專利名稱：新的導致禽病的細菌和由其衍生的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物健康領(lǐng)域，具體涉及一種新的細菌性禽病的致病因子(Causative agent)，海藻巴斯德氏菌(Pasteurella trehalosi)和/或溶血性曼氏菌(Mannheimia haemolytica)。本發(fā)明提供了所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌細菌，一種含有滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的疫苗，以及一種為防止雞感染所述疾病而對雞進行免疫的方法。
背景技術(shù)：
在過去的十年中，為提高生產(chǎn)能力而采取的集約化禽類養(yǎng)殖方法使得所有主要禽類生產(chǎn)國的發(fā)病率升高。因而亟需新的更好的疫苗及接種方案來控制這類疾病。目前，多數(shù)動物都被免疫以抗多種病毒及細菌病源性疾病。
禽類病毒病的實例為新城疫(Newcastle)、傳染性支氣管炎(InfectiousBronchitis)、禽肺病毒(Avian Pneumovirus)、禽痘(Fowlpox)、傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease)等。
細菌性疾病的實例有由下面所導致的雞鼻炎(Avian Coryza)、副雞嗜血桿菌(Haemophilus Paragallinarum)(上呼吸道)、鳥博德特氏菌(Bordetellaavium)(上呼吸道)、鼻腔鳥桿菌(ornithobacterium rhinotracheale)(下呼吸道)，沙門氏菌(Salmonella)感染(消化道)，多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)，其是禽霍亂(敗血癥的(Septicemic))致病因子，敗血癥以及大腸桿菌感染。
因此，本發(fā)明的首要技術(shù)問題是鑒定一種新的細菌性禽病，提供所述疾病的致病因子以及提供一種防止所述疾病的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
說明書使用術(shù)語的定義在本發(fā)明的實施方案之前，必須注意的是本文及所附權(quán)利要求書中，除上下文清楚注明之外，其中使用的單數(shù)形式“一(“a”、“an”)”和“該(“the”)”將復數(shù)情況包括在內(nèi)。因此，例如，“一種海藻巴斯德氏菌”其中包括多個這樣的海藻巴斯德氏菌，提到“該細胞″是指一個或多個細胞及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等價物，等。一個詞大寫與否沒有區(qū)別，因此“Arabinose”和“arabinose”具有相同的含義。除非另有說明，本申請中使用的所有技術(shù)及科學術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)理解相同。盡管與本申請所述方法及材料類似或等同的任一方法及材料都可以使用，但是本文描述了優(yōu)選的方法、設(shè)備及材料。本申請中提到的所有出版物在此引入旨在描述及公開這些出版物中報道的與本發(fā)明有關(guān)的細胞系、載體及方法學。但是，本申請任何內(nèi)容都不能理解為本申請由于使用了在前發(fā)明就使得本發(fā)明在時間上不能早于在前發(fā)明的公開內(nèi)容。
令人驚奇的是，本發(fā)明人觀察到了一種新的細菌性禽病，該病主要發(fā)生于蛋雞，肉雞中較少發(fā)生。已經(jīng)接種了抗副雞嗜血桿菌(雞鼻炎(avian coryza)致病因子)及多殺性巴氏桿菌(禽霍亂致病因子)的小雞出現(xiàn)了這種疾病。這種新的疾病的癥狀不同于鼻炎的特異性癥狀。如果這種新發(fā)現(xiàn)的疾病明顯表現(xiàn)出下文所述的上呼吸道臨床癥狀，則可以排除副雞嗜血桿菌為致病因子的可能。
本發(fā)明的第一個實施方案涉及導致一種新的家禽上呼吸道及生殖道疾病的革蘭氏陰性、兼性厭氧、多形性桿-狀細菌，該細菌選自海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。
本發(fā)明所述細菌可分離自感染后的氣管、腭裂、卵巢、肝、心、腎及生殖腺(肉雞)。根據(jù)下列測試它們被鑒定為本發(fā)明的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌β溶血+革蘭氏染色-氧化酶+過氧化氫酶+脲酶 -硝酸鹽+吲哚 -該細菌分離物可以根據(jù)Jaworski et al.(1)所述方法純化并生物分型。該方法還在實施例中舉例說明。細菌分類的重要方法有DNA-DNA雜交、REA(限制酶分析，參見，例如，J.Clinical Microbiol，1993，31831-835)以及核糖體分型。技術(shù)人員可以利用所述方法判明細菌是否在本發(fā)明范圍之內(nèi)。一種驗證柯赫(koch)法則的攻擊(challenge)模型也在實施例中例示說明。
因此，本發(fā)明的一個重要實施方案是海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的巴斯德氏和/或曼氏(Pasteurella and/or Mannheimia)菌是貝它(β)-溶血-陽性、革蘭氏-陰性、氧化酶-陽性、過氧化氫酶-陽性，脲酶-陰性、硝酸鹽-陽性及吲哚-陰性。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌也是麥氏(MacConkey)-陽性。甚至更優(yōu)選的，本發(fā)明所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌另外還是葡萄糖-陽性，蔗糖-陽性，甘露醇-陽性，阿拉伯糖-陰性，纖維二糖-陰性，木糖-陽性，水楊苷-陰性，鳥氨酸-陰性，七葉苷-陰性，α-巖藻糖苷酶-陰性，β-半乳糖苷酶-陽性。最優(yōu)選的是本發(fā)明所述的海藻巴斯德氏菌，其中該巴氏桿菌也是阿拉伯糖-陰性和海藻糖-陽性。還優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的海藻巴斯德氏菌還為貝它(β)-葡萄糖苷酶-陰性或-陽性，根據(jù)生物分型。另外最優(yōu)選的是本發(fā)明所述的溶血性曼氏菌，其中該曼氏菌進一步還是阿拉伯糖-陰性和海藻糖-陰性。還優(yōu)選的是，本發(fā)明所述的溶血性曼氏菌是β-葡糖苷酶陰性。
本發(fā)明所述細菌的這些特征賦予了本發(fā)明所述細菌相對于其他已知細菌性禽病原體的新穎性(Diseases of Poultry，Tenth Edition，Edited by B.W.Calnek，lowa State University Press，lowa，U.S.A.1997)。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案是本發(fā)明所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述禽類選自雞、火雞、鴨、鵝、dove，pigeon以及鵪鶉。
本發(fā)明提供了一種新型革蘭氏陰性、兼性厭氧、多形性桿-狀細菌，所述新型細菌具有保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，1081，UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA，具有下列保藏號的細菌的特征-海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667(內(nèi)部命名為BIV-4985)；-海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668(內(nèi)部命名為BIV-AVICOR)；-溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669(內(nèi)部命名為BIV-07990)。
保藏日期為2001年8月22日。
因此，本發(fā)明的一個最優(yōu)選實施方案是保藏號為ATCC No.PTA-3667的海藻巴斯德氏菌。這些細菌另外還例示于實施例1的表3中。
本發(fā)明的另一最優(yōu)選實施方案是保藏號為ATCC No.PTA-3668的海藻巴斯德氏菌。這些細菌另外還例示于實施例1的表2中。
本發(fā)明的另一最優(yōu)選實施方案是保藏號為ATCC No.PTA-3669的溶血性曼氏菌，這些細菌另外還例示于實施例1的表1中。
實施例中A部分和B部分的測試結(jié)果(表1，2和3)確證了細菌BIV-4895；ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-3668屬于巴斯德氏菌家族(海藻巴斯德氏菌，它們都是海藻糖陽性和阿拉伯糖陰性)，而細菌BIV-07990；ATCC No.PTA-3669屬于曼氏菌科(溶血性曼氏菌，它們是海藻糖陰性和阿拉伯糖陰性)。
本發(fā)明還涉及含有上述本發(fā)明細菌的微生物培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物可以通過在35-37℃下培養(yǎng)所述細菌制得。該細菌可在正常大氣氧壓下生長。該細菌也可生長于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種不同的常用促進細菌生長的培養(yǎng)基，例如，胰蛋白胨肉湯(TB)、大豆Trypticasein肉湯或腦心灌注液肉湯或任一營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基。還可37℃下綿羊血瓊脂上孵育24小時培養(yǎng)該細菌。
各種物理及化學的細菌滅活方法已為本領(lǐng)域所知。物理滅活的實例為UV-照射、X-射線照射、γ-射線照射以及加熱。滅活用化學藥品的實例為β-丙內(nèi)酯、戊二醛、β-乙烯亞胺及甲醛。
優(yōu)選地本發(fā)明的細菌用甲醛滅活。令人驚奇的是，使用終濃度為0.2％的甲醛仍然是一種滅活本發(fā)明所述細菌的極好方法。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及一種滅活本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的方法，其中包括使用終濃度0.2％的甲醛。
用上述方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他滅活細菌方法滅活的本發(fā)明所述細菌具體體現(xiàn)在本發(fā)明中。因此，另一重要方面是用本發(fā)明方法或本領(lǐng)域已知方法可得到滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌選自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。
因此，另一重要方面是用本領(lǐng)域已知方法可獲得的活的減毒海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的活的減毒海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌選自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的減毒采用在合適培養(yǎng)基上多次傳代或本領(lǐng)域已知的任一其他方法。
本申請中，滅活意指本發(fā)明的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌被殺死而不能復制引發(fā)臨床疾病。
本申請中，減毒意指本發(fā)明的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌是活菌能夠復制但不能導致臨床疾病。
另一重要方面是用本領(lǐng)域已知方法可獲得海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的組分或片段。所述片段可以通過用去污劑溶解本發(fā)明海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌或者其他任一本領(lǐng)域已知方法制得。
優(yōu)選地，所述組分或片段是本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的純化抗原。優(yōu)選地，所述組分/片段是本發(fā)明海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的外膜蛋白。
本發(fā)明所述的“片段”是本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的任一免疫原性亞單位，即任一多肽子集。
因此，本發(fā)明涉及含本發(fā)明海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌至少一種抗原的片段。最優(yōu)選地，所述片段含有細菌的至少一種抗原，該細菌選自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667、海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。所述片段可包括所述菌株的整個細菌細胞、細菌提取物、外膜蛋白組分、細菌外-和/或內(nèi)毒素以及純化蛋白。其抗原性多肽或片段可例如獲自純化的細菌蛋白或者通過在一些原核或真核表達系統(tǒng)中表達相應遺傳物質(zhì)獲得或者通過有機-化學(organo-chemical)合成獲得。所述方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明所述活的、和/活的減毒、和/或滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌組分在疫苗中的用途。
本發(fā)明進一步提供了一種源自上述新鑒定細菌的疫苗。因此，本發(fā)明進一步還涉及一種疫苗組合物，其中含有本發(fā)明所述活的、和/或活的減毒、和/或滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌組分。
本申請中的“疫苗“是指獸用疫苗，其中含有抗原物質(zhì)，施用可誘導抗所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌導致疾病的特異性主動或被動免疫。本發(fā)明所述的活的或活的減毒海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌賦予主動免疫，可通過抗其所含免疫原的母源抗體被動轉(zhuǎn)移，并且有時還能抗抗原性相關(guān)生物體。本發(fā)明所述的滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的組分賦予被動免疫。能夠增強免疫應答的其他成分為通常稱為佐劑的組分，例如，氫氧化鋁、礦物油或其他油或者添加到疫苗的輔助分子或被所述附加成分相應誘導后機體產(chǎn)生的輔助分子，例如但不限于干擾素、白介素或生長因子。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述疫苗包含滅活細菌。優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗是指上述疫苗，其中一種免疫活性成分是活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。術(shù)語“活疫苗”是指一種含有能分化/增殖的顆粒的疫苗。
還優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗包含減毒后的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌以及一種藥物學可接受的載體或賦形劑。所述疫苗還可以聯(lián)合疫苗的方式施用，其中包含兩株或多株活的、和/或活的且減毒后的和/或滅活的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或兩株或多株所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的組分。最優(yōu)選地，疫苗中的活的、和/或活的且減毒后的和/或滅活的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的組分選自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。
還優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗包含滅活的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌以及藥物學上可接受的載體或賦形劑。所述疫苗也可以聯(lián)合疫苗的形式使用，其中含有兩株或多株所述滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。
另外，也可用全細胞的組分作為本發(fā)明疫苗中的相關(guān)免疫原。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗包含本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的組分以及一種藥物學上可接受的載體或賦形劑。所述疫苗也可以聯(lián)合疫苗的形式使用，其中含有兩株或多株所述滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。具體而言，本發(fā)明涉及含有片段的疫苗，該片段包含本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的至少一種抗原。最優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種含有片段的疫苗，該片段包含選自菌株的至少一種抗原，該菌株選自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。所述片段可以包括全菌體細胞、細菌提取物，外膜成分、菌體外-和/或內(nèi)毒素，以及純化蛋白。其抗原多肽或片段可例如獲自純化的細菌蛋白或者通過在一些原核或真核表達系統(tǒng)中表達相應遺傳物質(zhì)獲得或者通過有機-化學(organo-chemical)合成獲得。所述方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗還包括一種佐劑。因此，本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明所述疫苗組合物，該組合物中進一步包括一種或多種合適的佐劑和/或賦形劑和/或載體。
本申請中使用的佐劑包括能激發(fā)被注射動物免疫應答的物質(zhì)。大量不同佐劑已為本領(lǐng)域已知。本申請中使用的佐劑包括氟氏完全(Freund’s Complete)佐劑及氟氏不完全佐劑、維生素E、非-離子嵌段共聚物、胞壁酰二肽、Quil A、礦物及非礦物油、植物油以及Carbopol(一種同聚物)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明細菌的疫苗包含一種油包水乳劑佐劑。所述疫苗也可稱為一種含滅活的(殺死的)本發(fā)明所述細菌以及一種油包水乳劑佐劑的菌苗。本發(fā)明中還詳細公開了其他輔佐菌體的方法。
還優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗可包含一種或多種合適乳化劑，例如Span或Tween。
另外還優(yōu)選地，疫苗中的所述活的、和/或活的且減毒后的和/或滅活的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的組分選自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。
優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗含有至少一種細菌抗原，該細菌選自海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCC No.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCC No.PTA-3669。所述疫苗可包括所述菌株的全菌體細胞、細菌提取物、外膜蛋白組分、細菌外-和/或內(nèi)毒素以及純化蛋白。其抗原性多肽或片段可例如獲自純化的細菌蛋白或者通過在一些原核或真核表達系統(tǒng)中表達相應遺傳物質(zhì)獲得或者通過有機-化學(organo-chemical)合成獲得。所述方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
最優(yōu)選地，本發(fā)明進一步涉及一種疫苗組合物，其中進一步含有至少一種其他的源自對禽類致病的病毒或微生物的抗原。優(yōu)選地，所述抗原為活的、減毒的或滅活的病毒或微生物或其片段。所述片段可以包括全菌體細胞或病毒顆粒、細菌提取物、病毒抗原、病毒亞單位、外膜成分、細菌外-和/或內(nèi)毒素以及純化蛋白。其抗原性多肽或片段可例如獲自純化的細菌蛋白或者通過在一些原核或真核表達系統(tǒng)中表達相應遺傳物質(zhì)獲得或者通過有機-化學(organo-chemical)合成獲得。所述方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
最優(yōu)選地，本發(fā)明進一步涉及一種疫苗組合物，其中含有至少一種其他的源自對禽類致病的病毒或微生物的抗原，其中所述的病毒或微生物選自，但不限于，傳染性支氣管炎病毒，新城疫病毒、傳染性法氏囊病(Bursal)病毒(疾病Gumboro)，雞傳染性貧血因子(Chicken Anaemia agent)、禽呼腸孤病毒(Avian Reovirus)、雞敗血枝原體(Mycoplasma gallisepticum)、禽肺病毒、副雞嗜血桿菌(疾病鼻炎)、雞痘病毒(chicken poxvirus)、禽腦脊髓炎病毒(AvianEncephalomyelitis)、多殺性巴斯德氏桿菌以及大腸桿菌。
“藥物組合物”基本上由一種或多種成分組成，該成分能修飾所給藥機體的生物體或者存活于機體之內(nèi)或之上生物體的生理功能，例如免疫原性。該術(shù)語包括，但不限于抗生素或抗寄生劑、以及其他用于實現(xiàn)其他特定目的的其他組分，例如但不限于，加工特性(processing traits)，滅菌，穩(wěn)定，使得組合物可通過腸道或非胃腸道途徑施用如經(jīng)口、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮或其他合適途徑，施用后耐受、控制釋放特性。因此，本發(fā)明另一重要方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其中含有活的、和/或活的減毒的、和/或滅活的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的組分。
本發(fā)明涉及一種對感染了海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌(例如，上述活細菌)的屬于禽類的動物進行治療的方法，其中將上述本發(fā)明的活的、減毒的、滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌以及/或者其組分和/或片段，按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適劑量施用給需要其的禽類，然后監(jiān)測由所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌感染所引發(fā)癥狀的減輕情況。所述治療優(yōu)選可重復進行。
另一個重要的實施方案是一種免疫禽類抗海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌(例如，上述活細菌)引發(fā)的呼吸及生殖道疾病的方法，該方法包括施用免疫學有效量本發(fā)明所述疫苗，然后監(jiān)測由所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌感染所引發(fā)癥狀的減輕情況。
另一個重要實施方案是滅活的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或存活的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或存活但減毒的本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或者本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的片段或組分在制備用于預防海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌感染疫苗中的用途。
本發(fā)明還涉及一種診斷所致疾病的方法，該方法包括從禽類獲取樣本，其中所述樣本選自全血、血清、血漿、組織刮取物、洗滌物、拭子、組織，然后分析樣本中本發(fā)明所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的存在情況。
在一個優(yōu)選實施方案中，海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的存在通過免疫試驗測定。免疫試驗使用海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌特異性單克隆抗體或多克隆抗血清。單克隆抗體的制備已為本領(lǐng)域已知(3，4)。免疫試驗包括本領(lǐng)域已知的檢測方法，例如ELISA試驗(酶聯(lián)免疫吸附測定)或所謂的夾心-ELISA試驗、斑點印跡、免疫印跡、放射免疫試驗(放射免疫測定RIA)，二維雙向擴散試驗(diffusion-based Ouchterlony)或火箭免疫熒光測定)，或者凝集試驗(快速平板或微量滴定板凝集試驗)。另一種免疫試驗是所謂的Western印跡(又稱Western轉(zhuǎn)移法或Western轉(zhuǎn)印)。Western印跡的目的是將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后的蛋白或多肽轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或其他合適載體上，與此同時保持各蛋白或多肽電泳后得到的相對位置。然后，用試驗中能特異性結(jié)合所述蛋白或抗體的抗體孵育上述Western印跡。這些檢測方法可被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用來實施本申請所述的發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從下列參考文獻中找到上述方法及其他檢測方法An Introduction toRadioimmunoassay and Related Techniques，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1986)；Bullock et al.，Techniques inImmunocytochemistry，Academic Press，Orlando，F(xiàn)L Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme ImmunoassaysLaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，The Netherlands(1985)。
在另一最具體實施方案中，用海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌特異性抗體孵育上述樣本，然后測定生成的抗原/抗體復合物。
在本發(fā)明所述方法的一具體優(yōu)選實施方案中，上述樣本中海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的存在情況用分子生物學方法測定。本申請中使用的分子生物學方法是指檢測方法，包括，例如，聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)或者可以是Northem或Southem印跡，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在常見參考書中找到這些方法(例如Sambrook et al.(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York and Bertram，S.and Gassen，H.G.GentechnischeMethoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1991)。
本發(fā)明還包括診斷試劑盒，其特征為其中含有檢測海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌所需的全部組件。
診斷試劑盒是實施本發(fā)明診斷方法所用全部成分的集合。實施本發(fā)明方法所用其他元件的一些實例(并非窮舉)包括容器例如96-孔平板或微量滴定板、試管、其他合適容器，平面及支持物，膜例如硝酸纖維素濾膜，洗滌試劑及緩沖液。診斷試劑盒還可包括檢測結(jié)合抗體的試劑，例如標記后的二抗、生色團、酶(例如，與抗體偶聯(lián))及其底物或其他能夠結(jié)合抗體的底物。
本發(fā)明進一步還涉及一種診斷試劑盒，其特征為其中含有實施PCR或RT-PCR檢測海藻巴斯德氏菌-和/或溶血性曼氏菌-特異性DNA或RNA所需的全部組件。所述試劑盒可包括，但不限于除試管或96-孔平板或微量滴定板外的其他容器，平面及支持物，膜例如硝酸纖維素濾膜，洗滌試劑及反應緩沖液(其可以改變pH值及鎂離子濃度)，無菌水，礦物油，BSA(牛血清白蛋白)，MgCl2，(NH4)2SO4，DMSO(二甲亞砜)，巰基乙醇，核苷酸(dNTPs)，酶例如Taq-聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，作為DNA基質(zhì)的，海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌特異性DNA或cDNA，海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌DNA或RNA的特異性寡核苷酸，對照模板，DEPC-水，DNA酶，RNA酶，以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知化合物。本發(fā)明所述的寡核苷酸是長度約15-約100各核苷酸的短核酸分子，其在嚴謹條件下能與互補于海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌蛋白的核酸序列結(jié)合。至于嚴謹條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員是指同源性大于85％，優(yōu)選大于90％選擇的條件(參見，Sambrook etal.(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual，2″d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York and Bertram，S.and Gassen，H.G.Gentechnische Methoden，G.Fischer Verlag，Stuttgart，New York，1991)。


A)自發(fā)作部位(field)圖1)肉雞(Broilers)鼻腔分泌物及眼周圍水腫圖2)肉雞心臟及冠狀脂肪出血。
圖3)肉雞結(jié)膜炎及眼部周圍炎癥。
圖4)蛋雞(Layers)鼻腔分泌物以及雞冠青紫下垂(displaced comb withcyanosis)。
圖5)蛋雞眼睛周圍炎癥并出血。
圖6)蛋雞耳道入口后皮膚組織出血。
圖7)蛋雞腎臟炎癥圖8)蛋雞輸卵管出血。
圖9)蛋雞卵巢卵泡畸形。
圖10)蛋雞前胃(proventriculus)和腺胃(gizzard)之間結(jié)合處出血。
圖11)蛋雞輸卵管充血和出血。
B)實驗性感染圖12)蛋雞腎臟炎癥并出血。
圖13)SPF衰竭(俯臥)。
圖14)蛋雞關(guān)節(jié)及肌肉出血。
圖15)蛋雞鼻腔分泌物及蒼白肉冠。
圖16)蛋雞肌肉出血。
圖17)SPF心臟及冠狀動脈脂肪(coronary fat)出血。
圖18)蛋雞左側(cè)為健康雞，右側(cè)為羽毛凌亂的病雞。
圖19)蛋雞綠色痢疾。
圖20)SPF肌肉出血。
圖21)SPF衰竭(運動障礙)及綠色痢疾。
圖22)蛋雞肝腫大出血。
下列實施例是為了進一步闡釋本發(fā)明，絕不應理解為是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1與海藻巴斯德氏菌及溶血性曼氏菌相關(guān)的野外疾病暴發(fā)臨床癥狀觀察發(fā)作部位



三株新型革蘭氏陰性、兼性厭氧、多形性桿-狀細菌，保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，1081，University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，USA，保藏號BIV-4985海藻巴斯德氏菌為ATCC No.PTA-3667；BIV-AVICOR海藻巴斯德氏菌為ATCC No.PTA-3668以及BIV-07990溶血性曼氏菌為ATCC No.PTA-3669。保藏日為2001年8月22日。
按照常規(guī)測定方法對這些細菌分型，使用Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology Volume I(1984.Williams and Wilkins，428 East PrestonStreet.Baltimore，USA.)表1溶血性曼氏菌BIV-07990(生物1型)；ATCC No.PTA-3669肉眼觀察的形態(tài)在綿羊血瓊脂上培養(yǎng)24小時后長成的菌落，直徑1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、光滑、奶油狀，β-溶血。
顯微鏡下觀察到的形態(tài)革蘭氏-陰性，不運動，多形性桿狀，常呈現(xiàn)兩極染色。
生化及其他試驗A部分


部分B

表2海藻巴斯德氏菌BIV-AVICOR(生物2型)；ATCC No.PTA-3668肉眼觀察的形態(tài)在綿羊血瓊脂上培養(yǎng)24小時后長成的菌落，直徑1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、表面光滑、奶油狀，β-溶血。
顯微鏡下觀察到的形態(tài)革蘭氏-陰性，不運動，多形性桿狀，常呈現(xiàn)兩極染色。
生化及其他試驗A部分


部分B

α80％是陽性表3海藻巴斯德氏菌BIV-4895(生物4型)；ATCC No.PTA-3667肉眼觀察的形態(tài)在綿羊血瓊脂上培養(yǎng)24小時后長成的菌落，直徑1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、干燥微粒狀，β-溶血。
顯微鏡下觀察到的形態(tài)革蘭氏-陰性，不運動，多形性桿狀，常呈現(xiàn)兩極染色。
生化及其他試驗
A部分

部分B

A和B部分試驗結(jié)果(表1，2和3)證實了細菌BIV-4895；ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-3668屬于巴斯德氏菌家族(family)(海藻巴斯德氏菌，海藻糖陽性及阿拉伯糖陰性)，而細菌BIV-07990；ATCC No.PTA-3669屬于曼氏菌科(溶血性曼氏菌，海藻糖陰性和阿拉伯糖陰性)。
致病因子的鑒定細菌分離自感染后的氣管、腭裂、卵巢、肝、心、腎及生殖腺(肉雞)。根據(jù)下列試驗它們被鑒定為海藻巴斯德氏菌和溶血性曼氏菌β溶血 +革蘭氏染色 -氧化酶 +過氧化氫酶 +Mac Conkey +脲酶-硝酸鹽 +吲哚-沒有分離病毒或任一其他細菌。
生物分型純化細菌分離株，并按照Jaworski et al.(1)所述方法進行生物分型。鑒定出三種不同生物型(4，2，1)。
簡而言之，從純化后的分離物中，將單個菌落接種入裝有3ml胰蛋白胨肉湯的試管，37℃孵育8小時。然后從試管取一接種環(huán)接種物(20μl)轉(zhuǎn)移入含3ml 1％蔗糖的另一試管，37℃孵育7天然后記錄結(jié)果。
攻擊模型(challege mode)細菌純化后，將分離物培養(yǎng)于胰蛋白胨培養(yǎng)基獲得大量純化病原體。為了驗證柯赫(koch)法則，用每一生物型(0.2ml/雞；3×108CFU/ml)通過靜脈內(nèi)途徑感染三個不同組(每組20只雞)的13周齡無特定病原體(SPF)雞。每天觀察雞的發(fā)病率和死亡率，共三天。在第三天時，所有雞全部宰殺，記錄尸檢病變，收集器官(肝和生殖腺)樣本用于重分離。另外還記錄死雞的尸檢病變。
結(jié)果臨床癥狀俯臥(prostration)，跛行，雞冠下垂，羽毛凌亂，冠頂青紫(cyanosis)。
病變

實施例II本發(fā)明細菌的培養(yǎng)、疫苗制備及SPF雞的接種。
將菌株培養(yǎng)于胰蛋白胨肉湯(TB)。依菌株而定接種后約6-8小時的對數(shù)生長期時收獲。用滴定用的綿羊血瓊脂進行平板計數(shù)。用收獲產(chǎn)物的1∶10稀釋液測定每毫升的菌落形成單位(CFU/ml)。通過加入甲醛至終濃度為0.2％殺死細胞。無菌檢驗該懸浮液后，將最小滴定量的108CFU/ml加入到疫苗終產(chǎn)物中。
通過把兩菌株(BIV-4895，ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR，ATCC No.PTA-3668)和油佐劑(用礦物油按60％油/40％水的比例的油包水乳液)混合至最小濃度107.0CFU/菌株/ml，制備疫苗。
無特定病原體(SPF)雞在2、5和9周齡時，以在頸部下半部皮下注射0.5ml疫苗的方式接種。
實施例III攻擊菌株的制備以及接種和對照組的攻擊。
將菌株BIV-4895、ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR，ATCC No.PTA-3668在綿羊血瓊脂上37℃培養(yǎng)24小時。用胰蛋白胨肉湯(TB)收獲細胞直至獲得用波長540nm分光光度計測得的光密度為2.0的懸液。為了實施攻擊，制備最終攻擊-體積中含有下列數(shù)目細胞的制劑3×109CFU/ml BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-36681.45×1010CFU/ml BIV-4895；ATCC No.PTA-3667在13周齡時，20只接種后的和20只未-接種的雞通過靜脈途徑0.2ml接種物(至少108CFU/雞)攻擊。觀察三天內(nèi)雞的發(fā)病率和死亡率。觀察3天后，將剩下的雞全部宰殺，從每只雞的肝和生殖腺中重-分離細菌。將死雞的尸檢病變也記錄了下來。
結(jié)果雞的分組 攻擊接種死亡率+重分離保護％陰性對照 N/A 0N/A陽性對照 ATCC No.PTA-366777 23陽性對照 ATCC No.PTA-366854 46接種 ATCC No.PTA-36670100接種 ATCC No.PTA-3668595實施例IV本發(fā)明細菌的培養(yǎng)、疫苗制備及SPF雞的接種。
將菌株培養(yǎng)于胰蛋白胨肉湯(TB)。依菌株而定接種后約6-8小時的對數(shù)生長期時收獲。用滴定用的綿羊血瓊脂進行平板計數(shù)。用收獲產(chǎn)物的1∶10稀釋液測定每毫升的菌落形成單位(CFU/ml)。通過加入甲醛至終濃度為0.2％殺死細胞。無菌檢驗該懸浮液后，將最小滴定量的108CFU/ml加入到疫苗終產(chǎn)物中。
通過把三個菌株(BIV-4895，ATCC No.PTA-3667和BIV-AVICOR，ATCCNo.PTA-3668和BIV-07990，ATCC No.PTA-3669)和油佐劑(用礦物油按60％油40％水的比例的油包水乳液)混合至最小濃度107.0CFU/菌株/ml，制備疫苗。
無特定病原體(SPF)雞在2、5和9周齡時，以在頸部下半部皮下注射0.5ml疫苗的方式接種。
實施例V攻擊菌株的制備以及接種和對照組的攻擊。
將菌株BIV-4895、ATCC No.PTA-3667，BIV-AVICOR、ATCC No.PTA-3668和BIV-07990，ATCC No.PTA-3669在綿羊血瓊脂上37℃培養(yǎng)24小時。用胰蛋白胨肉湯(TB)收獲細胞直至獲得用波長540nm分光光度計測得的光密度為2.0的懸液。為了實施攻擊，制備最終攻擊-體積中含有下列數(shù)目細胞的制劑8.3×109CFU/ml BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-36682.2×109CFU/ml BIV-4895；ATCC No.PTA-36671.0×1010CFU/ml BIV-07990；ATCC No.PTA-3669在13周齡時，20只接種后的和20只未-接種的雞通過靜脈途徑0.2ml接種物(至少108.0CFU/雞)攻擊。觀察三天內(nèi)雞的發(fā)病率和死亡率。觀察3天后，將剩下的雞全部宰殺，從每只雞的肝和生殖腺中重-分離細菌。將死雞的尸檢病變也記錄了下來。
結(jié)果雞的分組 攻擊接種死亡率+重分離保護％接種陰性對照 N/A 0N/A未接種陰性對照N/A 0N/A接種 ATCC No.PTA-366927.3 72.7接種 ATCC No.PTA-366820.9 79.1接種 ATCC No.PTA-366716.7 83.7陽性對照 ATCC No.PTA-366953.3 46.7陽性對照 ATCC No.PTA-366853.3 46.7陽性對照 ATCC No.PTA-366764.3 35.7
血清學試驗按照Biberstein et.al.(2)中的方法，用兔子制備代表各生物型的分離株的高免血清。
分離株用血瓊脂培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，然后收獲于含0.3％的福爾馬林的鹽水中。細胞洗滌一次，調(diào)節(jié)至575nm處透光度為10％用于注射。按照下列方案靜脈內(nèi)(IV)注射0.5ml、1.0、2.0、3.0、3.0、3.0，時間間隔為4天，最后一次注射后4天對所有兔子放血。
用3個生物型毒株測試高免血清的特異性，并通過快速平板凝集與同源及異源抗血清(2倍稀釋)反應。
對每一生物型的抗血清進行稀釋直至能測得陽性結(jié)果的最大稀釋程度為止。
稀釋(log2)抗原生物型1

稀釋(log2)抗原生物型4

稀釋(log2)抗原生物型2


然后用生物型特異性高免血清作為微量-滴定板血清凝集試驗的陽性對照。
實施例VI攻擊菌株的制備以及接種和對照組的攻擊。
將菌株BIV-4895、ATCC No.PTA-3667，BIV-AVICOR、ATCC No.PTA-3668和BIV-07990，ATCC No.PTA-3669在綿羊血瓊脂上37℃培養(yǎng)24小時。用胰蛋白胨肉湯(TB)收獲細胞直至獲得用波長540nm分光光度計測得的光密度為2.0的懸液。為了實施攻擊，制備最終攻擊-體積中含有下列數(shù)目細胞的制劑1.5×1010CFU/ml BIV-AVICOR；ATCC No.PTA-36681.7×1010CFU/ml BIV-4895；ATCC No.PTA-36671.6×1010CFU/ml BIV-07990；ATCC No.PTA-3669在13周齡時，20只接種后的和20只未-接種的雞通過靜脈途徑0.2ml接種物(至少108.0CFU/雞)攻擊。觀察三天內(nèi)雞的發(fā)病率和死亡率。觀察3天后，將剩下的雞全部宰殺，記錄死后損傷并從每只雞的肝、心和生殖腺中重-分離細菌。
結(jié)果表1.根據(jù)死亡率和重-分離情況評估疫苗的效用雞的分組 攻擊接種 死亡率+保護％重分離未接種陰性對照N/A N/AN/A陽性對照 BIV-4895 70 30陽性對照 BIV-AVICOR 80 20陽性對照 BIV-0799088.8 11.2接種 BIV-4895 10 90接種 BIV-AVICOR 10 90接種 BIV-0799015 85
表2.根據(jù)攻擊后肉眼觀察病變評估疫苗的效用雞的分組攻擊接種物 病變％ 保護％未接種的陰性對照N/AN/A N/A陽性對照BIV-4895 74.4 25.6陽性對照BIV-AYICOR 27.0 73.0陽性對照BIV-07990 7.0 93.0接種BIV-4895 4.0 96.0接種BIV-AYICOR 1.1 99.0接種BIV-07990 2.4 98.0參考文獻1)Jaworski M.D.，D.L.Hunter，A.C.S.Ward.Biovariants of isolates of Pasteurellafrom domestic and wild ruminants.J.Vet.Invest.1988，1049-55.
2)Biberstein EL.，Meyer M.E.，and Kenedy P.C.Colonial variation of Pasteurellahaemolytica isolated from sheep.J.Bact.1958，76445-452.
3)Kearney，J.F.，Radbruch A.，Liesegang B.，Rajewski K.A new mouse myelomacell line that has lost imunoglobulin expression but permits construction ofantibody-secreting hybrid cell lines.J.Immunol.1979，1231548-1550.
4)K_hler，G.，Milstein，C.Continous culture of fused cells secreting antibody ofpredefined specifity.Nature 1975，265495-497.
PCT原始文件(用于提交)---2002年10月23日09:05:55印制1-1265-PCT




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美國典型培養(yǎng)物保藏中心10801 University Blvd.
Manassas，VA 20110-2209電話703-365-2700傳真703-365-2745此為傳真件日期2001年9月12日收件人Abelardo Aquilar收件人傳真號碼52 3 668 80 80發(fā)件人ATCC專利保藏處 傳真頁數(shù)1(包括此首頁)題由專利保藏Avian Pasteurella trehalosiBIV-4895被給予ATCC保藏號PTA-3667；Avian Pasteurella trehalosiBIV-AVICOR被給予ATCC保藏號PTA-3668；Avian Mannheimia haemolyticaBIV-07990被給予ATCC保藏號PTA-3669。
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1.保藏物名稱。如果是保藏物是微生物，請給出其科學命名法的全稱，包括屬名，種名和該材料的分離來源；如果保藏物是病毒，請給出其命名，并明確是來源于植物還是動物，其來源地，包括其地理位置；如果保藏物是細胞系，請給出其組織和種名，分離來源的地理位置，以及任何與其相關(guān)的危害(HIV，EBV，等)；如果保藏物是基因材料，請給出衍生其的載體，克隆或文庫的生物名稱，請給出由物種(例如，人，鼠)鑒定的DNA插入的來源或其科學命名，基因的名稱，以及對宿主生物的同一性；如果保藏是聚生體(consortia)或混合培養(yǎng)的，請明確每一種成分；如果保藏物是種子，胚胎，蟲卵等，請給出俗名，科學名以及地理來源。
Avian Mannheimia haemolytica(以前被稱為Pasteurella haemolytica)2.菌株命名(即，數(shù)字，符號等)(該菌株命名必須與其貯藏瓶上的標簽一致)BIV-079903.這是布達佩斯條約下的首次保藏嗎？是4.這是否是將ATCC的已有保藏轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏？如果是請給出ATCC命名。
不適用于該情況。
5.該保藏物是微生物或細胞的混合物嗎？不是6.請?zhí)峁╆P(guān)于對該保藏物的培養(yǎng)，存活檢測及儲存保藏物的詳細條件。如果是混合物，請對各個成分給予說明并提供鑒別其存在的方法。如果是質(zhì)粒，請?zhí)峁┢渌拗髅Q以及抗生素抗性。
見附件3
7.請?zhí)峁┠茏孉TCC確證保藏物特性的足夠信息(例如，革蘭氏陰性桿狀)見附件3a.如果保藏物是一種細胞培養(yǎng)物，其是否要在抗生素存在條件下培養(yǎng)？如果是，請列出所述抗生素。
不適用于該情況。
b.如果保藏物是一種雜交瘤，其所產(chǎn)生抗體的同種型是什么？不適用于該情況8.該菌株對人有害嗎？是□，否 動物呢？是 否□植物呢？是□，否 如果答案是“是”，請推薦對此菌株操作時所需遵循的生物安全級別？19.保藏物的可獲得性在相關(guān)的美國專利被授予之前，只有在接到保藏人或是相關(guān)專利局的指示時，ATCC才能向外提供該保藏物。接到布達佩斯條約參加國的專利局的指示后，ATCC必須將保藏物樣品提供給某一特定的調(diào)查人。以下的請保藏人務必回答a)自滿足布達佩斯條約的要求的保藏之日起，或是自保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏之日起，您是否愿意任何人在提出要求后可以獲得您的保藏物？如果答案是肯定的，那么提出要求想獲得您的保藏物的人是沒有限制的。如果答案是否定的，在相應的美國專利被授予之后才能保證此保藏物為公眾所得到。是□，否 b)自滿足布達佩斯條約的要求的保藏之日起，或是自保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏之日起，您是否愿意讓不屬于布達佩斯條約，但是滿足國家條件的專利局請求得到您的保藏物？是□，否 如果是肯定的，請給出您指定的國家＿＿＿＿＿＿＿＿＿請注意，如果您希望將保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏，而您的保藏物因為相應的美國的授權(quán)而向公眾公開發(fā)售，您將不能對其的進一步發(fā)售作出限制。
在相應的美國專利被授權(quán)并且ATCC被通知后，根據(jù)美國專利局條約和細則(37CFR 1.808[a][2])，任何人向ATCC請求得到該保藏物都將被允許。
10.在存活實驗完全之后ATCC將告知您該保藏物的ATCC保藏號。
被告知人＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿傳真52 3 668 80 80電話52 3 668 8038E-mailbaguilar@gua.boehringer-ingelheim.com11.除非事先對付帳事宜有約定，使用支票或信用卡(Mastercard，VISA或American Express)時必須出示保藏。ATCC也接受正確帳戶中的訂單。
訂單號＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿支票號＿＿＿＿＿＿信用卡號(請注明是Master卡，VISA卡還是AE卡)＿＿＿＿＿＿＿＿＿到期日＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 卡上名字(請清晰書寫或打印)＿＿＿＿＿持卡人簽名 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿支付ATCC必須要有一個寄帳單的地址，請注明負責所有保藏物的聯(lián)系人，電話和傳真號碼。
聯(lián)系人Abelardo AguilarCalle 30 No.2614 Zonal Industrial 44940Guadalajara，Jalisco，Mexico傳真52 3 668 80 80電話52 3 668 803812.您的律師的姓名，地址，電話和傳真號碼13.必填項此保藏是在Boehringer Ingelheim Vetmedica，S.A.de C.V.的名義下。
我明白并且同意此保藏物在布達佩斯條約規(guī)定的一段時間(自保藏日起30年內(nèi)或自對該保藏物的最近一次請求之日內(nèi)5年內(nèi)，取上述兩者中長者，)能被我撤消。如果在相應的專利期限或規(guī)定的一段時間內(nèi)保藏物死亡或被毀壞，提供相同生物的活的培養(yǎng)或病毒情況下為，細胞培養(yǎng)物，質(zhì)粒，胚胎和種子將是我的責任。在規(guī)定的一段時間內(nèi)提供足夠量的保藏物也將是我的責任。
Ing.Jorge Suchil B. 2001年5月24日打印的 簽名日期地址Calle 30 No.2614 Zona Industrial 44940 Guadalajara，Jalisco，Mexico傳真523 668 80 80電話523 668 8038E-mail
jsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com保藏物和表格需要寄給如下地址Patent DepositoryAmerican Type Culture Collection10801 University Blvd.Manassas，VA20110-2209，USA保藏正如大多數(shù)國家的專利局所要求的，保藏日期是自保藏日起30年內(nèi)或自對該保藏物的最近一次請求之日內(nèi)5年內(nèi)，取上述兩者中長者。
收費請登陸我們的網(wǎng)站www.atcc.org，或是通過電郵applied-sci@atcc.org，或是打電話至703-365-2700來索取我們的收費單，收費價格可能浮動。
由ATCC填寫ATCC指定國＿＿＿＿＿＿是否收到＿＿＿＿＿＿＿＿存活實驗結(jié)果＿＿＿＿保藏物名稱＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿菌株指定國＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
對此表格的不正確填寫將會延誤申請請打印或清楚書寫

Vs表格16-3(99年11月)
附件3布達佩斯條約保藏對問題6的回答培養(yǎng)特性 該菌株能夠生長于心腦浸出液肉湯(Brain Heart Infusionbroth)(Difco)或胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptose Soy broth)。37℃下孵育約6-8小時達到對數(shù)生長期。
在血瓊脂平板中，生長峰值出現(xiàn)于37℃孵育24小時后，這種方法的優(yōu)點是能夠觀察到溶血現(xiàn)象。
凍干保存.細菌在心腦浸出液肉湯(Difeo)中生長6-8小時。用Bacto SkimMilk(Difco)的10％無菌溶液，按1∶1(v/v)比例作為穩(wěn)定劑。
存活力試驗.取一小瓶凍干物，用1ml無菌PBS 1X，pH 7.2重配。用無菌PBS，pH 7.2作10倍系列稀釋。每一稀釋度各取100μl接種于血瓊脂平板。37℃孵育24小時。用菌落計數(shù)方法檢驗存活力。
對問題7的回答7.3.BIV-0799肉眼觀察的形態(tài)在綿羊血瓊脂上培養(yǎng)24小時后長成的菌落，直徑1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、表面光滑、奶油狀，β-溶血。
顯微鏡下觀察到的形態(tài)革蘭氏-陰性，不運動，多形性桿狀，常呈現(xiàn)兩極染色。
生化及其他試驗


附件6進入許可對問題6的回答(進入美國前材料的處理)BIV-07990菌株1.從產(chǎn)蛋雞輸卵管中分離2.器官浸軟(Maceration)3.接種于營養(yǎng)肉湯(20ml購自Difco的BHI)4.37℃孵育24小時5.接種于綿羊血瓊脂平板6.分離β溶血菌落7.接種于綿羊血瓊脂平板8.鑒定(生化及其他試驗)9.接種于購自Difco的BHI10.細菌在心腦浸出液肉湯(Difco)中培養(yǎng)6-8小時11.用Bacto Skim Milk(Difco)的10％無菌溶液，按1∶1(v/v)比例作為穩(wěn)定劑。
12.樣本凍干13.生存力、純度及生化試驗生物保藏布達佩斯條約美國典型培養(yǎng)物保藏中心10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209ATCC電話703-365-2700；傳真703-365-2745；emailapplied-sci@atcc.org本表格用于專利目的的保藏或?qū)Ρ２仡愋偷霓D(zhuǎn)換，以使之滿足布達佩斯條約關(guān)于微生物保藏的國際認可的要求所有問題必須有英文作答。一張表格只能填寫一種菌株。
1.保藏物名稱。如果是保藏物是微生物，請給出其科學命名法的全稱，包括屬名，種名和該物質(zhì)的分離來源；如果保藏物是病毒，請給出其命名，并明確是來源于植物還是動物，其來源地，包括其地理位置；如果保藏物是細胞系，請給出其組織和種名，分離來源的地理位置，以及任何與其相關(guān)的危害(HIV，EBV，等)；如果保藏物是基因材料，請給出衍生其的載體，克隆或文庫的生物名稱，請給出由物種(例如，人，鼠)鑒定的DNA插入的來源或其科學命名，基因的名稱，以及對宿主生物的同一性；如果保藏是聚生體(consortia)或混合培養(yǎng)的，請明確每一種成分；如果保藏物是種子，胚胎，蟲卵等，請給出俗名，科學名以及地理來源。
Avian Pasteurella(以前被稱為Pasteurella haemolvtica)2.菌株命名(即，數(shù)字，符號等)(該菌株命名必須與其貯藏瓶上的標簽一致)BIV-AVICOR3.這是布達佩斯條約下的首次保藏嗎？是4.這是否是將ATCC的已有保藏轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏？如果是請給出ATCC命名。
不適用于該情況。
5.該保藏物是微生物或細胞的混合物嗎？不是6.請?zhí)峁╆P(guān)于對該保藏物的培養(yǎng)，存活檢測及儲存保藏物的詳細條件。如果是混合物，請對各個成分給予說明并提供鑒別其存在的方法。如果是質(zhì)粒，請?zhí)峁┢渌拗髅Q以及抗生素抗性。
見附件27.請?zhí)峁┠茏孉TCC確證保藏物特性的足夠信息(例如，革蘭氏陰性桿狀)見附件2a.如果保藏物是一種細胞培養(yǎng)物，其是否要在抗生素存在條件下培養(yǎng)？如果是，請列出所述抗生素。
不適用于該情況。
b.如果保藏物是一種雜交瘤，其所產(chǎn)生抗體的同種型是什么？不適用于該情況8.該菌株對人有害嗎？是□，否 動物呢？是 否□植物呢？是□，否 如果答案是“是”，請推薦對此菌株操作時所需遵循的生物安全級別？1(Refer to Biosafety in Microbiological and BiomedicalLaboratories，4thed.US Dept.of Health and human serviceswww.cdc.gov./od/ohs/biosftv/bmbl4toc.htm)9.保藏物的可獲得性在相關(guān)的美國專利被授予之前，只有在接到保藏人或是相關(guān)專利局的指示時，ATCC才能向外提供該保藏物。接到布達佩斯條約參加國的專利局的指示后，ATCC必須將保藏物樣品提供給某一特定的調(diào)查人。以下的請保藏人務必回答a)自滿足布達佩斯條約的要求的保藏之日起，或是自保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏之日起，您是否愿意任何人在提出要求后可以獲得您的保藏物？如果答案是肯定的，那么提出要求想獲得您的保藏物的人是沒有限制的。如果答案是否定的，在相應的美國專利被授予之后才能保證此保藏物為公眾所得到。是□，否 b)自滿足布達佩斯條約的要求的保藏之日起，或是自保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏之日起，您是否愿意讓不屬于布達佩斯條約，但是滿足國家條件的專利局請求得到您的保藏物？是□，否 如果是肯定的，請給出您指定的國家請注意，如果您希望將保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏，而您的保藏物因為相應的美國的授權(quán)而向公眾公開發(fā)售，您將不能對其的進一步發(fā)售作出限制。
在相應的美國專利被授權(quán)并且ATCC被通知后，根據(jù)美國專利局條約和細則(37CFR 1.808[a][2])，任何人向ATCC請求得到該保藏物都將被允許。
10.在存活實驗完全之后ATCC將告知您該保藏物的ATCC保藏號。
被告知人Abelardo Agualar傳真52 3 668 80 80電話52 3 668 8038E-mailbaguilar@gua.boehringer-ingelheim.com11.除非事先對付帳事宜有約定，使用支票或信用卡(Mastercard，VISA或American Express)時必須出示保藏。ATCC也接受正確帳戶中的訂單。
訂單號＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿支票號＿＿＿＿＿＿信用卡號(請注明是Master卡，VISA卡還是AE卡)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿到期日＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿卡上名字(請清晰書寫或打印)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 持卡人簽名＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿支付ATCC必須要有一個寄帳單的地址，請注明負責所有保藏物的聯(lián)系人，電話和傳真號碼。
聯(lián)系人Abelardo AguilarCalle 30 No.2614 Zonal Industrial 44940Guadalajara，Jalisco，Mexico傳真52 3 668 80 80電話52 3 668 803812.您的律師的姓名，地址，電話和傳真號碼＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿13.必填項此保藏是在Boehringer Ingelheim Vetmedica，S.A.de C.V.的名義下。
我明白并且同意此保藏物在布達佩斯條約規(guī)定的一段時間(自保藏日起30年內(nèi)或自對該保藏物的最近一次請求之日內(nèi)5年內(nèi)，取上述兩者中長者，)能被我撤消。如果在相應的專利期限或規(guī)定的一段時間內(nèi)保藏物死亡或被毀壞，提供相同生物的活的培養(yǎng)或病毒情況下為，細胞培養(yǎng)物，質(zhì)粒，胚胎和種子將是我的責任。在規(guī)定的一段時間內(nèi)提供足夠量的保藏物也將是我的責任。
Ing.Jorge Suchil B. 2001年5月24日打印的簽名 簽名 日期地址Calle 30 No.2614 Zona Industrial 44940 Guadalajara，Jalisco，Mexico傳真52 3 668 80 80電話52 3 668 8038E-mailjsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com保藏物和表格需要寄給如下地址Patent DepositoryAmerican Type Culture Collection10801 University Blvd.Manassas，VA20110-2209，USA保藏正如大多數(shù)國家的專利局所要求的，保藏日期是自保藏日起30年內(nèi)或自對該保藏物的最近一次請求之日內(nèi)5年內(nèi)，取上述兩者中長者。
收費請登陸我們的網(wǎng)站www.atcc.org，或是通過電郵applied-sci@atcc.org，或是打電話至703-365-2700來索取我們的收費單，收費價格可能浮動。
由ATCC填寫ATCC指定國＿＿＿＿＿＿ 是否收到 ＿＿＿＿＿＿存活實驗結(jié)果＿＿＿＿＿＿保藏物名稱＿＿＿＿＿＿＿＿菌株指定國＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
對此表格的不正確填寫將會延誤申請 請打印或清楚書寫

VS表格16-3(99年11月)
附件2布達佩斯條約保藏對問題6的回答培養(yǎng)特性該菌株能夠生長于心腦浸出液肉湯(Brain Heart Infusionbroth)(Difco)或胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptose Soy broth)。37℃下孵育約6-8小時達到對數(shù)生長期。
在血瓊脂平板中，于37℃孵育24小時后出現(xiàn)生長峰值，這種方法的優(yōu)點是能夠觀察到溶血現(xiàn)象。
凍干保存.細菌在心腦浸出液肉湯(Difco)中生長6-8小時。用Bacto SkimMilk(Difco)的10％無菌溶液，按1∶1(v/v)比例作為穩(wěn)定劑。
存活力試驗.取一小瓶凍干物，用1ml無菌PBS 1X，pH 7.2重配。用無菌PBS，pH 7.2作10倍系列稀釋。每一稀釋度各取100μl接種于血瓊脂平板。37℃孵育24小時。用菌落計數(shù)方法檢驗存活力。
對問題7的回答。
7.2.BIV-AVICOR肉眼觀察的形態(tài)在綿羊血瓊脂上培養(yǎng)24小時后長成的菌落，直徑1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、表面光滑、奶油狀，β-溶血。
顯微鏡下觀察到的形態(tài)革蘭氏-陰性，不運動，多形性桿狀，常呈現(xiàn)兩極染色。
生化及其他試驗


α80％是陽性附件5進入許可對問題6的回答(進入美國前材料的處理)BIV-AVICOR菌株1.從產(chǎn)蛋母雞心臟中分離2.器官浸軟3.接種于營養(yǎng)肉湯(20ml購自Difco的BHI)4.37℃孵育24小時5.接種于綿羊血瓊脂平板6.分離β溶血菌落7.接種于綿羊血瓊脂平板8.鑒定(生化及其他試驗)9.接種于購自Difco的BHI10.細菌在心腦浸出液肉湯(Difco)中培養(yǎng)6-8小時11.用Bacto Skim Milk(Difco)的10％無菌溶液，按1∶1(v/v)比例作為穩(wěn)定劑12.樣本凍干13.生存力(viability)、純度及生化試驗生物保藏布達佩斯條約美國典型培養(yǎng)物保藏中心10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209ATCC電話703-365-2700；傳真703-365-2745；emailapplied-sci@atcc.org本表格用于專利目的的保藏或?qū)Ρ２仡愋偷霓D(zhuǎn)換，以使之滿足布達佩斯條約關(guān)于微生物保藏的國際認可的要求所有問題必須有英文作答。一張表格只能填寫一種菌株。
1.保藏物名稱。如果是保藏物是微生物，請給出其科學命名法的全稱，包括屬名，種名和該物質(zhì)的分離來源；如果保藏物是病毒，請給出其命名，并明確是來源于植物還是動物，其來源地，包括其地理位置；如果保藏物是細胞系，請給出其組織和種名，分離來源的地理位置，以及任何與其相關(guān)的危害(HIV，EBV，等)；如果保藏物是基因材料，請給出衍生其的載體，克隆或文庫的生物名稱，請給出由物種(例如，人，鼠)鑒定的DNA插入的來源或其科學命名，基因的名稱，以及對宿主生物的同一性；如果保藏是聚生體(consortia)或混合培養(yǎng)的，請明確每一種成分；如果保藏物是種子，胚胎，蟲卵等，請給出俗名，科學名以及地理來源。
Avian Pasteurella trehalosi(以前被稱為Pasteurella haemolytica)2.菌株命名(即，數(shù)字，符號等)(該菌株命名必須與其貯藏瓶上的標簽一致)BIV-48953.這是布達佩斯條約下的首次保藏嗎？是4.這是否是將ATCC的已有保藏轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏？如果是請給出ATCC命名。
不適用于該情況。
5.該保藏物是微生物或細胞的混合物嗎？不是6.請?zhí)峁╆P(guān)于對該保藏物的培養(yǎng)，存活檢測及儲存保藏物的詳細條件。如果是混合物，請對各個成分給予說明并提供鑒別其存在的方法。如果是質(zhì)粒，請?zhí)峁┢渌拗髅Q以及抗生素抗性。
見附件17.請?zhí)峁┠茏孉TCC確證保藏物特性的足夠信息(例如，革蘭氏陰性桿狀)見附件1a.如果保藏物是一種細胞培養(yǎng)物，其是否要在抗生素存在條件下培養(yǎng)？如果是，請列出所述抗生素。
不適用干該情況。
b.如果保藏物是一種雜交瘤，其所產(chǎn)生抗體的同種型是什么？不適用于該情況8.該菌株對人有害嗎？是□，否 動物呢？是 否□植物呢？是□，否 如果答案是“是”，請推薦對此菌株操作時所需遵循的生物安全級別？19.保藏物的可獲得性在相關(guān)的美國專利被授予之前，只有在接到保藏人或是相關(guān)專利局的指示時，ATCC才能向外提供該保藏物。接到布達佩斯條約參加國的專利局的指示后，ATCC必須將保藏物樣品提供給某一特定的調(diào)查人。以下的請保藏人務必回答a)自滿足布達佩斯條約的要求的保藏之日起，或是自保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏之日起，您是否愿意任何人在提出要求后可以獲得您的保藏物？如果答案是肯定的，那么提出要求想獲得您的保藏物的人是沒有限制的。如果答案是否定的，在相應的美國專利被授予之后才能保證此保藏物為公眾所得到。是□，否 b)自滿足布達佩斯條約的要求的保藏之日起，或是自保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏之日起，您是否愿意讓不屬于布達佩斯條約，但是滿足國家條件的專利局請求得到您的保藏物？是□，否 如果是肯定的，請給出您指定的國家請注意，如果您希望將保藏的類型轉(zhuǎn)為滿足布達佩斯條約要求的保藏，而您的保藏物因為相應的美國的授權(quán)而向公眾公開發(fā)售，您將不能對其的進一步發(fā)售作出限制。
在相應的美國專利被授權(quán)并且ATCC被通知后，根據(jù)美國專利局條約和細則(37CFR 1.808[a][2])，任何人向ATCC請求得到該保藏物都將被允許。
10.在存活實驗完全之后ATCC將告知您該保藏物的ATCC保藏號。
被告知人Abelardo Agular傳真52 3 668 80 80電話52 3 668 8038E-mailbaguilar@gua.boehringer-ingelheim.com11.除非事先對付帳事宜有約定，使用支票或信用卡(Mastercard，VISA或American Express)時必須出示保藏。ATCC也接受正確帳戶中的訂單。
訂單號＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿支票號＿＿＿＿＿＿信用卡號(請注明是Master卡，VISA卡還是AE卡)＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿到期日 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿卡上名字(請清晰書寫或打印)＿＿＿＿＿＿＿＿持卡人簽名＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿支付ATCC必須要有一個寄帳單的地址，請注明負責所有保藏物的聯(lián)系人，電話和傳真號碼。
聯(lián)系人Abelardo AguilarCalle 30 No.2614 Zonal Industrial 44940Guadalajara，Jalisco，Mexico傳真52 3 668 80 80電話52 3 668 803812.您的律師的姓名，地址，電話和傳真號碼13.必填項此保藏是在Boehringer Ingelheim Vetmedica，S.A.de C.V.的名義下。
我明白并且同意此保藏物在布達佩斯條約規(guī)定的一段時間(自保藏日起30年內(nèi)或自對該保藏物的最近一次請求之日內(nèi)5年內(nèi)，取上述兩者中長者，)能被我撤消。如果在相應的專利期限或規(guī)定的一段時間內(nèi)保藏物死亡或被毀壞，提供相同生物的活的培養(yǎng)或病毒情況下為，細胞培養(yǎng)物，質(zhì)粒，胚胎和種子將是我的責任。在規(guī)定的一段時間內(nèi)提供足夠量的保藏物也將是我的責任。
Ing.Jorge Suchil B. 2001年5月24日打印的簽名 簽名 日期地址Calle 30 No.2614 Zona Industrial 44940 Guadalaiara，Jalisco，Mexico傳真52 3 668 80 80電話52 3 668 8038E-mailjsuchil@gua.boehringer-ingelheim.com保藏物和表格需要寄給如下地址Patent DepositoryAmerican Type Culture Collection10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209，USA保藏正如大多數(shù)國家的專利局所要求的，保藏日期是自保藏日起30年內(nèi)或自對該保藏物的最近一次請求之日內(nèi)5年內(nèi)，取上述兩者中長者。
收費請登陸我們的網(wǎng)站www.atcc.org，或是通過電郵applied-sci@atcc.org，或是打電話至703-365-2700來索取我們的收費單，收費價格可能浮動。
由ATCC填寫ATCC指定國＿＿＿＿＿＿＿是否收到＿＿＿＿＿＿＿存活實驗結(jié)果＿＿＿＿＿保藏物名稱＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿菌株指定國＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
對此表格的不正確填寫將會延誤申請 請打印或清楚書寫

Vs表格16-3(99年11月)
附件1布達佩斯條約保藏對問題6的回答培養(yǎng)特性該菌株能夠生長于心腦浸出液肉湯(Brain Heart Infusionbroth)(Difco)或胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptose Soy broth)。37℃下孵育約6-8小時達到對數(shù)生長期。
在血瓊脂平板中，于37℃孵育24小時后出現(xiàn)生長峰值，這種方法的優(yōu)點是能夠觀察到溶血現(xiàn)象。
凍干保存.細菌在心腦浸出液肉湯(Difco)中生長6-8小時。用Bacto SkimMilk(Difco)的10％無菌溶液，按1∶1(v/v)比例作為穩(wěn)定劑。
存活力試驗.取一小瓶凍干物，用1ml無菌PBS 1X，pH 7.2重配。用無菌PBS，pH 7.2作10倍系列稀釋。每一稀釋度各取100μl接種于血瓊脂平板。37℃孵育24小時。用菌落計數(shù)方法檢驗存活力。
對問題7的回答。
7.1.BIV-4895肉眼觀察的形態(tài)在綿羊血瓊脂上培養(yǎng)24小時后長成的菌落，直徑1.0-1.5mm，光亮半透明，微凸起、低溶解度、干燥，β-溶血。
顯微鏡下觀察到的形態(tài)革蘭氏-陰性，不運動，多形性桿狀，常呈現(xiàn)兩極染色。
生化及其他試驗


附件4進入許可對問題6的回答(進入美國前材料的處理)BIV-4895菌株1.從產(chǎn)蛋母雞腭裂中分離2.接種于營養(yǎng)肉湯(20ml購自Difco的BHI)3.37℃孵育24小時4.接種于綿羊血瓊脂平板5.分離β溶血菌落6.接種于綿羊血瓊脂平板7.鑒定(生化及其他試驗)8.接種于購自Difco的BHI9.細菌在心腦浸出液肉湯(Difco)中培養(yǎng)6-8小時10.用Bacto Skim Milk(Difco)的10％無菌溶液，按1∶1(v/v)比例作為穩(wěn)定劑11.樣本凍干12.生存力、純度及生化試驗
權(quán)利要求
1.一種引發(fā)新的家禽上呼吸道及生殖道疾病的革蘭氏陰性、兼性厭氧、多形性桿-狀細菌，其中該細菌選自海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。
2.海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的巴斯德氏菌和/或曼氏菌是β溶血-陽性，革蘭氏-陰性，氧化酶-陽性，過氧化氫酶-陽性，脲酶-陰性，硝酸鹽-陽性以及吲哚-陰性。
3.權(quán)利要求2中的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的巴斯德氏菌和/或曼氏菌為麥氏陽性。
4.權(quán)利要求2或3中任一項的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的巴斯德氏和/或曼氏菌為葡萄糖-陽性，蔗糖-陽性，甘露醇-陽性，阿拉伯糖-陰性，纖維二糖-陰性，木糖-陽性，水楊苷-陰性，鳥氨酸-陰性，七葉苷-陰性，α-巖藻糖苷酶-陰性，β-半乳糖苷酶-陽性。
5.權(quán)利要求2-4中任一項所述的海藻巴斯德氏菌，其中所述的巴斯德氏菌為阿拉伯糖-陰性和海藻糖-陽性。
6.權(quán)利要求2-4中任一項所述的溶血性曼氏菌，其中所述的曼氏菌為阿拉伯糖-陰性和海藻糖-陰性。
7.權(quán)利要求2-6中任一項所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的禽類選自雞、火雞、鴨、鵝、dove，pigeon或鵪鶉。
8.一種保藏號為ATCCNo.PTA-3667的海藻巴斯德氏菌。
9.一種保藏號為ATCCNo.PTA-3668的海藻巴斯德氏菌。
10.一種保藏號為ATCCNo.PTA-3669的溶血性曼氏菌。
11.滅活權(quán)利要求1-10中任一項所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的方法，其中包括使用福爾馬林至終濃度為0.2％。
12.用權(quán)利要求11所述方法或本領(lǐng)域已知方法獲得的滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。
13.權(quán)利要求12中的滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌選自海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCCNo.PTA-3669。
14.一種活的減毒的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中權(quán)利要求1-10中任一項所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌被減毒。
15.權(quán)利要求14中的活的減毒的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌選自海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCCNo.PTA-3669。
16.含有權(quán)利要求1-10中任一項所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的至少一種抗原的片段或組分。
17.權(quán)利要求16中的片段或組分，其中所述片段含有至少一種細菌抗原，該細菌選自海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCCNo.PTA-3669。
18.疫苗組合物，其中含有權(quán)利要求12或13所述的滅活海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或權(quán)利要求1-10中任一項所述的活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或權(quán)利要求14或15所述的活的減毒的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或權(quán)利要求16或17所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌片段或組分。
19.權(quán)利要求18中的疫苗組合物，其進一步包含一種或多種合適的佐劑和/或賦形劑和/或載體。
20.權(quán)利要求18或19中的疫苗組合物，含有滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌，其中所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌選自海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCCNo.PTA-3669。
21.權(quán)利要求18-20中任一項所述的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物含有兩株或多株權(quán)利要求1-10以及12-15所述活的、和/或活的減毒的、和/或滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或權(quán)利要求16或17所述的兩株或多株海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌組分。
22.權(quán)利要求18-21中任一項所述的疫苗組合物，其中所述疫苗中的活的、和/或活的減毒的、和/或滅活的本發(fā)明海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的組分選自海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3667，海藻巴斯德氏菌ATCCNo.PTA-3668和/或溶血性曼氏菌ATCCNo.PTA-3669。
23.權(quán)利要求18-22中任一項所述的疫苗組合物，進一步含有至少一種其他的源自對禽類致病的病毒或微生物的抗原。
24.權(quán)利要求18-23中任一項所述的疫苗組合物，其中所述病毒或微生物選自傳染性支氣管炎病毒、新城疫病病毒、傳染性法氏囊病病毒、雞傳染性貧血因子、禽呼腸孤病毒、雞敗血枝原體、禽肺病毒、副雞嗜血桿菌、雞痘病毒、禽腦脊髓炎病毒、多殺性巴氏桿菌或大腸桿菌。
25.權(quán)利要求12或13所述的滅活海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或權(quán)利要求1-10中任一項所述的活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或權(quán)利要求14或15所述的活的減毒的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌和/或權(quán)利要求16或17所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌片段或組分在制備用于預防海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌感染的疫苗中的用途。
26.免疫禽類抗由權(quán)利要求1-10中所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌所引發(fā)呼吸及生殖道疾病的方法，包括免疫有效量的權(quán)利要求18-24中任一項所述疫苗，和監(jiān)測由所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌感染引發(fā)癥狀的減輕情況。
27.通過含有下述步驟來診斷所致疾病的方法，從禽類獲取樣本，其中所述樣本選自血液、血清、血漿、組織刮取物、洗滌物、拭子、組織，分析樣本中權(quán)利要求1-10任一所述海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌存在。
28.權(quán)利要求27中的方法，其中所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌存在是通過免疫檢測測定的。
29.權(quán)利要求27中的方法，其中所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌存在是通過分子生物學方法測定的。
30.診斷試劑盒，含有實施權(quán)利要求27-29中任一項所述方法所需的全部組件。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物健康領(lǐng)域，具體地是涉及一種新的細菌性禽病的致病因子，海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌。本發(fā)明提供了所述的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌細菌，一種含有滅活的海藻巴斯德氏菌和/或溶血性曼氏菌的疫苗，以及一種為防止雞感染所述疾病而對雞進行免疫的方法。
文檔編號A61P11/00GK1575334SQ02821251
公開日2005年2月2日 申請日期2002年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月26日
發(fā)明者瑪麗亞·B·瓦茲奎茲, 勞爾·坎波加里多, 卡洛斯·岡薩雷斯-赫南德茲, 韋薩納塞恩·西瓦南登 申請人:貝林格爾·英格海姆維特梅迪卡公司