專利名稱：人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)。
人源抗體如Fab片段的制備主要有兩條技術(shù)路線，一是鼠源抗體的人源化；二是從人的抗體基因文庫(kù)中篩選出抗原特異性抗體Fab。應(yīng)用生物技術(shù)原核表達(dá)人源抗-HBsFab最早源于Zebedee SL，此后國(guó)內(nèi)外相繼有多處制備人源生物工程抗HBsFab和ScFv的報(bào)道。迄今為止，所有抗HBsFab的制備均采用組合抗體文庫(kù)技術(shù)，應(yīng)用pComb3載體，ITPG誘導(dǎo)表達(dá)，一直處于實(shí)驗(yàn)研究階段。Lac Z啟動(dòng)子是研究領(lǐng)域應(yīng)用較多的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄元件，結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，使用方便，其不足之處是在非誘導(dǎo)態(tài)克隆基因的表達(dá)控制不夠嚴(yán)格，會(huì)有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，因而影響宿主菌的生長(zhǎng)密度和誘導(dǎo)狀態(tài)下的高表達(dá)。另外在批量制備時(shí)，IPTG也不是經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的誘導(dǎo)劑。
pBAD載體是Invitogen公司的商品載體，有多種形式，原用于多種生物蛋白、多肽的克隆與表達(dá)，如血紅素I蛋白(Rosado Ruiz T2001)，polycyclic aromatic ring dioxygenase(Khaa AA 2001)，重組綠熒光蛋白，人源破傷風(fēng)抗毒素片段，乳酸脫氫酶等，均獲較好效果。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在現(xiàn)有pBAD系統(tǒng)的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，提供一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的批量制備人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明公開的制備人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)是在pBAD系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因插入的方式對(duì)原質(zhì)粒進(jìn)行改造，形成雙啟動(dòng)子、雙肽分別表達(dá)，菌體質(zhì)周腔定向分泌的載體形式，再分別克隆目的抗體片段基因于改構(gòu)的pBAD中，經(jīng)擴(kuò)增、克隆和酶切電泳，菌體發(fā)酵，誘導(dǎo)表達(dá)和產(chǎn)物純化獲得目標(biāo)抗體。
本發(fā)明所述的人源片段抗體是指抗體的Fab片段。本發(fā)明制備人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)包括載體的改構(gòu)與抗原特異Fab的克隆與表達(dá)，具體包括1、選擇商品高表達(dá)載體pBAD/gIII作為本產(chǎn)品的克隆載體，應(yīng)用供體的外周血或骨髓分離淋巴細(xì)胞，制備mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以特定目的基因兩端的序列特異引物擴(kuò)增出編碼肽的基因片段(peptide 1，peptide 2)，電泳并膠回收目的片段。
2、依據(jù)peptide 1，peptide 2兩端所引入的特異性酶切位點(diǎn)E1，E2(peptide 1兩端的酶切位點(diǎn))和E3，E4(peptide 2兩端的酶切位點(diǎn))，以相同的內(nèi)切酶分別酶切載體，電泳并膠回收載體片段，分別以連接酶與相應(yīng)的單肽基因連接，構(gòu)建單肽表達(dá)載體。
3、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌后，經(jīng)PCR法或酶切鑒定，篩選目的基因陽(yáng)性克隆，形成pBAD啟動(dòng)單肽表達(dá)模式。
4、設(shè)計(jì)特異引物，以基因擴(kuò)增方式制備包含單肽基因(peptide 2)和啟動(dòng)子、引導(dǎo)序列的核苷酸序列。
5、雙酶切已克隆的含單肽(peptide 1)基因的載體和步驟4擴(kuò)增制備的核苷酸序列，電泳并膠回收目的片段，以連接酶連接，改構(gòu)后的質(zhì)粒圖見圖5；6、載體轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌后，經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆，增菌、發(fā)酵培養(yǎng)所選克隆，在阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)融合蛋白，進(jìn)行雙啟動(dòng)表達(dá)試驗(yàn)，驗(yàn)證雙肽同步表達(dá)的可行性。
本發(fā)明所述的分泌性表達(dá)載體為pBAD/gIII，其結(jié)構(gòu)見

圖1。
與商品pBAD系統(tǒng)比較，該系統(tǒng)的主要改進(jìn)是增加了一個(gè)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。在生物體內(nèi)，為數(shù)不少的蛋白有兩個(gè)或多個(gè)多肽構(gòu)成，成為一個(gè)完整的功能體，因而兩個(gè)亞單位的同步、等量比轉(zhuǎn)錄和翻譯是此類蛋白表達(dá)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。鑒于人源抗體的結(jié)構(gòu)特征以及許多此類蛋白的表達(dá)要求，本系統(tǒng)的改造具有很強(qiáng)的針對(duì)性和實(shí)用性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系統(tǒng)對(duì)雙基因的同步表達(dá)是高效、可行的，也擴(kuò)展了原系統(tǒng)的使用空間。
本發(fā)明所述的載體啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)劑為阿拉伯糖。加入阿拉伯糖后，pBAD中的轉(zhuǎn)錄子啟動(dòng)，大量轉(zhuǎn)錄目的基因并翻譯成相應(yīng)蛋白；屬高拷貝載體，蛋白表達(dá)量高；可呈分泌性表達(dá)，便于活性蛋白的構(gòu)形和部分的修飾。
本發(fā)明人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)可用于任一活性抗體片段的表達(dá)，如Fab片段，F(xiàn)v片段，ScFv等，由于抗體是一個(gè)巨大的生物產(chǎn)品范疇，涉及人類諸多疾病的防治，如幾乎所有的傳染病，破傷風(fēng)、毒蛇傷、多種腫瘤、自身免疫病等等，因而該系統(tǒng)有極廣的應(yīng)用領(lǐng)域。此外，鑒于該載體系統(tǒng)的質(zhì)周性、可溶性表達(dá)的特點(diǎn)，其他一些可溶性蛋白，融合蛋白的表達(dá)也可在該系統(tǒng)完成。
2、pBAHBs-Fd和pBAHBs-Lc的克隆 載體質(zhì)粒分為二組，一組用Xho I和Bgl II雙酶切，另一組用Pst I和Xba I雙酶切，1％的瓊脂糖電泳回收載體DNA。Fd PCR產(chǎn)物和Lc PCR產(chǎn)物用相同于克隆載體的雙酶切，酶的用量為30u/μg，酚氯仿重復(fù)抽提、乙醇沉淀法純化出PCR產(chǎn)物，按載體插入片段1∶5的比例16℃連接過(guò)夜。以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10，取單菌落用LB增菌，質(zhì)粒DNA制備同上，酶切電泳法篩選插入陽(yáng)性菌落。
3.pBAHBs-Fab載體的構(gòu)建(1)pBAD/Lc片段的制備此片段是指pBAD啟動(dòng)子和Lc片段，而非完整的輕鏈表達(dá)載體，制備的目的是在Fd重鏈載體中再插入另外一個(gè)pBAD啟動(dòng)子和Lc片段，形成雙啟動(dòng)子、雙肽定向表達(dá)的單載體結(jié)構(gòu)。分別增菌pBAD-Fd和pBAD-Lc陽(yáng)性克隆，Mini-prep提取質(zhì)粒DNA，用pBAD-Lc兩端引物(Forward5’-GAA TTC AAACCA ATT GTC CAT ATT GC，Backward5’-TT AAC TCT AGA ACTATG AAC)擴(kuò)增出pBAD/Lc片段。
(2)pBAHBsFab克隆EcoR I和Xba I分別酶切切pBAHBs-Fd載體和pBAD/Lc擴(kuò)增產(chǎn)物，連接后轉(zhuǎn)入感受態(tài)TOP10菌株供雙重插入篩選。
4.陽(yáng)性菌株的篩選與鑒定篩選雙重插入菌落，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，PAGE和Westem blot鑒定抗-HBsFab的表達(dá)效果。
(1)克隆載體的酶切鑒定取轉(zhuǎn)化菌落，LB增菌過(guò)夜，常規(guī)法制備質(zhì)粒DNA。1.Not I單酶切雙重插入的載體，以同樣酶切無(wú)插入pBAD載體為對(duì)照，瓊脂糖電泳分別于5.7Kb和4.1Kb處可見酶切條帶，證實(shí)Fd和pBAD/Lc基因的正確插入；2.Xho I與Xba I雙酶切，用Marker顯示分別于1.6Kb和4.1Kb處可見酶切條帶。見圖2。
(2)陽(yáng)性克隆的誘導(dǎo)表達(dá) 取上述鑒定結(jié)果為正確插入的克隆，增菌至OD600 1.4，加入終濃度為0.02％的阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，28-30℃過(guò)夜。次日，按反復(fù)凍融法制備菌液上清，10％的PAGE經(jīng)Coommasia blue染色，于約47.5Kd處可見濃集的表達(dá)產(chǎn)物條帶，見圖3。
(3)Westerm Blot和抗原特異Dot Blot鑒定抗-HBs Fab的正確表達(dá)PAGE步驟同上，電泳畢，按半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印分離條帶于硝酸纖維膜上，與HRP標(biāo)記抗-Fab反應(yīng)后，以DAB顯色，證實(shí)于47.5Kd的蛋白區(qū)帶確為Fab；HBsAg溶液(mg/血)3μl點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上，封閉液浸泡過(guò)夜，PBS沖冼后加入制備的菌液上清，室溫反應(yīng)2h，洗膜后再與HRP標(biāo)記抗-Fab反應(yīng)，用DAB液顯色，表明表達(dá)產(chǎn)物具有抗原結(jié)合活性。見圖4和6。實(shí)施例2 HIA-I類抗原的克隆與表達(dá)HLA-I類抗原的克隆與表達(dá)HLA-I類抗原具有結(jié)構(gòu)不同的兩個(gè)亞單位，分別為α與β鏈。在制備中要求一定的化學(xué)修飾如二硫鍵和空間結(jié)構(gòu)的維持；要求等比例的合成；要求二個(gè)亞單位的自然結(jié)合并保持特定的立體構(gòu)型。因載體己具備雙啟動(dòng)表達(dá)結(jié)構(gòu)，在啟動(dòng)子之后又有多克隆位點(diǎn)，因而可以應(yīng)用分步克隆法完成HLA-I類抗原的克隆與表達(dá)。
1、先通過(guò)雙酶切(XhoI，Bgl II for α鏈克隆，EcoR I，Xba I forβ鏈克隆)制備線性粘末端載體DNA。
2、用序列特異引物分別擴(kuò)增出α與β鏈的基因片段，以相同的雙酶切后與線性載體作單一亞單位的基因連接。
α鏈forward GAA CTC AGA T CAT TCT ATG AGA TAT TTC TTCACA TCC GTG3’backward AGA TCT
β鏈forward5’A CCGGAA TTCAAT CCC CTC ATT AAG 3’backward5’A CCGTCT AGACAG TCT TGG GCT CCT 3’3、篩選正確克隆載體，使用另外雙種內(nèi)切酶處理篩選過(guò)的載體和另一條鏈的基因，進(jìn)行二次克隆和陽(yáng)性株的篩選與鑒定。
4、對(duì)雙克隆陽(yáng)性株進(jìn)行雙啟動(dòng)表達(dá)實(shí)驗(yàn)和HLA-I類抗原的結(jié)構(gòu)與功能研究。
其他某些二聚體，雙亞單位蛋白的表達(dá)也可以使用該系統(tǒng)。
權(quán)利要求
1.人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)是在原有pBAD系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因插入的方式對(duì)原質(zhì)粒進(jìn)行改造，分別克隆目的抗體片段基因于改構(gòu)的pBAD中，經(jīng)擴(kuò)增、克隆和酶切電泳，菌體發(fā)酵，誘導(dǎo)表達(dá)和產(chǎn)物純化獲得目標(biāo)抗體，其特征在于該系統(tǒng)對(duì)原質(zhì)粒進(jìn)行改造形成雙啟動(dòng)子、雙肽分別表達(dá)，菌體質(zhì)周腔定向分泌的載體形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于所述的人源片段抗體是指抗體的Fab片段。本發(fā)明制備人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)，包括載體的改構(gòu)與抗原特異Fab的克隆與表達(dá)，其特征具體包括1)選擇商品高表達(dá)載體pBAD/gIII作為本產(chǎn)品的克隆載體，應(yīng)用供體的外周血或骨髓分離淋巴細(xì)胞，制備mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以特定目的基因兩端的序列特異引物擴(kuò)增出編碼肽的基因片段peptide 1，peptide 2，電泳并膠回收目的片段；2)依據(jù)peptide 1，peptide 2兩端所引入的特異性酶切位點(diǎn)E1，E2和E3，E4，以相同的內(nèi)切酶分別酶切載體，電泳并膠回收載體片段，分別以連接酶與相應(yīng)的單肽基因連接，構(gòu)建單肽表達(dá)載體；3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌后，經(jīng)PCR法或酶切鑒定，篩選目的基因陽(yáng)性克隆，形成pBAD啟動(dòng)單肽表達(dá)模式；4)設(shè)計(jì)特異引物，以基因擴(kuò)增方式制備包含單肽基因peptide 2和啟動(dòng)子、引導(dǎo)序列的核苷酸序列；5)雙酶切已克隆的含單肽peptide 1基因的載體和步驟4擴(kuò)增制備的核苷酸序列，電泳并膠回收目的片段，以連接酶連接；6)載體轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌后，經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆，增菌、發(fā)酵培養(yǎng)所選克隆，在阿拉伯糖誘導(dǎo)條件下表達(dá)融合蛋白，進(jìn)行雙啟動(dòng)表達(dá)試驗(yàn)，驗(yàn)證雙肽同步表達(dá)的可行性。
全文摘要
本發(fā)明涉及人源片段抗體的pBAD表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)是在pBAD系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因插入的方式對(duì)原質(zhì)粒進(jìn)行改造，形成雙啟動(dòng)子、雙肽分別表達(dá)，菌體質(zhì)周腔定向分泌的載體形式，再分別克隆目的抗體片段基因于改構(gòu)的pBAD中，經(jīng)擴(kuò)增、克隆和酶切電泳，菌體發(fā)酵，誘導(dǎo)表達(dá)和產(chǎn)物純化獲得目標(biāo)抗體。該系統(tǒng)有極廣的應(yīng)用領(lǐng)域，特別適用于可溶性蛋白，融合蛋白的表達(dá)。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1442481SQ0311623
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者韓煥興 申請(qǐng)人:韓煥興, 陸慧琦, 羅榮城