相比對醛固酮具有較高的特異性。在本發(fā)明方法中選擇依匹樂酮作為醛固酮拮抗劑將有利地減少某些副作用，例如使用特異性較小的醛固酮拮抗劑時發(fā)生的男子女性型乳房。
適用于本發(fā)明方法的非環(huán)氧甾族醛固酮拮抗劑包括式III定義的螺甾內(nèi)酯型化合物家族 其中 是 或 其中R是多達(dá)5個碳原子的低級烷基，且其中 是 或 低級烷基殘基包括支鏈和非支鏈基團(tuán)，優(yōu)選甲基、乙基和正丙基。
式III范圍內(nèi)有用的特定化合物為以下化合物7α-乙酰硫基-3-氧代-4，15-雄甾二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；3-氧代-7α-丙酰硫基-4，15-雄甾二烯-[17((β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；6β，7β-亞甲基-3-氧代-4，15-雄甾二烯-[17((β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；
15α，16α-亞甲基-3-氧代-4，7α-丙酰硫基-4-雄甾烯[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；6β，7β，15α，16α-二亞甲基-3-氧代-4-雄甾烯[17(β-1′)-螺-5′]-全氫化呋喃-2′-酮；7α-乙酰硫基-15β，16β-亞甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；15β，16β-亞甲基-3-氧代-7β-丙酰硫基-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；和6β，7β，15β，16β-二亞甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮。
制備式I的化合物的方法如1978年12月12日授權(quán)的Wiechart等人的美國專利4,129,564所述。
感興趣的非環(huán)氧甾族化合物的另一家族由式III定義 其中R1為C1-3-烷基或C1-3?；?，而R2為H或C1-3-烷基。
式II范圍內(nèi)的特定的感興趣的化合物如下1α-乙酰硫基-15β，16β-亞甲基-7α-甲硫基-3-氧代-17α-孕-4-烯-21，17-碳內(nèi)酯(carbolactone)；和15β，16β-亞甲基-1α，7α-二甲硫基-3-氧代-17α-孕-4-烯-21，17-碳內(nèi)酯。
1988年12月6日授權(quán)的Nickisch等人的美國專利4,789,668描述了式III的化合物的制備方法。
感興趣的非環(huán)氧甾族化合物的另一家族由式IV的結(jié)構(gòu)定義
其中R為低級烷基，優(yōu)選的低級烷基為甲基、乙基、丙基和丁基。特定的感興趣的化合物包括3β，21-二羥基-17″-孕-5，15-二烯-17-羧酸(-內(nèi)酯；3β，21-二羥基-17″-孕-5，15-二烯-17-羧酸(-內(nèi)酯3-乙酸酯；3β，21-二羥基-17″-孕-5-烯-17-羧酸(-內(nèi)酯；3β，21-二羥基-17″-孕-5-烯-17-羧酸(-內(nèi)酯3-乙酸酯；21-羥基-3-氧代-17″-孕-4-烯-17-羧酸(-內(nèi)酯；21-羥基-3-氧代-17″-孕-4，6-二烯-17-羧酸(-內(nèi)酯；21-羥基-3-氧代-17″-孕-1，4-二烯-17-羧酸(-內(nèi)酯；7″-酰硫基-21-羥基-3-氧代-17″-孕-4-烯-17-羧酸(內(nèi)酯；和7″-乙酰硫基-21-羥基-3-氧代-17″-孕-4-烯-17-羧酸(-內(nèi)酯。
1966年6月21日授權(quán)的Patchett的美國專利3,257,390描述了式IV的化合物的制備方法。
感興趣的非環(huán)氧甾族化合物的另一家族由式V表示 其中E′選自亞乙基、亞乙烯基和(低級烷酰基)硫代亞乙基，E″選自亞乙基、亞乙烯基、(低級烷酰基)硫代亞乙基和(低級烷?；?硫代亞丙基；R為甲基，除了當(dāng)E′和E″分別為亞乙基和(低級烷?；?硫代亞乙基時，這種情況下的R選自氫和甲基；并如此選擇E′和E″以存在至少一個(低級烷?；?硫代基團(tuán)。
式IV范圍內(nèi)的優(yōu)選的非環(huán)氧甾族化合物由式VI表示 更優(yōu)選的式VI的化合物為1-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羥基-雄甾-4-烯-3-酮內(nèi)酯。
式IV范圍內(nèi)的非環(huán)氧甾族化合物的另一優(yōu)選的家族由式VII表示 式VII范圍內(nèi)的最優(yōu)選的化合物包括以下7″-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羥基-雄甾-4-烯-3-酮內(nèi)酯；7β-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羥基-雄甾-4-烯-3-酮內(nèi)酯；1″，7″-二乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羥基-雄甾-4，6-二烯-3-酮內(nèi)酯；7″-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羥基-雄甾-1，4-二烯-3-酮內(nèi)酯；7″-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羥基-19-去甲雄甾-4-烯-3-酮內(nèi)酯；和7″-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羥基-6″-甲基雄甾-4-烯-3-酮內(nèi)酯；在式IV-VI中，術(shù)語“烷基”意在包括含有一至大約八個碳的直鏈和支鏈烷基。術(shù)語“(低級烷?；?硫”包括下式低級烷基 特別感興趣的是具有以下結(jié)構(gòu)和正式名稱的化合物螺內(nèi)酯 “螺內(nèi)酯”17-羥基-7″-巰基-3-氧代-17″-孕-4-烯-21-羧酸γ-內(nèi)酯乙酸酯。
1961年12月12日授權(quán)的Cella等人的美國專利3,013,012描述了式V-VII的化合物的制備方法。螺內(nèi)酯由G.D.Searle & Co.，Skokie，Illinois銷售，其商標(biāo)為″ALDACTONE″，是每片劑量為25mg、50mg和100mg的片劑劑型。
本發(fā)明所考慮的甾族醛固酮拮抗劑的另一家族的實(shí)例為屈螺酮、[6R-(6α，7α，8β，9α，10β，13β，14α，15α，16α，17β)]-1，3′，4′，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，20，21-十六氫-10，13-二甲基螺[17H-二環(huán)丙[6，715，16]環(huán)戊[a]菲-17，2′(5′H)-呋喃]-3，5′(2H)-二酮，CAS注冊號67392-87-4。在優(yōu)先權(quán)DE 2652761 1976的專利GB 1550568 1979中描述了制備和使用屈螺酮的方法。
定義術(shù)語“治療(treatment)”或“治療(treating)”包括對需要的人施用一定數(shù)量的抑制或逆轉(zhuǎn)病理性心血管病發(fā)展的醛固酮阻滯劑。
術(shù)語“預(yù)防(prevention)”或“預(yù)防(preventing)”包括防止臨床上顯著的心血管病發(fā)生，或者防止個體中心血管病的臨床前期的發(fā)生。此術(shù)語包括對有發(fā)生心血管病的危險性的受試者進(jìn)行預(yù)防性治療。
短語“治療有效量”意在限定將達(dá)到改善疾病嚴(yán)重程度或發(fā)生率的目的，同時避免不良副作用的二種聯(lián)合給藥的藥劑的量。
用于治療目的的術(shù)語“受試者”包括易患或患有炎癥的任何人或動物受試者，優(yōu)選人類受試者。例如，受試者可能由于食物、暴露于細(xì)菌或病毒感染而處于危險，具有常見癥狀，遺傳學(xué)上有心血管病等傾向等。
術(shù)語“醛固酮”意指包括醛固酮和醛固酮酯，例如醛固酮-18-乙酸酯、醛固酮-20-乙酸酯和醛固酮-21-乙酸酯。
術(shù)語“醛固酮阻滯劑”意指能夠減小或抑制醛固酮生理作用的化合物。醛固酮阻滯劑可以是醛固酮抑制劑或醛固酮受體拮抗劑。
本發(fā)明的醛固酮阻滯劑廣義上分成兩類；醛固酮抑制劑和醛固酮受體拮抗劑。
術(shù)語“醛固酮抑制劑”意指直接或間接地減少或終止醛固酮的合成或活性的化合物。
術(shù)語“醛固酮拮抗劑”和“醛固酮受體拮抗劑”意指能夠與醛固酮受體結(jié)合，在受體部位作為醛固酮自身作用的競爭性抑制劑，從而調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的醛固酮活性的化合物。
本發(fā)明的醛固酮抑制劑的實(shí)例包括但不限于芳香化酶抑制劑、例如R-76713、R-83842、CGS-16949A(法倔唑)、CGS-20267(來曲唑)、CGS-20267、氨基苯乙哌啶酮、CGS-47645、ICI-D-1033、色酮和山酮衍生物以及YM-511；12-脂加氧酶抑制劑、例如PDGF、TNF、IL-1、IL-1β、BW755c、菲尼酮、黃芩黃素、氨基胍、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)、桂皮?；?3，4-二羥基-α-氰基肉桂酸酯(CDC)、人參醇、吡格列酮和mRNA裂解核酶；P45011β抑制劑、例如18-乙烯基孕酮和18-乙炔基孕酮、脂肪酸、例如油酸；18-乙烯基去氧腎上腺酮、酮康唑、克霉唑、咪康唑、依托咪酯、螺內(nèi)酯和23-0586；心房促尿鈉排泄因子、例如ANP、ANF和ANF片斷；17，20裂合酶(Lysase)抑制劑、例如YM-55208和YM-53789；前列腺素合成抑制劑、例如吲哚美辛、甲氯芬那酸、氨基苯乙哌啶酮和阿司匹林；PKC抑制劑、例如鞘氨醇、視黃醛、H-7、staurosporine和三氟拉嗪；苯并二氮雜、例如安定和咪達(dá)唑侖；鈣阻滯劑、例如氨氯地平和米貝拉地爾；二酰甘油脂酶抑制劑、例如RHC-80267[1，6-雙-(環(huán)己基肟基羰基氨基)-己烷]；鉀離子載體、例如纈氨霉素和色滿卡林；電子轉(zhuǎn)移阻滯劑(代謝抑制劑)、例如抗霉素A、氰化物、魚藤酮和異戊巴比妥；多巴胺(催乳素抑制激素)、三氯叔丁醇、18-乙炔基-11-去氧腎上腺酮(18-EtDOC)；和乙醇。
某些化合物，例如11β-羥基雄甾-4-烯-3-酮17-螺甾內(nèi)酯，同時用作為醛固酮合酶抑制劑和醛固酮受體拮抗劑。這些化合物也在本發(fā)明考慮范圍之內(nèi)，并落入“醛固酮阻滯劑”的定義。
此外，已知血管緊張素II抑制劑和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑減少醛固酮的合成。血管緊張素II抑制劑包括血管緊張素II類似物，例如Des-asp1-thr8血管緊張素II(L-Ary-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Thr)、Des-asp1-Ile8血管緊張素II(L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Ile)和Des-asp1-ala8血管緊張素II(L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Ala)；和血管緊張素II受體拮抗劑，例如坎地沙坦、依普羅沙坦、厄貝沙坦、氯沙坦、替米沙坦和纈沙坦。
術(shù)語“前炎癥”表征為在體內(nèi)產(chǎn)生的誘導(dǎo)、活化或增強(qiáng)組織或器官炎癥反應(yīng)的分子。
術(shù)語“氫基”意指單一氫原子(H)。此氫基可以例如連接到氧原子上形成羥基或者二個氫基可以連接到一個碳原子上形成亞甲基(-CH2-)基團(tuán)。單獨(dú)或在其它術(shù)語，例如“鹵烷基”，“烷基磺酰基”，“烷氧基烷基”和“羥基烷基”中使用的術(shù)語“烷基”包括具有1至大約20個碳原子，優(yōu)選1至大約12個碳原子的直鏈或支鏈基團(tuán)。更優(yōu)選的烷基為具有1至大約10個碳原子的“低級烷基”。最優(yōu)選具有1至大約6個碳原子的低級烷基。這些基團(tuán)的實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基等。術(shù)語“鏈烯基”包括2至大約20個碳原子，優(yōu)選2至大約12個碳原子的具有至少1個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈基團(tuán)。更優(yōu)選的烷基為具有2至大約6個碳原子的“低級鏈烯基”基團(tuán)。鏈烯基的實(shí)例包括乙烯基、丙烯基、烯丙基、丙烯基、丁烯基和4-甲基丁烯基。術(shù)語“炔基”意指具有2至大約20個碳原子，優(yōu)選2至大約12個碳原子的直鏈或支鏈基團(tuán)。更優(yōu)選炔基為具有2至大約10個碳原子的“低級炔基”。最優(yōu)選具有2至大約6個碳原子的低級炔基。這些基團(tuán)的實(shí)例包括炔丙基、丁炔基等。術(shù)語“鏈烯基”、“低級鏈烯基”包括具有“順”和“反”取向，或者可選擇為“E”和“Z”取向的基團(tuán)。術(shù)語“環(huán)烷基”包括具有3-12個碳原子的飽和環(huán)烷基。更優(yōu)選的環(huán)烷基為具有3至大約8個碳原子的“低級環(huán)烷基”基團(tuán)。這些基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。術(shù)語“環(huán)烯基”包括具有3-12個碳原子的部分飽和碳環(huán)基團(tuán)。更優(yōu)選的環(huán)烯基為具有4至大約8個碳原子的“低級環(huán)鏈烯基”基團(tuán)。這些基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)戊二烯基和環(huán)己烯基。術(shù)語“鹵”意指鹵素，例如氟、氯、溴或碘。術(shù)語“鹵代烷基”包括這樣的基團(tuán)其中任何一個或多個烷基碳原子被以上定義的鹵素取代。具體包括一鹵代烷基、二鹵代烷基和多鹵代烷基。例如，一鹵代烷基在其基團(tuán)內(nèi)可以有一個碘、溴、氯或氟原子。二鹵代和多鹵代烷基可以具有2個或多個相同的鹵原子或不同鹵代基團(tuán)的組合。“低級鹵代烷基”包括具有1-6個碳原子的基團(tuán)。鹵代烷基的實(shí)例包括氟甲基、二氯甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、六氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。術(shù)語“羥基烷基”包括具有1至大約10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其中任何一個碳原子可以被一個或多個羥基取代。更優(yōu)選的羥基烷基為具有1-6個碳原子和1或多個羥基的“低級羥基烷基”。這種基團(tuán)的實(shí)例包括羥基甲基、羥基乙基、羥基丙基、羥基丁基和羥基己基。術(shù)語“烷氧基(alkoxy)”和“烷氧基(alkyloxy)”包括各自具有1至大約10個碳原子的烷基部分的直鏈或支鏈含氧基團(tuán)。更優(yōu)選的烷氧基為具有1-6個碳原子的“低級烷氧基”基團(tuán)。這種基團(tuán)的實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。術(shù)語“烷氧基烷基”包括具有一個或多個與烷基連接的烷氧基的烷基，即形成一烷氧基烷基和二烷氧基烷基的。“烷氧基”基團(tuán)可以進(jìn)一步被一個或多個鹵原子，例如氟、氯或溴取代，以提供鹵代烷氧基。更優(yōu)選的鹵代烷氧基為具有1-6個碳原子和一或多個鹵代基團(tuán)的“低級鹵代烷氧基”。這種基團(tuán)的實(shí)例包括氟甲氧基、氯甲氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、氟乙氧基和氟丙氧基。術(shù)語“芳基”單獨(dú)或組合地意指包含一、二或三個環(huán)的碳環(huán)芳香系統(tǒng)，其中這種環(huán)可以下垂物的方式連接在一起或者可以稠合。術(shù)語“芳基”包括芳香基團(tuán)，例如苯基、萘基、四氫萘基、二氫化茚和聯(lián)苯。芳基部分還可以在可取代的位置被一個或多個獨(dú)立地選自以下的取代基取代烷基、烷氧基烷基、烷基氨基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、烷氧基、芳烷氧基、羥基、氨基、鹵素、硝基、烷基氨基、?；?、氰基、羧基、氨基羰基、烷氧基羰基和芳烷氧基羰基。術(shù)語“雜環(huán)基”包括飽和、部分不飽和和不飽和的含雜原子環(huán)形狀的基團(tuán)，其中雜原子可以選自氮、硫和氧。飽和雜環(huán)基的實(shí)例包括含有1-4個氮原子的飽和3至6元雜單環(huán)基團(tuán)(例如吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶子基、哌嗪基等)；含有1-2個氧原子和1-3個氮原子的飽和3至6元雜單環(huán)基(例如嗎啉基等)；含有1-2個硫原子和1-3個氮原子的飽和3至6元雜單環(huán)基(例如噻唑烷基等)。部分不飽和雜環(huán)基的實(shí)例包括二氫噻吩基、二氫吡喃、二氫呋喃和二氫噻唑。術(shù)語“雜芳基”包括不飽和雜環(huán)基。還稱為“雜芳基”基團(tuán)的不飽和雜環(huán)基的實(shí)例包括含有1-4個氮原子的不飽和3至6元雜單環(huán)基，例如吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三唑基(例如4H-1，2，4-三唑基、1H-1，2，3-三唑基、2H-1，2，3-三唑基等)、四唑基(例如1H-四唑基、2H-四唑基等)等；含有1-5個氮原子的不飽和稠合雜環(huán)基，例如吲哚基、異吲哚基、吲嗪基、苯并咪唑基、喹啉基、異喹啉基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并噠嗪基(例如四唑并[1，5-b]噠嗪基等)等；含有氧原子的不飽和3至6元雜單環(huán)基，例如吡喃基、呋喃基等；含有硫原子的不飽和3至6元雜單環(huán)基，例如噻吩基等；含有1-2個氧原子和1-3個氮原子的不飽和3至6元雜單環(huán)基，例如噁唑基、異噁唑基、噁二唑基(例如1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基等)等；含有1-2個氧原子和1-3個氮原子的不飽和稠合雜環(huán)基(例如苯并噁唑基、苯并噁二唑基等)；含有1-2個硫原子和1-3個氮原子的不飽和3至6元雜單環(huán)基，例如噻唑基、噻二唑基(例如1，2，4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基等)等；含有1-2個硫原子和1-3個氮原子的不飽和稠合雜環(huán)基(例如苯并噻唑基、苯并噻二唑基等)等。術(shù)語還包括雜環(huán)基與芳基稠合的基團(tuán)。這種稠合的二環(huán)基團(tuán)的實(shí)例包括苯并呋喃、苯并噻吩基等。該“雜環(huán)基”可以具有1-3個取代基，例如烷基、羥基、鹵素、烷氧基、氧代、氨基和烷基氨基。術(shù)語“烷硫基”包括含有1至大約10個與二價硫原子連接的碳原子的直鏈或支鏈烷基。更優(yōu)選的烷硫基是具有1-6個碳原子的烷基的“低級烷硫基”基團(tuán)。這種低級烷硫基基團(tuán)的實(shí)例是甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基和己硫基。術(shù)語“烷硫基烷基”包括含有通過二價硫原子與1至大約10個碳原子的烷基連接的烷硫基的基團(tuán)。更優(yōu)選的烷硫基烷基是具有1-6個碳原子的烷基的“低級烷硫基烷基”基團(tuán)。這種低級烷硫基烷基的實(shí)例包括甲硫基甲基。術(shù)語“烷基亞硫?；卑ê信c二價-S(＝O)-基團(tuán)連接的1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基的基團(tuán)。更優(yōu)選的烷基亞硫?；鶊F(tuán)是具有1-6個碳原子的烷基的“低級烷基亞硫?；被鶊F(tuán)。這種低級烷基亞硫?；膶?shí)例包括甲基亞硫?；?、乙基亞硫?；⒍』鶃喠蝓；图夯鶃喠蝓；为?dú)或與其它術(shù)語，例如烷基磺?；?lián)合使用的術(shù)語“磺酰基”分別意指二價基團(tuán)-SO2-。“烷基磺?；卑ㄅc磺?；B接的烷基，其中烷基如以上定義。更優(yōu)選的烷基磺?；蔷哂?-6個碳原子的“低級烷基磺酰基”基團(tuán)。這種低級烷基磺?；膶?shí)例包括甲基磺?；?、乙基磺?；捅酋；?。“烷基磺?；被鶊F(tuán)還可以被一或多個鹵素原子，例如氟、氯或溴取代，以得到鹵代烷基磺?；Ｐg(shù)語“氨磺?；?、“氨基磺?；焙汀盎前坊币庵窷H2O2S-。術(shù)語“?；币庵冈趶挠袡C(jī)酸中除羥基后的殘基提供的基團(tuán)。這種酰基的實(shí)例包括烷?；头减；?。這種低級烷酰基的實(shí)例包括甲?；?、乙酰基、丙?；?、丁?；?、異丁?；?、戊?；?、異戊?；?、新戊?；?、己?；?、三氟乙?；Ｐg(shù)語“羰基”，不管是單獨(dú)還是與其它術(shù)語，例如與“烷氧基羰基”一起使用，意指-(C＝O)-。術(shù)語“芳?；卑ň哂幸陨隙x的羰基的芳基。芳酰基的實(shí)例包括苯甲?；?、萘甲酰基等，且該芳?；械姆蓟梢愿郊拥乇蝗〈Ｐg(shù)語“羧基(carboxy)”或“羧基(carboxyl)”，不管單獨(dú)或與其它術(shù)語如“羧基烷基”一起使用，意指-CO2H。術(shù)語“羧基烷基”包括被羧基取代的烷基。更優(yōu)選包括以上定義的低級烷基的“低級羧基烷基”，并可以附加地在烷基上被鹵素取代。這種低級羧基烷基的實(shí)例包括羧基甲基、羧基乙基和羧基丙基。術(shù)語“烷氧基羰基”意指包含以上定義的烷氧基，通過氧原子與羰基連接的基團(tuán)。更優(yōu)選具有1-6個碳的烷基部分的“低級烷氧基羰基”基團(tuán)。這種低級烷氧基羰基(酯)基團(tuán)的實(shí)例包括取代或未取代的甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基和己氧基羰基。術(shù)語“烷基羰基”、“芳基羰基”和“芳烷基羰基”包括具有與羰基連接的以上定義的烷基、芳基和芳烷基的基團(tuán)。這種基團(tuán)的實(shí)例包括取代或未取代的甲基羰基、乙基羰基、苯基羰基和芐基羰基。術(shù)語“芳烷基”包括芳基取代的烷基，例如芐基、聯(lián)苯甲基、三苯基甲基、苯基乙基和聯(lián)苯乙基。該芳烷基中的芳基可以附加地被鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基和鹵代烷氧基取代。術(shù)語芐基和苯基甲基是可以互換的。術(shù)語“雜環(huán)基烷基”包括飽和和部分不飽和的雜環(huán)基-取代的烷基，例如吡咯烷基甲基和雜芳基取代的烷基，例如吡啶基甲基、喹啉基甲基、噻吩基甲基、呋喃基乙基和喹啉基乙基。該雜芳烷基上的雜芳基可以附加地被鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基和鹵代烷氧基取代。術(shù)語“芳烷氧基”包括通過氧原子與其它基團(tuán)連接的芳烷基。術(shù)語“芳烷氧基烷基”包括通過氧原子與烷基連接的芳烷氧基。術(shù)語“芳烷硫基”包括與硫原子連接的芳烷基。術(shù)語“芳烷硫基烷基”包括通過硫原子與烷基連接的芳烷硫基。術(shù)語“氨基烷基”包括被一個或多個氨基取代的烷基。更優(yōu)選“低級氨基烷基”基團(tuán)。這種基團(tuán)的實(shí)例包括氨基甲基、氨基乙基等。術(shù)語“烷基氨基”意指已被一個或多個烷基取代的氨基。優(yōu)選具有含1-6個碳原子的烷基部分的“低級N-烷基氨基”。適宜的低級烷基氨基可以是一或二烷基氨基，例如N-甲基氨基、N-乙基氨基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基等。“芳基氨基”意指已被一個或二個芳基取代的氨基，例如N-苯基氨基。“芳基氨基”基團(tuán)還可以在此基團(tuán)的芳環(huán)位置被取代。術(shù)語“芳烷基氨基”包括通過氨基氮原子與其它基團(tuán)連接的芳烷基。術(shù)語“N-芳基氨基烷基”和“N-芳基-N-烷基-氨基烷基”意指已分別被一個芳基或一個芳基和一個烷基取代的氨基，并具有與烷基連接的氨基。這種基團(tuán)的實(shí)例包括N-苯基氨基甲基和N-苯基-N-甲基氨基甲基。術(shù)語“氨基羰基”意指式-C(＝O)NH2的酰胺基團(tuán)。術(shù)語“烷基氨基羰基”意指在氨基氮原子上被一個或二個烷基取代的氨基羰基。優(yōu)選“N-烷基氨基羰基”、“N，N-二烷基氨基羰基”基團(tuán)。更優(yōu)選“低級N-烷基氨基羰基”、“低級N，N-二烷基氨基羰基”基團(tuán)，其低級烷基部分如以上定義。術(shù)語“烷基氨基烷基”意指具有一個或多個與氨基烷基連接的烷基的基團(tuán)。術(shù)語“芳氧基烷基”意指具有通過二價氧原子與烷基連接的芳基的基團(tuán)。術(shù)語“芳基硫代烷基”包括具有通過二價硫原子與烷基連接的芳基的基團(tuán)。
用于本發(fā)明方法的化合物可以游離堿或其可藥用酸加成鹽的形式存在。術(shù)語“可藥用鹽”包括常用于形成堿金屬鹽和形成游離酸或游離堿的加成鹽的鹽。它只要可藥用，鹽的性質(zhì)不關(guān)鍵。式I的化合物的適宜的可藥用酸加成鹽可以由無機(jī)酸或有機(jī)酸制備。這些無機(jī)酸的實(shí)例是鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、碳酸、硝酸、硫酸和磷酸。適宜的有機(jī)酸可以選自脂肪酸、環(huán)脂肪酸、芳香酸、芳香脂肪酸、雜環(huán)酸、羧酸和磺酸類有機(jī)酸，其實(shí)例是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、葡糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、葡糖醛酸、馬來酸、富馬酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、鄰氨基苯甲酸、甲磺酸、4-羥基苯甲酸、苯基乙酸、扁桃酸、雙羥萘酸(pamoic)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、2-羥基乙磺酸、甲苯磺酸、磺胺酸、環(huán)己基氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸、β-羥基丁酸、水楊酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。適宜的可藥用堿加成鹽包括由鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制備的金屬鹽和由N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普魯卡因制備的有機(jī)鹽。所有這些鹽可以采用常規(guī)方法，由對應(yīng)的化合物，通過例如使適宜的酸或堿與化合物反應(yīng)而制備。
本發(fā)明包括用于預(yù)防心血管病的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的醛固酮阻滯劑與至少一種可藥用載體、助劑或稀釋劑(本文總稱為“載體”材料)和可能需要的其它活性成分的組合。本發(fā)明的活性化合物可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適宜的途徑給藥，優(yōu)選以適于這種途徑的藥物組合物的形式和有效進(jìn)行目標(biāo)治療的劑量給藥。例如，活性化合物和組合物可以口服、血管內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、支氣管內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或局部(包括氣霧劑)給藥。
醛固酮阻滯劑的給藥可以通過口服途徑或通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射完成。制劑可以是大丸藥的形式，或者水或非水等滲無菌注射液或懸浮液的形式。這些溶液和懸浮液可以由具有一種或多種可藥用載體或稀釋劑或例如明膠或羥基丙基-甲基纖維素的粘合劑，和一種或多種潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑的無菌粉末或顆粒制備。
對于口服給藥，例如藥物組合物可以是片劑、膠囊、懸浮液或液體的形式。藥物組合物優(yōu)選為包含特定量活性成分的劑量單元的形式。這種劑量單元的實(shí)例為片劑或膠囊。這些劑型可以有利地包含數(shù)量為大約0.5至250mg，優(yōu)選大約25至150mg的每種活性成分。哺乳動物的適宜的劑量可以依賴于患者的癥狀和其它因素而有寬泛的變化。但是，大約0.01-30mg/kg體重，特別是大約1-15mg/kg體重的劑量可能是適宜的。
活性成分還可以通過注射組合物來給藥，其中例如可以將鹽水、右旋糖或水用作適宜的載體。每種活性組分的適宜的日劑量為大約0.01-15mg/kg體重，根據(jù)治療的疾病而每天注射多次劑量。優(yōu)選的日劑量為大約1-10mg/k體重。指定用于預(yù)防治療的化合物優(yōu)選的日給藥劑量范圍一般為大約0.1mg至大約15mg/千克體重/天。更優(yōu)選的劑量范圍為大約1mg至大約15mg/千克體重。最優(yōu)選劑量范圍為大約1至大約10mg/千克體重/天。適宜的劑量可以是每天進(jìn)行多個亞劑量給藥。這些亞劑量可以單元劑型給藥。通常，劑量或亞劑量可以包含大約1mg至大約100mg活性化合物/單元劑型。更優(yōu)選的劑量包含大約2mg至大約50mg活性化合物/單元劑型。最優(yōu)選包含大約3mg至大約25mg活性化合物/單元劑量的劑型。
在一個優(yōu)選的聯(lián)合治療中，醛固酮受體拮抗劑存在的數(shù)量范圍可以為大約10mg至大約200mg。
用本發(fā)明的方法治療病癥的劑量方案根據(jù)多個因素選擇，所述因素包括患者的類型、年齡、體重、性別和健康狀況，疾病的嚴(yán)重程度，給藥途徑和所用的特定化合物，并因此可以寬泛地變化。
對于治療目的，本方法的活性組分一般與一種或多種適于指定給藥途徑的助劑組合。如果經(jīng)口給藥，則可以將組分與乳糖、蔗糖、淀粉、鏈烷酸的纖維素酯、纖維素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉和鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/聚乙烯醇混合，然后制片或制膠囊用于常規(guī)給藥。這些膠囊或片劑可以包含控釋制劑，如以羥基丙基甲基纖維素中活性化合物的分散體提供。用于腸胃外給藥的制劑可以是水或非水等滲無菌注射溶液或懸浮液的形式。這些溶液和懸浮液可以由具有一種或多種所述的用于口服給藥制劑的載體或稀釋劑的無菌粉末或顆粒制備。組分可以溶于水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉花籽油、花生油、芝麻油、芐醇、氯化鈉和/或多種緩沖劑。其它助劑和給藥方式在藥學(xué)技術(shù)中非常廣泛熟知。
環(huán)氧甾族醛固酮拮抗劑固態(tài)形式本發(fā)明的方法包括施用治療有效量的依匹樂酮，其為任何固態(tài)形式，其自身作為一種或多種固態(tài)形式或包含一種或多種固態(tài)形式依匹樂酮的藥物組合物的形式。這些新的固態(tài)形式包括但不限于溶劑化結(jié)晶依匹樂酮、非溶劑化結(jié)晶依匹樂酮和無定形依匹樂酮。
在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法給藥的依匹樂酮為具有下表1A所述X射線粉末衍射圖的依匹樂酮的非溶劑化晶形(本文稱為“高熔點(diǎn)多晶型物”或“晶形H”)。依匹樂酮晶形H公開在國際公開文本W(wǎng)O01/42272中，本文引用其內(nèi)容作為參考。
在另一個實(shí)施方案中，依匹樂酮以藥物組合物的形式給藥，其中組合物中所含的全部數(shù)量的依匹樂酮以相純的晶形H存在。
在另一個實(shí)施方案中，依匹樂酮以藥物組合物的形式給藥，其中組合物中所含的全部數(shù)量的依匹樂酮以相純的晶形L存在。晶形L依匹樂酮公開在國際公開文本W(wǎng)O 01/41535，本文引用其內(nèi)容作為參考。
在另一個實(shí)施方案中，依匹樂酮以藥物組合物的形式給藥，其中組合物中所含的全部數(shù)量的依匹樂酮以相純的溶劑化結(jié)晶依匹樂酮存在。
在另一個實(shí)施方案中，依匹樂酮以藥物組合物的形式給藥，其中組合物中所含的全部數(shù)量的依匹樂酮以無定形依匹樂酮存在。
在另一個實(shí)施方案中，依匹樂酮以藥物組合物的形式給藥，其中該組合物包含依匹樂酮的第一固態(tài)形式和依匹樂酮的第二固態(tài)形式，且依匹樂酮的第一和第二固態(tài)形式選自晶形H、晶形L、溶劑化依匹樂酮和無定形依匹樂酮。一般地，該第一固態(tài)形式與該第二固態(tài)形式的重量比優(yōu)選為至少大約1∶9，優(yōu)選大約1∶1，更優(yōu)選至少大約2∶1，更優(yōu)選至少大約5∶1，甚至更優(yōu)選至少大約9∶1。依匹樂酮制劑也公開在國際公開文本W(wǎng)O 00/33847和WO 01/41770中，本文引用其內(nèi)容作為參考。
在另一個實(shí)施方案中，依匹樂酮以藥物組合物的形式給藥，其中組合物包含晶形H和晶形L。組合物中晶形L與晶形H的數(shù)量比通常為大約1∶20至大約20∶1。在另一個實(shí)施方案中，例如該比率為大約10∶1至大約1∶10；大約5∶1至大約1∶5；大約2∶1至大約1∶2；或大約1∶1。
雖然以上每個實(shí)施方案可以包括寬泛的依匹樂酮粒徑范圍的依匹樂酮固態(tài)形式的給藥，已發(fā)現(xiàn)依匹樂酮的固態(tài)形式的選擇和依匹樂酮粒徑的減小的結(jié)合可以改善未配制的依匹樂酮和包含該依匹樂酮固態(tài)形式的藥物組合物的生物利用度。
在一個實(shí)施方案中，未配制的依匹樂酮或用作藥物組合物中的原料的依匹樂酮的D90粒徑通常小于約400微米，優(yōu)選小于約200微米，更優(yōu)選小于約150微米，甚至更優(yōu)選小于約100微米，甚至更優(yōu)選小于約90微米。在另一個實(shí)施方案中，D90粒徑為約40微米至約100微米。在另一個實(shí)施方案中，D90粒徑為約30微米至約50微米。在另一個實(shí)施方案中，D90粒徑為大約50微米至大約150微米。在另一個實(shí)施方案中，D90粒徑為大約75微米至大約125微米。
在另一個這樣的實(shí)施方案中，未配制的依匹樂酮或用作藥物組合物中的原料的依匹樂酮的D90粒徑通常小于大約15微米，優(yōu)選小于大約1微米，更優(yōu)選小于大約800nm，甚至更優(yōu)選小于大約600nm，甚至更優(yōu)選小于大約400nm。在另一個實(shí)施方案中，D90粒徑為大約10nm至大約1微米。在另一個實(shí)施方案中，D90粒徑為大約100nm至大約800nm。在另一個實(shí)施方案中，D90粒徑為大約200nm至大約600nm。在另一個實(shí)施方案中，D90粒徑為大約400nm至大約800nm。
粒徑小于大約15微米的依匹樂酮的固態(tài)形式可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的可應(yīng)用的粒徑減小技術(shù)制備。這些技術(shù)包括但不限于美國專利5,145,684、5,318,767、5,384,124和5,747,001所述的技術(shù)。美國專利5,145,684、5,318,767、5,384,124和5,747,001如同其被詳細(xì)地被完整描述一樣被引用作為參考。根據(jù)美國專利5,145,684的方法，例如適宜大小的顆粒通過將依匹樂酮分散在液體分散介質(zhì)并在研磨介質(zhì)存在下濕研磨混合物產(chǎn)生目標(biāo)大小的顆粒而制備。如果需要或有利的話，可以在表面改性劑存在下減小顆粒的大小。
適用于依匹樂酮的術(shù)語“無定形”指依匹樂酮分子無序排列存在且不形成顯著的晶格或晶胞的固態(tài)。當(dāng)接受X射線粉末衍射時，無定形依匹樂酮不產(chǎn)生任何特征性結(jié)晶峰。
如果在本申請中提及物質(zhì)或溶液的“沸點(diǎn)”，則術(shù)語“沸點(diǎn)”意指在可應(yīng)用的工藝條件下的物質(zhì)或溶液的沸點(diǎn)。
應(yīng)用于依匹樂酮的術(shù)語“結(jié)晶形”指依匹樂酮分子排列形成明顯的晶格(i)包含明顯的晶胞，和(ii)在接受X射線照射時產(chǎn)生衍射峰的固態(tài)形式。
本申請全文中所用的術(shù)語“結(jié)晶”可以指根據(jù)與依匹樂酮原料的制備有關(guān)的應(yīng)用環(huán)境而進(jìn)行的結(jié)晶和/或重結(jié)晶。
術(shù)語“蒸煮”意指這樣一個過程其中將在溶劑或溶劑混合物中的固體依匹樂酮的漿于溶劑或溶劑混合物的沸點(diǎn)和可應(yīng)用的工藝條件下加熱。
本文所用的術(shù)語“直接結(jié)晶”指不經(jīng)中間產(chǎn)物依匹樂酮的溶劑化結(jié)晶固態(tài)形式形成或去溶劑化而直接用適宜的溶劑結(jié)晶依匹樂酮。
本文所用的術(shù)語“粒徑”指通過本技術(shù)中已知的常規(guī)粒徑測定技術(shù)，例如激光散射法、沉降區(qū)流動分級、光子相聯(lián)分光術(shù)或圓盤離心法測定的粒徑。術(shù)語“D90粒徑”意指通過這種常規(guī)粒徑測定技術(shù)測定的至少90％顆粒的粒徑。
術(shù)語“純度”意指根據(jù)常規(guī)HPLC分析得到的依匹樂酮的化學(xué)純度。本文所用的“低純度依匹樂酮”通常意指包含有效量的晶形H生長促進(jìn)劑和/或晶形L生長抑制劑的依匹樂酮。本文所用的“高純度依匹樂酮”通常意指不含或含有小于有效量的晶形H生長促進(jìn)劑和/或晶形L生長抑制劑的依匹樂酮。
術(shù)語“相純度”意指如本文所述的紅外光譜分析法測得的關(guān)于依匹樂酮的特定的結(jié)晶或無定形形式的依匹樂酮固態(tài)純度。
術(shù)語“XPRD”意指X射線粉末衍射。
術(shù)語“Tm”意指熔化溫度。
固態(tài)形式的特征1.分子構(gòu)象單晶X射線分析表明在晶形H和晶形L之間依匹樂酮的分子構(gòu)象不同，特別是甾環(huán)7-位的酯基的取向不同。該酯基的取向可以通過C8-C7-C23-02扭轉(zhuǎn)角定義。
在晶形H的晶格中，依匹樂酮分子采用的構(gòu)象中在7-位上酯的甲氧基與C-H鍵大約成直線，而羰基大約位于B-甾環(huán)的中心。在該構(gòu)象中C8-C7-C23-02扭轉(zhuǎn)角大約是-73.0°。在該取向中，酯基的羰基氧原子(01)與9，11一環(huán)氧環(huán)的氧原于(04)緊密接觸。01-04的距離約為2.97埃，其恰低于范德華接觸距離3.0埃(假設(shè)氧原子的范德華半徑是1.5埃)。
在晶形L的晶格中，依匹樂酮分子采用的構(gòu)象中相對于晶形H來說該酯基大約旋轉(zhuǎn)了150°，且C8-C7-C23-02扭轉(zhuǎn)角為約±76.9°。在該取向中，該酯的甲氧基直接與A-甾環(huán)的4，5-烴部分相對。在此取向中，與晶形H確定的距離相比，該酯基的任一氧原子(01，02)和9，11-環(huán)氧環(huán)的氧原子(04)之間的距離都加大了。02-04距離約為3.04埃，恰高于范德華接觸距離。01-04距離約為3.45埃。
在通過單晶X射線衍射分析的溶劑化晶形中，依匹樂酮分子似乎采用晶形L特征的構(gòu)象。
2.X-射線粉末衍射用Siemens D5000粉末衍射計(jì)或Inel Multipurpose衍射計(jì)分析依匹樂酮的各種晶形。對于Siemens D5000粉末衍射計(jì)，對于2q值，從2-50測定原始數(shù)據(jù)，其間距為0.020而間距期為2秒。對于InelMultipurpose衍射計(jì)，將樣品置于鋁制樣品夾持器，并在所有2θ值同時收集30分鐘的原始數(shù)據(jù)。
表IA、IB和IC根據(jù)2q值和強(qiáng)度分別給出了依匹樂酮晶形的晶形H(通過將蒸煮低純度依匹樂酮獲得的乙醇合物去溶劑化而制得的)、晶形L(通過將重結(jié)晶高純度依匹樂酮獲得的甲基乙基酮溶劑化物去溶劑化而制得的)和甲基乙基酮溶劑化物(通過在甲基乙基酮中室溫漿液轉(zhuǎn)化高純度依匹樂酮而制得的)的主要峰的重要參數(shù)(X-射線輻射，波長為1.54056埃)。
在晶形H和晶形L的衍射圖中可能出現(xiàn)峰位置的較小的位移，這是晶形H和晶形L的制備途徑(即溶劑化物的去溶劑化)結(jié)晶衍射面間距不完美所至造成的。此外，品形H是從通過蒸煮粗品依匹樂酮制備的溶劑化物中分離的。該方法導(dǎo)致晶形H的整體化學(xué)純度較低(約90％)。最后，預(yù)計(jì)由于在晶格的溶劑通道內(nèi)溶劑分子的流動性增加，依匹樂酮溶劑化形式的衍射峰位置出現(xiàn)了一些位移。
表1A晶形H數(shù)據(jù)
表1B晶形L數(shù)據(jù)
表1C甲基乙基酮數(shù)據(jù)
依匹樂酮的晶形H、晶形L和甲基乙基酮溶劑化物晶形的X-射線衍射圖的實(shí)例圖分別見圖1-A、1-B和1-C。晶形H在7.0±0.2、8.3±0.2和12.0±0.2°2θ顯示出了區(qū)別峰。晶形L在8.0±0.2、12.4±0.2、12.8±0.2和13.3±0.2°2θ顯示出了區(qū)別峰。甲基乙基酮溶劑化物的晶形在7.6±0.2、7.8±0.2和13.6±0.2°2θ顯示出了區(qū)別峰。
3.熔化/分解溫度用TA Instruments 2920差示掃描量熱計(jì)測定非溶劑化的依匹樂酮晶形的熔化和/或分解溫度。將各樣品(1-2mg)置于密封或非密封的鋁盤中并以約10℃/分鐘的升溫速度加熱。熔化/分解范因是從熔化/分解吸熱線外推的開始至最大值而定義的。
依匹樂酮晶形H和晶形L的熔化與化學(xué)分解和晶格中所捕獲溶劑的損失有關(guān)。熔化/分解溫度也受分析前固體處理的影響。例如，通過從適當(dāng)溶劑中直接結(jié)晶或者將在適當(dāng)溶劑或溶劑的混合物中結(jié)晶高純度依匹樂酮獲得的溶劑化物去溶劑化制得的非研磨晶形L(D90粒徑為約180-450μm)的一般熔化/分解范圍為約237℃-242℃。研磨的晶形L(D90粒徑約為80-100μm)(通過從高純度依匹樂酮在適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉軇┗旌衔镏械娜芤褐薪Y(jié)晶溶劑化物，將此溶劑化物去溶劑化，并研磨所得晶形L而制得的)一般具有較低和較寬的熔化/分解溫度范圍，為約223C-234℃。通過將蒸煮低純度依匹樂酮獲得的溶劑化物去溶劑化制得的非研磨的晶形H(D90粒徑為約180-450μm)一般具有較高的熔化/分解范圍，為約247℃-251℃。(a)直接從甲基乙基酮中結(jié)晶制備的非研磨的晶形L，(b)通過將從甲基乙基酮中結(jié)晶高純度依匹樂酮獲得的溶劑化物去溶劑化而制備的非研磨的晶形L，(c)通過研磨從甲基乙基酮中結(jié)晶高純度依匹樂酮所得溶劑化物去溶劑化狀態(tài)而制備的晶形L，和(d)通過將從甲基乙基酮中蒸煮低純度依匹樂酮獲得的溶劑化物去溶劑化制備的非研磨的晶形H的DSC差示熱分析圖的實(shí)例，分別如圖2-A、2-B、2-C和2-D所示。
用Perkin Elmer Pyrisl差示掃描量熱計(jì)測定依匹樂酮的溶劑化形式的DSC差示熱分析囹。將各樣品(1-10mg)置于非密封的鋁盤中并以10℃/分鐘的升溫速度加熱。當(dāng)從溶劑化物晶格中有溶劑損失時，在較低溫度下的一個或多個吸熱過程伴有焓的變化。最高溫度吸熱線(一個或多個)與依匹樂酮晶形L或晶形H的熔化/分解有關(guān)。圖2-E顯示了依匹樂酮的甲基乙烯酮溶劑化晶形的DSC差示熱分析圖的實(shí)例4.紅外吸收光譜用Nicolet DRIFT(漫反射紅外博里葉變換)Magna系550光譜儀獲得非溶劑化依匹樂酮晶形H和晶形L的紅外吸收光譜。使用Spectra-Tech收集器系統(tǒng)和微樣品杯。在溴化鉀中分析樣品(5％)并從400到4000cm-1掃描。用Bio-rad FTS-45光譜儀獲得依匹樂酮在稀氯仿溶液(3％)或在溶劑化晶形中的紅外吸收光譜。用0.2mm路徑長度帶氯化鈉鹽板的溶液池分析氯仿溶液樣品。用IBM微-MIR(多功能內(nèi)部反射度)輔助設(shè)備收集溶劑化物FTIR光譜。從400到4000cm-1掃描樣品。(a)晶形H、(b)晶形L、(c)甲基乙基酮溶劑化物和(d)在氯仿溶液中的依匹樂酮的紅外吸收光譜的實(shí)例分別如圖3-A、3-B、3-C和3-D所示。
表2公開了晶形H、晶形L和甲基乙基酮溶劑化物晶形的依匹樂酮的示例性吸收帶。還公開了氯仿溶液中的依匹樂酮的示例性吸收帶以作為對比。觀察到了晶形H與晶形L或甲基乙基酮溶劑化物之間的差別，例如，在光譜的羰基區(qū)觀察到了差別。晶形H的酯羰基伸展區(qū)在約1739cm-1，而晶形L和甲基乙基酮溶劑化物分別在約1724和1722cm-1有相應(yīng)的伸展。在氯仿溶液中的依匹樂酮在約1727cm-1產(chǎn)生酯羰基的伸展。晶形H和晶形L之間酯羰基的伸展頻率的變化反映了這兩種晶形之間的酯基取向的變化。此外，在A甾環(huán)中共軛酮的酯的伸展從晶形H或甲基乙基酮溶劑化物的約1664-1667cm-1位移至晶形L的約1655cm-1。在稀溶液中相應(yīng)的羰基伸展發(fā)生在約1665cm-1。
晶形H和晶形L之間的另一個差別見于C-H彎曲區(qū)。晶形H在約1399cm-1有吸收，這在晶形L、甲基乙基酮溶劑化物或在氯仿溶液中的依匹樂酮中沒有觀察到。此1399cm-1伸展發(fā)生在鄰近羰基的C2和C21亞甲基的CH2剪切區(qū)。
表2
5.核磁共振在31.94區(qū)獲得13CNMR光譜。依匹樂酮晶形H和晶形L的13CNMR光譜的實(shí)例分別如圖4和5所示。通過分析依匹樂酮晶形H以獲得在圖4中反映的數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)依匹樂酮晶形H不是相純的并含有小量的依匹樂酮晶形L。晶形H通過在64.8ppm、24.7ppm和19.2ppm周圍的碳共振使其最清楚地區(qū)別于其它形式。晶形L通過在67.1ppm和16.0ppm周圍的碳共振使其最清楚地區(qū)別于其它形式。
6.熱重量分析法用TA Instruments TGA 2950熱重量分析儀進(jìn)行熱重量分析。在氮沖洗下，將樣品置于未封閉的鋁盤中起始溫度為25℃，溫度以約10℃/分鐘的速度升溫。圖6-A顯示了甲基乙基酮溶劑化物的熱重量分析法分析圖的實(shí)例7.晶胞參數(shù)下表3A、3B和3C總結(jié)了測定的晶形H，晶形L和幾種溶劑化晶形的晶胞參數(shù)。
表3A
表3B
1由于通道中溶劑分子的紊亂，溶劑化物分子沒有徹底精制。
表3C
1由于通道中溶劑分子的紊亂，溶劑化物分子沒有徹底精制。
對所選依匹樂酮溶劑化晶形的其它信息在下表4中報(bào)告。上表3A中報(bào)告的甲基乙基酮的晶胞數(shù)據(jù)也代表了很多其它依匹樂酮結(jié)晶溶劑化物的晶胞參數(shù)。被測的大多數(shù)依匹樂酮結(jié)晶溶劑化物基本上彼此同構(gòu)。雖然由于摻入溶劑分子的大小不同，一種溶劑化晶形與另一種在X-射線粉末衍射峰中存在一些很小的位移，但是整個衍射圖基本上相同，而晶胞參數(shù)和分子位置對于大多數(shù)所測試的溶劑化物來說基本上一致。
表4溶劑
1定義為從最終溶劑重量損失步驟外推的去溶劑化溫度，這是通過熱重量分析以10℃/分鐘的加熱速度在氮?dú)鉀_洗下測定的。但是去溶劑化溫度可能受溶劑化物制備方法的影響。不同的方法可能產(chǎn)生不同數(shù)量的成核作用位點(diǎn)，該位點(diǎn)能在較低溫度引起溶劑化物的去溶劑化。
溶劑化物的晶胞由4個依匹樂酮分子組成。對于多種溶劑化物，依匹樂酮分子和溶劑分子在此晶胞中的化學(xué)計(jì)量也報(bào)告于上表4。晶形H晶胞由4個依匹樂酮分子組成。晶形L晶胞由兩個依匹樂酮分子組成。當(dāng)依匹樂酮分子晶形遷移并旋轉(zhuǎn)以填補(bǔ)溶劑分子留下的空間時，溶劑化物晶胞在去溶劑化過程中轉(zhuǎn)變?yōu)榫蜨和/或晶形L晶胞。表4也報(bào)告了很多不同溶劑化物的去溶劑化溫度。
8.雜質(zhì)分子的結(jié)晶性質(zhì)在溶劑化物的去溶劑化過程中，在依匹樂酮中所選擇的雜質(zhì)可誘導(dǎo)晶形H的形成。特別是評價如下兩種雜質(zhì)分子的作用4α，5α9”，11α-二環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-17α-孕烷-7α，21-二甲酸氫7-甲酯，(γ-內(nèi)酯3(“二環(huán)氧化物”)；和11α，12α-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-17-孕-4-烯-7”，21-二甲酸氫7-甲酯，(γ-內(nèi)酯4(“11，12-環(huán)氧化物”)。
這些雜質(zhì)分子對去溶劑化所得依匹樂酮晶形的作用在本文實(shí)施例中更詳細(xì)地描述。
由于17-羥基-3-氧代-17”-孕-4，9(11)-二烯-7α，21-二甲酸氫7-甲酯，(γ-內(nèi)酯5(“9，11一烯烴”)的單晶結(jié)構(gòu)與晶形H依匹樂酮類似，因此我們假定在溶劑化物的去溶劑化期間9，11-烯烴也可誘導(dǎo)晶形H的形成。
二環(huán)氧化物，11，12-烯烴和9，11-烯烴可以分別如Ng等人，WO98/25948的實(shí)施例47C、47B和37H所述制備。分離每種雜質(zhì)化合物的單晶。分離的二環(huán)氧化物、11，12-環(huán)氧化物和9，11-烯烴晶形的代表性X-射線粉末衍射圖分別如圖9、10和11所示。每種雜質(zhì)分子的X-射線粉末衍射圖類似于晶形H的X-射線粉末衍射圖，這表明晶形H和這三種雜質(zhì)化合物具有相似的單晶結(jié)構(gòu)。
也分離了每種雜質(zhì)化合物的單晶，并進(jìn)行X-射線結(jié)構(gòu)測定以證實(shí)這三種化合物采用的單晶結(jié)構(gòu)類似于晶形H。從甲基乙基酮中分離此二環(huán)氧化物的單晶。從異丙醇中分離11，12-環(huán)氧化物的單晶。從正丁醇中分離9，11-烯烴的單晶。測定每種雜質(zhì)化合物晶形的晶體結(jié)構(gòu)所得數(shù)據(jù)如表5所示。對晶形H、二環(huán)氧化物、11，12-環(huán)氧化物和9，11-烯烴晶形的所得晶系和晶胞參數(shù)基本上是相同的。
表5
表5中報(bào)告的4種化合物結(jié)晶成相同的空間群，并具有相似的晶胞參數(shù)(即它們是同構(gòu)的)。假定該二環(huán)氧化物、11，1 2-環(huán)氧化物和9，11-烯烴采用晶形H構(gòu)象。對于每種雜質(zhì)化合物來說，相對容易分離晶形H填料(直接從溶液中)，這表明在此系列結(jié)構(gòu)相似的化合物中晶形H晶格是穩(wěn)定的填充方式。
制備依匹樂酮用于制備本發(fā)明新晶形的依匹樂酮原料可以通過本身已知方法，包括在上述Ng等人的國際專利出版物WO97/21720和WO98/25948中給出的方法，特別是在二者中給出的方案1制得。
制備晶形1.制備溶劑化晶形依匹樂酮的溶劑化晶形可以通過從適宜的溶劑或適宜溶劑的混合物中結(jié)晶依匹樂酮來制備。適宜的溶劑或適宜溶劑的混合物一般包括這樣的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物，其在升高的溫度下溶解依匹樂酮和任何雜質(zhì)，但是冷卻時優(yōu)先結(jié)晶溶劑化物。室溫下在這些溶劑或溶劑的混合物中依匹樂酮的溶解度一般為約5至大約200mg/mL。這些溶劑或溶劑混合物優(yōu)選選自制備依匹樂酮原料的過程中已使用過的溶劑，特別是如果包含在含依匹樂酮晶形的最終藥物組合物中時是可藥用的溶劑。例如，得到含二氯甲烷的溶劑化物的含二氯甲烷的溶劑系統(tǒng)一般是不可取的。
所用各溶劑優(yōu)選是可藥用溶劑，特別是在“雜質(zhì)殘余溶劑指南”人用藥物注冊技術(shù)要求協(xié)調(diào)國際會議(International Conference onHarmonlsatlon of Technical Requirements For Reslstratlon ofPharmaceuticals ForHuman Use)(ICH指導(dǎo)委員會1997年7月17日在ICH程序步驟4中推薦采用)中定義的2類或3類溶劑。更優(yōu)選地，這些溶劑或溶劑混合物選自甲基乙基酮、1-丙醇、2-戊酮、乙酸、丙酮、乙酸丁酯、氯仿、乙醇、異丁醇、乙酸異丁酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、正丁醇、正辛醇、異丙醇、乙酸丙酯、丙二醇、叔丁醇、四氫呋喃、甲苯、甲醇和乙酸叔丁酯。更優(yōu)選的是，所述溶劑選自甲基乙基酮和乙醇.
為了制備依匹樂酮的溶劑化晶形，將一定量的依匹樂酮原料溶解在一定體積的溶劑中，并冷卻直至形成晶體。向溶劑中加入依匹樂酮時的溶劑溫度一般是根據(jù)該溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線來選擇。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，例如該溶劑溫度一般為至少約25℃，優(yōu)選約30℃至該溶劑的沸點(diǎn)溫度，更優(yōu)選為低于該溶劑沸點(diǎn)約25℃的溫度至該溶劑的沸點(diǎn)溫度。
或者，可將熱溶劑加到依匹樂酮中并可以將該混合物冷卻直至形成晶體。向依匹樂酮中加入溶劑時的溶劑溫度一般是根據(jù)該溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線來選擇。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，例如該溶劑溫度一般為至少約25℃，優(yōu)選約50℃至該溶劑的沸點(diǎn)溫度，更優(yōu)選為低于該溶劑沸點(diǎn)約15℃的溫度至該溶劑的沸點(diǎn)溫度。
與給定體積的溶劑混合的依匹樂酮原料的量同樣取決于該溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線。一般情況下，加到溶劑中的依匹樂酮的量在室溫下在該體積的溶劑中不能完全溶解。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，例如與給定體積的溶劑混合的依匹樂酮原料的量通常為在室溫時所能在該體積的溶劑中溶解的依匹樂酮的量的至少約1.5至約4.0倍、優(yōu)選為約2.0至約3.5倍、更優(yōu)選為約2.5倍。
當(dāng)依匹樂酮原料已經(jīng)完全溶解在溶劑中時，通常將該溶液緩慢地冷卻以結(jié)晶出依匹樂酮的溶劑化晶形。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，例如以低于約20℃/分鐘的速度、優(yōu)選以約10℃/分鐘或更低的速度、更優(yōu)選以約5℃/分鐘或更低的速度、還更優(yōu)選以約1℃/分鐘或更低的速度冷卻該溶液。
收獲溶劑化晶形的終點(diǎn)溫度取決于溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，例如該終點(diǎn)溫度一般為低于約25℃、優(yōu)選低于約5℃、更優(yōu)選低于約-5℃。降低該終點(diǎn)溫度通常有利于溶劑化晶形的形成。
或者，可使用其它技術(shù)來制備溶劑化物。這樣的技術(shù)的實(shí)例包括但不限于(i)將依匹樂酮原料溶解在一種溶劑中并加入助溶劑來促進(jìn)溶劑化晶形的結(jié)晶，(ii)溶劑化物的蒸氣擴(kuò)散生長，(iii)通過蒸發(fā)例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)分離溶劑化物，和(iv)漿液轉(zhuǎn)化。
可通過任意合適的常規(guī)手段例如過濾或離心來將如上所述制得的溶劑化晶形的晶體從溶劑中分離出來。在結(jié)晶期間提高溶劑系統(tǒng)的攪拌通常導(dǎo)致生成粒徑更小的晶體。
2.從溶劑化物制備晶形L依匹樂酮晶形L可通過去溶劑化由溶劑化晶形直接制得?？赏ㄟ^任意合適的去溶劑化手段，例如但不限于將溶劑化物加熱、降低溶劑化物周圍的環(huán)境壓力、或二者的組合來實(shí)現(xiàn)去溶劑化。如果將溶劑化物加熱，例如在烘箱中加熱來除去溶劑，在該操作期間的溫度一般不超過晶形H和晶形L的互變轉(zhuǎn)化溫度。該溫度優(yōu)選不超過約150℃。
去溶劑化壓力和去溶劑化時間并不很重要。去溶劑化壓力優(yōu)選為約1個大氣壓或更低。然而，當(dāng)降低去溶劑化壓力時，同樣要降低可進(jìn)行去溶劑化的溫度和/或去溶劑化時間。特別是對于具有較高去溶劑化溫度的溶劑化物，真空干燥使得可以采用較低的干燥溫度。僅需要能足以進(jìn)行完去溶劑化以形成晶形L的去溶劑化時間。
為了保證制得基本上都由晶形L組成的產(chǎn)物，依匹樂酮原料一般是高純度依匹樂酮，優(yōu)選基本上是純的依匹樂酮.用于制備依匹樂酮晶形L的依匹樂酮原料一般具有至少90％的純度，優(yōu)選至少95的純度，更優(yōu)選至少99％的純度。如在本申請別處所討論的那樣，依匹樂酮原料中的一些雜質(zhì)可能對通過該方法所得產(chǎn)物的產(chǎn)率和晶形L含量造成不利影響。
通過該方法由高純度依匹樂酮原料制得的依匹樂酮結(jié)晶產(chǎn)物一般包含至少10％晶形L，優(yōu)選至少50％晶形L，更優(yōu)選至少75％晶形L，還更優(yōu)選至少90％晶形L，再更優(yōu)選至少約95％晶形L，進(jìn)一步更優(yōu)選基本上是相純的晶形L。
3.由溶劑化物制備晶形H可按照基本上與上述晶形L制備法相同的方法制備包含晶形H的產(chǎn)物，通過(i)使用低純度依匹樂酮原料來代替高純度依匹樂酮原料，(ii)向溶劑系統(tǒng)中加入相純晶形H晶體的晶種，或者(iii)聯(lián)合使用(i)和(ii)。
A.使用雜質(zhì)作為晶體生長促進(jìn)劑和抑制劑在依匹樂酮原料中存在所選雜質(zhì)和其含量，而不是依匹樂酮中所有雜質(zhì)的總量在溶劑化物的去溶劑化期間實(shí)現(xiàn)晶形H晶體的形成潛力。所選雜質(zhì)一般是晶形H生長促進(jìn)劑或晶形L生長抑制劑。所選雜質(zhì)可包含在依匹樂酮原料中，在加入依匹樂酮原料前包含在溶劑或溶劑混合物中，和/或在加入依匹樂酮原料后加到溶劑或溶劑混合物中。Bonafede等人，“通過在分子晶體底物上突出導(dǎo)向的外延的有機(jī)多晶型物的選擇性成核作用和生長”，J.Amer.Chem.SOC，117(30)(1995年8月2日)(引入本發(fā)明以作參考)討論了在多晶型物系統(tǒng)中使用生長促進(jìn)劑和生長抑制劑。對于本發(fā)明，合適的雜質(zhì)一般包含具有與依匹樂酮品形H的單晶結(jié)構(gòu)基本上相同的單晶結(jié)構(gòu)的化合物，雜質(zhì)優(yōu)選為其X-射線粉末衍射圖與依匹樂酮晶形H的X-射線粉末衍射圖基本上相同的化合物，更優(yōu)選選自二環(huán)氧化物、11，12-環(huán)氧化物、9，11-烯烴和它們的組合。
制備晶形H晶體所需的雜質(zhì)的量一般部分取決于溶劑或溶劑混合物和雜質(zhì)相對于依匹樂酮的溶解度。當(dāng)從甲基乙基酮溶劑中結(jié)晶晶形H時，例如二環(huán)氧化物與低純度依匹樂酮原料的重量比一般為至少約1∶100，優(yōu)選為至少約3∶100，更優(yōu)選為約3∶100至約1∶5，還更優(yōu)選為約3∶100至約1∶10。11，12-環(huán)氧化物在甲基乙基酮中的溶解度比二環(huán)氧化物高，并且為了制備依匹樂酮晶形H晶體，通常需要更大量的11，12-環(huán)氧化物。當(dāng)雜質(zhì)包含11，12-環(huán)氧化物時，該二環(huán)氧化物與低純度依匹樂酮原料的重量比一般為至少約1∶5，更優(yōu)選為約3∶25，還更優(yōu)選為約3∶25至約1∶5。當(dāng)在制備晶形H晶體的過程中既使用二環(huán)氧化物又使用11，12-環(huán)氧化物雜質(zhì)時，每種雜質(zhì)與依匹樂酮原料的重量比可低于在制備晶形H晶體的過程中僅使用一種雜質(zhì)時的相應(yīng)比。
當(dāng)把包含所選雜質(zhì)的溶劑化物去溶劑化時，通常會獲得依匹樂酮晶形H和晶形L的混合物。在通過將溶劑化物開始去溶劑化所獲得的產(chǎn)物中，晶形H的重量分?jǐn)?shù)一般為低于約50％。如下所述通過結(jié)晶或蒸煮將該產(chǎn)物進(jìn)一步處理后，產(chǎn)物中晶形L的重量分?jǐn)?shù)一般會增加。
B.加入晶種晶形H晶體可通過在結(jié)晶依匹樂酮之前向溶劑系統(tǒng)中加入相純晶形H的晶種(或如上所述的晶形H生長促進(jìn)劑和/或晶形L生長抑制劑)而制得。依匹樂酮原料可以是低純度依匹樂酮或高純度依匹樂酮、當(dāng)把由任一種原料制得的溶劑化物去溶劑化時，晶形H在產(chǎn)物中的重量分?jǐn)?shù)一般為至少約70％、并且可以大至約100％。
加到溶劑系統(tǒng)中的晶形H晶種與加到溶劑系統(tǒng)中的依匹樂酮原料的重量比一般為至少約0.75∶100，優(yōu)選為約0.75∶100至約1∶20，更優(yōu)選為約1∶100至約1∶50。晶形H晶種可通過本申請中描述的關(guān)于制備晶形H晶體的任意方法，特別是如下所述通過蒸煮制備晶形H晶體的方法制得。
晶形H晶種可一次性加入、分多次加入、或經(jīng)一段時間基本連續(xù)地加入。然而，通常在依匹樂酮開始從溶液中結(jié)晶之前完成晶形H晶種的加入，即在達(dá)到濁點(diǎn)(亞穩(wěn)帶低終點(diǎn))前完全加入晶種。一般當(dāng)溶液溫度為濁點(diǎn)以上約0.5℃至濁點(diǎn)以上約10℃，優(yōu)選為濁點(diǎn)以上約2℃至約3℃時加入晶種。當(dāng)加入晶種時的濁點(diǎn)以上的溫度增加時，結(jié)晶晶形H晶體所需的晶種加入量一般為增加。
加入晶種優(yōu)選不僅可在濁點(diǎn)以上進(jìn)行，而且也可以在亞穩(wěn)帶內(nèi)進(jìn)行。濁點(diǎn)和亞穩(wěn)帶都取決于依匹樂酮在溶劑或溶劑混合物中的溶解度和濃度。例如，對于甲基乙基酮的12體積稀釋，亞穩(wěn)帶高終點(diǎn)一般為約70℃至約73℃，亞穩(wěn)帶低終點(diǎn)(即濁點(diǎn))為約57℃至約63℃。對于8體積甲基乙基酮的濃度，亞穩(wěn)帶窄得多，這是由于溶液過飽和所致。在該濃度下，該溶液的濁點(diǎn)為約75℃約76℃。因?yàn)樵诃h(huán)境條件下甲基乙基酮的沸點(diǎn)約為80℃，所以一般在約76.5℃至該沸點(diǎn)溫度向該溶液中加入晶種。
本文實(shí)施例7給出了加入晶形H晶種的非限制性實(shí)例。
用晶形H生長促進(jìn)劑或晶形L生長抑制劑，和/或加入晶形H晶種所獲得的依匹樂酮結(jié)晶產(chǎn)物一般包含至少2％晶形H，優(yōu)選至少5％晶形H，更優(yōu)選至少7％晶形H，還更優(yōu)選至少約10％晶形H。余下的依匹樂酮結(jié)晶產(chǎn)物是一般是晶形L。
C.通過研磨依匹樂酮制備晶形H在另一實(shí)施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)少量的晶形H可通過適當(dāng)?shù)匮心ヒ榔吠频?。已?jīng)觀察到，在研磨的依匹樂酮中，晶形H的濃度高達(dá)約3％。
D.從由低純度依匹樂酮制得的溶劑化物制備晶形L如上所述，結(jié)晶低純度依匹樂酮以形成溶劑化物，然后將該溶劑化物去溶劑化一般可制得包含晶形H和晶形L的產(chǎn)物。按照與上述制備晶形H的方式基本上相同的方法，通過向溶劑系統(tǒng)中加入相純的晶形L晶種，或通過使用晶形L生長促進(jìn)劑和/或晶形H生長抑制劑，可由低純度依匹樂酮制得具有較大晶形L含量的產(chǎn)物。加入晶種的方案以及加到溶劑系統(tǒng)中的晶形L晶種的量與加到溶劑系統(tǒng)中的依匹樂酮原料的量的重量比與上文關(guān)于通過加入相純晶形H晶種來制備依匹樂酮晶形H所述的重量比類似。
以該方法制得的依匹樂酮結(jié)晶產(chǎn)物一般包含至少10％晶形L，優(yōu)選至少50％晶形L，更優(yōu)選至少75％晶形L，更優(yōu)選至少90％晶形L，還更優(yōu)選至少約95％晶形L，進(jìn)一步更優(yōu)選基本上是相純的晶形L。
本文所述關(guān)于制備依匹樂酮晶形H的加入晶種方案也可用于改善結(jié)晶的依匹樂酮粒徑的控制。
5.從溶液直接制備晶形L依匹樂酮晶形L還可通過從合適的溶劑或溶劑混合物中直接結(jié)晶依匹樂酮來制得，而不用形成溶劑化物中間體和所伴隨需要的去溶劑化。一般情況下，(i)溶劑具有與溶劑化物晶格中的可用通道空間不相容的分子大小，(ii)依匹樂酮的所存在的任何雜質(zhì)在升高的溫度下能溶于該溶劑中，(iii)冷卻導(dǎo)致結(jié)晶出非溶劑化的依匹樂酮晶形L。在室溫下，依匹樂酮在溶劑或溶劑混合物中的溶解度一般為約5至約200mg/ml。所述溶劑或溶劑混合物優(yōu)選包含一種或多種選自甲醇、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙腈、硝基苯、水和乙基苯的溶劑。
為了直接從溶液中結(jié)晶出依匹樂酮晶形L，將一定量的依匹樂酮原料溶解在一定體積的溶劑中，并冷卻直至形成晶體。向溶劑中加入依匹樂酮時的溶劑溫度一般是根據(jù)該溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線來選擇。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，該溶劑溫度一般為至少約25℃，優(yōu)選約30℃至該溶劑的沸點(diǎn)溫度，更優(yōu)選為低于該溶劑沸點(diǎn)約25℃的溫度至該溶劑的沸點(diǎn)溫度。
或者，可將熱溶劑加到依匹樂酮并可以將該混合物冷卻直至形成晶體。向依匹樂酮中加入溶劑時的溶劑溫度一般是根據(jù)該溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線來選擇。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，該溶劑溫度一般為至少約25℃，優(yōu)選約50℃至該溶劑的沸點(diǎn)溫度，更優(yōu)選為低于該溶劑沸點(diǎn)約15℃的溫度至該溶劑的沸點(diǎn)溫度。
與給定體積的溶劑混合的依匹樂酮原料的量同樣取決于該溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線。一般情況下，加到溶劑中的依匹樂酮的量在室溫下在該體積的溶劑中不能完全溶解。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，與給定體積的溶劑混合的依匹樂酮原料的量通常為在室溫時所能在該體積的溶劑中溶解的依匹樂酮的量的至少約1.5至約4.0倍，優(yōu)選為約2.0至約3.5倍，例如更優(yōu)選為約2.5倍。
為了保證制得包含基本上相純的晶形L的產(chǎn)物，依匹樂酮原料一般是高純度原料。依匹樂酮原料優(yōu)選具有至少約65％純度，更優(yōu)選具有至少約90％純度，還更優(yōu)選具有至少約98％純度，最優(yōu)選具有至少約99％純度。
在依匹樂酮原料已經(jīng)完全溶解在溶劑中之后，通常將該溶液緩慢地冷卻以結(jié)晶出依匹樂酮晶形L。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，例如以低于約1.0℃/分鐘的速度，優(yōu)選以約0.2℃/分鐘或更低的速度，更優(yōu)選以約5℃/分鐘至約0.1℃/分鐘的速度冷卻該溶液。
收獲晶形L的終點(diǎn)溫度取決于溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，該終點(diǎn)溫度一般為低于約25℃，優(yōu)選低于約5℃，更優(yōu)選低于約-5℃。
或者，可使用其它技術(shù)來制備溶劑化物。這樣的技術(shù)的實(shí)例包括但不限于(i)將依匹樂酮原料溶解在一種溶劑中，并加入助溶劑來促進(jìn)依匹樂酮晶形L的結(jié)晶，(ii)依匹樂酮晶形L的蒸氣擴(kuò)散生長，(iii)通過蒸發(fā)例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)分離出依匹樂酮晶形L，和(iV)漿液轉(zhuǎn)化。
可通過任意合適的常規(guī)手段例如過濾或離心來將如上所述制得的依匹樂銅晶形L的晶體從溶劑中分離出來。
此外，依匹樂酮晶形L可通過將高純度依匹樂酮在甲基乙基酮中的槳液蒸煮(如下所述)，并在該漿液的沸點(diǎn)溫度下過濾蒸煮的依匹樂酮來制得。
6.從溶液中直接制備晶形H據(jù)假定，如果在晶形H和晶形L的互變轉(zhuǎn)變溫度(Tt)以上進(jìn)行結(jié)晶，特別是如果存在晶形H生長促進(jìn)劑或晶形L生長抑制劑或者加入相純的晶形H晶種，晶形H將直接從溶液中結(jié)晶出來，這是因?yàn)榫蜨在這些較高溫度條件下更穩(wěn)定的緣故。優(yōu)選使用的溶劑系統(tǒng)包含高沸點(diǎn)溶劑例如硝基苯。合適的晶形H生長促進(jìn)劑包括但不限于如上所述的二環(huán)氧化物和11，12-烯烴。
7.用A溶劑蒸煮依匹樂酮依匹樂酮的溶劑化晶形、晶形H和晶形L也可通過將依匹樂酮原料在合適的溶劑或溶劑混合物中蒸煮而制得。在該蒸煮方法中，依匹樂酮漿液在溶劑或溶劑混合物沸點(diǎn)下加熱，例如，將一定量的依匹樂酮原料與一定體積的溶劑或溶劑混合物合并，加熱至回流，除去餾出液，同時再加入一定量的溶劑和除去餾出液?；蛘?，可將餾出液冷凝并循環(huán)使用，這樣在蒸煮操作期間就不用再另外加入溶劑。一般情況下，一旦初始體積的溶劑已經(jīng)被除去或者冷凝和循環(huán)，即將漿液冷卻，并形成了溶劑化晶形?？赏ㄟ^任意常規(guī)手段例如過濾或離心來將溶劑化的晶體從溶劑中分離出來。根據(jù)該溶劑化的晶體中存在還是不存在所選雜質(zhì)，如上所述將溶劑化物去溶劑化可生成依匹樂酮晶形H或晶形L。
合適的溶劑或溶劑混合物一般包含一種或多種上述溶劑。溶劑可選自例如甲基乙基酮和乙醇。
在蒸煮操作中，加到所用溶劑中的依匹樂酮原料的量一般是足以在該溶劑或溶劑混合物的沸點(diǎn)溫度下保持漿液(即依匹樂酮在溶劑或溶劑混合物中不能完全溶解)的量。示例性的值包括但不限于之約1克依匹樂酮每4升甲基乙基酮和大約1克依匹樂酮每8升乙醇。
通常一旦溶劑周轉(zhuǎn)(turnover)完全后，即把漿液緩慢地冷卻以結(jié)晶出依匹樂酮的溶劑化晶形。對于測試溶劑，以低于約20℃/分鐘，優(yōu)選約10℃/分鐘或更低，更優(yōu)選約5℃/分鐘或更低，還更優(yōu)選約1℃/分鐘或更低的速度冷卻該漿液。
收獲溶劑化晶形的終點(diǎn)溫度取決于溶劑或溶劑混合物的溶解度曲線。對于本文所描述的大多數(shù)溶劑，該終點(diǎn)溫度一般為低于約25℃，優(yōu)選低于約5℃，更優(yōu)選低于約-5℃。
如果需要主要包含或僅包含晶形L的產(chǎn)物，通常將高純度依匹樂酮原料蒸煮。所述高純度依匹樂酮原料優(yōu)選具有至少約98％純度，更優(yōu)選至少約99％純度，還更優(yōu)選至少約99.5％純度。以該方式制得的依匹樂酮蒸煮產(chǎn)物一般包含至少約10％晶形L，優(yōu)選至少約50％晶形L，更優(yōu)選至少約75％晶形L，還更優(yōu)選至少約90％晶形L，再更優(yōu)選至少約95％晶形L，最優(yōu)選基本上是相純的晶形L。
如果需要主要包含或僅包含晶形H的產(chǎn)物，通常將低純度依匹樂酮原料蒸煮。低純度依匹樂酮原料通常包含為了生成晶形H最小必需量的晶形H生長促進(jìn)劑和/或品形L生長抑制劑。該低純度依匹樂酮原料優(yōu)選具有至少約65％純度，更優(yōu)選至少約75％純度，還更優(yōu)選至少約80％純度。以該方式制得的依匹樂酮蒸煮產(chǎn)物一般包含至少約10％晶形H，優(yōu)選至少約50％晶形H，更優(yōu)選至少約75％晶形H，還更優(yōu)選至少約90％晶形H，再更優(yōu)選至少約95％晶形H，最優(yōu)選基本上是相純的晶形H。
8.制備無定形依匹樂酮無定形依匹樂酮可通過將依匹樂酮固體合適粉碎，例如通過壓碎、研磨和/或微粉化將依匹樂酮固體粉碎來少量制得。相純的無定形依匹樂酮，即基本上不含依匹樂酮晶體的無定形依匹樂酮可通過例如將依匹樂酮溶液、特別是依匹樂酮水溶液冷凍干燥而制得。以下實(shí)施例13和14舉例說明了這些方法。
工作實(shí)施例下述實(shí)施例詳細(xì)描述了制備本文所述的各種固態(tài)形式依匹樂酮的方法。這些詳細(xì)描述在本發(fā)明范圍內(nèi)，并用于對本發(fā)明進(jìn)行舉例。這些詳述的提供僅用于例示目的，而不意在限制本發(fā)明的范圍。除非另外指出，否則所有百分比都是按重量計(jì)，溫度以攝氏度計(jì)。在每一下述實(shí)施例中使用的依匹樂酮原料都是依據(jù)上文引用的Ng等人的國際專利出版物WO98/25948的方案1制備的。
實(shí)施例1由高純度依匹樂酮原料制備(a)甲基乙基酮溶劑化物和由所得的溶劑化物制備(b)依匹樂酮晶形LA.制備甲基乙基酮溶劑化物在900rpm的磁攪拌下，通過在電熱板上加熱至沸將高純度依匹樂酮(437mg；純度＞99％，二環(huán)氧化物和11，12-環(huán)氧化物的的存在＜0.2％)溶于10ml甲基乙基酮。在持續(xù)的磁攪拌下，將所得溶液冷卻至室溫。一旦達(dá)到室溫，就把該溶液轉(zhuǎn)移到1℃浴中，并繼續(xù)攪拌1小時。1小時后，通過真空過濾從該冷溶液中收集甲基乙基酮溶劑化物固體。
B.制備依匹樂酮晶形L
將如上所述制得的甲基乙基酮溶劑化物固體在烘箱中于100℃、常壓下干燥4小時。通過DSC和XPRD分析證實(shí)了該干燥的固體是純晶形L。
實(shí)施例2由高純度的原料制備另外的溶劑化物按照基本上與實(shí)施例1相同的方法，分別用下述溶劑代替甲基乙基酮制備另外的溶劑化物正丙醇、2-戊酮、乙酸、丙酮、乙酸丁酯、氯仿、乙醇、異丁醇、乙酸異丁酯、異丙醇、乙酸甲酯、丙酸乙酯、正丁醇、正辛醇、乙酸丙酯、丙二醇、叔丁醇、四氫呋喃和甲苯，并基本上如以上實(shí)施例1步驟A所述完成結(jié)晶。由每一種基本上如實(shí)施例1步驟B所述的溶劑化物形成晶形L依匹樂酮。
實(shí)施例3通過蒸氣擴(kuò)散生長制備甲基乙基酮溶劑化物通過在電熱板上溫?zé)釋⒁榔吠?400mg，純度＞99.9％)溶于20ml甲基乙基酮中，以形成貯備液。將8ml量的貯備液轉(zhuǎn)移到第一個20mL閃爍瓶中，并用甲基乙基酮(80％)稀釋成10ml。將10ml量的貯備液轉(zhuǎn)移到第二個20ml閃爍瓶中，并用用甲基乙基酮(40％)稀釋成10ml。用甲基乙基酮(20％)將最終2ml量的貯備液稀釋至10ml。將4個包含稀釋液的瓶轉(zhuǎn)移到含有少量作為抗溶劑的己烷的干燥器缸中。將該干燥缸密封，并使得己烷蒸氣擴(kuò)散到甲基乙基酮溶液中。依匹樂酮甲基乙基酮溶劑化物的晶體在80％稀釋樣品中生長直至第二天。
實(shí)施例4通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀制備依匹樂酮溶劑化物晶體稱重約400mg依匹樂酮(純度＞99.9％)置于250ml圓底燒瓶中，將溶劑(150ml)加到該燒瓶中，如果需要的話將溶液輕微加熱直至依匹樂酮溶解。將所得澄清溶液置于具有約85℃浴溫的Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中。當(dāng)燒瓶中剩余約10ml溶劑時停止除去溶劑。通過適當(dāng)方法(例如XPRD、DSC、TGA顯微鏡法等)分析所得固體以確定晶形。
實(shí)施例5漿液轉(zhuǎn)化將大約150mg依匹樂酮晶形L和150mg依匹樂酮晶形H加到5ml乙酸乙酯中。將所得漿液在300rpm下(磁攪拌)過夜。第一天通過過濾收集所得固體樣品。通過XPRD分析樣品，結(jié)果表明該樣品完全由依匹樂酮晶形L組成。
實(shí)施例6由低純度依匹樂酮原料制備(a)溶劑化物和由所得的溶劑化物制備(b)依匹樂酮晶形H通過將所需量的雜質(zhì)與足以提供100mg總樣品質(zhì)量的一定量依匹樂酮一起加到7ml閃爍瓶中來制備含有不同量雜質(zhì)4α，5α，9α，11α-二環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-17α-孕-7α，21-二甲酸氫7-甲酯，(γ-內(nèi)酯(“二環(huán)氧化物”)或雜質(zhì)11α，12α-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-17α-孕-4-烯-7α，21-二甲酸氫7-甲酯，(γ-內(nèi)酯(“11，12-環(huán)氧化物”)的樣品。各樣品中二環(huán)氧化物或11，12-環(huán)氧化物的重量百分比分別如表X-6A和X-6B所示。向每一閃爍瓶中加入微型磁攪拌器和1ml甲基乙基酮。將閃爍瓶松松地封蓋，通過在磁攪拌下在電熱板上加熱至回流將固體溶解。當(dāng)溶解完成時，在熱板上將溶液冷卻至室溫。在冷卻期間保持磁攪拌。在溶液達(dá)到室溫后，通過真空過濾收集固體，并立即通過X-射線粉末衍射(XPRD)分析。然后將固體置于100℃烘箱中，并在常壓下干燥1小時。通過XPRD分析干燥的固體，通過監(jiān)測在約12.1°2θ的晶形H衍射峰的面積確定晶形H含量。所有XPRD衍射圖都是在Inel Multlpufpose衍射儀上記錄的。
表X-6A
表X-6B
A.二環(huán)氧化物結(jié)果圖13顯示了得自摻入了(a)0％、(b)1％、(c)3％和(d)5％二環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶的甲基乙基酮溶劑化物濕餅(甲基乙基酮溶劑化物)的X-射線粉末衍射圖。為了便于比較，已經(jīng)將峰強(qiáng)度進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化(normalized)。在衍射圈中沒有任何晶形H或二環(huán)氧化物的特征峰。該圖是依匹樂酮甲基乙基酮溶劑化物的特征。
圖14顯示了得自摻入了(a)0％、(b)1％、(c)3％和(d)5％二環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶干燥固體的X-射線粉末衍射圖。為了便于比較，已經(jīng)將峰強(qiáng)度進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。在與其中二環(huán)氧化物的摻雜水平為0％或1％的甲基乙基酮結(jié)晶相對應(yīng)的干燥樣品中沒有檢測到任何晶形H。在與其中摻雜水平為3％或5％的甲基乙基酮結(jié)晶相對應(yīng)的干燥樣品中檢測到了晶形H。對于每一樣品，在約12.1°2θ的晶形H衍射峰的面積和所估算的晶形H含量如下表X-6C所示。
表X-6C
表X-6C中報(bào)告的結(jié)果證實(shí)了在去溶劑化期間存在二環(huán)氧化物影響依匹樂酮晶形H的形成。當(dāng)把二環(huán)氧化物摻入到和/或吸附到甲基乙基酮溶劑化物晶體上時，誘導(dǎo)了晶形H的形成。
進(jìn)行第二個3％二環(huán)氧化物摻雜實(shí)驗(yàn)以分析制備途徑對去溶劑化期間所形成的晶形H量的影響。在此實(shí)驗(yàn)中，將由摻雜結(jié)晶獲得的甲基乙基酮溶劑化物分成兩部分。第一部分不處理，第二部分在研缽中用研棒輕輕地研磨，以誘導(dǎo)出較高水平的晶體缺損。將這兩部分都在常壓下于100℃干燥1小時。通過XPRD分析干燥的固體。圖15顯示了從摻入3％二環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶獲得的干燥固體的XPRD圖，其中(a)是干燥前沒有研磨該溶劑化物，(b)是干燥前研磨了該溶劑化物。XPRD圖表明，與未研磨的樣品相比，研磨的樣品中含有更多的晶形H。這些結(jié)果表明，分離和處理甲基乙基酮溶劑化物的條件可影響去溶劑化所形成的晶形。
B.11，12-環(huán)氧化物結(jié)果圖16顯示了得自摻入了(a)0％、(b)1％、(c)5％和(d)10％的11，12-環(huán)氧化物的甲基乙基酮結(jié)晶的濕餅(甲基乙基酮溶劑化物)的X-射線粉末衍射圖。為了便于比較，已經(jīng)將峰強(qiáng)度進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。在衍射圖中沒有任何晶形H或11，12-環(huán)氧化物的特征峰。該圖是依匹樂酮甲基乙基酮溶劑化物的特征。
圖17顯示了得自摻入了(a)0％、(b)1％、(c)5％和(d)10％11，12-環(huán)氧化物甲基乙基酮結(jié)晶干燥固體的X-射線粉末衍射圖。為了便于比較，已經(jīng)將峰強(qiáng)度進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。在與摻雜水平為0％、1％或5％的甲基乙基酮結(jié)晶相對應(yīng)的干燥樣品中沒有檢測到任何晶形H。在與摻雜水平為10％的甲基乙基酮結(jié)晶相對應(yīng)的干燥樣品中檢測到了晶形H。對于每一樣品，在約12.1°2θ的晶形H衍射峰的面積和所估算的晶形H含量如表X-6D所示。
表X-6D
表X-6D中報(bào)告的結(jié)果證實(shí)了在去溶劑化期間存在11，12-環(huán)氧化物影響依匹樂酮晶形H的形成。對于誘導(dǎo)形成依匹樂酮晶形H所需的甲基乙基酮結(jié)晶中的雜質(zhì)水平，11，12-環(huán)氧化物似乎要大于二環(huán)氧化物。
實(shí)施例7結(jié)晶和干燥對最終晶形的影響進(jìn)行下述4個實(shí)驗(yàn)以分析結(jié)晶和干燥對最終晶形的影響(i)依匹樂酮的甲基乙基酮結(jié)晶(23+3統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn))，(ii)低質(zhì)量母液殘余物的結(jié)晶，(iii)加入晶形H晶種的高純度依匹樂酮的結(jié)晶，和(iV)加入晶形L晶種的低純度依匹樂酮的結(jié)晶。這些實(shí)驗(yàn)中的變量包括冷卻速度、原料純度水平和結(jié)晶的終點(diǎn)溫度。為此實(shí)施例目的，高純度依匹樂酮定義為超純研磨過的依匹樂酮(HPLC分析表明這種材料為100.8％純)，低純度依匹樂酮定義為純度為89％的依匹樂酮。為了制備低純度依匹樂酮，將在制備依匹樂酮的過程中汽提所獲得的母液分析，并混合以獲得含有61.1％依匹樂酮、12.8％二環(huán)氧化物和7.6％11，12-環(huán)氧化物的材料。然后將該材料與足量高純度依匹樂酮混合以獲得純度為89％的依匹樂酮。
A.甲基乙基酮結(jié)晶在該甲基乙基酮結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中，所有批次都是用60g高純度依匹樂酮進(jìn)行的。高終點(diǎn)定義為45℃，低終點(diǎn)定義為5℃。高冷卻速度定義為3℃/分鐘，低冷卻速度定義為0.1℃/分鐘。中點(diǎn)是1.5℃/分鐘冷卻速度，純度為94.5％的依匹樂酮和25℃終點(diǎn)。
用FTIR進(jìn)行背景讀數(shù)后，將250ml甲基乙基酮置于1升Mettler RC，MP10反應(yīng)器中，并以100rpm攪拌。掃描幾次后，向該反應(yīng)器中加入依匹樂酮，然后再加入470ml甲基乙基酮。將攪拌速度提高至500rpm以懸浮固體，并將該批溫度增加至80℃。將該批的溫度保持在80℃以保證依匹樂酮溶解。在所得透明溶液中一般可看見黑色或白色斑點(diǎn)。然后通過斜坡冷卻以所需速度將該批溫度降至所需的終點(diǎn)，在該終點(diǎn)溫度保持1小時，然后將其倒入移液瓶中并過濾，獲得了濕餅。然后用120ml甲基乙基酮洗滌該反應(yīng)器、移液瓶和濕餅。一但洗液穿過濕餅，就停止。對于每份樣品，將約10g濕餅在真空烘箱中于75℃、輕氮?dú)饣旌系臉?biāo)準(zhǔn)條件下真空干燥。對于下述的“高、高、高”和“低、低、低”實(shí)驗(yàn)，在高和低條件下進(jìn)行流化床干燥。高條件定義為100℃、安裝4個風(fēng)機(jī)，而低條件定義為40℃、安裝1個風(fēng)機(jī)。
B.結(jié)晶低質(zhì)量母液殘余物在結(jié)晶低質(zhì)量母液殘余物的實(shí)驗(yàn)中，將60g 61.1％純度的依匹樂酮和720ml甲基乙基酮直接加到1升Mettler RC-1，MP10反應(yīng)器中。在加到反應(yīng)器中之前，純度61.1％的依匹樂酮與高純度依匹樂酮并不混合。將所得混合物加熱至80℃，其在室溫呈不透明的漿液。繼續(xù)結(jié)晶，在迅速冷卻條件下于45℃過濾該混合物。
C.加入晶形H晶種在加入晶形H晶種的實(shí)驗(yàn)中，將60g高純度依匹樂酮(100.8％)和720ml甲基乙基酮加到1升Mettler RC-1，MP10反應(yīng)器。將該混合物加熱至80℃，然后以1.5℃/分鐘的速度冷卻至25℃。當(dāng)溶液冷卻至62℃時，向其中加入3g相純的晶形H晶體以引發(fā)結(jié)晶。所述晶形H晶種是通過在下述實(shí)施例9中的蒸煮法制得的。
D.加入晶形L晶種在加入晶形L晶種的實(shí)驗(yàn)中，將66.6g 89.3％的依匹樂酮(通過將48.3g純度100％依匹樂酮與18.3g純度61.1％的依匹樂酮混合而制得的)和720ml甲基乙基酮加到1升Mettler RC-1，MP10反應(yīng)器中。將該混合物加熱至80℃，然后以1.5℃/分鐘的速度冷卻至25℃。當(dāng)溶液冷卻至63℃時，向其中加入3g相純的晶形L晶體以引發(fā)結(jié)晶。所述晶形L晶種是通過在實(shí)施例1中所述的結(jié)晶和去溶劑化方法制得的。
這些實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果報(bào)告在表X-7A中。在n+1結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中，只有當(dāng)使用含有二環(huán)氧化物的低純度依匹樂酮時才檢測到晶形H。在更高的冷卻速度下還觀察到終產(chǎn)物中二環(huán)氧化物的水平增加。
結(jié)晶低質(zhì)量母液殘余物的實(shí)驗(yàn)生成了低質(zhì)量原材料，通過X-射線粉末衍射分析發(fā)現(xiàn)其似乎是二環(huán)氧化物與晶形H的混合物。
在加入晶形H晶種的實(shí)驗(yàn)(使用高純度依匹樂酮，加入晶形H晶種)生成的產(chǎn)物中，根據(jù)X-射線粉末衍射分析其含有77％晶形H，但是根據(jù)DSC其全部是晶形H。然而，對于超過約15％晶形H的線性，XPRD模型從沒有測試過。在這4個實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，該實(shí)驗(yàn)是唯一一個不存在二環(huán)氧化物即生成晶形H的實(shí)驗(yàn)。
加入晶形L晶種的實(shí)驗(yàn)(使用低純度依匹樂酮，加入晶形L晶種)生成了全部是晶形L的產(chǎn)物。
對于依匹樂酮的高條件流化床干燥，所得數(shù)據(jù)似乎與真空烘箱干燥所得數(shù)據(jù)相一致。從低條件流化床干燥所獲得的結(jié)果與真空烘箱干燥所得結(jié)果不同。
表X-7A
1冷卻速度(+)＝3℃/分；(0)＝1.5℃/分；和(-)＝0.1℃/分。
2冷卻終點(diǎn)(+)＝45℃；(0)＝25℃；和(-)＝5℃。
3雜質(zhì)水平(+)＝89.3％純依匹樂酮原料；(++)＝61.1％純依匹樂酮原料；(0)＝100.8％純依匹樂酮原料；和(-)＝94.5％純依匹樂酮原料。
4將溶劑化物在真空烘箱中于75℃干燥后的重量百分比5通過XPRD分析發(fā)現(xiàn)似乎是晶形H與二環(huán)氧化物的混合物6通過XPRD分析似乎是77％晶形H和通過DSC分析似乎是100％晶形H。
A.材料純度圖18顯示了基于在表X-7A所報(bào)告的數(shù)據(jù)的產(chǎn)物純度、原料純度、冷卻速度和終點(diǎn)溫度的立方圖。該立方圖表明，在開始結(jié)晶時使用較高純度依匹樂酮能生成較高純度產(chǎn)物。結(jié)晶的終點(diǎn)溫度對產(chǎn)物純度的影響似乎不大。然而，冷卻速度顯得有影響，較快冷卻速度導(dǎo)致生成了純度稍低的產(chǎn)物。實(shí)際上，在較快的冷卻速度下，二環(huán)氧化物的水平一般較高。
圖19表示的是，為了確定對終產(chǎn)物的純度具有統(tǒng)計(jì)顯著影響的變量(如果有的話)，用該立方圖結(jié)果繪制的半標(biāo)準(zhǔn)圖。原料純度對產(chǎn)物純度有最大的統(tǒng)計(jì)顯著影響，而冷卻速度的影響以及冷卻速度與原料純度之間的相互作用也有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
圖20是基于這些結(jié)果的相互作用圖，其表示的是原料純度與冷卻速度之間的相互作用對產(chǎn)物純度的影響。當(dāng)使用高純度依匹樂酮(100.8％依匹樂酮原料)時，冷卻速度看上去對最終純度的影響很小或沒有任何影響。然而，當(dāng)使用低純度依匹樂酮(89.3％依匹樂酮原料)時，隨著冷卻速度的增加產(chǎn)物純度下降了。該結(jié)果表明，當(dāng)在較高冷卻速度進(jìn)行結(jié)晶時，會結(jié)晶出更多的雜質(zhì)。
B.晶形H含量圖21表示的是基于表X-7A所報(bào)告數(shù)據(jù)的晶形H重量分?jǐn)?shù)、原料純度、冷卻速度和終點(diǎn)溫度的立方圖。該立方圖表明，在開始結(jié)晶時使用較高純度的依匹樂酮會得到較少量的晶形H。結(jié)晶的終點(diǎn)溫度似乎也對終產(chǎn)物的形式有影響。冷卻速度看上去對晶形H的形成影響不大，雖然在雜質(zhì)存在下，在低的終點(diǎn)溫度以較快速度冷卻會生成一些晶形H。
圖22表示的是，為了確定對終產(chǎn)物中晶形H含量具有統(tǒng)計(jì)顯著影響的變量(如果有的話)，用該立方圖結(jié)果繪制的半標(biāo)準(zhǔn)圖。看上去原料純度、結(jié)晶的終點(diǎn)溫度、以及這兩個變量之間的相互作用有統(tǒng)計(jì)顯著影響。
當(dāng)使用高純度依匹樂酮(100.8％依匹樂酮原料)時，看上去終點(diǎn)溫度對晶形H含量影響很小。在使用純依匹樂酮的兩個實(shí)驗(yàn)中都沒有生成任何晶形H。然而，當(dāng)使用低純度依匹樂酮(89.3％依匹樂酮原料)時，在兩個實(shí)驗(yàn)中都生成了晶形H，并且在較高終點(diǎn)溫度顯著生成了更多的晶形H。
表X-7B報(bào)告了在使用流化床(Lab-Line/P.R.L.Hi-Speed流化床干燥器，Lab-LineInstruments，Inc)或真空烘箱(Baxter ScientificProducts真空干燥烘箱，型DP-32)干燥的材料中測定的晶形H的重量分?jǐn)?shù)。對于在高流化床或真空烘箱中干燥的可比的材料，觀測到了類似的晶形H含量。然而，對于在低流化床中干燥的可比的材料，所觀測到的結(jié)果與真空烘箱不同。
表X-7B
實(shí)施例8從甲基乙基酮中結(jié)晶晶形H和晶形L的混合物以制備溶劑化物，并(b)去溶劑化溶劑化物以制備晶形L將依匹樂酮晶形H(10g)與80ml甲基乙基酮合并。將該混合物加熱至回流(79℃)，并在該溫度下攪拌約30分鐘。然后通過將該漿液在65℃、50℃、35℃和25℃分別保持90分鐘來將所得漿液以逐步、停點(diǎn)(holdPoint)的方式冷卻。過濾該漿液，并用約20ml甲基乙基酮洗滌。將所分離出的固體首先在濾器上干燥，并然后在真空烘箱中于40-50℃干燥。在真空烘箱中于90-100℃完成干燥。以82％的收率獲得了去溶劑化的固體。XPRD、MIR和DSC證實(shí)了該固體具有晶形L晶體結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例9用溶劑蒸煮低純度依匹樂酮原料來制備晶形HA.用乙醇溶劑蒸煮將低純度依匹樂酮(24.6g，HPLC測定的純度為64％)與126ml乙醇3A合并。將該漿液加熱至回流，并除去餾出液。當(dāng)126ml溶劑通過常壓蒸餾被除去時，同時加入126ml乙醇3A。溶劑周轉(zhuǎn)完成后，將該混合物冷卻至25℃并攪拌1小時。將所得固體過濾，并用乙醇3A洗滌，然后風(fēng)干，獲得了乙醇合物。將該溶劑化物在真空烘箱中于90-100℃進(jìn)一步干燥6小時，獲得了14.9g依匹樂酮晶形H。
B.用甲基乙基酮溶劑蒸煮在另一蒸煮方法中，將1克低純度依匹樂酮(純度大約為65％)在4ml甲基乙基酮中蒸煮2小時，然后將該混合物冷卻至室溫。一旦冷卻，即通過真空過濾收集所得固體，并通過XPRD分析證實(shí)了其為甲基乙基酮溶劑化物。將該固體在100℃干燥30-60分鐘。XPRD證實(shí)該干燥的固體是純的晶形H。
實(shí)施例10用溶劑蒸煮高純度依匹樂酮原料來制備晶形LA.用乙醇溶劑蒸煮將高純度依匹樂酮(1克)在8ml乙醇中蒸煮大約2小時。然后將該溶液冷卻至室溫，并通過真空過濾收集固體。過濾后立即通過XPRD分析該固體，結(jié)果表明該固體是溶劑化物(假定是乙醇溶劑化物)。然后將該固體在100℃于常壓下干燥30分鐘。通過XPRD分析該干燥的固體，結(jié)果證實(shí)了其主要是晶形L(沒有檢測到任何晶形H)。
B.用甲基乙基酮溶劑蒸煮將高純度依匹樂酮(1克)在4ml甲基乙基酮中蒸煮大約2小時。然后將該溶液冷卻至室溫，并通過真空過濾收集固體。立即通過XPRD分析該固體，結(jié)果表明該固體是溶劑化物(假定是甲基乙基酮溶劑化物)。然后將該固體在100℃于常壓下干燥30-60分鐘。通過XPRD分析該干燥的固體，結(jié)果證實(shí)了其主要是晶形L，不存在到任何晶形H衍射峰。
實(shí)施例11從溶液中直接結(jié)晶晶形L方法A通過加熱至75℃將2.5g依匹樂酮溶于乙酸乙酯中。將該溶液在75℃保持30分鐘以確保溶解完全，然后以1℃/分鐘的冷卻速度冷卻至13℃。用架空式攪拌器以750rPm將所得漿液攪拌2小時。通過真空過濾收集固體，并在真空烘箱中于40℃干燥1小時。該固體的XPRD圖和DSC差示熱分析圖是依匹樂酮晶形L的特征。該固體的熱重分析(TGA)表明，在最高達(dá)200℃該固體沒有重量損失。
方法B在一個可選擇的方法中，通過在磁攪拌下在電熱板上加熱將2g依匹樂酮溶于350ml 15％乙腈和85％水的混合物中。一旦依匹樂酮已經(jīng)溶解，在磁攪拌下將該溶液于室溫冷卻過夜，通過真空過濾收集所得固體。該晶體有雙折射效應(yīng)，并具有三角形片狀晶體習(xí)性，該固體具有依匹樂酮晶形L的XPRD和DSC分析特征。TGA表明在最高達(dá)200℃也沒有任何重量損失。
方法C在一個可選擇的方法中，將640mg依匹樂酮置于具有20ml乙基苯的50ml燒瓶中。將所得漿液加熱至116℃，該混合物變成了澄清溶液，然后用30分鐘將其冷卻至25℃。在冷卻期間在84℃開始成核。將所得固體從該溶液中過濾出來，風(fēng)干，獲得了530mg固體(收率83％)。熱臺(Hot-stage)顯微鏡檢查和XPRD證實(shí)了該固體是依匹樂酮晶形L。
方法D在一個可選擇的方法中，將1.55g依匹樂酮加到20ml硝基苯中并加熱至200℃。將所得漿液在200℃攪拌過夜，該混合物變成了澄清溶液，然后通過自然空氣對流將其冷卻至室溫以分離出固體。通過XPRD和偏振光顯微鏡證實(shí)了該固體是依匹樂酮晶形L。
方法E在一個可選擇的方法中，將5.0g依匹樂酮(純度＞99％)加到82g(104ml)甲醇中。在攪拌作用(210rpm)下，將該溶液加熱至60℃，并在該溫度下保持20分鐘以確保完全溶解。然后在攪拌下以0.16℃/分鐘的速度將該溶液冷卻至-5℃。通過過濾收集所得固體，并在真空烘箱中于40℃真空干燥20小時。DSC和XPRD分析證實(shí)了該干燥的固體是純的依匹樂酮晶形L。
方法F在一個可選擇的方法中，將6.0g依匹樂酮(含有9％乙醇的乙醇合物，其校正純度為95.2％)加到82g(104ml)甲醇中。在攪拌作用(210rpm)下，將該溶液加熱至60C，并在該溫度下保持20分鐘以確保完全溶解。然后以0.14℃/分鐘的速度將該溶液冷卻至50℃，并在該溫度下保持2.5小時。然后在攪拌下以0.13℃/分鐘的速度將該溶液冷卻至-5℃。通過過濾收集晶體，并在真空烘箱中于40℃真空干燥16小時。DSC和XPRD分析證實(shí)了該干燥的固體是純的依匹樂酮晶形L。
實(shí)施例12從溶液中直接結(jié)晶晶形H將150.5mg二環(huán)氧化物和2.85g依匹樂酮加到1.5ml硝基苯中。將該混合物在200℃下磁攪拌幾小時。然后通過自然空氣對流將所得漿液冷卻至室溫。將樣品干燥并通過偏振光顯微鏡和XPRD分析樣品。XPRD分析表明該樣品是晶形H與晶形L的混合物。該晶體在顯微鏡下是半透明的，這表明沒有發(fā)生去溶劑化(和轉(zhuǎn)化成晶形H或晶形L)。
實(shí)施例13通過粉碎制備無定形依匹樂酮將大約1半鋼制Wig-L-Bug容器填充上約60g依匹樂酮(純度＞99.9％)。將鋼球和蓋放在該樣品容器上，并通過該Wig-L-Bug裝置攪拌30秒。將依匹樂酮從該Wig-L-Bug容器的表面上刮下來，并將該容器再攪拌30秒。通過XPRD和DSC分析所得固體，發(fā)現(xiàn)該固體是無定形依匹樂酮和依匹樂酮晶形L的混合物。
實(shí)施例14通過凍干制備無定形依匹樂酮稱重約100mg依匹樂酮粗品置于含有400ml水的燒杯中。將溶液輕微加熱5分鐘，然后超聲處理，并再攪拌5分鐘。將大約350ml依匹樂酮溶液過濾到含有50ml HPLC水的1000ml圓底燒瓶中。將該溶液于干冰/丙酮浴中迅速冷凍1-2分鐘。將燒瓶連接到Labconco Freezone 4.5冷凍干燥器上，并將其中的內(nèi)容物干燥過夜。將燒瓶中的固體轉(zhuǎn)移到棕色小瓶中。在偏振光顯微鏡下于10×、1.25×optivar放大倍數(shù)觀察在cargille油(1.404)中的小等分試樣，并觀察到至少有95％無定形依匹樂酮。圖24和25顯示了無定形依匹樂酮的XPRD圖和DSC差示熱分析圖。在圖24中，在39°2θ觀察到的峰是由于鋁樣品容器所致。
實(shí)施例15依匹樂酮多晶型物組合物制備含有25mg、50mg、100mg和200mg劑量依匹樂酮晶形L的片劑，且其具有以下組成
實(shí)施例16依匹樂酮多晶型物組合物制備含有100mg劑量依匹樂酮并具有以下組成的膠囊(明膠膠囊，#0)
實(shí)施例17依匹樂酮多晶型物組合物制備含有200mg劑量依匹樂酮、并具有以下組成的膠囊(硬明膠膠囊，大小#0)。
實(shí)施例18依匹樂酮細(xì)粉的制備首先，將干燥的依匹樂酮甲基乙基酮溶劑化物在FitZ碾磨機(jī)上經(jīng)由20目篩網(wǎng)過篩以使其解塊。然后，以約250kg/小時的加料速度在液氮冷卻下使用Alpine Hosakawa柱栓圓盤針式研磨(stud disk pin mil)粉碎操作對解塊的固體進(jìn)行針式研磨、針式研磨后的依匹樂酮的D90粒徑為大約65-100微米。
受試者群體某些小組更易患調(diào)節(jié)醛固酮作用的疾病。這些對醛固酮敏感的小組成員一般還對鹽敏感，其中個體的血壓通常分別隨鈉消耗的增加和減少而升高和降低。雖然不應(yīng)將本發(fā)明理解為限于這些小組的實(shí)施，但考慮這些受試者小組可能特別適于用抗炎劑量的本發(fā)明醛固酮阻滯劑來治療。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，受試者的部分或全部優(yōu)選為日本人種族或黑人種族中的一個成員。日本的高血壓是一個嚴(yán)重的問題。一項(xiàng)最近的研究提示，大約3千萬的日本成人患有高血壓(Saruta T.J ClinTher Med 1997；134024-9)。盡管血壓控制狀況最近在日本得到了改進(jìn)，高血壓控制仍被認(rèn)為是不夠的(Shimamoto；K.Japanese Cases.Nihon Rinsyo(Clinical Medicine in Japan)，2000；58(Suppl)593-6) Trends in blood pressure and urinary sodium and potassiumexcertion in Japanreinvestigation in the 8th year after theIntersalt Study.Nakagawa H等人Hum Hypertens 1999 Nov.；13(11)735-41推薦日本人增加飲食鉀以減少飲食鈉。
然而，限鈉方案在日本由于依從性差而受到了阻礙。由Kobayashi等進(jìn)行的一項(xiàng)日本人的研究制定了將飲食限制在5-8g/日的方案，但仍然難以達(dá)到良好的依從性。(kobayashi，Y等人Jpn Circ J1983；47268-75)。日本健康和福利部門推薦了將鈉限制在低于10克/日(Guidelines on treatment of hypertension In the elderly，1995---atentative plan for comprehensive research projects on aging andhealth---Members of the Research Group for“Guidelines onTreatment of Hypertension in the Elderly”，ComPrehensiveResearch Projects on Aging and Health，the 20 Ministry of Healthand Welfare of Iapan)。ogihara T等人，Nippon Ronen Igakkai Zasshi.1996；33(12)945-75)。盡管主動對公眾進(jìn)行了10年的教育，仍然存在很高的不依從率(估計(jì)高于約50％)，這由日本的正常和高血壓個體的尿鈉水平而測量(Kobayashi Y等人，Jpn Circ J；47(2)268-75)。
此外，日本人有兩個主要的群體鹽敏感和鹽不敏感(Preventivenutritional factors In epidemiologyInteraction between sodiumand calcium Mizushima S，Clin Exp Pharmacol Physiol 1999；26573)。已經(jīng)確認(rèn)許多日本人的高血壓是鹽敏感的。因此，表現(xiàn)出鹽敏感、高鈉攝取和不能主動限制鈉消耗的日本人種族成員尤其可以從本發(fā)明的治療獲益。
因此，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，需要治療的受試者是鹽敏感個體，他們?nèi)炕虿糠譃槿毡救朔N族的成員，并且具有或易患高血壓和/或心血管病，特別是選自以下一種或多種的心血管病心衰、左心室舒張功能障礙、肥厚性心肌病以及舒張性心衰。
黑人中的高血壓同樣是一個顯著的問題。許多高血壓和正常血壓的黑人是鹽敏感的(svetkey等人，Hypertension.1996；28854-8)。積累的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，在幾乎所有年齡和性別匹配的組中，黑人中高血壓的流行高于白人。高血壓黑人一般比高血壓白人具有更高的左心室功能障礙、中風(fēng)和腎臟損傷的發(fā)病率(但缺血性心臟病的發(fā)病率更低)(Eisner，GM.Am J Kidney Dis 1990；16(4 Suppll)35-40)。美國黑人中高血壓的流行原因很大程度上是環(huán)境引起的高鈉和酒精攝取、肥胖、身體活動少、以及心理壓力都被鑒定為原因(Flack，JM等人，J Assoc Acad Minor Phys 1991；2143-50)。
黑人和白人中都具有的問題的原因是不明確的，但似乎鈉處理上的差異可能會造成黑人高血壓患者的特定血液動力學(xué)和體液特征。已經(jīng)提出，限制尿鈉排泄能力的內(nèi)在或高血壓誘導(dǎo)的腎功能異常、Na+、K(+)-ATP酶泵活性的減少、其它膜離子運(yùn)輸失調(diào)、對心理壓力的不同暴露、更大的胰島素抵抗以及飲食因素(鈣和鉀攝取減少)可能起了一定作用(Flack，JM等人Hypertension；1991；17(Supp)1115-2)。一項(xiàng)研究表明，遺傳差異可能也會成為黑人中鹽敏感性的基礎(chǔ)(Syetkey LP等人Hypertension 1996；28854-8)。
黑人中的高血壓起初一般是通過限制飲食中的鈉攝取而控制的。如果飲食控制還不夠，推薦給予一種具有24小時效力并降低血管外周阻力、促進(jìn)鈉排泄、并潛在改進(jìn)腎臟血液動力學(xué)的抗高血壓劑(Eisner，GMAm J Kidney Dis 1990；16(4 Suppll)35-40)。然而，與白人相比，黑人一般對抗高血壓劑的反應(yīng)不同。總的說來，β-腎上腺素受體拮抗劑或ACE抑制劑的單一治療在黑人中不如白人中有效。黑人男性對ACE抑制劑的反應(yīng)甚至容易低于黑人女性(Eisner GM.Am J Kidney Dis 1990；16(4 Suppl 1)35-40)。因此，表現(xiàn)出鹽敏感、高鈉攝取和不能主動限制鈉消耗的黑人種族尤其可以從本發(fā)明的治療獲益。
因此，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，需要治療的受試者是鹽敏感個體，他們?nèi)炕虿糠譃楹谌朔N族的成員，并且具有或易患高血壓和/或心血管病，特別是選自以下一種或多種的心血管病心衰、左心室舒張功能障礙、肥厚性心肌病以及舒張性心衰。
非調(diào)節(jié)個體非調(diào)節(jié)個體表現(xiàn)出在腎血流速度和腎上腺醛固酮產(chǎn)生方面對高鈉攝取或血管緊張素II給藥的鈍化陽性反應(yīng)。這些非調(diào)節(jié)個體還可以表現(xiàn)出空腹胰島素水平的增加和葡萄糖刺激胰島素水平增加的增加(Ferri等人，Diabetes 1999；481623-30)。胰島素抗性也與心肌梗塞風(fēng)險的增加相關(guān)。
因此，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，需要治療的受試者是鹽敏感和非調(diào)節(jié)個體，他們(i)具有或易患胰島素抗性，特別是I型或II型糖尿病，和/或葡萄糖抗性，和/或(ii)具有或易患心血管病。
老年個體在鹽敏感個體中，對給定增加飲食鈉攝取的血壓升高反應(yīng)隨年齡增加。同樣，在老年個體中更容易觀察到鹽敏感性。而且，胰島素耐受類似地隨年齡增加。
因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，需要治療的受試者是至少55歲的鹽敏感個體，優(yōu)選至少約60歲，更優(yōu)選至少約65歲，并且具有或易患胰島素抗性，特別是I型或II型糖尿病，和/或葡萄糖抗性。
解毒的和恢復(fù)的酗酒者解毒的和恢復(fù)的酗酒者一般也是鹽敏感的(Genaro C等人，Hypertension 2000869-874)。因此，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，需要治療的受試者是鹽敏感個體，并且，是解毒或恢復(fù)的酗酒者。
肥胖肥胖個體一般是鹽敏感的。Bonner的研究(MMW Fortschr Med 1999；14 34-6)估計(jì)，44％的高血壓患者是超重的，并進(jìn)一步與鹽敏感性、細(xì)胞內(nèi)鈣升高、鈉儲留、和心輸出量的增加相關(guān)。此外，Dimsdale等人(AmJ Hypertens 1990；3429-35)報(bào)道了肥胖病人更容易反應(yīng)于鹽負(fù)荷而增加收縮壓。此外，鹽敏感兒童也增加了肥胖和心血管病的可能性(Falkner B等人，Am J Clin Nutr 1997；65618S-621S)。甚至在血壓正常的個體中，鈉敏感個體的體重容易超過鈉耐受性個體(RocchiniAP等人，Am J Med Sci 1994；307 SuppllS75-80)。因此，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，需要治療的受試者是鹽敏感個體，并且肥胖。
生物學(xué)評價人心血管病是復(fù)雜的病癥，一般由血管性高血壓或心肌梗塞(MI)引起。為了確定對心血管病的可能治療功效，在許多試驗(yàn)中確定組分的效力是重要的。因此，在試驗(yàn)″A″中，用血管緊張素II灌輸確定醛固酮拮抗劑依匹樂酮(環(huán)氧美沙樂酮)對血管炎癥高血壓大鼠模型的效力。在試驗(yàn)″B″中，描述了用醛固酮灌輸產(chǎn)生高血壓和血管炎癥來評價醛固酮拮抗劑依匹樂酮(環(huán)氧美沙樂酮)對大鼠模型的效力的研究。在試驗(yàn)″C″中，描述了用醛固酮灌輸產(chǎn)生高血壓和血管炎癥來評價醛固酮拮抗劑依匹樂酮(環(huán)氧美沙樂酮)對大鼠模型的效力的另一項(xiàng)研究。
此外，用臨床試驗(yàn)評價人的醛固酮拮抗劑治療。這些治療試驗(yàn)中的許多實(shí)例已公開，包括American Journal of Cardiology 78，902-907(1996)所述的RALES 003研究和New England Journal ofMedicine 341，709-717(1999)所述的RALES 004研究。
試驗(yàn)A體內(nèi)血管緊張素II灌輸模型方案方法●雄性Wistar大鼠(n＝50，10/組；BW＝200g)●待飲用的1％NaCl●實(shí)驗(yàn)組1.對照2.血管緊張素II(25ng/分鐘，皮下，通過alzet微型真空泵)3.血管緊張素II(25ng/分鐘，皮下)+依匹樂酮100mpk4.血管緊張素II(25ng/分鐘，皮下)+腎上腺切除術(shù)+地塞米松(12μg/kg/d，皮下)5.血管緊張素II(25ng/分鐘，皮下)+腎上腺切除術(shù)+地塞米松(12μg/kg/d，皮下)+醛固酮(40mg/kg/d，皮下，通過alzet微型真空泵)●通過每周尾套測定SBP●每天測定24小時食物和液體攝入和尿液排出●每天收集尿樣以測定尿電解質(zhì)●4周后通過exanguination處死。將血液收集在干燥管中以測定血清電解質(zhì)，收集在含EDTA的管中以測定醛固酮和腎上腺酮水平。
●用蘇米精和曙紅將心臟染色，并分析確定形態(tài)異常(即壞死、血管損傷)。
結(jié)果血壓所有接受血管緊張素II灌輸?shù)膭游锸湛s血壓升高。與接受賦形劑的動物相比，依匹樂酮和腎上腺切除術(shù)都沒有降低血壓。醛固酮灌輸升高血管緊張素II/鹽、腎上腺切除大鼠的血壓。圖23顯示這種收縮血壓升高。
電解質(zhì)排泄每日尿Na+排泄和尿K+排泄之間的比率(U Na+/K+比率)用作尿鈉排泄的指數(shù)。尿Na+/K+比率在開始處理前在所有的組中類似，并在所有動物中在開始高鹽飲食時類似地增大。尿Na+/K+比率在所有接受血管緊張素II灌輸?shù)膭游镏袥]有改變，直至第17天這些動物相對于賦形劑灌輸?shù)拇笫蠖云淠騈a+/K+比率顯著增大。類似的地作用發(fā)生在接受依匹樂酮的血管緊張素II灌輸動物，它們在灌輸?shù)?4天起顯示出尿Na+/K+比率增大。但是，依匹樂酮處理的大鼠沒有在任何時間點(diǎn)表現(xiàn)出比用賦形劑處理的血管緊張素II灌輸?shù)拇笫蟾叩哪騈a+/K+比率。實(shí)際上，僅在第21天觀察到顯著的變化，當(dāng)灌輸血管緊張素II時，賦形劑處理的大鼠表現(xiàn)出比依匹樂酮處理的動物更高的尿Na+/K+比率，表明在這些實(shí)驗(yàn)條件下依匹樂酮不產(chǎn)生顯著的利尿或促尿鈉排泄作用。進(jìn)行或不進(jìn)行醛固酮灌輸?shù)哪I上腺切除動物總是表現(xiàn)出比腎上腺完整動物更高的尿Na+/K+比率。
心肌損傷.10只血管緊張素II/鹽處理的動物中有7只產(chǎn)生冠狀動脈血管炎性改變。這些改變的特征是血管周圍空間白細(xì)胞滲透，主要是巨噬細(xì)胞滲透。在某些動脈中觀察到血管中膜的纖維蛋白樣壞死。在某些情況下，當(dāng)損傷廣泛時，存在與周圍心肌有關(guān)的心肌細(xì)胞壞死。在這些情況下觀察到實(shí)質(zhì)性出血，與心肌壞死的發(fā)現(xiàn)一致。僅在10只接受依匹樂酮的血管緊張素II灌輸?shù)膭游镏械囊恢簧嫌^察到這些血管炎性損傷，盡管這些動物與賦形劑處理的血管緊張素II灌輸大鼠一樣具有高血壓(參見圖24)。類似地，腎上腺切除術(shù)防止心臟血管炎性損傷。但是，醛固酮補(bǔ)充恢復(fù)了嚴(yán)重的冠脈和心肌炎癥以及在血管緊張素-II灌輸、腎上腺完整、賦形劑處理大鼠上觀察到的損傷。
采用環(huán)加氧酶-2特異性抗體免疫染色血管緊張素II灌輸大鼠心臟鑒定在動脈周圍炎癥區(qū)域中，主要在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中存在這種酶。還在冠狀動脈的血管中層的血管平滑肌細(xì)胞中觀察到環(huán)加氧酶-2染色，甚至在血管周圍空間沒有明顯的形態(tài)變化或炎性聚集(圖26)。依匹樂酮處理以及腎上腺切除術(shù)顯著地降低，并在大部分情況下完全防止血管緊張素II灌輸大鼠心臟中環(huán)加氧酶-2的表達(dá)(參見圖25和27)。給血管緊張素-II、腎上腺切除大鼠補(bǔ)充醛固酮恢復(fù)冠狀動脈中環(huán)加氧酶-2的存在。
骨橋蛋白(還已知為早期T細(xì)活化-1，Eta-1)是一種具有前炎癥特征的分泌型糖蛋白，它調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的化學(xué)吸引、活化和遷移。用骨橋蛋白特異性抗體將血管緊張素II灌輸?shù)?、飲用鹽水的大鼠免疫染色鑒定冠狀動脈血管中膜中存在骨橋蛋白。依匹樂酮處理和腎上腺切除術(shù)防止血管緊張素II灌輸?shù)娘嬘名}水的大鼠心臟中骨橋蛋白表達(dá)(圖28和29)。醛固酮補(bǔ)充恢復(fù)腎上腺切除動物中骨橋蛋白表達(dá)。
試驗(yàn)B體內(nèi)醛固酮灌輸模型方案2方法●雄性Sprague Dawley大鼠(n＝39；BW＝250g)●待飲用的1％NaCl●在植入微型真空泵中進(jìn)行單測腎切除術(shù)●實(shí)驗(yàn)組1.對照2.醛固酮(0.75mg/小時，皮下，通過alzet微型真空泵)2.醛固酮(0.75mg/小時，皮下，通過alzet微型真空泵)+依匹樂酮100mpk，口服1.醛固酮(0.75mg/小時，皮下，通過alzet微型真空泵)+在飲用液體中的0.6％KCl●第1、2和3組僅接受在飲用溶液中的0.3％KCl。
●通過在腹主動脈插入放射遙測術(shù)探針來測定SBP。
●4周后處死。
→收集心臟并通過中部心室橫切面分成兩半上半部分保存于福爾馬林。下部分在液氮中快速冷凍以用于進(jìn)行生物化學(xué)分析。
●用蘇木精和曙紅和膠原特異性染料picro-sirius紅將心臟染色，并分析測定間質(zhì)膠原體積分?jǐn)?shù)和形態(tài)異常(即壞死、血管損傷)。
●測定冷凍心臟的羥基脯氨酸濃度。
●通過定量RT-PCR(Taqman)測定骨橋蛋白和COX-2。還通過免疫組織化學(xué)鑒定心臟中的骨橋蛋白。
結(jié)果血壓所有接受醛固酮灌輸?shù)膭游锸湛s血壓升高。依匹樂酮處理顯著降低血壓，但沒有使血壓正常化。圖43圖示這些結(jié)果。
心肌損傷飲用鹽、單側(cè)進(jìn)行腎切除手術(shù)的大鼠沒有心肌損傷。通過組織學(xué)測定間質(zhì)膠原體積分?jǐn)?shù)或通過生物化學(xué)測定羥基脯氨酸濃度證明在接受醛固酮/鹽處理的動物中不存在心肌纖維化。但是，檢查醛固酮/鹽處理的大鼠中蘇木精和曙紅染色的心臟證明嚴(yán)重的血管炎性損傷。這些損傷與方案1所述的損傷相同。依匹樂酮給藥完全抑制醛固酮灌輸、飲用鹽水、單側(cè)腎上腺切除大鼠的血管炎性變化(圖32)，盡管它沒有使血壓正?；?。飲食鉀的升高并沒有顯著影響醛固酮誘導(dǎo)的損傷的發(fā)展，因?yàn)檫@些動物表現(xiàn)出與接受賦形劑的醛固酮/鹽處理大鼠類似的損傷水平。
在第28天測定血清骨橋蛋白水平，并對每組進(jìn)行測定(飲用NaCl 1％的大鼠，飲用NaCl 1％及醛固酮的大鼠，飲用NaCl 1％及醛固酮和依匹樂酮的大鼠)。圖48表示依匹樂酮處理大鼠中循環(huán)骨橋蛋白水平的顯著降低。
還對這些動物心臟進(jìn)行骨橋蛋白免疫染色。在未接受醛固酮的飲用鹽水、單側(cè)腎上腺切除動物上未檢測到骨橋蛋白。但是，在接受醛固酮灌輸?shù)膭游锏墓跔顒用}的血管中膜中鑒定骨橋蛋白。依匹樂酮處理，防止醛固酮灌輸大鼠心臟中骨橋蛋白的表達(dá)(圖30和40)。增加飲食鉀并沒有降低骨橋蛋白表達(dá)。通過定量RT-PCR測定骨橋蛋白mRNA，表明接受賦形劑的醛固酮/鹽處理大鼠心臟中細(xì)胞因子明顯(7倍)上調(diào)(相對mRNA表達(dá)1.7±0.2 vs 12.25±1.7，P＜0.0001)。依匹樂酮(相對mRNA表達(dá)2.5±0.6，P＜0.0001對醛固酮/鹽+賦形劑組)防止這種作用。與環(huán)加氧酶-2在心臟醛固酮誘導(dǎo)的血管炎癥發(fā)展中的作用一致的是，醛固酮/鹽+賦形劑處理的大鼠的COX-2mRNA表達(dá)增加3倍(相對mRNA表達(dá)1.2±0.12對3.7±0.46，P＜.0001)。與對骨橋蛋白表達(dá)的作用類似的是，依匹樂酮防止醛固酮/鹽處理大鼠的COX-2表達(dá)增加(相對mRNA表達(dá)1.8±0.36，P＜0.01對醛固酮/鹽+賦形劑組，參見圖31和39)。
以上數(shù)據(jù)表明，醛固酮調(diào)節(jié)高血壓大鼠心臟的血管炎性表型。這種表型與動脈血管中膜的血管平滑肌中細(xì)胞因子骨橋蛋白和酶環(huán)加氧酶-2的上調(diào)有關(guān)，從而可能調(diào)節(jié)觀察到的血管周圍炎癥和結(jié)果的冠狀動脈和心肌的局部缺血/壞死損傷。在不意受限于任何理論的情況下，認(rèn)為這是調(diào)節(jié)在疾病，例如心衰、冠狀動脈疾病、自體免疫或病毒心肌炎、結(jié)節(jié)性動脈外膜炎、中風(fēng)和腎硬化中觀察到的血管改變機(jī)制。圖33顯示骨橋蛋白和環(huán)加氧酶以類似的冠狀動脈壁的區(qū)域表達(dá)。盡管理論對本發(fā)明不起作用，但圖34表示這種模型的一種建議的機(jī)理。在這些實(shí)例中，依匹樂酮處理防止心臟血管炎癥的程度類似于腎上腺切除術(shù)，如在方案#1所示。依匹樂酮的作用很大程度上獨(dú)立于收縮血壓原發(fā)性降低，如方案#1證明。依匹樂酮在血管緊張素II/鹽性高血壓大鼠中利尿或促尿鈉排泄作用的缺乏表明選擇性醛固酮拮抗劑的保護(hù)作用還獨(dú)立于其對上皮組織的潛在作用。此外，飲食鉀升高難以模仿依匹樂酮的作用的事實(shí)，反駁了依匹樂酮通過其鉀潴留性能提供益處的可能性。因此，我們建議醛固酮對冠狀血管可能直接具有有害作用，其與這種激素在上皮組織電解質(zhì)動態(tài)平衡中的作用或其對血壓的作用無關(guān)。依匹樂酮對人的給藥可以通過其在血管化的器官，包括但不限于心臟、腎和腦中的抗炎作用提供優(yōu)點(diǎn)，如本實(shí)驗(yàn)建議。
試驗(yàn)C進(jìn)一步的體內(nèi)醛固酮灌輸研究將試驗(yàn)B的方法擴(kuò)展至進(jìn)一步的研究。單側(cè)腎切除手的Sprague-Dawley大鼠飲用1％NaCl-0.3％KCl和進(jìn)行一種以下處理賦形劑；醛固酮灌輸或醛固酮灌輸與依匹樂酮(100mg/kg/day)聯(lián)合。30天后醛固酮/鹽處理誘導(dǎo)大鼠嚴(yán)重高血壓，其通過依匹樂酮得以顯著降低。在處理后第7、14或30天檢查每一處理組動物的心肌組織。組織病理學(xué)分析表明血管炎性損傷起始于第14天，并延伸至心肌周圍，導(dǎo)致病灶局部缺血/壞死變化。損傷之前是前炎癥分子表達(dá)和漸進(jìn)性上調(diào)。通過依匹樂酮處理顯著地減少前炎癥分子上調(diào)和相關(guān)的血管與心肌損害。這些數(shù)據(jù)證明依匹樂酮有效地降低血壓，并提供對醛固酮誘導(dǎo)的心臟血管炎癥損害的終點(diǎn)器官保護(hù)作用。
動物將雄性Sprague-Dawley大鼠，重230-250g，(HarlanSprague-Dawley Industries，Indianapolis，IN)籠養(yǎng)于12小時亮/12小時暗日循環(huán)和22±1℃(n＝96)的外周溫度的室內(nèi)。動物在到達(dá)之后調(diào)整一周并自由獲取TEKLAD 22/5嚙齒動物食物(Harlan TEKLAD，Madison，WI)和自來水直至實(shí)驗(yàn)開始。
實(shí)驗(yàn)方案在手術(shù)前，將動物單獨(dú)稱重，并置于以下小組之一(I)高鹽對照(賦形劑/普通固型食物/1％NaCl和0.3％KCl飲用水，n＝31，涉及3個時間點(diǎn)組)，(II)醛固酮對照(醛固酮/普通固型食物/1％NaCl和0.3％KCl飲用水，n＝28，涉及3個時間點(diǎn)組)，(III)100mg/kg/天依匹樂酮(醛固酮/依匹樂酮固型食物/1％NaCl和0.3％KCI飲用水，n＝30，涉及3個時間點(diǎn))。將氯化鉀補(bǔ)劑加到鹽溶液以防止與醛固酮過量有關(guān)的潛在低血鉀。
在手術(shù)時的處理，將含有賦形劑(9％乙醇/87％丙二醇/4％dH2O)或1.0mg/mL d-醛固酮(Sigma Chemical，St.Louis，MO)的Alzet 2002滲透微型真空泵(Alza Corp.，Palo Alto，Calif.)皮下插入頸背。以0.75μg/小時的劑量施用醛固酮。以固型食物(計(jì)算遞送100mg/kg/天)的濃度將依匹樂酮加到TEKLAD22/5嚙齒動物食物(Harlan TEKLAD，Madison，Wis.)。先前的分析工作表明依匹樂酮在這種食物中的穩(wěn)定性以及在制備后獲得的均勻性。對于每組(n＝8-13)在處理后7、14或30天處死動物。
手術(shù)方法在處理后第7或14天處死的動物進(jìn)行單側(cè)腎切除，并植入Alzet微型真空泵。對處理30天的動物進(jìn)行單側(cè)腎切除，配合Alzet微型真空泵，并根據(jù)以下方法植入放射遙測單元(型#TA11PA-C40，DataSciences Inc.，St.Paul，Minn.)。用5％異氟烷(SOLVAY Animal HealthInc.，Mendota Heights，Minn.)麻醉動物，用VMS麻醉裝置將其在O2中遞送(Matrix Medical，Inc.，Orchard Park，N.Y.)。用1-2％異氟烷通過手術(shù)方法保持麻醉。夾住手術(shù)部位，用洗必泰擦洗，并用聚烯吡酮碘噴霧。用11號解剖刀片作喙尾部切口通過胸腔基底的皮膚至恥區(qū)。作第二切口通過腹壁肌肉以暴露腹腔。分離左腎尿道、腎動脈和靜脈，用4-0絲打結(jié)，并將腎切除并棄去。小心地用組織牽開器處理器官以暴露腹主大動脈。清除腹主動脈分歧進(jìn)入回腸動脈的口的1.5cm片段周圍過量的結(jié)締組織，并用4-0絲與大動脈附近錨定。然后將微血管夾置于清除區(qū)域的兩端以終止過度的血液流動。使用彎曲、21標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格針穿透腹主大動脈。插入放射遙測單元的套管并用4-0絲錨定于大脈。重新放置器官，并將遙測單元置于器官上。用帶4-0絲的非中斷的縫合方式將腹壁封閉，然后用4-0絲以中斷縫合方式封閉皮膚。在縫合處附近用100μL麻醉劑麻卡因HCl(Sanofi Winthrop Pharmaceuticals，New York，N.Y.)注射動物，并注射(i.m.)抗生素頭孢羥唑鈉甲酸酯(Eli Lilly &Co.，Indianapolis，Ind.)。手術(shù)后護(hù)理包括在回收期間在加熱板上監(jiān)測動物直至重新恢復(fù)胸骨橫臥。每天監(jiān)測動物的痛苦癥狀和手術(shù)部位的感染。用0.1-0.5mg/kg，皮下施用Buphrenorphine(Rickett & ColmanPharmaceuticals，Inc.Richmond，VA)處理手術(shù)后的繼續(xù)表現(xiàn)出不適的動物。然后將動物獲得自來水和TEKLAD22/5嚙齒動物食物(HarlanTEKLAD，Madison，WI)。
血壓分析用DATAQUEST A.R.T 1.1版Gold軟件(Data SciencesInternational，St.Paul，Minn.)計(jì)算放射遙測的動脈血壓。對于每只動物在24小時期間內(nèi)用設(shè)定為每5分鐘進(jìn)行10秒讀數(shù)的收集速率收集數(shù)據(jù)點(diǎn)。所用的24小時期間為6:00a.m.至6:00a.m。
處死在每次實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)結(jié)束時，用戊巴比妥(65mg/kg i.p.，SigmaChemical，St.Louis MO)麻醉動物，并用Mettler PM6000天平(Mettler-Toledo，Inc.，Hightstown，N.J.)稱重。打開腹腔以暴露腹主大動脈。將16-標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格針插到腹主大動脈，并將動物抽血至12cc注射器。立即將血樣轉(zhuǎn)移到玻璃血清收集管(Terumo Medical Corp.，Elkton，Md.)以進(jìn)行藥物水平分析。將樣品置于濕冰直至完成樣品收集，并在4℃下以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。
在抽血之后，分離心臟和腎，移出，用冷的磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，并吸干。立即通過用刀片沿長軸將腎分為兩部分，并將其置于10％中性緩沖的福爾馬林(NBF，Richard-Allen Scientific，Kalamazoo，MI)。對于心臟，將右心室(RV)與左心室切開，用Mettler AEl63天平(Mettler-Toledo，Inc.，Hightstown，N.J.)對二個心室稱重，并將右心室置于10％NBF。移出2mm左心室頂端的冠狀厚塊，用干冰/異戊烷冷凍以分析基因表達(dá)，并將左心室的剩余部分置于10％NBF以進(jìn)行固定。在固定后3-4天完成最后的濕修整，其中取出第二個2mm冠狀厚塊以進(jìn)行羥基脯氨酸分析，并從中緯區(qū)移出第三個2mm厚塊以進(jìn)行組織學(xué)分析。
組織處理和染色用自動組織處理器(Hypercenter XP，Shandon/Lipshaw Inc.，Pittsburgh，PA)常規(guī)石蠟處理心臟中緯區(qū)，并將其包埋入新鮮石蠟中，頂面向下(Shandon Embedding Center，Shandon/Lipshaw Inc.)。用Leica RM2035旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica Inc.，Houston，Texas)從每個組織區(qū)塊中切除5個10μm切片，并將其封固于Superfrost/Plus顯微鏡玻片(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)。用膠原特異性染料，Picrosirius紅F3BA(飽和苦味酸(Sigma Chemical，St.Louis，MO)和0.1％(w/v)Sirius紅F3BA(C.I.#35780，Pfaltz & Bauer，Inc.Waterbury，CN)(6)將10μm切片染色。用水將封固的組織水合。然后用含0.2％(w/v)磷鉬酸(Sigma Chemical，St.Louis MO)的蒸餾水將玻片培養(yǎng)15分鐘，將其轉(zhuǎn)移到0.1％Picrosirius紅F3BA染料，持續(xù)110分鐘，在95％乙醇w/1％乙酸(v/v)中放置1分鐘，然后在100％乙醇中進(jìn)行2次1分鐘培養(yǎng)，并在二甲苯中清洗1分鐘。用#1蓋玻片和Permount組織封固劑(Fisher Scientific)蓋片。為每只動物切2個封有5μm切片的玻片。一個玻片用蘇木精和曙紅染色處理，一個用高碘酸Schiff(PAS)染色處理。蘇木精和曙紅和PAS用于對心臟進(jìn)行病理打分。
組織病理分析如前述并進(jìn)行細(xì)微修改(7)來進(jìn)行心肌損傷半定量。簡言之，0-4刻度用于給心肌損傷水平打分。0分代表沒有損害。1分代表存在血管和血管周圍炎癥損害但沒有心肌細(xì)胞損傷。在觀察到一個清楚的心肌壞死區(qū)域時打2分。心肌壞死定義為在心肌細(xì)胞中存在壞死性損害，例如核固縮或核溶解、非收縮性邊緣波狀纖維和細(xì)胞質(zhì)的嗜曙紅細(xì)胞過度增多，或者明顯的心肌細(xì)胞膜破壞癥狀。當(dāng)發(fā)現(xiàn)2個或更多個單獨(dú)的壞死區(qū)時(意味著存在2個不同的內(nèi)折區(qū))，心臟接受的打分為3分。4分指定表現(xiàn)出廣泛的包括大于50％的左心室的壞死區(qū)域的心臟。
圖像分析Picrosirius紅F3BA染色的玻片用于用Videometric 150 Image分析系統(tǒng)(Oncor Inc.，Gaitherburg，Md.)對間質(zhì)膠原進(jìn)行定量。簡言之，用與Nikon Optiphot顯微鏡(Nikon Inc.)相連的Nikon E Plan10/0.25；160/-物鏡(Nikon Inc.Garden City，N.Y.)捕捉圖像。Toshiba 3 CCD彩色攝影機(jī)(Model#IK-T30T，Toshiba Corp.Japan)轉(zhuǎn)播來自顯微鏡的RGB格式的圖像至具有V150視頻板的386計(jì)算機(jī)。V150視頻板/V150軟件應(yīng)用程序(Oncor Inc.)將RGB圖像轉(zhuǎn)化成HIS(Hue，Intensity，Saturation)格式以在放大率為305×的Sony Trinitron彩色攝影機(jī)(Model#PVM-1342Q，Sony Corp，Tokyo，Japan)上顯示和分析。一旦在圖像監(jiān)示器上顯示圖像，則通過稱為限定閾值的方法定義待測定的像素的色調(diào)、亮度和飽和度。然后將V150應(yīng)用程序僅衡量落入閾值限內(nèi)的像素。用測微計(jì)刻度(EM Sciences，F(xiàn)T.Washington，Pa.19034)校準(zhǔn)系統(tǒng)，它以mm2或μm2為單位表示數(shù)據(jù)。在每次測定之后，將數(shù)據(jù)自動保存成ASCII文件格式，并轉(zhuǎn)化成Microsoft Excel 7.0版以進(jìn)行最后的合計(jì)。
免疫組織化學(xué)在二甲苯將5μm切片脫蠟(二次，5-10分鐘培養(yǎng))，并如下通過在乙醇中培養(yǎng)3分鐘再次水合在100％乙醇中進(jìn)行2次培養(yǎng)，然后在95％醇中2次培養(yǎng)，并在70％醇中1次培養(yǎng)。一旦水合，用自來水將切片沖洗1分鐘，并用蒸餾水沖洗1分鐘。通過將玻片在3.0％H2O2中放置15分鐘，然后用蒸餾水沖洗5分鐘來阻斷內(nèi)源性過氧化物活性。用檸檬酸，pH6.0處理玻片以進(jìn)行抗原恢復(fù)。將玻片加熱至沸騰，在25℃下冷卻20分鐘，并用蒸餾水沖洗。用DAKO自動染色器(DAKO Corporation，Carpinteria，Calif.)將玻片染色。在染色前，沖洗玻片并在封閉緩沖劑中培養(yǎng)20分鐘。封閉緩沖劑在Vectastain ABC試劑盒(Vector Labs，Burlingame，Calif.)中描述，且包含10mL TNB(NEN TSA生物素系統(tǒng)試劑盒，Cat#NEL700A，NEN Life ScienGe Products，Boston，Mass.)和3滴正常(對應(yīng)于第二抗體)血清。
用于染色的主要抗體包括1∶100稀釋的骨橋蛋白(Mousemonoclonal，Cat#MPIIIb10，Developmental Studies Hybridoma Bank，The University of Iowa，Iowa City，Iowa)；1∶500稀釋的ED-1(抗巨噬細(xì)胞糖蛋白，小鼠單克隆，MAB1435，Chemicon International Inc.，Temecula，Calif.)；1∶300稀釋的CD-3(抗T細(xì)胞，兔多克隆親合力純化抗體，A0452，DAKO Corporation，Carpineria，Calif.)；1∶100稀釋的ICAM-1(山羊多克隆親合力純化，M-19sc-1511，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，Calif.)；1∶100稀釋的VCAM-1(山羊多克隆親合力純化，C-19sc-1504，Santa Cruz Biotechnology)。用主要抗體將玻片培養(yǎng)60分鐘，然后用最終濃度為5μL/mL的生物素化抗體在25℃下培養(yǎng)30分鐘。用Vectastain ABC-AP試劑盒(VectorLaboratories)和二氨基聯(lián)苯胺染色法(DAKO Corporation，Carpinteria，Calif.)使染色顯色。用水沖洗玻片并用蘇木精反染色大約30秒。將同型相符的IgG(Sigma Chemical，St.Louis MO)用作主要抗體的陰性對照。
骨橋蛋白mRNA的原位雜交基于大鼠骨橋蛋白的序列(GenBank登錄號#NM 008608-1)產(chǎn)生RNA探針。簡言之，通過RT-PCR使用以下引物產(chǎn)生大鼠骨橋蛋白的cDNA片斷正向引物，5′-TGG CAC ATT TGT CTT；反向引物，3′AGC CCA TCC AGTC。用TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Calif.)將cDNA片斷插入PCR II質(zhì)粒。在100μL包含以下的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物中標(biāo)記探針rRNasin(2U)、DNase(0.5U)、TE緩沖液(1X)、rGTP(10mM)、rCTP(10mM)、rATP(10mM)、rUTP(10mM)、(PROMEGA，Madison，Wis)、5μL(50μCi)33P-UTP(Elkin Pelmer，Boston，MA)和適宜的RNA聚合酶(Sp6 RNA聚合酶；T7 RNA聚合酶、PROMEGA)，在37℃下持續(xù)60分鐘。用MicroconYM-50微型濃縮器(Amicon，Bedford，MA)從反應(yīng)物中移出游離標(biāo)記物。在二甲苯中將切片脫蠟，在分級乙醇溶液中如以上所述進(jìn)行再水合，并在4％多聚甲醛(EMS，F(xiàn)t.Washington，Pa.)中于4℃下固定10分鐘。然后用蛋白酶K(5mg/mL；10分鐘，37℃，Roche，Indianapolis，IN)將組織消化，并用0.5X SSC緩沖液(鹽水-檸檬酸鈉緩沖液)洗滌(10分鐘)。在分級的一系列乙醇中連續(xù)脫水之后進(jìn)行預(yù)雜交，如上述作反轉(zhuǎn)處理以進(jìn)行再水合，然后在雜交緩沖液(50％甲酰胺，2X SSC，10％硫酸右旋糖酐，v/v)中于42℃下培養(yǎng)2小時。用含有tRNA(50μg/mL，Sigma，St.Louis，MO)的雜交緩沖液和適宜標(biāo)記的探針在55℃下雜交過夜。然后連續(xù)地用2X SSC緩沖液，0.1X SSC-EDTA緩沖液(0.1X SSC，1mM EDTA)和2x SSC緩沖液將雜交組織洗滌1小時40分鐘。最后在如上述包含NH4OAc(各2分鐘)的一系列分級的乙醇中將玻片脫水，并在真空干燥器中于室溫下干燥1.5小時。將組織過夜暴露于磷篩網(wǎng)。用照相乳液(Kodak，Rochester，N.Y.)涂布玻片，并在4℃下曝光3-5周，然后顯影。用蘇木精和曙紅將顯影的玻片反染色。
TaqMan分析的原理使用Applied Biosystems′7700 Sequence DetectionSystem(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，Calif.)進(jìn)行熒光5′-核酸酶分析(TaqMan PCR)允許通過監(jiān)測基因特異性、染料標(biāo)記的寡核苷酸探針的熒光的增大而實(shí)時檢測/定量特定的基因。用于目標(biāo)和對比基因的探針在5′-端用6-羧基熒光素(6FAM)報(bào)告染料標(biāo)記，在3′-端用6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基羅丹明(TAMRA)猝滅劑染料標(biāo)記。當(dāng)將探針退火至目標(biāo)基因時，通過緊密相鄰的TAMRA防止6FAM的熒光。Taq聚合酶的外切核酸酶活性通過取代來自目標(biāo)序列的探針來釋放來自寡核苷酸探針的染料，導(dǎo)致與存在的目標(biāo)信息的數(shù)量成正比的熒光激發(fā)。用來自Applied Biosystems的Sequence Detection System軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
TaqMan引物和探針TGFβ1、ANP、膠原I、膠原III用Oligo Primer Analysis Software，5.0版(NationalBiosciences Inc.(NBI)-Wojciech Rychlik，Cascade，CO)設(shè)計(jì)引物和探針。由Life Technologies(Grand Island，N.Y.)合成引物，并由Applied Biosystems合成探針。由大鼠基因的已知序列設(shè)計(jì)引物/探針組以作分析。將所有的目標(biāo)基因值根據(jù)比較基因組成型表達(dá)的親環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)化。引物/探針組序列可見于表8。
表8TaqMan RT-PCR基因標(biāo)記引物/探針組
所有的寡核苷酸寫成5′-3′。引物未標(biāo)記或者所有的探針在5′端用6-羧基熒光素(6FAM)受體染料標(biāo)記，并在3′端用6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基羅丹明(TAMRA)猝滅劑染料標(biāo)記。
RNA分離TGFβ1、ANP、膠原I、膠原III根據(jù)制造商教導(dǎo)(Leedo Medical Laboratories，Inc.，Houston，Texas)用1.5mL RNA-STAT 60從冷凍(-70℃)的左心室組織(大約10-20mg)中提取RNA。簡言之，用配備5mm探針(Ultra-Turrax T8Homogenizer，IKA Works，Inc.Wilmington，N.C.)的組織均化器均化組織。在均化之后，在室溫下周期性混合10分鐘來培養(yǎng)等體積的分子級氯仿(Sigma Chemical Co.)。將樣品在12,000g下離心10分鐘，并通過加入等體積的分子級異丙醇(Sigma Chemical Co.)而從頂層沉淀RNA，然后在-80℃下培養(yǎng)過夜。通過在12,000g下離心使RNA沉淀，用75％乙醇洗滌，并在不含核酸酶的水(Promega，Madison，WI)中溶解。將RNA稀釋并用分光光度法分析濃度和純度(A260/A280＝1.9-2.0，且平均產(chǎn)率為2-5μg RNA)。
逆轉(zhuǎn)錄TGFβ1、ANP、膠原I、膠原III通過將400ng RNA(4μL)加到20μl包含15％不含核酸酶的水(Promega，Madison，WI)、1X RT緩沖液(Life Technologies，GrandIsland，N.Y.)、10mM DTT(Life Technologies)、0.5mM每種dATP、dTTP、dGTP、dCTP(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，Calif.)、2.5μM寡聚d(T)15(Oligo Therapeutics，Inc.，Wilsonville，Oreg.)、40單位RNAsin(Promega)和200個單位SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)的最終體積而合成雙鏈cDNA。在帶蓋薄壁反應(yīng)管中(Applied Biosystems)進(jìn)行反應(yīng)以確保準(zhǔn)確的反應(yīng)溫度。用GeneAmp9600熱循環(huán)控制裝置(Applied Biosystems)根據(jù)以下方案進(jìn)行反應(yīng)在37℃下1小時，在95℃下5分鐘，和在4℃下10分鐘。
TaqMan分析TGFβl、ANP、膠原I、膠原III各PCR反應(yīng)物包含以下2.5μL(50ng)各cDNA，其加到22.5μL含有以下的PCR混合物38.5％不含核酸酶的水(Promega)，1X PCR緩沖液II、2mM MgCl2、0.05U/μL AmpliTaq Gold(PCR Core Reagent Kit，N808-0228，Applied Biosystems)、300nM每一種正向和反向引物(LifeTechnologies)、200nM探針(Applied Biosystems)和200μM各種dATP、dTTP、dGTP和dCTP(Applied Biosystems)。在帶MicroAmp光學(xué)蓋MicroAmp光學(xué)管(Applied Biosystems)中設(shè)立單一反應(yīng)物，并將其裝載至7700序列檢測器。將以下方案應(yīng)用于所有反應(yīng)在95℃下10分鐘(聚合酶活化)、在95℃下10秒循環(huán)(變性)和在57℃下1分鐘(退火)。
TaqMan引物和探針COX-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1使用補(bǔ)充7700 Sequence Detection System的Primer Express軟件設(shè)計(jì)所有的引物和探針，并通過Applied Biosystems合成。用5倍稀釋的總RNA(來自200ng-320pg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定設(shè)置在TaqMan反應(yīng)中的每種引物/探針在實(shí)驗(yàn)樣品分析前的效率。由已知的待分析的大鼠基因序列設(shè)計(jì)引物/探針組。將所有的目標(biāo)基因值根據(jù)對比基因組成表達(dá)的親環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)化。引物/探針序列見于表8。
RNA分離COX-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1用完全RNA分離試劑盒(Ambion，Inc.，Austin，TX)從冷凍的(-80℃)的大鼠心臟組織中提取RNA。用不銹鋼臼和研棒壓碎已冷卻至-80℃的組織，并轉(zhuǎn)移至含有3-10mL冷的變性緩沖液的杜恩斯均化器(Kontes，Vineland，N.J.)。將組織均化并轉(zhuǎn)移至無菌、15mL聚丙烯離心管中。加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，將樣品劇烈振蕩1分鐘，并在冰上培養(yǎng)至少15分鐘。在10,000g下將樣品離心30分鐘。移出水相，加入1/10體積的乙酸鈉溶液(3.0M NaOAc pH4.5)，并將樣品振蕩或倒置10秒，加入與原始樣品體積相等體積的酸-酚(與異丙醇預(yù)混合)∶氯仿(5∶1，Ambion，Inc.)。將樣品劇烈攪拌1分鐘，然后在冰上培養(yǎng)15分鐘，并在10,000g下離心30分鐘。移出水相，并將其置于清潔的聚丙烯管中。加入等體積的異丙醇(Sigma，St.Louis，Mo.)，并將樣品混合并在-20℃下培養(yǎng)過夜。將樣品在10,000g下離心30分鐘，移出上清液，并將RNA沉淀再懸浮在不含DNAse/RNAse的水中。在-80℃下將樣品冷凍至少2小時，在濕冰上融化，并稀釋用于定量。
所有的RNA還通過DNase消化純化除去基因組DNA，并進(jìn)行LiCl沉淀以除去糖類。各RNA(100μg)在37℃下與在含有40mM Tris pH7.8、6mM MgCl2、10mM CaCl2的緩沖液中的1單位的DNAse(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)和10單位的RNAse抑制劑(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，Calif.)一起培養(yǎng)45分鐘。使用用于RNA清除(Qiagen，Valencia，Calif.)的RNeasy Mini方案除去DNAse和緩沖液。然后用等于樣品體積一半的體積的7.5M LiCl/50mM EDTA(Ambion，Inc.，Austin，TX)沉淀RNA，在-20℃下培養(yǎng)過夜，并在4℃下于13-16,000g下離心30分鐘。在-80℃下將所有的RNA冷凍至少2小時，融化，稀釋并進(jìn)行分光光度法分析濃度和純度。
TaqMan分析COX-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1如下完成TaqMan反應(yīng)。將10μL(200ng)總RNA(DNAsed和LiCl沉淀)加到包含以下的15μLRT-PCR反應(yīng)混合物12.5μL不含尿嘧啶-N-糖基化酶(包含AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTP和dUTP、陰性對照和最佳緩沖液組分)的2X一步PCR Master Mix、0.625μL 40X MultiScribe和RNAse抑制劑Mix、0.625μL 20μM正向引物、0.625μL 20μM反向引物、0.5μL的5μMTaqMan探針和0.125μL不含DNAse/RNAase的水。將反應(yīng)物2等份裝在帶MicroAmp光學(xué)蓋或粘合蓋的MicroAmp光學(xué)96孔反應(yīng)平板(Applied Biosystems)，并將其裝載至7700序列檢測器。將以下方案應(yīng)用于所有反應(yīng)在48℃下30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄)、95℃下10分鐘(逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶活化失活)、95℃下15秒(變性)和6℃下1分鐘(退火)的循環(huán)進(jìn)行40個。
羥基脯氨酸分析通過對如前述的氧化羥基脯氨酸和對二甲基氨基苯甲醛之間的反應(yīng)進(jìn)行定量的比色法分析測定心肌羥基脯氨酸濃度(4)。簡言之，在60℃下用Reacti-Therm加熱儲備液(Pierce，Rockford，IL)將組織干燥18小時并稱重。用2mL 6N HCl在150℃下將干燥組織和陽性膠原對照(牛膠原類型I，Sigma，St.Louis，Mo.)水解3小時。在氮?dú)夥障抡舭l(fā)酸，用1mL檸檬酸鹽-乙酸鹽緩沖液(0.7M NaOAc，0.2M檸檬酸鹽，45mM檸檬酸，pH 6.0)在4mL異丙醇存在下將樣品再水合，并通過0.45μmMillex LCR過濾器(Gelman Sciences，Ann Arbor，Mich.)過濾。
通過用350μL檸檬酸鹽-乙酸鹽-異丙醇緩沖液(檸檬酸鹽-乙酸鹽緩沖液和40％異丙醇，v/v)和100μL 300mM氯胺T(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)將60μL水解樣品或膠原標(biāo)準(zhǔn)品在25℃下培養(yǎng)5分鐘來測定羥基脯氨酸含量。加入Erlich試劑(1.25mL，3.5M對二甲基氨基苯甲醛，在70％高氯酸和80％異丙醇中，v/v)以顯現(xiàn)和定量羥基脯氨酸。將樣品在60℃下培養(yǎng)30分鐘，冷卻至室溫，并在558nm下監(jiān)測吸光率。由新制作的反-4-羥基-L-脯氨酸(Sigma，St.Louis，Mo.)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對羥基脯氨酸含量進(jìn)行定量。所有的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行雙份實(shí)驗(yàn)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用單向差異分析法(ANOVA)分析數(shù)據(jù)。由于組內(nèi)的正態(tài)和組間的差異等同性不可能一致地相符，根據(jù)原始數(shù)據(jù)的等級轉(zhuǎn)化值進(jìn)行分析(非參數(shù)分析)。α＝0.05水平的差異性用于方法之間的預(yù)定比較。最小顯著性差異(LSD)方法用于組間的預(yù)定比較。用在SAS統(tǒng)計(jì)軟件包(SAS PC，6.12版，SAS Institute，Cary，N.C.)的PROC TTEST分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)報(bào)道為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEM)。
動物排除三只動物在實(shí)驗(yàn)期間死亡大鼠#17(醛固酮+鹽組，在灌輸后第24天發(fā)現(xiàn)死亡)，大鼠#64(醛固酮+鹽組，在手術(shù)后死亡)，和大鼠5(賦形劑組，在手術(shù)后死亡)。如果發(fā)現(xiàn)多個參數(shù)不代表它們被指定的處理組(例如偏離該處理組平均值大于3個標(biāo)準(zhǔn)偏差)，則排除附加的動物。三只這種動物從研究中排除大鼠#57(來自7天的方案，醛固酮+鹽組)，rat#97(來自14-天方案，醛固酮+鹽組)，和大鼠24(來自30天的方案，100mg/kg/天依匹樂酮組)。這三只動物表現(xiàn)出炎癥標(biāo)記(COX-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1)基因的表達(dá)，即偏離處理組平均值大于3個標(biāo)準(zhǔn)偏差。還由于遙測單元功能障礙而排除大鼠#24。這些動物產(chǎn)生的值顯示于表9.10-表9.19，其獨(dú)立于該數(shù)據(jù)表中其它動物的數(shù)據(jù)。
表9.10用于表10的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
--＝由于技術(shù)困難沒有收集到數(shù)據(jù)表9.10(續(xù))醛固酮+鹽
--＝由于技術(shù)困難沒有收集到數(shù)據(jù)表9.10(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
--＝由于技術(shù)困難沒有收集到數(shù)*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中。
表9.11用于表11的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
表9.11(續(xù))醛固酮+鹽
--＝由于技術(shù)困難沒有收集到數(shù)據(jù)
*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中。
表9.11(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
--＝由于技術(shù)困難沒有收集到數(shù)據(jù)。
表9.12用于表12的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
--＝由于技術(shù)困難沒有收集到數(shù)據(jù)。
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)表9.12(續(xù))醛固酮+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)
*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中。
表9.12(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)表9.13用于表13的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
表9.13(續(xù))醛固酮+鹽
表9.13(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中。
表9.14用于表14的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
表9.14(續(xù))醛固酮+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)
*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中。
表9.14(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
表9.15用于表15的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)表9.15(續(xù))醛固酮+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)
*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中。
表9.15(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
表9.16用于表16的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
中醫(yī)臨床癥狀、體征明顯改善，證候積分減少≥70％；C)有效中醫(yī)臨床癥狀、體征明顯改善，證候積分減少≥30％D)無效中醫(yī)臨床癥狀、體征均無明顯改善，甚至加重，證侯積分減少不足30％；注計(jì)算公式(尼莫地平法)為{(治療前積分-治療后積分)/治療前積分*100％}4)治療結(jié)果A疾病療效試驗(yàn)結(jié)果；表1疾病療效試驗(yàn)結(jié)果
B西醫(yī)，主要撿測指標(biāo)(血糖)療效試驗(yàn)結(jié)果表2西醫(yī)主要撿測指標(biāo)(血糖)療效試驗(yàn)結(jié)果
<p>表9.17用于表17的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)表9.17(續(xù))醛固酮+鹽
*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中。
表9.17(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)表9.18用于表18的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)表9.18(續(xù))醛固酮+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)
*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中。
表9.18(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
表9.19用于表19的個體數(shù)據(jù)對照賦形劑+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)醛固酮+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)。
表9.19(續(xù))依匹樂酮+醛固酮+鹽
nd＝由于mRNA樣品不足而沒有報(bào)道數(shù)據(jù)。
*來自這種動物的數(shù)據(jù)不考慮進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并不包括在最終的結(jié)果中結(jié)果血壓整個實(shí)驗(yàn)中賦形劑+鹽對照組的血壓保持正常(表10)。醛固酮+鹽誘導(dǎo)血壓隨時間漸進(jìn)性升高。接受依匹樂酮+醛固酮+鹽的動物的收縮血壓在第8-30天顯著降低。但是，與賦形劑+鹽對照相比血壓保持升高。
表10醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理隨時間對血壓的影響
這些數(shù)據(jù)如圖1圖示。
數(shù)值為在24小時期間內(nèi)每5分鐘得到的數(shù)值的平均±SEM。
*與賦形劑+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
#與醛固酮+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
體重、心肌肥大和ANP與賦形劑+鹽正常血壓的對照相比，接受醛固酮+鹽處理的動物在第7、14和30天體重顯著降低(表11-13)。醛固酮+鹽處理導(dǎo)致的體重降低通過在第30天進(jìn)行依匹樂酮給藥而顯著減少(表11；圖45)。對醛固酮+鹽處理的反應(yīng)是發(fā)生顯著的左右心室肥大。左心室肥大在醛固酮+鹽處理7天后明顯(表11)，而右心室肥大僅在醛固酮+鹽處理后30天明顯(表13)。依匹樂酮根本不影響由醛固酮+鹽處理誘導(dǎo)的心室重量或心室重量與脛骨長度比率(表11-13)。在用醛固酮+鹽處理的動物上也觀察到心房促尿鈉排泄肽(ANP)mRNA水平的升高(表11-13)。依匹樂酮在處理后30天而不是14天顯著降低ANP mRNA上調(diào)(表13)。
表11醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理在處理7天后對大鼠的影響
數(shù)值為處理7天后測定的平均值±SEM。
*與賦形劑+鹽對照有顯著性差異，p＜0.05。
#與醛固酮+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
依匹樂酮劑量為100mg/kg/天。
ANP＝心房促尿鈉排泄肽。
AU＝任意單位，相對于親環(huán)素表達(dá)測定。
表12醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理在處理14天后對大鼠的影響
數(shù)值為處理14天后測定的平均值±SEM。
*與賦形劑+鹽對照有顯著性差異，p＜0.05。
依匹樂酮劑量為100mg/kg/天。
ANP＝心房促尿鈉排泄肽。
AU＝任意單位，相對于親環(huán)素表達(dá)測定。
表13醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理在處理30天后對大鼠的影響
數(shù)值為處理30天后測定的平均值±SEM。
*與賦形劑+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
#與醛固酮+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
依匹樂酮劑量為100mg/kg/天。
ANP＝心房促尿鈉排泄肽。
AU＝任意單位，相對于親環(huán)素表達(dá)測定。
心肌纖維化實(shí)驗(yàn)組間在任何時間點(diǎn)的間質(zhì)的膠原體積分?jǐn)?shù)和羥基脯氨酸水平?jīng)]有在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(表14-16)。與賦形劑+鹽對照相比，在醛固酮+鹽和醛固酮+依匹樂酮+鹽處理的30天內(nèi)膠原類型I信使的適度增加(表16)。膠原類型III mRNA水平在任何時間點(diǎn)沒有顯著增加(表14-16)。
表14醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理在處理7天后對大鼠心肌損傷和纖維化的影響
數(shù)值為處理7天后測定的平均值±SEM。
依匹樂酮劑量為100mg/kg/天。
ICVF＝間質(zhì)膠原體積分?jǐn)?shù)膠原-I＝膠原類型I mRNA膠原-III＝膠原類型III mRNAAU＝任意單位，相對于親環(huán)素表達(dá)測定。
表15醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理在處理14天后對大鼠心肌損傷和纖維化的影響
數(shù)值為處理14天后測定的平均值±SEM。
依匹樂酮劑量為100mg/kg/天。
ICVF＝間質(zhì)膠原體積分?jǐn)?shù)膠原-I＝膠原類型I mRNA膠原-III＝膠原類型III mRNAAU＝任意單位，相對于親環(huán)素表達(dá)測定。
表16醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理在處理30天后對大鼠心肌損傷和纖維化的影響
數(shù)據(jù)為處理30天后測定的平均值±SEM。
*與賦形劑有顯著性差異，p＜0.05。
#與醛固酮+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
依匹樂酮劑量為100mg/kg/天。
ICVF＝間質(zhì)膠原體積分?jǐn)?shù)膠原-I＝膠原類型I mRNA膠原-III＝膠原類型III mRNAAU＝任意單位，相對于親環(huán)素表達(dá)測定。
心肌組織病理在處理7、14和30天后用半定量評分系統(tǒng)評價的心肌組織損害。賦形劑+鹽對照的心臟在所有時間點(diǎn)組織學(xué)正常。在處理7天后接受醛固酮+鹽的大鼠的心臟沒有鑒定到血管和心肌損害(表14)。相反，從處理14天開始觀察到病灶性動脈和心肌改變(表15和16)。醛固酮+鹽處理14天和30天后的動脈和心肌的質(zhì)變類似，但頻率和嚴(yán)重程度隨時間增大。如圖44所示，依匹樂酮給藥顯著減少所有時間點(diǎn)的心肌損傷(表14-16)。
炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)用定量Taqman PCR分析評價多種前炎癥分子的表達(dá)水平(表17-19)。環(huán)加氧酶-2(COX-2)和單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白(MCP-1)的表達(dá)水平類似，并通過醛固酮+鹽處理而在所有的時間點(diǎn)顯著增加。骨橋蛋白表達(dá)在醛固酮+鹽處理后14天(6倍)和30天(13倍)也顯著上調(diào)(表18-19)。轉(zhuǎn)化生長因子β-1(TGF-β，mRNA水平在任何檢查時間點(diǎn)沒有上調(diào)。細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(ICAM-1)mRNA表達(dá)在醛固酮+鹽處理后14和30天上調(diào)，雖然增加是適度的(表9-10)。血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)的基因表達(dá)在醛固酮+鹽處理第30天增加2倍，但是這種增加沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(表19)。與用醛固酮+鹽處理的動物的基因表達(dá)相比，依匹樂酮顯著降低所有標(biāo)記基因的表達(dá)(圖46)。
表17.醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理在處理7天后對大鼠炎癥標(biāo)記物的相對mRNA表達(dá)的影響
數(shù)值為處理7天后任意單位的mRNA表達(dá)平均值±SEM(相對于親環(huán)素表達(dá))。
*與賦形劑+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
#與醛固酮+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
依匹樂酮劑量為100mg/kg/天。
COX-2＝環(huán)加氧酶-2。
MCP-1＝單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白-1。
TGF-β1＝轉(zhuǎn)化生長因子β-1。
ICAM＝分子內(nèi)粘附分子-1。
VCAM＝血管細(xì)胞粘附分子-1。
表18.醛固酮+鹽單獨(dú)或與依匹樂酮聯(lián)合處理在處理14天后對大鼠炎癥標(biāo)記物的相對mRNA表達(dá)的影響
數(shù)值為處理14天后任意單位的mRNA表達(dá)平均值±SEM(相對于親環(huán)素表達(dá))。
*與賦形劑+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
#與醛固酮+鹽有顯著性差異，p＜0.05。
依匹樂酮劑量為100mg/kg/天。
COX-2＝環(huán)加氧酶-2。
MCP-1＝單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白-1。
TGF-β1＝轉(zhuǎn)化生長因子β-1。
ICAM＝分子內(nèi)粘附分子-1。
表4
按照上述配比，調(diào)制并洗凈厚度3mm的凝膠板后，在干燥器中50℃的溫度干燥24小時。將其粉碎、過篩，配制成粒徑在0.2mm以下的粉粒狀外用劑。
(試驗(yàn)例1)將實(shí)施例1、2所示的制劑例1及4的外用劑各50g充裝入層壓管后，放入濕度75％、溫度40℃的穩(wěn)定性試驗(yàn)機(jī)內(nèi)，在1個月和2個月后對有效成分碘的影響做了調(diào)查。對碘的測定，是按照《第十三改正日本藥局方解說書》日本廣川書店1996年出版的C-2606所記載的定量法進(jìn)行的。另外，在2個月后觀察了外觀。其結(jié)果，以充裝時的碘的含量作為100％，將殘存的碘的含量作為相對于初期值的％在表5中示出。
表5
如表5所示，2個月后兩制劑在外觀上都看不到任何變化，另外，有效成分碘殘存95％以上。所以，可知本發(fā)明的創(chuàng)傷用外用劑，不論是用作散劑還是用作軟膏劑，都能夠長期穩(wěn)定地將碘保持。
(試驗(yàn)例2)將為本發(fā)明外用劑的制劑例1和4及作為比較例的制劑例6～8的外用劑，在豬肉片上適量涂布后用紗布覆蓋，常溫下放置1天后剝?nèi)ゼ啿?，觀察各制劑是否可以容易地除去和制劑的狀態(tài)。觀察的結(jié)果在表6中示出。
骨橋蛋白mRNA的原位雜交進(jìn)行原位雜交以將骨橋蛋白表達(dá)定位于心肌組織。在冠狀動脈的中間細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大部分的骨橋蛋白mRNA；但還在血管周圍細(xì)胞和滲透局部缺血和壞死區(qū)域的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白信息。骨橋蛋白mRNA在心肌細(xì)胞或未影響的間質(zhì)區(qū)域中未出現(xiàn)。
結(jié)論在鹽誘導(dǎo)的血管炎癥和心組織損害的情況下用醛固酮處理大鼠。醛固酮+鹽處理誘導(dǎo)的這種損害之前是炎癥反應(yīng)，其特征是前炎癥分子上調(diào)。依匹樂酮顯著減少最初的血管炎癥反應(yīng)和隨后的心肌損傷。
可以獲得許多其它適于評價心血管癥狀的預(yù)防，包括動脈粥樣硬化的預(yù)防的動物模型。參見Stehbens，Prog.Card.Dis.，XXIX，1007-28(1986)和Zhang等人，Science，258，468-71(1992)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，公開了一種治療或預(yù)防脈管炎的方法。貝切特氏病(BD)是一種多系統(tǒng)疾病，其特征在于脈管炎。已提出BD和結(jié)腸的憩室疾病有關(guān)。Sahan C等人，Behcet’s Disease andDiverticulosis Dig Surg 2001，18(5)421-2。用于本發(fā)明方法的醛固酮阻滯劑用于治療和預(yù)防心血管炎癥。因此，本發(fā)明的方法將用于治療和預(yù)防貝切特氏病和憩室疾病，包括結(jié)腸憩室疾病。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，公開了一種治療或預(yù)防心肌炎的方法。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，公開了一種治療或預(yù)防心肌病的方法。
大鼠實(shí)驗(yàn)性自體免疫性心肌炎(EAM)在心臟肌球蛋白誘導(dǎo)的自體免疫心肌炎之后大鼠的膨脹心肌病可以用作慢性心衰的動物模型。用豬心臟肌球蛋白誘導(dǎo)Lewis大鼠的實(shí)驗(yàn)性自體免疫性心肌炎。特征為在損害處出現(xiàn)多核巨大細(xì)胞的急性嚴(yán)重性心肌炎在免疫后第15天引起。暴發(fā)性心肌炎持續(xù)至大約第28天，然后炎性細(xì)胞從心肌中的滲出平息。在自體免疫巨大細(xì)胞心肌炎痊愈之后，可見類似人膨脹心肌病的慢性心衰。治療期可能持續(xù)6周，例如大約29天。在一個實(shí)例中，構(gòu)建小組以確定治療的效力。例如可以構(gòu)建四組。一組可以是對照組，用賦形劑，例如用鹽水處理。其它組可以由用低劑量、中等劑量和高劑量醛固酮阻滯劑給藥的大鼠組成。在一個特別優(yōu)選的實(shí)例中，第一組以大約20毫克環(huán)氧美沙樂酮/千克/體重/天的低劑量給藥。第二組以大約100毫克環(huán)氧美沙樂酮/千克體重/天的中等劑量給藥。第三組以500毫克環(huán)氧美沙樂酮/千克體重/天的高劑量給藥?？梢酝ㄟ^測定心臟重塑的不同指標(biāo)來展示效力。非限制性的指標(biāo)包括血液動力學(xué)參數(shù)，例如左心室收縮壓、右心室終點(diǎn)舒張壓張；病理發(fā)現(xiàn)，例如心臟重量，心臟重量與體重比率，心肌纖維化面積和膠原纖維組分的測定；以及已知影響重塑的翻譯不同蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的mRNA的表達(dá)。據(jù)信，本發(fā)明的方法有效地治療和預(yù)防心肌炎和心肌病。
生長和分化因子的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族調(diào)節(jié)極寬范圍的成人的生物功能，并對胚胎發(fā)育期間的圖式發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)決定是非常重要的。TGF-β具有寬泛的生物作用。具體而言，它刺激細(xì)胞外基質(zhì)組分的產(chǎn)生，且它通過抑制蛋白酶的表達(dá)和增加蛋白酶抑制劑的表達(dá)而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解。這些對生長和細(xì)胞外基質(zhì)的作用對心肌病的發(fā)展是重要的。
Roselear等人，(Arterioscle.Thromb.Vasc.Biol.，16，1013-18(1996))描述了動脈粥樣硬化的APOe小鼠模型。醛固酮阻滯劑應(yīng)該具有防止動脈粥樣硬化損害的活性。
雖然根據(jù)特定的實(shí)施方案描述本發(fā)明，但不應(yīng)將這些實(shí)施方案的細(xì)節(jié)認(rèn)為是限定。
本文引用的參考專利文獻(xiàn)作為本文的參考。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防或治療受試者的選自以下的炎癥相關(guān)病癥的方法心肌炎、心肌病、脈管炎和貝切特氏病，該方法包括用足以改變一種或多種在受試者的炎癥或心臟重塑的調(diào)節(jié)中直接或間接涉及的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)的治療有效量的醛固酮阻滯劑治療該受試者。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該炎癥相關(guān)病癥為心肌炎。
3.權(quán)利要求1的方法，其中該炎癥相關(guān)病癥為心肌病。
4.權(quán)利要求1的方法，其中該炎癥相關(guān)病癥為脈管炎。
5.權(quán)利要求1的方法，其中該炎癥相關(guān)病癥為貝切特氏病。
6.權(quán)利要求1的方法，其中該一種或多種在受試者的炎癥或心臟重塑的調(diào)節(jié)中直接或間接涉及的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)選自環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、ANF、αvβ3、Inf-γ、IL-1、TNF-α、NADH/NADPH氧化酶、過氧化物自由基、TXA2、b-FGF、CD44、內(nèi)皮素、血管緊張素II受體、活性t-PA、非活性t-PA、PAI-1、CRP、IL-6、IL-10、IL-12、肌鈣蛋白T、HSP65、淀粉樣蛋白、磷脂酶A2、纖維蛋白原、CD40/CD40L、白介素-8、NF kappaB、轉(zhuǎn)化生長因子-β、膠原結(jié)合整合素α1β1和膠原結(jié)合整合素α2β1。
7.權(quán)利要求6的方法，其中兩種或更多種該表達(dá)產(chǎn)物同時共表達(dá)。
8.權(quán)利要求6的方法，其中該表達(dá)產(chǎn)物包含環(huán)加氧酶-2。
9.權(quán)利要求8的方法，其中該環(huán)加氧酶-2與一種或多種選自以下的表達(dá)產(chǎn)物共表達(dá)骨橋蛋白、MCP-1、白介素-8、NF kappaB、轉(zhuǎn)化生長因子-βICAM-1和VCAM-1。
10.權(quán)利要求6的方法，其中該表達(dá)產(chǎn)物包含骨橋蛋白。
11.權(quán)利要求10的方法，其中該骨橋蛋白與一種或多種選自以下的表達(dá)產(chǎn)物共表達(dá)環(huán)加氧酶-2、MCP-1、白介素-8、NF kappaB、轉(zhuǎn)化生長因子-β、ICAM-1和VCAM-1。
12.權(quán)利要求6的方法，其中該表達(dá)產(chǎn)物包含MCP-1。
13.權(quán)利要求12的方法，其中該MCP-1與一種或多種選自以下的表達(dá)產(chǎn)物共表達(dá)環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、白介素-8、NF kappaB、轉(zhuǎn)化生長因子-β、ICAM-1和VCAM-1。
14.權(quán)利要求6的方法，其中該表達(dá)產(chǎn)物包含ICAM-1。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該ICAM-1與一種或多種選自以下的表達(dá)產(chǎn)物共表達(dá)環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、MCP-1、白介素-8、NF kappaB、轉(zhuǎn)化生長因子-β和VCAM-1。
16.權(quán)利要求6的方法、其中該表達(dá)產(chǎn)物包含VCAM-1。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該VCAM-1與一種或多種選自以下的表達(dá)產(chǎn)物共表達(dá)環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、白介素-8、NF kappaB、轉(zhuǎn)化生長因子-β、ICAM-1和MCP-1。
18.權(quán)利要求6的方法，其中該表達(dá)產(chǎn)物包含白介素-8。
19.權(quán)利要求18的方法，其中該白介素-8與一種或多種選自以下的表達(dá)產(chǎn)物共表達(dá)環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、VCAM-1、NF kappaB、轉(zhuǎn)化生長因子-β、ICAM-1和MCP-1。
20.權(quán)利要求6的方法，其中該表達(dá)產(chǎn)物包含NF kappaB。
21.權(quán)利要求20的方法，其中該NF kappaB與一種或多種選自以下的表達(dá)產(chǎn)物共表達(dá)環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、VCAM-1、白介素-8、轉(zhuǎn)化生長因子-β、ICAM-1和MCP-1。
22.權(quán)利要求6的方法，其中該表達(dá)產(chǎn)物包含轉(zhuǎn)化生長因子-β。
23.權(quán)利要求22的方法，其中該轉(zhuǎn)化生長因子-β與一種或多種選自以下的表達(dá)產(chǎn)物共表達(dá)環(huán)加氧酶-2、骨橋蛋白、VCAM-1、白介素-8、NF kappaB、ICAM-1和MCP-1。
24.權(quán)利要求6的方法，其中三種或更多種表達(dá)產(chǎn)物同時共表達(dá)。
25.權(quán)利要求1的方法，其中該醛固酮阻滯劑為醛固酮受體拮抗劑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為螺甾內(nèi)酯型化合物。
27.權(quán)利要求25的方法，其中該螺甾內(nèi)酯型化合物選自7α-乙酰硫基-3-氧代-4，15-雄甾二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；3-氧代-7α-丙酰硫基-4，15-雄甾二烯-[17((β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；6β，7β-亞甲基-3-氧代4，15-雄甾二烯-[17((β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；15α，16α-亞甲基-3-氧代-4，7α-丙酰硫基-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；6β，7β，15α，16α-二亞甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]-全氫化呋喃-2′-酮；7α-乙酰硫基-15β，16β-亞甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；15β，16β-亞甲基-3-氧代-7β-丙酰硫基-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮；和6β，7β，15β，16β-二亞甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氫化呋喃-2′-酮。
28.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為螺內(nèi)酯。
29.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為環(huán)氧甾族醛固酮拮抗劑。
30.權(quán)利要求29的方法，其中該環(huán)氧甾族化合物具有與20-螺烷化合物甾核的″C″環(huán)稠合的環(huán)氧部分。
31.權(quán)利要求29的方法，其中該20-螺烷化合物的特征在于存在9-α，11-β-取代的環(huán)氧部分。
32.權(quán)利要求29的方法，其中該環(huán)氧甾族化合物選自孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-，(γ-內(nèi)酯，甲酯，(7α，11α，17β)-；孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-二甲酯，(7α，11α，17β)-；3′H-環(huán)丙[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，(6β，7β，11α，17β)-；孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代，7-(1-甲基乙基)酯，一鉀鹽，(7α，11α，17β)-；孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-，7-甲酯，一鉀鹽，(7α，11α，17β)-；3′H-環(huán)丙[6，7]孕-1，4，6-三烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，(6β，7β，11α)-；3′H-環(huán)丙[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，甲酯，(6β，7β，11α，17β)-；3′H-環(huán)丙[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，一鉀鹽，(6α，7β，11α，17β)-；3′H-環(huán)丙[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，(6β，7β，11α，17β)-；孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，乙基酯，(7α，11α，17β)-；和孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，1-甲基乙基酯，((7α，11α，17β)-。
33.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為環(huán)氧美沙樂酮。
34.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-二甲酯，(7α，11α，17β)-。
35.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為3′H-環(huán)丙[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，(6β，7β，11α，17β)-。
36.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代，7-(1-甲基乙基)酯，一鉀鹽，(7α，11α，17β)-。
37.權(quán)利要求2 5的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-，7-甲酯，一鉀鹽，(7α，11α，17β)-。
38.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為3′H-環(huán)丙[6，7]孕-1，4，6-三烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，(6β，7β，11α，)-。
39.權(quán)利要求2 5的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為3′H-環(huán)丙[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，甲酯，(6β，7β，11α，17β)-。
40.權(quán)利要求2 5的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為3′H-環(huán)丙[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，一鉀鹽，(6β，7β，11α，17β)-。
41.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為3′H-環(huán)丙[6，7]孕-4，6-二烯-21-羧酸，9，11-環(huán)氧-6，7-二氫-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，(6β，7β，11α，17β)-。
42.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，乙酯，(7α，11α，17β)-。
43.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為孕-4-烯-7，21-二羧酸，9，11-環(huán)氧-17-羥基-3-氧代-，γ-內(nèi)酯，乙酯，(7α，11α，17β)-。
44.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為屈螺酮。
45.權(quán)利要求25的方法，其中該醛固酮受體拮抗劑為環(huán)氧美沙樂酮。
46.權(quán)利要求45的方法，其中環(huán)氧美沙樂酮的給藥量為大約0.5mg至大約500mg/天。
47.權(quán)利要求45的方法，其中給藥的環(huán)氧美沙樂酮的治療有效量為大約0.5mg至大約100mg/天。
48.權(quán)利要求45的方法，其中給藥的環(huán)氧美沙樂酮的治療有效量為大約10mg至大約100mg/天。
49.權(quán)利要求45的方法，其中給藥的環(huán)氧美沙樂酮的治療有效量為大約0.5mg至大約25mg/天。
50.權(quán)利要求45的方法，其中給藥的環(huán)氧美沙樂酮的治療有效量為大約0.5至大約10mg/天。
51.權(quán)利要求1的方法，其中該醛固酮阻滯劑為11β-羥基雄甾-4-烯-3-酮17-螺甾內(nèi)酯或其可藥用鹽。
52.權(quán)利要求1的方法，其中該醛固酮阻滯劑為醛固酮抑制劑。
53.權(quán)利要求52的方法，其中該醛固酮抑制劑選自芳香化酶抑制劑、12-脂氧合酶抑制劑、P45011β抑制劑、心房促尿鈉排泄因子、20裂合酶抑制劑、PKC抑制劑、苯并二吖庚因、鈣阻滯劑、二酰甘油脂酶抑制劑、鉀離子載體、電子轉(zhuǎn)移阻滯劑和乙醇或其可藥用鹽。
54.權(quán)利要求52的方法，其中該醛固酮抑制劑為二酰甘油脂酶抑制劑。
55.權(quán)利要求54的方法，其中該二酰甘油脂酶抑制劑為1，6-雙-環(huán)己基肟基羰基氨基)-己烷或其可藥用鹽。
56.權(quán)利要求52的方法，其中該醛固酮抑制劑為苯并二氮化合物。
57.權(quán)利要求56的方法，其中該二氮化合物為安定或其可藥用鹽。
58.權(quán)利要求52的方法，其中該醛固酮抑制劑為芳香化酶抑制劑。
59.權(quán)利要求58的方法，其中該芳香化酶抑制劑為法倔唑或其可藥用鹽。
60.權(quán)利要求52的方法，其中該醛固酮抑制劑為脂氧合酶抑制劑。
61.權(quán)利要求60的方法，其中該脂氧合酶抑制劑為菲尼酮或其可藥用鹽。
62.權(quán)利要求52的方法，其中該醛固酮抑制劑為P45011β抑制劑。
63.權(quán)利要求62的方法，其中該P(yáng)45011β抑制劑為18-乙烯基孕酮或其可藥用鹽。
64.權(quán)利要求1的方法，其中該醛固酮阻滯劑為醛固酮合酶抑制劑。
65.一種預(yù)防或治療受試者炎癥相關(guān)病癥的方法，該方法包括用足以改變一種或多種選自白介素-8、NF kappaB和轉(zhuǎn)化生長因子-β的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)的治療有效量的醛固酮阻滯劑治療受試者。
全文摘要
一種預(yù)防或治療受試者的炎癥相關(guān)病癥、例如心肌炎、心肌病、脈管炎和貝切特氏病的方法，所述方法包括用足以改變一種或多種在受試者的炎癥或心臟重塑的調(diào)節(jié)中直接或間接涉及的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)的治療有效量的醛固酮阻滯劑治療受試者。
文檔編號A61K31/58GK1638777SQ03804981
公開日2005年7月13日 申請日期2003年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月25日
發(fā)明者R·羅查, M·D·扎克 申請人:法瑪西雅公司