專利名稱：腦膜炎球菌疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腦膜炎球菌疫苗。具體而言，本發(fā)明涉及一種腦膜炎球菌結(jié)合疫苗。更具體而言，本發(fā)明涉及一種含有A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白偶聯(lián)的結(jié)合疫苗。本發(fā)明還涉及這種疫苗的制備方法。
腦膜炎奈瑟氏球菌俗名為腦膜炎球菌，學(xué)名為Neisseriameningitidis，有時也稱為奈瑟氏腦膜炎球菌。腦膜炎奈瑟氏球菌為需氧菌，革蘭氏陰性有莢膜常成雙排列，故又稱為雙球菌。由于無莢膜菌株幾乎不引起臨床疾病，因此莢膜在細(xì)菌毒力方面扮演了重要作用。根據(jù)莢膜多糖特性的不同至少可分為13個血清群A、B、C、D、E29、H、I、K、L、W135、X、Y、Z。但只有屬于A，B，C，Y和W135這5個群中的任一群才會致病，90％的腦膜炎球菌疾病是由A、B、C三群引起的。
腦膜炎奈瑟氏球菌是全世界細(xì)菌性腦膜炎中主要的病原體。世界唯一能引起腦膜炎大規(guī)模爆發(fā)流行細(xì)菌。即使有良好的醫(yī)療條件，急性腦膜炎球菌經(jīng)?？捎诎l(fā)病后一二天內(nèi)產(chǎn)生死亡或留下嚴(yán)重后遺癥。化學(xué)藥品對于控制疾病爆發(fā)流行幾乎沒有價值。更為重要的是，隨著抗菌素大量使用和/或?yàn)E用，在世界許多地方包括中國在內(nèi)的腦膜炎球菌對抗菌素的耐藥性大量增加，就使得通過免疫接種疫苗來預(yù)防和控制該病成為緊迫的任務(wù)。
當(dāng)前已有2類疫苗在大規(guī)模應(yīng)用。第一類是多糖疫苗國際市場上有單價、兩價和四價腦膜炎球菌多糖疫苗，即A、A+C和A+C+Y+W135。該類疫苗是經(jīng)純化的莢膜多糖制備而成。第二類是腦膜炎球菌結(jié)合疫苗即C群特異性莢膜多糖與一蛋白載體經(jīng)偶聯(lián)后的結(jié)合疫苗。
第一類多糖疫苗非常安全，明顯的全身性反應(yīng)極少見。最常見的副反應(yīng)為注射部位持續(xù)1至2天的發(fā)紅和輕微的疼痛。超過38.5℃的發(fā)熱比率為1％-4％。單價疫苗、二價疫苗和四價疫苗在安全性或反應(yīng)原性方面沒有顯著性差異。但是，A群多糖在兩歲以下年齡組中表現(xiàn)很弱的免疫原性和短暫的保護(hù)期，而C群多糖在兩歲以下年齡組中根本就沒有免疫原性。腦膜炎球菌多糖抗原與其他類多糖抗原一樣屬于T細(xì)胞非依賴性抗原，不能誘導(dǎo)出免疫記憶反應(yīng)，再次免疫接種不能起到加免疫的效應(yīng)，故對嬰幼兒免疫效果差。因此A群和C群多糖疫苗不宜用于嬰幼兒和常規(guī)免疫接種程序中。
第二類是腦膜炎球菌結(jié)合疫苗，多糖和蛋白載體偶聯(lián)后，T細(xì)胞能識別載體，刺激B細(xì)胞對多糖產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并能誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫記憶反應(yīng)。目前已有3種C群腦膜炎結(jié)合疫苗(MCC)獲得在國際上上市，其中兩種是將多糖連結(jié)到突變無毒白喉毒素(CRM197)上，另一個是將破傷風(fēng)類毒素作為載體蛋白。上述結(jié)合疫苗均能產(chǎn)生足夠高水平的抗莢膜IgG抗體和有免疫記憶的B細(xì)胞。英國于1999年將C群多糖結(jié)合疫苗納入預(yù)防C群腦膜炎的國家免疫程序中。A群腦膜炎結(jié)合疫苗正在開發(fā)中，而A群腦膜炎球菌在引起大規(guī)模流行的各群腦膜炎球菌中占主導(dǎo)地位。
免疫實(shí)踐證明，細(xì)菌莢膜多糖屬于T細(xì)胞非依賴性抗原，其免疫效果與接種對象的年齡明顯相關(guān)，嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，接種多糖疫苗后不能有效激活T輔助細(xì)胞和T記憶細(xì)胞，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫回憶反應(yīng)，因而，免疫保護(hù)時間短暫，再次免疫接種也不能產(chǎn)生加強(qiáng)免疫效應(yīng)。同時，腦膜炎球菌多糖抗原雖能誘導(dǎo)產(chǎn)生IgM和IgG抗體，但人類所產(chǎn)生的IgG主要是IgG2亞類，而人血清IgG2亞類抗體出現(xiàn)較遲，一般要到8-12歲才能上升至成人水平。這可能與分泌IgG2亞類抗體的B淋巴細(xì)胞發(fā)育遲緩有關(guān)。故此，嬰幼兒接種多糖疫苗后，產(chǎn)生只有短暫作用的IgM抗體為主。為提高多糖疫苗的免疫效果，主要辦法是將多糖抗原與蛋白載體結(jié)合，使其轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原。研究表明，多糖與蛋白載體結(jié)合后，T細(xì)胞能識別載體，刺激B細(xì)胞對多糖產(chǎn)生應(yīng)答，并能誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫回憶反應(yīng)使更多的B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多糖和蛋白載體偶聯(lián)后的效果在Hib(b型流感嗜血桿菌)結(jié)合疫苗和C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗中得到了驗(yàn)證。B群腦膜炎球菌外膜蛋白作為一種載體蛋白的功能也在Hib結(jié)合疫苗中被證實(shí)。目前，國際上Hib結(jié)合疫苗所用的4種載體分別為；破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、無毒性白喉變異株(CRM197)毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白。盧錦漢，醫(yī)學(xué)生物制品學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，1995年，380頁中公開了B群腦膜炎球菌外膜蛋白的一種制備方法。該制備方法依據(jù)蔗糖密度梯度離心從破碎的B群腦膜炎球菌菌體的混合勻漿中分離B群腦膜炎球菌外膜蛋白，包括的主要步驟有培養(yǎng)菌體、分離菌體細(xì)胞、低滲破碎細(xì)胞、超速離心獲得外膜沉淀物、采用密度梯度離心純化外膜蛋白(反復(fù)兩次)、溶解、增溶、除菌過濾、沉淀等步驟。由于需要的離心速度高，并且需要反復(fù)兩次的密度梯度離心和溶解，所以對設(shè)備投資要求較高，十分繁瑣，步驟繁多復(fù)雜。所得產(chǎn)物為各種B群腦膜炎球菌外膜蛋白的混合物，沒有進(jìn)一步分離。
基于現(xiàn)有腦膜炎疫苗的上述問題，WHO和比爾蓋茨基金合作加速在短期內(nèi)開發(fā)出較低價格的腦膜炎球菌A+C群結(jié)合疫苗。WHO將開發(fā)有效、安全和適宜價格的多價腦膜炎球菌結(jié)合疫苗作為最優(yōu)先考慮的事。
鑒于上述原因，需要對腦膜炎球菌疫苗進(jìn)行革命性地改造，開發(fā)出較低價格用于兩歲以下年齡的兒童和嬰幼兒的A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗。
本發(fā)明所用腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)菌株購買于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心(CMCC)，其菌株號為；CMCC(B)29201 A4株CMCC(B)29205 C11株CMCC(B)29356 B4株CMCC(B)29361 B15株中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心的全稱為醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，上述菌株保藏在該中心所屬單位中國藥品生物制品檢定所，北京(NICPBP)。該機(jī)構(gòu)生產(chǎn)、銷售這些菌株，公眾可以購買。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，A群腦膜炎球菌多糖制備時可采用的菌株為CMCC(B)29201，C群腦膜炎球菌多糖制備時可采用的菌株為CMCC(B)29205，而B群腦膜炎球菌外膜蛋白制備時可采用的菌株為CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。如果滿足需要，也可采用其它合適的菌株，這里給出的菌株僅僅是為了例示性說明本發(fā)明。
本發(fā)明分別采用罐液體培養(yǎng)A、C群腦膜炎球菌，甲醛殺菌，連續(xù)流離心收集上清液，加Cetavlon沉淀多糖，連續(xù)離心收集多糖復(fù)合物，再經(jīng)CaCl2解聚而獲得粗多糖，用醋酸鈉溶液溶解粗多糖，并經(jīng)冷酚抽提，透析，超濾而分別獲得A、C群精制純化多糖。A、C群腦膜炎球菌多糖的層析分析參見

圖1和圖2。關(guān)于A群腦膜炎球菌多糖的制備方法的細(xì)節(jié)，參考中國生物制品規(guī)程2000年版。C群腦膜炎球菌多糖的制備細(xì)節(jié)與A群腦膜炎球菌多糖的制備方法相同。
本發(fā)明所用B群腦膜炎外膜蛋白可以使用已知方法制備，例如盧錦漢，醫(yī)學(xué)生物制品學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，1995年，380頁中公開的方法。
進(jìn)一步而言，可以對B群腦膜炎外膜蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分離，使用含1類、2類或者1類、3類外膜蛋白作為載體。
所以，本發(fā)明的一個方面是提供了一種新穎的B群腦膜炎外膜蛋白制備方法。該方法采用罐液體培養(yǎng)，連續(xù)離心而獲得B群菌體再采用LiCl抽提獲得B群腦膜炎外膜蛋白，經(jīng)乙醇沉淀，離心超濾，柱層析而獲得B群外膜蛋白。此處公開的B群腦膜炎外膜蛋白的制備方法與盧錦漢公開的方法截然不同(參考，盧錦漢，醫(yī)學(xué)生物制品學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，1995年，380頁)。
本發(fā)明所提供的B群腦膜炎外膜蛋白的制備方法的特點(diǎn)在于離心速度低，步驟相對簡單，并且對于B群腦膜炎外膜蛋白進(jìn)行了分離。B群腦膜炎球菌外膜蛋白包括5種，分別是1類、2類、3類、4類和5類外膜蛋白。其中1類外膜蛋白是B群腦膜炎球菌亞型分類的基礎(chǔ)，是一種44,000-47,000 Dolton的熱穩(wěn)定蛋白。2類或3類外膜蛋白是不能同時存在于同一菌株，分子量均為37,000-42,000 Dolton的熱穩(wěn)定蛋白，常以三聚體形式存在，可誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生。4類和5類外膜蛋白對于誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生作用不大。所以本發(fā)明的一個特點(diǎn)在于對B群腦膜炎外膜蛋白進(jìn)行分離。圖3是B群腦膜炎球菌外膜蛋白的柱層析圖，可以看到主要有三個峰。在本發(fā)明中，可以使用三個峰中的洗脫溶液中群腦膜炎球菌外膜蛋白的作為載體。優(yōu)選實(shí)施方案中，采用峰1和峰2的洗脫物作為載體，也即優(yōu)選使用1類、2類或者1類、3類外膜蛋白作為載體。
本發(fā)明采用溴化氰(CNBr)活化A、C群多糖，以己二酰肼(ADH)為雙功能親核間隔基，使之形成多糖己二酰肼衍生物，再通過碳二亞胺(EDAC)介導(dǎo)的縮合作用與B群外膜蛋白共價結(jié)合，分別獲得A、C群多糖-B群外膜蛋白結(jié)合物，再經(jīng)超濾濃縮，柱層析而獲得高分子量偶聯(lián)物，稀釋分裝而成結(jié)合疫苗。
本發(fā)明提供的組合疫苗包括A群腦膜炎球菌莢膜多糖和C群腦膜炎球菌莢膜多糖，它們分別與B群腦膜炎球菌外膜蛋白共價結(jié)合。雖然B群腦膜炎球菌外膜蛋白在本發(fā)明中主要作為載體發(fā)揮作用，但是它的作用也許超出了普通載體的作用，因?yàn)樗旧硎莵碓从贐群腦膜炎球的高分子物質(zhì)，具有一定的免疫原性，可能會對逐年增加的B群腦膜炎球菌疾病產(chǎn)生預(yù)防作用。因此，B群腦膜炎球菌外膜蛋白在本發(fā)明的疫苗中的作用不應(yīng)該等同于已有技術(shù)的公開。進(jìn)而言之，可以理解的是，本發(fā)明的疫苗包括A群腦膜炎球菌莢膜多糖、C群腦膜炎球菌莢膜多糖和B群腦膜炎球菌外膜蛋白，其中A群腦膜炎球菌莢膜多糖和C群腦膜炎球菌莢膜多糖分別與B群腦膜炎球菌外膜蛋白結(jié)合。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供的組合疫苗包括A群腦膜炎球菌莢膜多糖和C群腦膜炎球菌莢膜多糖，它們分別與B群腦膜炎球菌外膜蛋白中的1類和2類或者1類和3類外膜蛋白共價結(jié)合。應(yīng)該理解的是，在本實(shí)施方案中，組合疫苗中作為載體的B群腦膜炎球菌外膜蛋白主要成份是含有1類和2類或1類和3類的外膜蛋白。
如上所述，在多糖和蛋白形成偶聯(lián)物的過程中，可以由單個A群多糖或C群多糖經(jīng)活化后可能有多個位點(diǎn)同時結(jié)合多個B群腦膜炎球菌外膜蛋白。同樣也可以由活化后的單個B群腦膜炎球菌外膜蛋白的多個位點(diǎn)同時結(jié)合多個A或C群多糖。多糖和蛋白的結(jié)合并不限定于11，也就是一個多糖分子上可以偶聯(lián)上1個或者多個蛋白；同樣地，一個蛋白分子上可以偶聯(lián)上1個或者多個多糖分子。在多糖和蛋白的偶聯(lián)中，優(yōu)選發(fā)生多糖和蛋白的一一對應(yīng)的結(jié)合。但是如上所述，多糖和蛋白的各種結(jié)合只要并不影響本發(fā)明的結(jié)合疫苗所能達(dá)到的效果，那么所有這些偶聯(lián)中的細(xì)節(jié)變化均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
多糖與蛋白的偶聯(lián)有多種已知的方法，在此所述的偶聯(lián)方法僅僅是用于說明。所以，可以采用各種等同的方法實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的偶聯(lián)過程，因此任何用于分子偶聯(lián)的方法和工藝或者過程都有可能用于實(shí)施本發(fā)明。
在本發(fā)明的疫苗中，A群、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的動物試驗(yàn)每劑免疫劑量為含有A和C群腦膜炎球菌莢膜多糖各1.25-2.5g，優(yōu)選地所述A和C群腦膜炎球菌莢膜多糖在所述結(jié)合疫苗的每劑人用免疫劑量中各有5-20g。當(dāng)然，根據(jù)免疫對象的體質(zhì)狀況可以有所變化。至于用量的上限，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)疫苗使用的常規(guī)實(shí)踐靈活掌握。
并且，在本發(fā)明的疫苗中可以進(jìn)一步添加吸附劑，例如氫氧化鋁和/或磷酸鋁等鋁佐劑。使用時，可以對本發(fā)明的結(jié)合疫苗進(jìn)行稀釋，合適的稀釋液的不限定的實(shí)例有緩沖生理鹽水稀釋液。
本發(fā)明的疫苗可以采用常規(guī)接種方式，例如腹腔接種、肌肉或皮下接種等。腹腔接種較麻煩，安全性較差，故優(yōu)選肌肉或皮下接種方式。免疫接種推薦使用三針。
本發(fā)明對現(xiàn)有商業(yè)化多糖疫苗在下列方面進(jìn)行了改進(jìn)1、更少的反應(yīng)原性本發(fā)明的疫苗中沒有摻入蔗糖或明膠等穩(wěn)定劑，從而減少了現(xiàn)有疫苗的反應(yīng)原性。
2、本方法選擇適宜的超濾膜超濾抗原，并采用柱層析法純化獲得的高分子量偶聯(lián)物，從而提高了抗原的免疫原性。
3、提高了免疫效力本發(fā)明由于將腦膜炎球菌多糖抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原，能誘導(dǎo)出免疫記憶反應(yīng)，再次免疫接種能起到加強(qiáng)免疫的效應(yīng)。
4、將疫苗接種人群擴(kuò)展到兩歲以下的兒童和嬰幼兒本發(fā)明的疫苗對兩歲以下的兒童和嬰幼兒能提供良好的免疫保護(hù)力，誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng)，并可維持長期的免疫保護(hù)作用。
5、對現(xiàn)有免疫程序中的疫苗無干擾性本發(fā)明的疫苗沒有選破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素和/或突變的無毒白喉毒素(CRM197)作為載體蛋白載體，就避免了對現(xiàn)有免疫程序中的疫苗效果(例如百白破疫苗)的干擾性。
6、選擇B群腦膜炎球菌外膜蛋白作為載體蛋白，也是基于在世界范圍內(nèi)B群腦膜炎球菌發(fā)病率逐年升高，且截止目前尚無相應(yīng)的有效疫苗。B群腦膜炎球菌外膜蛋白除具有載體蛋白功能外，還可產(chǎn)生足夠的抗B群腦膜炎球菌抗體，對B群腦膜炎球菌的感染能起到一定的預(yù)防作用。
7、本發(fā)明的B群腦膜炎球菌外膜蛋白制備、純化工藝方面有了顯著的改進(jìn)，制備所需設(shè)備，人力和物力消耗降低，過程簡單，節(jié)約時間，并且可以進(jìn)一步對B群腦膜炎球菌外膜蛋白進(jìn)行分離。
總之，至今還沒有一種新的腦膜炎球菌A+C群結(jié)合疫苗能滿足上述優(yōu)點(diǎn)。而且，本發(fā)明所述疫苗的制備方法也有獨(dú)到之處，克服了已有技術(shù)存在的有些問題。
圖2、C群腦膜炎球菌莢膜多糖柱層析圖，表明其分子量不均一。
圖3、B群腦膜炎球菌外膜蛋白柱層析圖，其中圖中的3個峰，從左到右分別代表1類外膜蛋白、2/3類外膜蛋白和4/5類外膜蛋白。
圖4、A群腦膜炎球菌莢膜多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白共價結(jié)合物柱層析圖。圖中的上層峰A群腦膜炎球菌莢膜多糖峰，結(jié)合后，分子量增大，以V0附近高分子量化合物為主；下層峰B群腦膜炎球菌外膜蛋白峰，與多糖結(jié)合后，分子量隨之增大，以V0附近高分子量化合物為主。
圖5、C群腦膜炎球菌莢膜多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白共價結(jié)合物柱層析圖。圖中的上層峰C群腦膜炎球菌莢膜多糖峰，結(jié)合后，分子量增大，以V0附近高分子量化合物為主；下層峰B群腦膜炎球菌外膜蛋白峰，與多糖結(jié)合后，分子量隨之增大，以V0附近高分子量化合物為主。
實(shí)施例1B群腦膜炎球菌外膜蛋白的制備啟開B群腦膜炎球菌菌株接種于半綜合斜面，擴(kuò)菌傳至第五代液體罐培養(yǎng)，連續(xù)離心收集菌體，用0.3-0.6M LiCl和0.2-0.5MCH3COONa混合物提取外膜蛋白。35-45℃振蕩1-3小時。離心4000-8000轉(zhuǎn)/分×1小時，收集上清，繼而加乙醇濃度至60-80％沉淀外膜蛋白。用注射溶液復(fù)溶后，通過超濾收集400KD過濾液，再經(jīng)30KD超濾膜濃縮。用SDS-PAGE檢測所需1、2類或1、3類外膜蛋白含量。Sephacryl S 200-400層析，收集所需1、2類或1、3類外膜蛋白。檢測蛋白含量(Lowry法)、主要成份及1、2類或1、3類外膜蛋白的純度(SDS-PAGE法)和內(nèi)毒素含量(鱟試劑法)、無菌試驗(yàn)(見中國生物制品規(guī)程2000年版)。
實(shí)施例2A群腦膜炎莢膜球菌多糖偶聯(lián)A群腦膜炎莢膜球菌多糖稀釋至4mg/ml加溴化氰活化多糖，23±3℃下作用1-1.5小時，調(diào)PH并維持pH9-11，繼后加已二酰肼2.5～5mg/mgps，維持pH8-10作用10-30分鐘，在2-8℃攪拌10-20小時，透析去除小分子物質(zhì)，取樣測溴化氰殘余量，己二酰肼衍化率。加等量B群腦膜炎球菌外膜蛋白與多糖混合，加碳二亞胺15-25mg/ml混合物，5-15℃作用1-1.5小時，調(diào)整PH5-7。偶聯(lián)原液透析去除小分子物質(zhì)。300KD膜包超濾濃縮，經(jīng)Sepharose CL-4B柱層析，收集高分子量的偶聯(lián)化合物(參見圖4)，除菌過濾檢測磷含量，蛋白含量，計(jì)算多糖，蛋白比值，分子量測定及KD0.3回收率，多糖蛋白鑒別試驗(yàn)、內(nèi)毒素含量、無菌試驗(yàn)(見中國生物制品規(guī)程2000年版)。各項(xiàng)檢驗(yàn)合格后，待稀釋合并、分裝。
實(shí)施例3C群腦膜炎球菌莢膜多糖偶聯(lián)C群腦膜炎莢膜球菌多糖稀釋至4mg/ml，加溴化氰(CNBr)活化多糖，20～30℃下作用1-1.5小時，調(diào)PH并維持PH9-11，繼后加已二酰肼(ADH)2.5～5mg/mg多糖，維持PH8-10，反應(yīng)30分鐘，在2-8℃攪拌10-20小時，透析去除小分子物質(zhì)。取樣測CNBr殘余量，ADH衍化率。加等量B群腦膜炎球菌外膜蛋白與多糖混合，加碳二亞胺(EDAC)15～25mg/ml混合物，5-15℃反應(yīng)1-1.5小時，調(diào)PH5-7。偶聯(lián)原液透析去除小分子物質(zhì)，300KD膜包超濾濃縮，經(jīng)SepharoseCL-4B柱層析，收集高分子量的偶聯(lián)化合物(參見圖5)，除菌過濾，檢測唾液酸含量，蛋白含量計(jì)算多糖，蛋白比值，分子量測定及KD0.3回收率，多糖、蛋白鑒別試驗(yàn)、內(nèi)毒素含量、無菌試驗(yàn)(見中國生物制品規(guī)程2000年版)，各項(xiàng)檢定合格后，待稀釋，合并、分裝。
實(shí)施例4不含有佐劑的A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗根據(jù)A、C群多糖偶聯(lián)原液測定結(jié)果，稀釋分裝，使每支結(jié)合疫苗0.5ml裝量，含有A、C群多糖各10μg，并分別測定PH值，NaCl含量，A、C群多糖含量硫柳汞含量，高分子結(jié)合物含量，鑒別試驗(yàn)，急性毒性安全試驗(yàn)，鑒別試驗(yàn)，無菌試驗(yàn)，熱原質(zhì)試驗(yàn)，免疫原性試驗(yàn)，合格制品存放于2-8℃存。
實(shí)施例5氫氧化鋁(佐劑)吸附A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗稀釋、分裝根據(jù)A、C群腦膜炎球菌偶聯(lián)物半成品原液多糖測定的含量，以滅菌、無熱原的氫氧化鋁稀釋液稀釋疫苗原液。使每劑量含有A、C群多糖各8-14g，氫氧化鋁0.6-1.4mg，NaCl 0.75-1.0％，PH5.4-7.0。在疫苗稀釋過程中緩慢加入氫氧化鋁稀釋液，并充分混勻，使之形成均勻分布的懸濁液。無菌、無熱原分裝結(jié)合疫苗，使每劑量≥0.5ml。
實(shí)施例6緩沖生理鹽水稀釋、分裝A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗根據(jù)A、C群腦膜炎球菌偶聯(lián)物半成品原液多糖測定的含量，以滅菌、無熱原的緩沖生理鹽水稀釋液稀釋疫苗原液。使每劑量含有A、C群多糖各8-14g，NaCl0.75-1.0％，PH5.4-7.0。在疫苗稀釋過程中緩慢加入緩沖生理鹽水稀釋液，并充分混勻，使之形成均勻分布的清亮懸液。無菌、無熱原分裝結(jié)合疫苗，使每劑量≥0.5ml。
實(shí)施例7A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗檢測根據(jù)A、C群腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)原液測定結(jié)果，稀釋分裝，使每支結(jié)合疫苗≥0.5ml裝量，含有A、C群多糖各8-14μg，并分別測定高分子結(jié)合物含量、PH值，NaCl含量、A、C群多糖含量、硫柳汞含量、鑒別試驗(yàn)、急性毒性安全試驗(yàn)、鑒別試驗(yàn)、無菌試驗(yàn)、熱原質(zhì)試驗(yàn)、免疫原性試驗(yàn)(見中國生物制品規(guī)程2000年版)，合格制品存放于2-8℃存。
實(shí)施例8A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗接種劑量比較分別選用SPF級，Balb/c小鼠每組20只，每組小鼠分別皮下接種各含A、C群多糖各5μg、2.5μg，1.25μg，0.625μg的結(jié)合疫苗于0、14天各免疫一劑，第21天采血分離血清，用ELISA測定每只小鼠血清的IgG抗體滴度，計(jì)算GMT統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析接種劑量的影響因素，兩次試驗(yàn)結(jié)果列于表1。
表1.A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗接種劑量比較

兩次動物試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，2.5μg免疫劑量效果較為理想，既節(jié)省了抗原量，又達(dá)到了較高的抗體滴度。
實(shí)施例9A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫途徑比較試驗(yàn)分別選用SPF級Balb/C小鼠，每組20只，各接種A、C群多糖各2.5μg的結(jié)合疫苗分別于0、14天各接種一針，第21天采血，分離血清，ELISA測定抗體濃度計(jì)算GMT，其免疫途徑分別采用皮下，肌肉，腹腔注射?，F(xiàn)將兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2。
表2.A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫途徑比較

以上三種免疫途徑兩次實(shí)驗(yàn)比較說明，其IgG GMT結(jié)果相似，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異P＜0.05。但腹腔接種較麻煩，安全性較差，故可選擇肌肉或皮下接種。
實(shí)施例10A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫免疫針次比較試驗(yàn)分別選用SPF級Balb/c小鼠，每組20只，分別皮下接種含A、C群多糖各2.5μg的結(jié)合疫苗，免疫程序?yàn)?、14、28天各接種1針，末次免后2周采血，分離血清，測定每只小鼠血清的IgG抗體濃度，計(jì)算每組小鼠的GMT，實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表3。表3. A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫菌免疫針次比較試驗(yàn)

以上結(jié)果表明，結(jié)合疫苗具有明顯的免疫回憶反應(yīng)，三針免疫后，抗體增長明顯，因此，免疫接種推薦使用三針。
實(shí)施例11A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫原性研究在以上實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)上進(jìn)行了A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫原性研究，選用SPF Balb/c小鼠，每組20只，分別皮下接種含A、C群多糖各2.5μg的結(jié)合疫苗于0、14、28天各免疫一針，第42天采血，分離血清，采用ELISA分別測定每只小鼠血清的抗體滴度，并計(jì)算GMT，實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表4。
表4.A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫原性研究

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A.C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗具有較好的免疫原性。
實(shí)施例12用氫氧化鋁吸附劑和緩沖生理鹽水兩種稀釋液配制的A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫原性比較研究選用SPF Balb/c小鼠，每組20只，分別皮下接種兩種稀釋液配制的含A、C群多糖各2.5μg的結(jié)合疫苗于0、14、28天各免疫一針，于免后1、2周分別采血，分離血清，采用ELISA分別測定每只小鼠血清的抗體滴度，并計(jì)算GMT，實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表5。表5.兩種稀釋液配制的A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗免疫原性比較

動物試驗(yàn)證明，兩種稀釋液配制的A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗均能產(chǎn)生明顯的抗體應(yīng)答和免疫回憶反應(yīng)。但兩者在刺激機(jī)體快速產(chǎn)生抗體應(yīng)答、加強(qiáng)免疫后的回憶反應(yīng)、抗體滴度及免疫持久性方面有明顯差異。
實(shí)施例13A.C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的安全性對A.C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的安全性進(jìn)行考核，分別采用小鼠、豚鼠異常毒性試驗(yàn)法，考核其安全性。
選用豚鼠、腹腔接種10個人用劑量A.C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗，分別于免前、免后10天稱體重，并隨時觀察接種反應(yīng)。
選用SPF級Balb/C小鼠，腹腔接種2個人用劑量A.C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗，分別于免前、免后10天稱體重，并隨時觀察接種反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表6、表7。
表6.A.C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗豚鼠安全性試驗(yàn)


表7.A.C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗小鼠安全性試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)表明A.C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗具有可靠的安全性。
權(quán)利要求
1.一種A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白偶聯(lián)的結(jié)合疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合疫苗，其中所述A群腦膜炎球菌多糖可來自菌株CMCC(B)29201，所述C群腦膜炎球菌多糖可來自菌株CMCC(B)29205，以及所述B群腦膜炎球菌外膜蛋白可來自菌株CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合疫苗，其中所述的B群腦膜炎球菌外膜蛋白的主要成份是含有1類和2類或1類和3類的外膜蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合疫苗，其中所述偶聯(lián)由單個A群或C群腦膜炎球菌多糖經(jīng)活化后的多個位點(diǎn)同時結(jié)合多個B群腦膜炎球菌外膜蛋白實(shí)現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合疫苗，其中所述偶聯(lián)由活化后的單個B群腦膜炎球菌外膜蛋白的多個位點(diǎn)同時結(jié)合多個A群或C群腦膜炎球菌多糖實(shí)現(xiàn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，2，4和5中任一項(xiàng)所述的結(jié)合疫苗，其中所述A和C群腦膜炎球菌莢膜多糖在所述結(jié)合疫苗的每劑免疫劑量中各有1.25-2.5g。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合疫苗，其中所述A和C群腦膜炎球菌莢膜多糖在所述結(jié)合疫苗的每劑人用免疫劑量中各有5-20g。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合疫苗，其可以用鋁佐劑和/或緩沖生理鹽水稀釋液。
9.一種制備B群腦膜炎球菌外膜蛋白的方法，該方法包括(1)在收集的培養(yǎng)菌體中加入適量由0.3-0.6M LiCl和0.2-0.5M CH3COONa組成的混合物，離心收集上清；(2)向步驟(1)所得上清中加乙醇至60-80％，沉淀外膜蛋白；(3)收集步驟(2)的沉淀物，再次溶解進(jìn)行超濾；(4)收集400KD超濾液，用30KD超濾膜濃縮；(5)柱層析收集外膜蛋白組分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腦膜炎球菌疫苗及其制備方法。將純化的A群腦膜炎球菌多糖和C群腦膜炎球菌多糖分別與B群腦膜炎球菌外膜蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)而形成單價結(jié)合物，再將單價結(jié)合物混合配制而成。這種疫苗可以用于預(yù)防嬰幼兒由A、C群腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎及敗血癥疾病。
文檔編號A61P31/00GK1457879SQ03131108
公開日2003年11月26日 申請日期2003年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月12日
發(fā)明者范玉柱 申請人:范玉柱