專利名稱：表面吸附有治療藥劑的細菌孢子的制作方法
表面吸附有治療藥劑的細菌孢子本發(fā)明涉及一種在孢子上覆蓋一種或多種治療藥劑的方法。本發(fā)明還涉及一種通過該方法獲得的被覆孢子，以及被覆孢子作為疫苗的應用。新一代疫苗的發(fā)展遵循一系列戰(zhàn)略途徑，包括利用活的重組細菌。其中，遺傳工程菌株孢子的使用已顯示出具有粘膜的和耐熱疫苗傳輸系統(tǒng)的前景。芽胞桿菌屬的孢子目前被廣泛用作益生菌，這是證明其安全性的有力例證。 活細菌作為疫苗傳輸系統(tǒng)的使用提供了一個推動研發(fā)新型且更高效疫苗的途徑。活細菌疫苗包括沙門氏菌、志賀氏桿菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和芽孢桿菌等眾多種類(達特曼等，2006)。在一些情況下，所使用的策略是利用致病菌的生命周期，例如重組型、弱化的傷寒沙門菌Ty21a的一次口服劑量足夠產(chǎn)生一種有效的免疫反應，這是因為細菌有效地以腸道相關的淋巴組織(GALT)為目標(布曼等，2000)。此外，經(jīng)遺傳工程操作獲得的能在孢子表面或萌發(fā)孢子內表達異源抗原的枯草芽孢桿菌可被用于抗原的口服或經(jīng)鼻接種，獲得保護性免疫?？莶菅挎邨U菌的孢子作為休眠的生命形式具有熱穩(wěn)定性、非致病性等優(yōu)勢，目前作為益生菌用于人體和動物(洪等，2005)。表達來自破傷風梭狀芽孢桿菌(杜克等，2003)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(黃等，2008)、炭疽桿菌以及寄生蟲中華支睪吸蟲(周等，2008)的保護抗原的重組孢子都已在動物模型上顯示出能夠提供保護。另一方面，重組細菌的使用也提高了對轉基因微生物(GMOs)的使用和清除來自宿主的細菌的關注(達特曼等，2006)。研發(fā)更好疫苗的第二個目的是識別新的能夠提高免疫原性的佐劑、或弱化免疫原性抗原(例如，重組蛋白亞基和合成多肽)。目前，只有明礬一種佐劑獲得了用于人體的許可，還有一系列潛在的疫苗佐劑正在研發(fā)中，包括免疫刺激性佐劑、粘膜佐劑、脂質顆粒和微粒佐劑(辛格等，1999和莫伊爾等，2004)。其中每一種都各有優(yōu)缺點。新類型佐劑中的一種，即顆粒佐劑(例如，脂質體、病毒體、類病毒顆粒、丙交酯-乙交酯共聚物(PLG)微球體和免疫刺激復合體(ISCOMS))特別令人鼓舞，因為它們會模擬病原體而被免疫系統(tǒng)消滅。微粒佐劑高效地靶向抗原遞呈細胞(APCs)，一旦進入細胞內，即被I類和II類MHC(主要組織相容性復合物)途徑處理，使抗原遞呈在APC表面。生物可降解的PLGs可誘導細胞毒性T淋巴細胞CTL應答；一個與細胞內病原體戰(zhàn)斗的前提(馬洛伊等，1994)。對共聚物佐劑的研究顯示為了誘導大范圍的免疫反應(抗體和細胞介導的免疫反應)有必要使抗原維持其天然形式(亨特等，2002)。在油包水乳狀液中制備的許多抗原被抗原遞呈細胞(APCs)快速包裹、降解，并進入II類通路，以攻擊的模式誘導抗體的產(chǎn)生，未能達到保護作用。這可能是由于不能產(chǎn)生識別變構表位的關鍵的IgG2a亞類而失效(亨特等，2002)?？乖云涮烊恍问轿挥诙栊员砻娴姆€(wěn)定性與誘導有效免疫反應的能力仍然是疫苗與佐劑配方的挑戰(zhàn)之一。國際專利W003/055513和馬凱爾等在1971年發(fā)表的文章公開了一種結合抗原的枯草芽孢桿菌孢子的使用；然而，孢子上被覆抗原卻未公開。本發(fā)明提供了一種將治療藥劑吸附在細菌孢子上的方法，其中包含將孢子與治療藥劑在某一 pH條件下混合，該pH值小于或等于治療藥劑的等電點。已知在這種情況下，通過混合孢子和藥劑，治療藥劑會吸附到孢子上。細菌孢子帶負電荷的疏水表面可用于結合治療藥劑，例如抗原。治療藥劑結合到孢子表面，同時維持其天然構象和功能。尤其是當抗原吸附到孢子上時，會產(chǎn)生較強的免疫反應(例如，Thl和Th2應答)。
為了吸附治療藥劑，孢子和治療藥劑僅需接觸數(shù)分鐘；但是孢子與治療藥劑最好接觸10分鐘以上。孢子可以是任何合適的細菌孢子，包括芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌的孢子。孢子最好是益生菌孢子。尤其是芽孢桿菌孢子，例如枯草芽孢桿菌或克勞氏芽孢桿菌孢子。該孢子可以是一種遺傳工程孢子，用于在其表面表達一種或多種治療藥劑。特別包括枯草芽孢桿菌PY79菌株、枯草芽孢桿菌HU58菌株(塔姆等，2006)、枯草芽孢桿菌HT251菌株(與PY79菌株等基因，其基因組上攜帶表達修飾的孢子外被蛋白CotB的重組基因，該蛋白與GST-Cpa247-370融合(黃等，2008))、來自破傷風梭狀芽孢桿菌的枯草芽孢桿菌RH103菌株(表達免疫原、TTFC(破傷風毒素片段C)，其孢子表面上有與CotB蛋白嵌合體)(伊斯迪卡多等，2001)，以及克勞氏芽孢桿菌0/C菌株。絕大多數(shù)孢子是由枯草芽孢桿菌PY79菌株產(chǎn)生的。孢子優(yōu)選為經(jīng)過變性的(例如，滅活)，以防止其萌發(fā)而進一步增殖。本領域的技術人員已知多種滅活孢子的方法，包括高壓滅菌法、UV輻射、Y輻射，以及對孢子進行遺傳改造。孢子優(yōu)選為經(jīng)高壓滅菌法滅活。治療藥劑可以是任何適合的治療藥劑，包括蛋白質，例如抗原、酶(如促進或加強分解的酶，即纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶等)、抗體分子、抗癌蛋白(例如，赫賽汀、P53等)，以及其他治療蛋白(例如，來自ETEC(產(chǎn)腸毒素大腸桿菌)的不穩(wěn)定毒素、霍亂毒素B亞基、破傷風毒素，等)；變性病毒或其他傳染因子，例如HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、流感病毒(正粘液病毒)、皰疹病毒、乳多泡病毒、正彈狀病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等)；化學小分子，比如抗癌因子(例如，泰克索(taxol))、標記物、受體激動劑和受體拮抗劑?！爸委熕巹卑ㄖ苯又委熂膊』蛭蓙y的活化劑和阻止疾病或紊亂(例如，疫苗抗原)的發(fā)展或惡化的預防疾病藥劑。治療藥劑最好是一種抗原。適當?shù)目乖▉碜詡魅疽蜃印⒛[瘤抗原和過敏原的蛋白質或多肽。傳染因子可以是原核的、真核的、阮病毒或病毒。合適的傳染病毒包括HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、流感病毒(正粘液病毒)、皰疹病毒、乳多泡病毒、正彈狀病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等。合適的傳染細菌包括埃希氏菌(例如，大腸桿菌和ETEC(產(chǎn)腸毒素大腸桿菌))、軍團菌、芽孢桿菌、奈瑟氏菌、嗜血桿菌、螺旋桿菌、棒狀桿菌、肺炎球菌、沙門氏菌、分支桿菌、衣原體和志賀氏桿菌(例如，痢疾志賀菌，宋內志賀菌和福氏志賀菌)，等。適當?shù)募纳锇[孢子蟲，弓形蟲，利什曼蟲，泰勒蟲等，以及任何在其生命周期內具有胞內階段的寄生蟲，例如，瘧原蟲。腫瘤抗原可以是任何腫瘤的抗原。本領域的技術人員已知多種腫瘤抗原。腫瘤抗原的例子包括B7、CEA、ESOU Her2、Muc-U 0FA_iLRP (癌胚抗原未成熟層粘連蛋白受體蛋白)等。過敏原可以是該領域技術人員已知的任何一種過敏原。過敏原包括野草花粉(例如，Phl p 5b)、樹花粉(例如，Bet vl)、房間塵埃粒(例如，Der pi)、動物毛屑(例如，貓Fel dl)、霉菌、乳膠、食物過敏原(例如，花生Ara h2、雞蛋卵清蛋白和類卵粘蛋白)以及蜜蜂/黃蜂毒液(例如，磷脂酶A2)。多種不同的治療藥劑可吸附到孢子上。例如，不同的抗原可吸附到孢子上，提供對多種疾病的免疫保護。當若干種不同抗原吸附到孢子上時，抗原可彼此結合。此外，佐劑可被吸附到孢子上。適當?shù)淖魟┌ɑ魜y毒素B亞基(CTB)和不耐熱的腸毒素(LTB)。其他佐劑，包括Thl佐劑(例如，加強的Thl免疫反應的佐劑)，是該領域技術人員所熟知的。國際專利W099/58683描述了多種合適的佐劑。該治療藥劑可連接到一種調節(jié)劑上。適當?shù)恼{節(jié)劑包括能夠加強治療藥劑吸附到孢子上的媒介、或能加強治療藥劑構象穩(wěn)定的媒介。這種媒介包括谷胱甘肽-S轉移酶(GST)、來自流感嗜血桿菌等20脂蛋白D、麥芽糖結合蛋白、￠-半乳糖苷酶和伴侶蛋白。此夕卜，調節(jié)劑可作為佐劑發(fā)揮作用，刺激接受過這種蛋白質的機體的免疫系統(tǒng)?！盎旌稀?一詞是指孢子和治療藥劑被安排為彼此接觸，該治療藥劑可吸附到孢子表面。孢子與治療藥劑優(yōu)選為通過連續(xù)的攪動而混合。治療藥劑與孢子在一定的pH條件下混合在一起，該pH值低于或等于治療藥劑的等電點。治療藥劑的等電點可利用多種標準技術來確定。特別是該混合PH值優(yōu)選地低于治療藥劑的等電點。PH優(yōu)選為小于7，或小于5，最適宜的是4或以下?；旌掀陂g的pH值小于治療藥劑的等電點，高于孢子的零電荷點(ZPC)，也就是使孢子在混合pH值條件下帶負電荷。對于枯草芽孢桿菌孢子來說，其零電荷點約為2，因此，混合pH值最好高于2。孢子與治療藥劑優(yōu)選在提高孢子與治療藥劑間的疏水與離子相互作用的條件下混合。根據(jù)所使用的孢子和治療藥劑，不同的鹽濃度可促進靜電或疏水作用，例如結合。需要確定特定孢子與治療藥劑結合的最適鹽濃度。從根本上說，低鹽濃度通常有利于離子相互作用，所以主要通過離子相互作用結合的蛋白質在低鹽濃度下將有更好的結合。高鹽濃度通常促進疏水相互作用，因此主要通過疏水相互作用結合的治療藥劑將在高鹽濃度下更好地結合。低鹽濃度通常是指低于0. 3M的鹽濃度，優(yōu)選為小于0. 15M，最好是小于0. 05M。高鹽濃度通常是指高于0. 3M或更高，優(yōu)選為0. 8M或更高的鹽濃度。在本發(fā)明的一個具體實施例中，通過離子相互作用結合在一起的孢子與治療藥劑在結合溶液中混合在一起，該結合溶液的PH值小于或等于治療藥劑的等電點，其鹽濃度小于0.3M。結合溶液可以是一種磷酸鹽緩沖液(PBS)或任何其他適用溶液。在本發(fā)明的一個實施例中，該方法還包含通過結合一個或多個藥用的載體或媒介物，將孢子與吸收的治療藥劑一起構成制藥組分。制藥組分可以是一種免疫原組分或疫苗組分，該方法還包含添加佐劑到該組分中。本發(fā)明還提供了一種通過該方法獲得的免疫原組分或疫苗組分。免疫原組分或疫苗組分優(yōu)選地包括一種或多種來自一種或多種傳染因子的抗原。本發(fā)明還提供了免疫原組分或疫苗組分用于提高對一種或多種傳染因子的保護性免疫應答。本發(fā)明還涉及一種提高個體對一種或多種傳染因子的保護性免疫應答的方法，包含施用一定有效劑量的免疫原組分或疫苗組分，其中包括來自一種或多種傳染因子的一種或多種抗原。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明所述方法獲得的一種表面吸附有一種或多種治療藥劑的細菌孢子。
本發(fā)明還公開了一種通過本發(fā)明所述方法獲得的用于治療的表面吸附有一種或多種治療藥劑的細菌孢子。治療類型將依賴于吸附在孢子上的治療藥劑。例如，如果一種抗原吸附在孢子上，那么它可用于提高對該抗原起源的傳染因子的免疫系統(tǒng)應答?；蛘呤?，如果抗癌因子吸附在孢子上，那么則可用于治療癌癥。在本發(fā)明的一個具體實施例中，提供了對通過本發(fā)明所述方法獲得的表面吸附有一種或多種抗原的孢子的使用，以提高個體對一種或多種抗原的保護性免疫應答。本發(fā)明還提供了一種提高機體對一種抗原的保護性免疫反應的方法，包含通過本發(fā)明所述方法，施用一定有效劑量的表面吸附有抗原的孢子。在本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施例中，通過本發(fā)明所述方法獲得的一種表面吸附有一種或多種抗原的孢子可用作疫苗。使用本方法的表面吸附有抗原的孢子可提供對多種不同的病原體的防護。廣泛的免疫應答表明抗原可結合到孢子表面，同時保持其天然結構。發(fā)明者已確認孢子帶負電荷的疏水表層提供了一個適合吸附治療藥劑的平臺，例如蛋白質抗原。顯而易見的是，殺死或滅活的孢子與活孢子同樣有效。事實上，滅活孢子比活孢子的效率更高。孢子在其天然構象內呈現(xiàn)出一種結合抗原，促進細胞應答(Thl型偏移)及抗體反應。誘導的廣譜免疫反應結合安全性的伴隨得益表明孢子吸收適用于提高抗原的免疫原性，并釋放其他治療分子。利用本發(fā)明所述方法獲得的被覆孢子可與任何其他適當?shù)闹委熕巹┙Y合施用，例如，可進一步提高治療作用的干擾素、細胞因子等。本發(fā)明還提供了一種制藥組分，包含通過本發(fā)明所述方法獲得的被覆孢子，以及任何可藥用的載體或賦形劑?？伤幱玫妮d體或賦形劑是本領域技術人員所熟知的。本發(fā)明的制藥組分可以任何適當?shù)姆绞绞┯?，包括口服、腸道外、粘膜(口、鼻、直腸)和舌下。當口服施用被覆孢子時，它們優(yōu)選地被覆有適當?shù)耐繉?，以防止所吸附的藥劑被降解。被覆孢子?yōu)選為經(jīng)粘膜或腸道外施用。腸道外包括皮下、皮內、靜脈注射、肌肉注射、關節(jié)內、滑膜腔內、胸骨內和顱內注射或輸液。適用于腸道外的制劑包括含水或不含水滅菌的注射液，其中可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌性組分和溶解物，使制劑與個體的體液等滲，優(yōu)選為血液；含水和不含水滅菌的懸浮液可包括懸浮劑或增稠劑。該配方可出現(xiàn)在單位劑量或多劑量容器內，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，在凍干的條件下儲存，只需要在使用前直接添加滅菌的液態(tài)載體。此外，滅菌的可注射制劑可以是一種滅菌的可注射含水或含油懸浮液。這種懸浮液可通過本領域技術人員所熟知的技術，使用適當?shù)姆稚⒒蚣訚駝?例如，吐溫80)和懸浮劑制成。滅菌的可注射制劑也可以是一種溶于非毒性腸道外可接受的稀釋液或溶液內的滅菌的可注射溶液或懸浮液，例如溶于1，3_ 丁二醇。可用的適當載體和溶劑包括甘露醇、水、林格式溶液、等滲氯化鈉溶液。此外，滅菌的不揮發(fā)油通常可用作溶劑或懸浮介質。基于這一目的，還可使用任何不揮發(fā)清油，包括合成的單甘油 酯或雙甘油酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用于血管注射劑的制備，因為它們是天然的可藥用油劑，例如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚乙醇氧化物變體。這些油溶液或懸浮液也可以包括長鏈的乙醇稀釋劑或分散劑或乙醇類似物。本發(fā)明的制藥組分也包括佐劑系統(tǒng)，以提高組分的免疫原性。佐劑系統(tǒng)提高Thl
型應答。本發(fā)明的制藥組分可作為鼻氣霧劑或吸入劑經(jīng)鼻施用。這種組分可根據(jù)制藥配方的常用技術來制備，可制成鹽溶液，利用苯甲醇或其他防腐劑、促吸收劑來增強生物藥效率，碳氟化合物和/或其他增溶劑或分散劑是本領域所熟知的。本發(fā)明被覆孢子對個體的施用計量依賴于多種因素，例如年齡、體重和個體的總體條件、治療條件和施用被覆孢子的途徑。適宜的劑量可以是每劑量IO5至IO11個孢子。如果在此范圍內的劑量不夠，則可提高劑量。鑒于研究報道，本領域技術人員會識別測試的適當?shù)膭┝克?。然而，僅作指引，適用于哺乳動物，尤其是人類時，活性藥劑的每日劑量水平大約為0. 01mg/kg至10mg/kg,通常約lmg/kg。上述劑量是平均情況的典型。當然，根據(jù)個體情況可提高或降低劑量范圍，這些都 屬于本發(fā)明的范圍內。劑量范圍需要依賴于孢子與吸附藥劑的選擇、施用途徑、藥物配方的性質、主體條件的性質，以及主治醫(yī)師的判斷。疫苗組分是便于注射的形式。常規(guī)佐劑可用于加強免疫應答。疫苗的適當單位劑量為0. 5-5mg/kg抗原,這一劑量優(yōu)選在I至3周內分I至3次接種。在該標識劑量范圍，沒有觀察到本發(fā)明化合物具有會阻礙應用于合適個人的有害毒性作用。鑒于多種治療藥劑和多種用藥方式的不同功效，可預期到所需劑量的廣泛變化。例如，口服用藥將比靜脈注射的劑量高。劑量水平的變化可利用標準的經(jīng)驗程序進行優(yōu)化調節(jié)，這是本領域技術人員熟知的。下面將參考所附示圖中的實施例對本發(fā)明進行描述。 圖I顯示了堿性磷酸酶(AP)的吸附受pH值的影響。飽和的AP被吸附在具有2 X IO9個孢子(PY79，0/C,高壓蒸汽滅菌的PY79和0/C孢子)的200 U I結合緩沖液(分別為pH4，pH7和pHIO的PBS)的懸浮液中，置于RT (室溫)下45min。該混合物用相同緩沖液清洗3次，然后收集顆粒并懸浮在100 ill的底物(pNPP，p-硝基苯基磷酸鹽)中。45min后測定上層液體的OD (405nm)。吸附在孢子上的AP的量在AP活性參照的基礎上，從OD值轉化獲得。圖2顯示出NaCl濃度對孢子吸附堿性磷酸酶的影響。在200 含有不同濃度的NaCl的結合緩沖液(pH4)(分別為0. 03M，0. 06M，0. 125M，0. 5M和1M)中，在室溫條件下45min，飽和的AP被吸附在2X IO9個孢子(枯草芽孢桿菌PY79，克勞氏芽孢桿菌0/C)上。用相同的緩沖液清洗混合物3次，然后重懸于IOOiU底物(pNPP)中。45min后測定上層液體的OD (405nm)。吸附在孢子上的AP的量在AP活性參照的基礎上，從OD值轉化獲得。圖3顯示了不同洗脫緩沖液對堿性磷酸酶從吸附孢子上的分離。在200 Ul結合緩沖液(PBS，pH4)中，飽和的堿性磷酸酶于室溫被吸附在2X IO9個孢子(PY79，0/C和高壓滅菌的PY79，0/C孢子)上。然后用相同的緩沖液清洗3次孢子，用不同的洗脫緩沖液(PBSpH4, PBS+1M NaCl，PBS+1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X), PBS+lMNaCl+1 % Triton X，PBS+辛烷基P -D-吡喃葡萄糖苷，PBS+辛烷基P -D-吡喃葡萄糖苷+IM NaCl)清洗I次，然后用PBS清洗I次。通過離心收集孢子體，然后重溶于100 u I的pNPP底物內。45分鐘后在405nm處檢測上清的0D。孢子上的AP百分比是通過與只用結合緩沖液(PBS，pH4)清洗的孢子上的AP總量比較而計算的。注意不同緩沖液中的AP活性相似。圖4顯示了 PBS濃度對堿性磷酸酶吸附在孢子上的影響。在200 ill結合緩沖液(PH4，分別為0. 001M, 0. 01M, 0. IM的PBS)中，飽和的堿性磷酸酶于室溫被吸附在2 X IO9個孢子(PY79，0/C和高壓滅菌的PY79，0/C孢子)上45min。用相同的緩沖液清洗3次混合物，然后重溶于100 U I的pNPP底物內。45min后測定上清的OD (405nm)。吸附在孢子上的AP量是在參照AP活性的基礎上，從OD值轉化獲得。圖5顯示了免疫原吸附到孢子上。圖板A :在不同pH值的緩沖液(PBS)中，純化的PY79懸浮液與純化的重組蛋白(2 Ug)于室溫混合lh。離心收集孢子，清洗兩次，并提取外被蛋白。利用1/10的提取物做大小分級的蛋白質免疫印跡檢測。在不同情況下均檢測到一個主要條帶，如圖所示。0. I y g的純化重組蛋白用以比較。對照泳道(Con)顯示了在沒有蛋白質的整個流程中獲得的孢子的相應的印跡結果。
圖板B:如圖板A所示，將2iig的破傷風毒素片段C(TTFC)結合到孢子外層。泳道1，作為對照的0. I ii g TTFC ;泳道2，非結合的PY79孢子；泳道3，PY79孢子+TTFC ;泳道4，未結合的高壓滅菌的PY79孢子；泳道5，高壓滅菌的PY79孢子+TTFC。圖板C :孢子懸浮液(2 X 109菌落形成單位(c. f. u.))經(jīng)離心后重懸于0. 2ml pH4的PBS中。純化的重組TTFC蛋白(2 ii g)被添加到孢子懸浮液中，與結合混合物于室溫孵育I小時。孢子經(jīng)離心后，用PBS pH4清洗2次。洗過的沉淀再溶于200 u I PBS內，pH4(泳道A)，pH7 (泳道B)或pHIO (泳道C)。在指示時間點(30,60和90min)，對孢子進行離心，保存上清，取其中的1/20上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE膠)。沉淀重溶于IOOyl孢子外被抽提緩沖液中，在68°C孵育I小時，去除孢子外被中的蛋白質，其中的1/10上樣于12% SDS-PAGE膠中。0. I ii g的重組蛋白作為對照進行電泳。圖6顯示了吸附動力學。孢子懸浮液(2X IO9Cfu)與10 y g的重組蛋白混合于PBS(pH4)中，于室溫孵育，從而獲得樣品。用PBS(pH4)清洗孢子2次。〇，TTFC+PY79孢子；▲，GST-Cpa247_37Q+PY79 孢子；■，PA+HU58 孢子。圖7顯示了枯草芽孢桿菌PY79孢子的電動力學和疏水性。在pH介于I至12的水中，PY79孢子純化懸浮液的Zeta ( ^ )電位測量(〇)。在pH3_8范圍內，經(jīng)孢子吸附碳氫化合物(SATH)試驗確定PY79孢子的疏水性(■)。圖8顯示了蛋白吸收的離子和疏水性。圖板A :重組的 ITFC (IOii g)與 PY79 孢子(2 XlO9Cfu)在 0. 2ml PBS(pH4，0. 15M)的純化的懸浮液于室溫混合I小時。經(jīng)PBS兩次洗滌后，將沉淀重懸于pH4PBS、IM NaCl,0. 1% TritonX-100，或IM NaCl+0. 1% TritonX-100，用相同的緩沖液清洗后在室溫孵育15min，之后提取外被蛋白。所顯示的數(shù)據(jù)代表殘余結合蛋白的百分比。圖板B :純化的重組TTFC (10 U g)與純化的PY79孢子(2 X 109cfu)純化的懸浮液混合于含有不同濃度NaCl (0-4M)的0.2ml PBS (pH4)中。所有的結合混合物于室溫孵育I小時。離心孢子后，用含有相同NaCl濃度的PBS緩沖液清洗2次，抽提外被蛋白，表示為抽提蛋白總量/2X IO9個孢子。圖9顯示了炭疽毒素的中和作用。用預吸附有PA(2 u g)的HU58孢子經(jīng)鼻內使小鼠免疫，滴定測定血清(IgG，IgGl, IgG2a)和粘膜抗體(slgA)。通過毒素中和試驗(TNA)在體外測定炭疽脫酸抗體。對照組包括未實驗處理的小鼠、僅用HU58孢子免疫的小鼠或僅用PA蛋白免疫的小鼠。其中數(shù)據(jù)通過算術平均值處理，誤差線為標準差。

圖10顯示了結合飽和度。純化的重組蛋白，TTFC( O)、GST-Cpa247.( ▲)或PA ( )與2 X 109PY79孢子(TTFC和GST-Cpa247.)或HU58 (PA)混合，在室溫孵育I小時。離心孢子，并清洗兩次，使用相應的抗體經(jīng)蛋白免疫印跡檢測抽提的外被蛋白和孢子相關蛋白。圖11顯示了抗原特異的IgG應答。利用ELISA反應測定來自每個小鼠血清中的抗原特異性IgG。圖板A和B : 口服(A)或鼻內⑶免疫后的GST-Cpa247_37Q-特異的I gG應答。用菌株HT251 (cotB-GST-Cpa247_3ro ； ■ )、PY79 (非重組；A )、預吸附的 PY79 孢子和 GST_Cpa247_370 多肽混合物( ; 口服途徑為3. 6 ii g/劑量，經(jīng)鼻途徑為0. 15 u g/劑量)，純化的GST-Cpa247_37Q蛋白(口；口服途徑為3.6 yg/劑量，經(jīng)鼻途徑為0.15 yg/劑量)免疫的小鼠(丨)，和實驗對照組的未免疫小鼠(A)。
圖板C :經(jīng)鼻方式對小鼠進行免疫后的TTFC-特異性IgG應答。血清來自免疫的動物末端血。圖板D :經(jīng)鼻方式接種菌株HU58(〇)、預吸附的HU58和PA多肽混合物(■ ;2y g/劑量)、純化的PA蛋白(A;2iig/劑量)的小鼠(丨)以及僅接受PBS緩沖液的實驗對照組小鼠(*)的PA特異性IgG應答。圖12顯示了抗原特異性IgGl IgG2a比例。如下文所述的來自免疫試驗的血清樣品用于分析IgGl和IgG2a亞類，顯示IgGl相對于IgG2a的比例。圖板A : 口服免疫吸附有GST-Cpa247_37(l的孢子，圖板B :經(jīng)鼻免疫吸附有GST-Cpa247_37(l的孢子；圖板C :經(jīng)鼻免疫吸附有PA的孢子，圖板D :來自經(jīng)鼻免疫吸附有TTFC孢子的小鼠體內IgGl，IgG2a和IgG2b的抗體滴定率。圖13顯示了抗原特異性粘膜反應。測定來自本文中所描述的免疫試驗中免疫小鼠體內的肺洗液、唾液和排泄物中的抗體特異性slgA。圖板A和圖板B顯示了用藥60天GST-Cpa247^70-特異性IgA分析。圖板C顯示了用藥63天肺洗液中的TTFC-特異性slgA分析。圖14顯示了抗原特異性\干擾素(IFN-Y)產(chǎn)量。利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)反應測定孢子免疫小鼠的IFN-Y應答。從處死小鼠體內取出脾細胞，用TTFC(圖板A)或PA蛋白(圖板B) (5 u g/ml)重新刺激。孵育6天后測定上清中的IFN- y。圖15顯示了經(jīng)鼻用藥小鼠體內的IgGl比IgG2a的比例。a)H5Nl病毒顆粒，b)吸附有H5N1病毒顆粒的PY79孢子，c)吸附有H5N1病毒顆粒的高壓滅菌失活的PY79孢子，d)經(jīng)鼻用藥明礬和H5N1懸浮液。在所有情況下，H5N1病毒預制劑(來自國家生物學標準和質控研究所(NIBSC)的NIBRG-14)都用甲醛失活。每個結合試驗使用I X IO7個孢子。明礬+H5N1實驗組中低比率與高比例比較顯示出孢子明顯能夠誘導產(chǎn)生Thl型為主的免疫應答。由于絕大多數(shù)佐劑有利于促進Th2型為主的免疫應答，因此這里顯示出明礬具有高的IgGl IgG2a的比例。非常需要一種能夠促進Thl型為主的免疫應答的佐劑。圖16顯示了俄勒R紫杉醇經(jīng)由枯草芽孢桿菌孢子傳遞而結合在HCT-116結腸癌細胞上。0 iil，50 ill和200 ill的10 ii M俄勒岡紫杉醇與生長在2ml細胞培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)中的HCT-116孵育4小時，作為不同濃度的俄勒岡紫杉醇結合在HCT-116上的陰性和陽性對照。沒有紫杉醇的陰性對照為左圖板。0.25 和I 紫杉醇的結合分別如右上和左下圖板所述。0. 25 y M的俄勒岡紫杉醇吸附在5X IO7個孢子上的結合如右下圖板所述。
實施例I材料與方法芽孢桿菌孢子的準備枯草芽孢桿菌PY79和克勞氏芽孢桿菌0/C被用于通過在瓊脂孢子形成培養(yǎng)基(DSM)上，通過耗竭法培養(yǎng)出孢子。收集孢子，并通過溶菌酶處理破碎殘余細菌繁殖體來純化，用NaCl 1M, KCl IM和無菌水清洗。然后，將孢子重懸于無菌水中，連續(xù)稀釋法進行計數(shù)，在DSM平板上劃線后于-20°C冰凍。這種方式處理的孢子與平行試驗未處理孢子相比 具有更好的結合能力。其原因有可能是因為溶菌酶的處理能夠去除所有的細菌繁殖體，KCl和NaCl的處理則去除了來自培養(yǎng)基(用于產(chǎn)生孢子)中所有的蛋白酶、其他的蛋白質、多肽和重金屬，這些物質會非特異性地結合在孢子表面。這種處理有助于去除引起孢子外表面疏水結合位點空間位阻的分子，從而增加與抗原作用的結合位點。吸附與脫附實驗在本研究中，發(fā)明者設計實驗確定pH、鹽濃度對經(jīng)高壓滅菌和未經(jīng)高壓滅菌孢子的最大吸收時間、結合強度和吸附特性的影響。結合緩沖液是具有不同PH值(4，7，10)和不同濃度(0.001M，0.01M，0. 1M)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，其中根據(jù)每個實驗的需要含有濃度不同的NaCl。2父109個？￥79和0/(孢子(經(jīng)高壓滅菌和未經(jīng)高壓滅菌)，在使用前用無菌水清洗兩次，然后重懸于200 Ul結合緩沖液；保留15分鐘使孢子帶電。向含有2 X IO9個PY79和0/C孢子的懸浮液中添加10 u I堿性磷酸酶(AP) (0. 4u g/u I),于室溫連續(xù)輕晃45分鐘。吸附孵育后，離心收集孢子，用結合緩沖液或洗脫緩沖液清洗3到5次。堿性磷酸酶活性分析該研究中使用磷酸鹽分析法來測定AP出現(xiàn)在孢子上，這是本領域的技術人員所熟知的。P-硝基苯基磷酸鹽(pNPP)底物溶于二乙醇胺緩沖液(IOOmM 二乙醇胺/HCl，0. 5mMMgC12，pH9.8)制成濃度為lmg/ml的溶液。見蛋白操作手冊，約翰M.瓦爾克。孢子懸于含有pNPP (lmg/ml)的100 U I 二乙醇胺緩沖液中，于室溫孵育45分鐘。在該分析中，在AP的催化下產(chǎn)生了 P-硝基酚和磷酸基團，P-硝基酚是一種有色的化合物，能夠吸收405nm波長的光。出現(xiàn)這種顏色后，離心收集上清，并在405nm處測定其0D。為了在酶活性的基礎上定量孢子上吸附的AP的量，連續(xù)稀釋AP，在孢子上吸附AP測試的平行實驗組確定其活性，并繪制標準曲線。孢子上AP的量是通過比較標準AP溶液與孢子上吸附的AP，在標準曲線的基礎上計算得出。確立定量孢子上吸附的AP的方法，并與蛋白免疫印跡比較。當AP結合到孢子上后，采用十二烷基磺酸鈉(SDS)-二硫蘇糖醇抽提緩沖液來提取孢子外被蛋白。通過SDS-PAGE和使用抗AP抗體的蛋白免疫印跡進行提取蛋白的電泳。結果芽孢桿菌孢子對堿性磷酸酶的吸附在該實驗中，發(fā)明者檢測了 pH值對芽孢桿菌孢子吸附AP的影響。結合與洗脫使用pH值不同(pH4，pH7和pHIO)的同一緩沖液。結果表明，pH4時，AP吸附在孢子上，而在pH7和pHIO時則大大降低，高壓滅菌的孢子也依賴于pH，在pH4時吸附最多。見圖I。通過使用含有不同濃度NaCl (0-1M)的結合緩沖液(PBS pH4，0.01M)的實驗研究離子強度對芽孢桿菌孢子吸附AP的影響。如圖2所示。結果顯示，在低濃度的NaCl條件下，堿性磷酸酶較多地吸附到0/C孢子上，高濃度的NaCl則會大大降低吸附。然而,PY79在低濃度和高濃度的NaCl (0. 5M，1M)中都吸附有大量AP。這可以通過PY79孢子的疏水性增加來解釋，0/C孢子沒有這種現(xiàn)象。為了更好的了解吸附機制，使用不同的磷酸緩沖液(0. 001M，0. 01M, 0. 1M)進行吸附試驗，結果顯示，吸附隨著磷酸鹽緩沖液濃度的提高而增強(如圖4)。堿性磷酸酶從芽孢桿菌孢子上的脫附為了找到更多的證據(jù)說明AP吸附在孢子上的機制，該實驗轉為考慮AP從孢子上 的脫附。在PBS中進行結合，并用含有IM NaCl或I % Triton-X的PBS緩沖液進行清洗。重要的是，在不同的洗脫緩沖液中測定AP活性，結果顯示PA的活性相同(數(shù)據(jù)未示出)。數(shù)據(jù)顯示高鹽濃度(1M NaCl)可將少量的AP從孢子上脫離，而大量的AP被1%的Triton-X洗脫。有趣的是，IM NaCl與1% Triton-X的混合物幾乎可將所有的AP從孢子上脫附。見圖3。討論蛋白質等電點(pi)是指使該蛋白質不帶凈電荷時的pH值。當pH低于pi時,蛋白質攜帶正電荷，高于pi時攜帶負電荷。此外，孢子外被和芽孢桿菌內生孢子的外壁由蛋白質復合層組成。因此，孢子必然具有蛋白質的帶電特性(P.馬騰.畢舒瓦等，2004;克里斯托弗J.道尼等，2000)。芽孢桿菌孢子具有零電荷點(ZPC)的特性。當pH高于ZPC時，由于羧基、磷酸鹽和氨基等功能團的去質子化，孢子帶負電荷。當pH低于ZPC時，由于孢子表面上的主要基團發(fā)生質子化而帶正電荷(李M.河與布拉德利M.特博，1997)。0/C和PY79孢子的ZPC約為2 (ZPC 2) ,AP的等電點為4. 5。因此，在pH4的環(huán)境下，帶負電荷的孢子能夠通過離子相互作用吸附帶正電荷的AP。然而，在pH7和pHIO時，有一些AP吸附在孢子上。這一矛盾暗示可能有其他機制的參與，例如蛋白吸附的疏水相互作用。疏水相互作用與pH值呈負相關。隨著pH的增高，疏水相互作用降低(迪爾德利A.斯莫爾等，1986)。這可以利用電荷屏蔽作用來解釋，例如，羧基(pK2:4-5)在pH4條件下不帶電荷，因為它們在PH小于4時發(fā)生了質子化，從而提高孢子的疏水性(尼桑.易等，1999)。現(xiàn)有數(shù)據(jù)說明大多數(shù)蛋白質在pH4條件下發(fā)生吸附，在pH7和pHIO時，吸附大大降低。因此，孢子對蛋白質的吸附取決于離子相互作用和疏水相互作用這兩者。在不同濃度的NaCl條件下的吸附數(shù)據(jù)表明，隨著NaCl濃度的降低，AP吸附到0/C孢子上的數(shù)量增加，而AP在低濃度和高濃度的NaCl條件下均能吸附在PY79孢子上。AP吸附隨NaCl的低濃度而增加說明離子相互作用占優(yōu)勢，可解釋為含NaCl的結合緩沖液中的可自由移動的AP比例的增加(張Z.等，2003)。此外，疏水相互作用在PY79吸附中發(fā)揮作用。這些結果與0/C孢子的親水性和PY79孢子的高度疏水性是一致的。因此，根據(jù)所使用的孢子，結合緩沖液的疏水性影響著治療藥劑的吸附。根據(jù)孢子/治療藥劑的結合，使用不同鹽濃度可提高疏水相互作用的水平。為了確定最佳鹽濃度，應根據(jù)上述方法測定不同的鹽濃度。實施例2材料與方法菌株枯草芽孢桿菌PY79是一株標準的原養(yǎng)型實驗菌株，與168型菌株等基因(楊曼等，1984)。HU58是一株枯草芽孢桿菌的非馴化單菌(塔姆等，2006)。HT251 (amyE ( a -淀粉酶):cotB-GST-Cpa247_370)與PY79等基因系，其基因組上攜帶有重組基因，表達與GST-Cpa247.混合的已修飾的孢子外被蛋白，CotB，(黃等，2008)。RH103(amyE::cotB-tetC)在孢子表面表達免疫原，來自破傷風梭狀芽孢桿菌的TTFC(破傷風毒素片段C)，嵌合融于CotB蛋白(伊斯迪卡多等，2001)。孢子的準備所有實驗中使用的孢子是在瓊脂孢子形成培養(yǎng)基(DSM)上生長和形成的(尼克爾森等，1990)。每批孢子都經(jīng)過熱處理(68°C，45min)，以確保殺死所有的繁殖體細胞。將孢子重懸于無菌的PBS (pH7. 4)，等分試樣(I X IO11個孢子/ml)并存放于_70°C待用。使用(i)血球計-相差顯微鏡直接計數(shù)和(ii)連續(xù)稀釋法和平板計數(shù)來確定孢子數(shù)量。SDS-PAGE 電泳分離并分析孢子外被蛋白(尼克爾森等，1990)。Zeta電位測定用3000HS馬爾文Zeta測定儀(馬爾文儀器有限公司(Malvern Instrument Ltd),UK)在24°C測定兩種孢子的Zeta電位。將30 以5X IO9個孢子/ml的密度懸于超純水(Milli-Q水)中的等分孢子添加到3ml —定pH和離子強度的溶液中，如下所述。使用HCl或NaOH調節(jié)其pH值。從相同的樣本中進行兩次測定,確定其平均值。利用Smoluchowski方程，從電泳遷移率來計算zeta電位。孢子吸附碳氫化合物(SATH)試驗利用n-正十六燒作為碳氫化合物的孢子吸附碳氫化合物(SATH)試驗確定兩種孢子的表面疏水性(希爾等，2008)。用Milli-Q水或溶于Milli-Q水的IM NaCl來清洗純化的孢子，16000g離心10分鐘，以I X IO8個孢子/ml的密度重懸于0. IM NaCl。將孢子懸浮液(2ml)添入Iml n-正十六烷(奧德里奇公司(Aldrich))，渦旋lmin，于37°C孵育10分鐘，再渦旋30秒。在600nm處測定水相吸收值。測量兩次取平均值。通過原始孢子懸浮液(Ai)和正十六烷孵育后的水相(Af)的吸收度，根據(jù)方程％ H = [(Ai-Af)Ai] X 100確定疏水百分數(shù)(％H)。重組蛋白在含有重組質粒的大腸桿菌菌株BL21中表達蛋白。除了 GST-Cpa247_37Q，所表達的蛋白在3’端攜帶有多聚組氨酸標簽，并在表達后使用AKTA層析系統(tǒng)(法瑪西亞公司(Pharmacia))純化。⑴TTFC pET-28b-TTFC表達的破傷風梭狀芽孢桿菌TTFC是一條分子量為52. 6kDa的多肽(杜克等，2003)。(ii)PA pET-28b-PA表達來自炭疽芽孢桿菌的分子量為83. 5kDa的保護性抗原(PA)。其中允許膜分泌的分泌信號序列被刪除(杜克等，2007)。(iii)GST-Cpa247_37(l :已有報道將41kDa的Sj26GST雜合蛋白融于產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素(GST-Cpa247_37(l)的C-端(威廉姆森等，1993)，并使用GST-結合柱進行純化。(iv) GST pET-28b-GST表達來自日本血吸蟲分子量為26. 3kDa的谷胱甘肽-S-轉移酶(Sj26GST)。下文用GST代表Sj26GST。通過PCR擴增Sj26GST基因，并在載體pGEX3X13(法瑪西亞公司)中進行克隆?？贵w
通過在第1、14和28天經(jīng)腹膜(i.p.)對小鼠注射2iig純化蛋白使之免疫，獲得多克隆抗體。抗PA經(jīng)I 1000稀釋，抗TTFC和抗GST-Cpa247^370經(jīng)I 2000稀釋。結合分析
除特別說明外，均以如下方法將蛋白質吸附在孢子上。離心含有2X109個孢子的懸浮液，重懸于0. 2ml pH4、pH7或pHIO的PBS中。除特別說明外，所有反應均在0. 15M的PBS中進行。純化的重組蛋白被添加到孢子懸浮液和結合溶液中，于室溫孵育。離心(lmin，室溫)，用與結合溶液中使用的PH值相同的PBS緩沖液清洗2次。清洗后的沉淀重懸于100 ill孢子外被抽提緩沖液(尼克爾森等，1990)，于68°C孵育lh，以溶解孢子被覆蛋白，取1/10 上樣于 12% 的 SDS-PAGE 膠。動物本研究使用的動物是無病原體的BalbAHh^ (英國哈倫實驗室(Harlan UK))，用于產(chǎn)生抗體、分析PA或GST-Cpa247_37(l的免疫應答。TTFC免疫研究則使用C57BL/6小鼠(查士睿華公司(Charles River))。在所有情況下,均使用6_8周的雌鼠。動物飼養(yǎng)于倫敦皇家霍洛威大學動物房，在內政部項目許可PPL70/6126的指導下實施。免疫經(jīng)鼻內(輕度麻醉，使用20 U I的吸管)或灌胃法(經(jīng)口 ；每次填喂0. 2ml)對小鼠用藥。所有實驗均包括未免疫的對照組動物。⑴TTFC研究各組動物(3-10)經(jīng)鼻免疫⑴純化的TTFC蛋白，ii)預吸附的 PY79 孢子(2X IO9Cfu)和 TTFC 蛋白(I u g)混合物(PBS, pH4)，或iii)已用PBS緩沖液(pH4)洗兩次的預吸附的PY79孢子(2XlO9Cfu)和TTFC蛋白(5 u g)混合物(PBS，pH4)。另一組為預吸附有TTFC (Iiig)的經(jīng)高壓滅菌的PY79孢子(2 X IO9Cfu ；15p. s. i.，30min) (PBS, pH4)。對照組包括未經(jīng)處理(PBS, pH4)和經(jīng)鼻內途徑接受PY79孢子(2X109cfu)的小鼠。給藥方案包括在第1、15、29和43天免疫。另一組小鼠在第1、2、3、22、23、24、43、44 和 45 天口服 2X IOiciCfu RH103 孢子(PBS，pH7. 4)作為陽性對照。在第64天用破傷風梭狀芽孢桿菌破傷風毒素感染小鼠。(ii)GST_Cpa247.研究在第1、21和42天經(jīng)鼻內或口服免疫各組六只小鼠，然后在第63天進行攻擊?？诜庖呓M包括接受PY79孢子(5X IOiciCfu)、GST-Cpa247_3ro蛋白(3. 6 u g)的動物，以及接受預吸附(室溫，80min ；PBS pH7. 4)有 3. 6 y g GST-Cpa247^370蛋白的PY79孢子(5X IOiciCfu)混合物。陽性對照包括5X IOiciCfu個HT251孢子(amyE: :cotB-GST-Cpa247_370)。一組經(jīng)鼻內接受 PY79 孢子(2XlO9Cfu)，另一組接受GST-Cpa247.蛋白(0. 15 ii g)，還有一組接受預吸附的PY79孢子(2 X 109cfu)與GST-Cpa247^370 蛋白(0. 15 u g)的混合物(室溫，80min ；PBS pH7. 4)。(iii)PA研究各組六只小鼠在第1、22和43天經(jīng)鼻內施藥。各組接受HU58孢子(2 X IO9Cfu)或接受在PBS (pH4)中吸附I小時2 ii gPA蛋白(炭疽芽孢桿菌保護抗原)的等量HU58孢子。體液應答為了分析抗GST-Cpa247.應答，于_1、20、40和60天取血清、唾液和糞便。對于PA-特異性應答，于_1、21、42和63天取血清樣本。而TTFC應答則取末端血用于IgG分析。從處死動物肺部取肺洗液用于提取sIgA(溫等，2007)。利用ELISA法測定抗體滴定量(杜克等，2003 ;黃等，2008)。IFN-y ELISA將取自服用免疫原(蛋白質、孢子或蛋白質與孢子)的小鼠的脾細胞(5X105)，接種于含完全培養(yǎng)基的96孔板中,用5 ii g/ml TTFC或PA蛋白質刺激,I ii g/ml ConA用作陽性對照，或僅用培養(yǎng)基，在37°C，含5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)細胞。6天后收集懸浮液，用于分析IFN-Y (黃等，2008)。IFN-Y (BD生物科學公司(BD Bioscience))用作標準品。毒素中和分析(TNA)目前已有使用原生264.7細胞株檢測炭疽毒素的中和活性的報道(杜克等，2008)。免疫攻毒用破傷風梭狀芽孢桿菌破傷風毒素或產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素對小鼠進行免疫攻毒(杜克等，2003 ;黃等，2008)。需要注意的是，免疫攻毒實驗與免疫應答評估是獨立進行的。統(tǒng)計t_檢驗用于比較不同組間的差異。P值大于0.05說明差異不顯著。結果口服免疫預吸附免疫原的孢子，保護小鼠免受產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素的威脅在之前研究中，重組的枯草芽孢桿菌HT251可在其孢子表面表達GST-Cpa247_37Q，與孢子外被蛋白CotB融合(黃等，2008)。Cpa247_37Q是產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素(Cpa)的C-端片段，當融于GST時，可賦予其保護免疫性(威廉姆森等，1993)?？诜蚪?jīng)鼻服用HT251孢子的小鼠可抵御12半致死劑量(LD5tl)的a毒素。使用相同劑量的重組HT251孢子，給小鼠施用GST-Cpa247_37(l蛋白和非重組PY79孢子的混合物。對于口服途徑來說，每次劑量為3. 6 ii g GST-Cpa247^370與PBS緩沖液(pH7. 4)的混合物，相當于在單劑HT251孢子內表達的重組GST-Cpa247_37(l蛋白的 量。經(jīng)鼻途徑則需0.15 yg。發(fā)明者對經(jīng)口和經(jīng)鼻途徑服用GST-Cpa247^370的特異性IgG滴定度的分析表明其抗體反應水平和動力學與重組HT251孢子無差別。相反，僅用PY79孢子與蛋白則不產(chǎn)生顯著水平(P > 0. 05)的GST-Cpa247_37(l特異性應答。發(fā)明者評估了經(jīng)孢子免疫混合物免疫的小鼠抵御a毒素的能力(表I)。經(jīng)鼻免疫小鼠獲得的保護僅能抵御較低劑量的毒素(6LD5CI)，而經(jīng)口免疫的小鼠則能夠存活于相同劑量的毒素(6LD5CI)。僅用孢子或蛋白質都不能誘導抗體反應，最簡單的解釋是孢子與抗原能夠促進它們的相互作用，并被免疫細胞獲得。孢子吸附蛋白質為了確定一種蛋白免疫原是否能夠結合到孢子上，發(fā)明者設計了一個吸附試驗，將GST-Cpa247^370蛋白(分子量(mwt. )，40. 4kDa ；pl,5. 7)與PY79孢子混合，然后分析孢子外被蛋白抽提物和上清液，通過免疫印跡法確定GST-Cpa247_37(l的存在(圖5A)。數(shù)據(jù)顯示在pH4和pH7時，GST-Cpa247,有效吸附在孢子外層，但在pHIO時的結合則較低。發(fā)明者利用免疫定量計算出每個孢子吸附有2. 6X 10_4pg蛋白(每個孢子 3. 7X IO3個分子)。發(fā)明者擴展了該研究，以確定其他蛋白抗原是否吸覆到孢子表面。使用破傷風梭狀芽孢桿菌的破傷風毒素片段C (TTFC ；mwt.，52. 6kDa ;pl，6. 34)與炭疽芽孢桿菌的保護抗原(PA ；mwt. ,83. 5 ;pl，5. 87)，二者都能有效結合到孢子上(圖5A)。在兩種情況下，均在PH4檢測到結合，每個孢子結合4. 9 X l(r4pg TTFC (每孢子5. 4 X IO3個分子)，或每個孢子結合4.6X10_4pg PA(每孢子3. 2X103個分子)。發(fā)明者利用2X IO9個PY79孢子懸浮液中蛋白吸附量的增加來測定結合的飽和度，研究發(fā)現(xiàn)可吸附到孢子上的TTFC或GST-Cpa247_37Q的最大量為每2 X IO9個孢子吸附 l.Oug TTFC或 0. 5 u g GST-Cpa247.(見圖10)。由于GST-Cpa247_37Q是GST和Cpa的嵌合體，發(fā)明者想知道在pH7和pHIO條件下，這種減少但仍可測定的結合是否是由于其中一種構成多肽。不與GST嵌合的Cpa是不穩(wěn)定的，因此可檢測到只有GST的結合(圖5A)。GST可在所有三種pH條件下結合，而我們不能確定基于GST-Cpa247_37(l多肽的GST是否可以在所有三種pH條件下結合。意外的是，這里研究的三種蛋白質都可如“活”孢子那樣有效吸附到經(jīng)高壓滅菌的PY79孢子上(圖5B顯示了 TTFC的結合)。由于吸附有GST-Cpa247_37(l的孢子能夠在口服施用后產(chǎn)生一定的免疫應答，發(fā)明者研究了這些孢子是否能夠防護含有胃蛋白酶的模擬胃液(巴博薩等，2005)。在這些條件下，發(fā)明者未檢測到所吸附的蛋白質被降解的孢子具有任何保護(數(shù)據(jù)未顯示)。由于枯草芽孢桿菌孢子外被的最外面一層僅包括5種外被蛋白，CotA, CotB, CotC, CotG和GotF，發(fā)明者測定了缺乏每個Cot基因的無效突變體對蛋白質的吸附。在每個情況下均能顯示蛋白質吸附低于野生型PY79孢子，但不是完全沒有(數(shù)據(jù)未顯示)。可推斷出吸附主要是多價的、非特異性的。通過檢測從吸附孢子解離結合免疫原(TTFC)來衡量結合的穩(wěn)定性(圖5C)。結果表明，pH4條件下TTFC與孢子的結合可穩(wěn)定至少90分鐘,無明顯解離。當懸浮在更高pH值的緩沖液時，上層液體中只檢測到少量蛋白，這說明蛋白質與孢子的吸附是穩(wěn)定的。所有三種重組蛋白表現(xiàn)出與孢子快速結合，大約在10分鐘內實現(xiàn)最大程度的結合(圖6)。利用孢子吸附碳氫化合物(SATH)試驗確定PY79孢子的表面疏水性(希爾等，2008)，利用zeta電位檢測確定電動力學特性(阿莫等，2001)。在pH值在I和12之間的水中確定孢子的zeta電位(圖7),在整個pH范圍內顯示zeta負電位。在pHl時,zeta電位明顯表示出一個明顯增大的波峰增寬，表明這一 pH值接近等電點。在補充試驗中，在IMNaCl或5mM CaCl2中重懸孢子，并在pH3，5和7時測量zeta電位。Zeta電位高于在水中的檢測值，但仍保持負電位(數(shù)據(jù)未顯示)。在存在Na+和Ca2+離子時，Zeta電位帶更少的負電，這是因為陽離子屏蔽作用施加在孢子負電荷上。使用SATH分析，PY79孢子呈現(xiàn)幾乎恒定的疏水性，在PH3至8范圍內接近95% (圖7)。離子與疏水相互作用對于蛋白質吸附是非常重要的蛋白質吸附在pH值為4時最大，說明離子相互作用在結合中發(fā)揮主要作用。帶凈正電荷的蛋白質可有效結合在帶有凈負電荷的PY79孢子上。然而，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)用IM NaCl清洗的吸附有TTFC的孢子僅移除大約30%的結合免疫原，這表明天然狀態(tài)時，結合不僅僅是離子的(圖8A)。盡管用Triton X-100清洗不能釋放吸附的蛋白質,但聯(lián)合使用TritonX-100和NaCl可去除大約70%的結合蛋白，這證明了疏水相互作用(圖8A)。本發(fā)明還檢測了在含有不同濃度NaCl的PBS緩沖液中TTFC的吸附(pH均為4)(圖8B)。在很低鹽濃度時，結合較強，而當濃度增加到IM以上時迅速降低。在NaCl濃度大 于IM時，TTFC的結合穩(wěn)定增加，至4M NaCl時達到最高水平。圖I所示的結合研究是在能促成高水平結合的0. 15M(pH4)PBS緩沖液中進行的，其中電荷在吸附中發(fā)揮主要作用。在較高鹽濃度時蛋白質結合能力的提高表明這種特異的孢子/治療藥劑的結合中疏水作用是非常重要的(施爾茲等，1983)。
滅活孢子可用作疫苗輸送載體TTFC是用于評估預防破傷風疫苗的保護抗原(菲爾威瑟等，1987)。它作為嵌合體在孢子外被上表達融合至孢子外被蛋白CotB，重組孢子的口服方法顯示出其對破傷風毒素的保護作用(杜克等，2003)。發(fā)明者設計了一系列的實驗在施藥末期使用攻擊試驗來測定PY79孢子經(jīng)鼻內輸送TTFC的效率(表I)。一組小鼠施用與過量TTFC蛋白(5 y g)在PH4時混合的孢子，然后用PBS(pH4)清洗除去任何未結合的蛋白質。在這些條件下可結合的TTFC量計算近似為每劑量I U go經(jīng)這些孢子給藥的小鼠可防御50LD5(i劑量的破傷風毒素。其他組小鼠施以混有
1U g TTFC未經(jīng)洗滌的PY79孢子，也顯示出對50LD5(I劑量的抵御。施以含有相同TTFC蛋白量且無孢子的小鼠卻不能抵御。另一組免疫組是服以吸附有TTFC蛋白(Iyg)的經(jīng)高壓滅菌的PY79孢子。這些動物顯示出對破傷風毒素的同等保護(50LD5CI)。作為對照組，研究者還通過灌胃的方式用表面上表達有TTFC的重組RH103孢子免疫小鼠。每次免疫使用
2X 101°個孢子，每次施以約2 ii g的TTFC，發(fā)明者能夠實現(xiàn)與早前研究工作一致的對20LD5Q劑量的保護(杜克等，2003)。這些實驗首先證明預吸附有一種抗原的孢子可經(jīng)粘膜的方式接種，預防系統(tǒng)的病原體。其次，非活化或滅活的孢子與活性孢子同樣有效。炭疽疫苗通過經(jīng)常接種表達炭疽芽孢桿菌保護抗原(PA)的重組枯草芽孢桿菌孢子可顯示出對炭疽毒素的防御(杜克等，2007)。毒素中和抗體的產(chǎn)生依賴于PA (或PA片段)在孢子表面上的展示或其從萌發(fā)孢子的分泌。根據(jù)發(fā)明者對TTFC和GST-Cpa247_37(l的研究，確定了PA是否吸附到孢子上，能夠用于免疫小鼠抵御炭疽病。在第一個示例中，發(fā)明者測定了作為指示劑的毒素中和抗體(TNA)，研究顯示中和抗體的水平與保護相關(杜克等，2007 ;弗里克-史密斯等，2002 ;弗里克-史密斯等，2002)。為了確定結合現(xiàn)象是否是實驗室PY79菌株所特有的，發(fā)明者將一種枯草芽孢桿菌非馴化菌株，即HU58用于結合(塔姆等，2006)。發(fā)明者首次證實了 PA在pH4條件下結合在HU58孢子上，每個孢子結合約9. 34 XlO^pg PA——幾乎是PY79孢子結合的兩倍。經(jīng)鼻接種吸附有PA的HU58孢子的小鼠與僅接種HU58孢子或PA的小鼠相比能夠產(chǎn)生高水平的PA特異性IgG和slgA (圖9)，其量遠高于可保護小鼠抵御經(jīng)腹膜感染的> IO3MLD (大于IO3倍的最小致死量，為2000LD5(i)的炭疽芽孢桿菌STI孢子量(1000)(杜克等，2007 ;弗里克-史密斯等，2002)。接種預吸附孢子后產(chǎn)生的廣譜免疫應答對免疫預吸附GST-Cpa247.(圖IIA和11B)、TTFC(圖11C)或PA (圖11D)孢子的小鼠獲得免疫應答的范圍進行詳細地檢測。每個例子中接種預吸附孢子的小鼠血清產(chǎn)生高水平的抗原特異性IgG，明顯高于對照組(p < 0. 05)，包括僅接種蛋白質的對照組。同型抗原分析與和IgGl IgG2的提高表明了 GST-Cpa247_37Q特異體液反應的TH2偏移(圖12A和12B)。PA-吸附的孢子PA-特異性IgGl IgG2a比率減少，表示PA特異性IFN- y產(chǎn)生中的有效誘導對ThI偏移的支持(圖12C)。對于TTFC來說，IgG2a和IgGb的水平與刺激脾細胞誘導的IFN-Y相等(圖12D)(與先前對TTFC-特異性細胞應答研究一致(Mauriello 等，2007))，可表明Th1-Th2應答的平衡。肺部、唾液和糞便中也產(chǎn)生有抗體特異性分泌IgA(sIgA)(圖13A至C)證明了粘膜和系統(tǒng)應答(例如，IgG)的誘導。最后，接種有吸附TTFC或PA蛋白的PY79孢子小鼠體內強烈地誘導出細胞應答、THl偏移、IFN-Y產(chǎn)生(圖14)(免疫接種吸附有GST-Cpa247_37(l的孢子的小鼠體內未檢測IFN-Y)。綜上所述，預吸附有抗原的孢子可產(chǎn)生廣泛的應答，體液(粘膜和系統(tǒng))和細胞特別需要有效接種。討論細菌孢子顯示出作為重組疫苗載體的效用，其中抗原表達在孢子表面或萌發(fā)孢子內。如此，孢子具有其獨特的熱穩(wěn)定性優(yōu)勢，并使其具有特定的應用，例如旅行者疫苗或用于發(fā)展中國家。對于所有的重組細菌疫苗還有關于遺傳修飾微生物使用的擔憂。本工作證明了細菌孢子的一種特有的新型應用，抗原可固定在孢子表面，產(chǎn)生廣泛的免疫應答。不僅刺激免疫應答，該方法還可以利用兩種攻擊模型賦予保護，以及通過影響中和抗體水平的第三種。如是，孢子能夠作為佐劑使用，且無需進行遺傳改造。對佐劑研發(fā)最重要的憂慮是其安全性，出于此考慮，明礬仍然是僅有的被許可用于人類的佐劑。芽孢桿菌孢子，包括枯草芽孢桿菌，廣泛用作食品添加劑(例如，益生菌)，其中有很多種已注冊供人類使用，包括枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌和最近的凝結芽孢桿菌，已獲得來自美國食品與藥品監(jiān)督局的GRAS(總體安全)狀態(tài)。加上滅活孢子可與活孢子一樣有效地用于預防接種的事實，強有力地支持了它們作為安全佐劑的考慮。發(fā)明者的證明研究已使用經(jīng)鼻接種，還可以考慮經(jīng)口服，尤其是當使用適當?shù)谋Ｗo性外膜/賦形劑來保護治療藥劑時。孢子的大小(根據(jù)種類長度為0.8-1. 5nm)以最緊密的限度與微粒佐劑排列，同時在表面結構上展示的外生抗原準確地模擬潛在病原體的大小和外形(理查德弗里等，1998)。這種微粒佐劑很容易被抗原呈遞細胞(APCs)攝取，誘導潛在的免疫應答(辛格等，1999)。研究顯示，與僅有可溶性抗原相比，以這種方式展示的外生抗原通過類型I和類型II途徑由MHC(主要組織相容性復合體)能提高效用1000-10000倍(哈丁等，1994 ;科瓦索維克斯-班科夫斯基等，1993)。吸附孢子免疫體液、局部和細胞應答的廣泛性是疫苗所需的。IgG2a的高滴定量和IFN-Y的產(chǎn)生代表ThI偏移免疫應答和抗原決定簇的構象識別(施耐普等，1987)。對共聚物佐劑的研究提出了有必要維持免疫原的天然構象來產(chǎn)生保護免疫(亨特，2002)。除了本工作中實現(xiàn)的保護水平，發(fā)明者有證據(jù)表明結合到孢子上的蛋白質能夠維持他們的天然構象。研究顯示他們已將堿性磷酸酶結合到孢子上(在PH4時)，這說明保持了全部的酶活性(未公開數(shù)據(jù))。該現(xiàn)象明顯可用于酶的運輸?？诜咦颖籑細胞攝入，進入派伊爾氏淋巴集結，在那里被APCs吸收(杜克等，2003;李等，2004)。發(fā)明者預測吸附的孢子也將使用相同的路徑傳輸抗原。重要的是重組孢子也促進與吸附孢子相同范圍的免疫應答，只不過后者每個孢子上負載的抗體量更多。例如，利用TTFC，重組孢子的單一經(jīng)鼻劑量將傳遞0. g免疫原，相比之下使用孢子吸附則傳遞I U go此外，吸附的孢子可使抗原吸附在通常不能在孢子表面上表達的抗原。例如，發(fā)明者已經(jīng)成功在不能表達的孢子上吸附了來自伯氏瘧原蟲的CSP抗原(未公開數(shù)據(jù))。
蛋白質吸附到孢子上的重要一點是其在低pH值條件下有所加強。隨pH值降到等電點以下，攜帶凈正電荷的蛋白質將利用靜電相互作用結合到仍帶負電荷的孢子上。當PH在等電點以上，蛋白質與孢子將帶負電荷，從而可以解釋為什么結合最小或不存在。當然，GST-Cpa247^370的結合是一個例外，將在后文討論。在鹽和高離子強度存在下可顯著增加吸附。這些現(xiàn)象已有報道，脊髓灰質炎病毒在低PH值條件下吸附在濾膜上，其中靜電與疏水相互作用在病毒結合中發(fā)揮作用(施爾茲等，1983)。在病毒研究中，鹽(NaCl或MgCl2)可增強疏水相互作用，如果打破了疏水相互作用，高離子強度(> 0. 3M)的NaCl僅破壞靜電相互作用。在本發(fā)明中，用鹽和去污劑處理吸附的孢子能夠最有效地去除結合蛋白。這說明靜電與疏水相互作用與結合有關。重懸吸附孢子于更高pH值的緩沖液中后，發(fā)現(xiàn)結合后很少有解離。這種穩(wěn)定性對于佐劑的作用是重要且明顯的，因為孢子會遇到中性PH值的鼻咽粘液。相反，口服可進一步加強抗原在孢子上的吸附，但不能在缺少保護外殼的情況下保護其免受胃液內的酶作用。發(fā)明者論證了大 量的其他免疫原能夠以依賴于pH的方式結合到孢子上，數(shù)據(jù)未顯示，包括來自困難梭菌的毒素A，來自單核細胞增生李斯特菌的李斯特菌溶胞素和伯氏瘧原蟲的CSP蛋白。GST-Cpa247_37(l是一個例外，在低pH值條件下展現(xiàn)出最強的結合，同時也在pH高于其等電點條件下結合(5.7)。嵌合蛋白的GST或Cpa部分不能吸附到天然形式的孢子上，這可以解釋獲得的Th2偏移免疫應答?？莶菅挎邨U菌孢子的外被由40種不同的蛋白組成(亨里克斯等，2007)。絕大多數(shù)芽孢桿菌的孢子也具有一個發(fā)育良好的外壁，一個以囊樣結構圍繞孢子外被的松散裝配的糖基化包被。有證據(jù)表明枯草芽孢桿菌具有一個原始外壁(瓦勒等，2004)，更多見于枯草芽孢桿菌的天然菌株，以及這里所述的HU58孢子中(洪等，2009)。由于在此pH值下羧基完全質子化，低PH值條件下帶凈負電荷的原因不明。孢子在低pH值的結合與高pH值時相等，高pH值時孢子可能帶有更多的負電荷，能夠結合帶正電荷的分子。這種應用在重金屬的吸附和回收上已經(jīng)開發(fā)(何等，1998，道尼，2001 ;龐等2005)。本研究的其他應用來自于小肽、生物藥分子，以及早期報道的酶類的吸附，。許多研究顯示口服孢子可抑制產(chǎn)毒素細菌引起的癥狀，包括大腸桿菌070:K80，腸炎型腸道沙門菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌和檸檬酸桿菌(拉拉吉尼等，2003 ;拉拉吉尼等，2001 ;迪阿倫佐等，2006)。本發(fā)明的孢子可用作疫苗制劑，提供一種用于推進和控制免疫應答的簡單有效工具。表I免疫小鼠對a毒素和破傷風毒素威脅的防御
a毒素攻擊試驗a_____
w a毒素的劑量平均致死分組途徑幸存數(shù)____(LD50)___時間土 (h)
未處理組____-__2__0/4__4.5±0.權利要求
1.一種將治療藥劑吸附到細菌孢子上的方法，該方法包含 在PH小于或等于治療藥劑等電點的條件下混合孢子和治療藥劑。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，該孢子是ー種芽孢桿菌或梭狀芽孢桿菌孢子。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，該孢子是ー種芽孢桿菌孢子。
4.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在干，該孢子是變性孢子，從而防止孢子萌發(fā)。
5.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，多種不同的治療藥劑被吸附到孢子上。
6.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，治療藥劑連接至ー種調節(jié)劑。
7.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在干，pH值小于7。
8.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在干，pH值小于5。
9.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在干，pH值約為4或更低。
10.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在干，PH值高于孢子的零電荷點。
11. 根據(jù)權利要求I至9中任意一項所述的方法，其特征在干，pH值大于2。
12.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，孢子和治療藥劑在增強孢子與治療藥劑間的疏水相互作用的條件下混合在一起。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其特征在于，當混合孢子與治療藥劑時，通過使用低鹽濃度提高孢子與治療藥劑之間的疏水相互作用。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其特征在于，低鹽濃度小于0.3M。
15.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，在結合溶液中將孢子與治療藥劑混合在一起，其中結合溶液的PH值低于或等于治療藥劑的等電點，其鹽濃度小于0. 3M。
16.根據(jù)權利要求14或15所述的方法，其特征在于，低鹽濃度小于0.15M。
17.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，該方法還包括用吸附的治療藥劑作為制藥組分的孢子，結合一種或多種藥用的載體或媒介。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其特征在于，制藥組分是ー種免疫原組分或疫苗組分。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其特征在于，該方法還包括添加ー種佐劑。
20.根據(jù)上述任意一項權利要求所述的方法，其特征在于，治療藥劑是ー種抗原。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其特征在于，抗原源自下述的一個或多個傳染源 HIV,甲型肝炎、こ型肝炎、流感病毒(正粘液病毒)、皰疹病毒、乳多空病毒、桿狀病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、埃希氏菌，包括大腸桿菌和腸毒性大腸桿菌(產(chǎn)腸毒素大腸桿菌)、軍團菌、芽孢桿菌、奈瑟氏菌、嗜血桿菌、螺旋桿菌、棒狀桿菌、肺炎球菌、沙門氏菌、分支桿菌、衣原體以及包括痢疾志賀菌、宋內志賀菌和福氏志賀菌的志賀氏桿菌，隱孢子蟲、弓形蟲、利什曼蟲、泰勒蟲和瘧原蟲。
22.根據(jù)權利要求I至21任一所述方法獲得ー種細菌孢子，其特征在于，孢子表面上吸附有ー種或多種治療藥劑。
23.根據(jù)權利要求18或權利要求19所述方法獲得ー種免疫原性組分或疫苗組分。
24.根據(jù)權利要求23所述的免疫原組分或疫苗組分，其特征在干，其包含ー種或多種來自ー種或多種傳染因子的抗原。
25.根據(jù)權利要求24所述的免疫原組分或疫苗組分，其特征在干，其用于增加對抗ー種或多種傳染因子的預防免疫應答。
26.根據(jù)權利要求25所述的免疫原組分或疫苗組分，其特征在于，使用的免疫原組分或疫苗經(jīng)腸胃外、粘膜或舌下途徑施藥。
27.根據(jù)權利要求24所述的免疫原組分或疫苗組分的一種提高個體對ー種或多種傳染因子免疫應答的方法，其特征在于，該方法包含施用有效劑量的所述免疫原組分或疫苗組分，所述的ー種或多種抗原來自上述一種或多種傳染因子。
28.根據(jù)權利要求27所述的方法，其特征在于，免疫原組分或疫苗經(jīng)腸胃外、粘膜或舌下途徑施用。
29.根據(jù)權利要求I至21任一所述方法獲得ー種孢子，孢子表面吸附有ー種或多種治療藥劑，用于治療。
30.根據(jù)權利要求I至21任一所述方法獲得ー種孢子，孢子表面吸附有ー種或多種抗原，用于提高個體應對ー種或多種抗原的保護性免疫應答。
31.根據(jù)權利要求I至21中任一所述方法的一種提高個體應對ー種或多種抗原的保護性免疫應答的方法，其特征在于，該方法包含施用一定量的表面吸附有ー種或多種抗原的細菌孢子。
32.根據(jù)權利要求I至21任一所述方法獲得的ー種表面吸附有ー種或多種抗原的細菌孢子，其特征在干，該細菌孢子用作疫苗。
33.根據(jù)權利要求I至21中任一所述方法獲得的制藥組分，其特征在于，該制藥組分包含ー種表面吸附有ー種或多種治療藥劑的孢子，以及ー種可制藥用的載體或媒介。
34.根據(jù)權利要求33所述的制藥組分，其特征在于，該制藥組分經(jīng)腸胃外、粘膜或舌下施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在孢子上覆蓋一種或多種治療藥劑的方法。本發(fā)明還涉及一種通過該方法獲得的被覆孢子，以及被覆孢子作為疫苗的應用。
文檔編號A61K39/02GK102630163SQ201080053702
公開日2012年8月8日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權日2009年9月21日
發(fā)明者西蒙·邁克爾·卡廷, 黃鴻英 申請人:皇家霍洛威和貝德福德新學院