專利名稱：乙型肝炎病毒特異抗體和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體涉及免疫介導(dǎo)療法用于檢測和治療乙肝病毒(HBV)和HBV相關(guān)疾病的領(lǐng)域和制備這些療法的方法。具體地，所述免疫介導(dǎo)療法可為HBV特異T細(xì)胞受體(TCR)樣抗體的形式。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)感染是全世界主要的公眾健康問題，造成慢性肝病的嚴(yán)重發(fā)病率和死亡率。估計(jì)全球有3. 5-4億HBV攜帶者。75%的慢性HBV患者在亞洲，且美國約有150萬人感染。而且，盡管可獲得有效疫苗，每年美國約報(bào)道50000-100000個(gè)新病例。感染更常見于某些風(fēng)險(xiǎn)人群中，如與男人發(fā)生性行為的男人、腎透析患者和血友病患者，慢性乙肝影響10-15%的第一代亞裔美國人且約5%的收養(yǎng)自俄羅斯、亞洲和東歐的兒童患有慢性肝炎。慢性HBV還導(dǎo)致包括肝硬化和肝癌(肝細(xì)胞癌)在內(nèi)的嚴(yán)重肝臟疾病，每年造成多 于100萬例死亡。治療這樣大量的慢性感染對象存在問題，因?yàn)楝F(xiàn)有藥物抑制但不消除HBV。這些藥物控制病毒的能力有限且造成嚴(yán)重的副作用，導(dǎo)致許多HBV患者過早中斷使用。感染的肝細(xì)胞的清除需要存在能分泌抗病毒細(xì)胞因子的病毒特異性T細(xì)胞。然而，這些病毒特異性T細(xì)胞在慢性HBV感染的患者中功能性受損。這些患者中HBV特異性T細(xì)胞免疫缺陷被認(rèn)為是治療停止后大多數(shù)患者經(jīng)歷HBV復(fù)發(fā)的原因。80%的肝細(xì)胞癌(HCC)與慢性HBV感染有關(guān)，使3. 5億慢性感染HBV的人成為有發(fā)展HCC風(fēng)險(xiǎn)的最大人群。慢性HBV患者中發(fā)展的HCC通常具有整合到腫瘤細(xì)胞染色體中的部分HBV基因組，導(dǎo)致所述腫瘤表達(dá)病毒抗原。因此HBC抗原可在HCC細(xì)胞上表達(dá)。這些病毒感染的細(xì)胞被人體免疫系統(tǒng)識別，因?yàn)樗黾?xì)胞在其表面暴露的小肽衍生自與主要組織相容性復(fù)合抗體(MHC)I類分子相關(guān)的病毒蛋白。TCR樣單克隆抗體已用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤方法或通過使用噬菌體抗體庫生產(chǎn)。但是，這些抗體與其相應(yīng)抗原HBV或腫瘤相關(guān)抗原有較低的結(jié)合親合力。發(fā)明概述本發(fā)明解決上述問題，且具體提供對至少一種HBV和/或HBV感染細(xì)胞特異的至少一種新抗體。根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供至少一種分離的T細(xì)胞受體(TCR)樣抗體或其片段，其中所述抗體或其片段能特異性結(jié)合至少一種HBV衍生的肽。所述HBV衍生肽可包括至少一種乙肝核心抗原和/或至少一種乙肝包被抗原。所述HBV衍生肽可與主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類分子有關(guān)。所述抗體可選自下組(a)雜交瘤細(xì)胞系PTA-10167和/或PTA-11068生產(chǎn)的抗體；(b)具有雜交瘤細(xì)胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生產(chǎn)抗體的結(jié)合特征的抗體；(c)與能結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生產(chǎn)抗體的抗原結(jié)合的抗體；(d)結(jié)合包含SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :24、其變體、突變或片段的氨基酸序列的抗原的抗體；和(e)包含至少一種輕鏈和至少一種重鏈的抗體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :32、其變體、突變或片段的氨基酸序列且所述重鏈包含SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :33、其變體、突變或片段的氨基酸序列。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供至少一種分離的雜交瘤細(xì)胞系，其于2009年7月2日以登錄號PTA-10167和2010年6月18日以登錄號PTA-11068保藏于ATCC(弗吉尼亞州20110馬納薩斯的大學(xué)大道10801)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)至少一種雜交瘤、乙肝病毒(HBV)特異抗體或其中片段的方法，所述方法包括以下步驟
a.用至少一種與MHC I類分子關(guān)聯(lián)的HBV衍生肽免疫至少一種非人哺乳動物，形成至少一種對與MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的B細(xì)胞；b.選擇至少一種對與MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的B細(xì)胞；和c.將所選B細(xì)胞與至少一種永生細(xì)胞融合以產(chǎn)生至少一種雜交瘤，其中所述雜交瘤能生產(chǎn)至少一種對與MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的HBV特異抗體或其片段；和任選地從所述雜交瘤中分離所述HBV特異抗體。根據(jù)其他方面，本發(fā)明提供檢測和/或定量存在的HBV的方法，治療HBV和/或至少一種HBV關(guān)聯(lián)疾病的方法，用作藥物的本發(fā)明的抗體或其片段，就制備藥物、藥盒、核酸和其用途而言本發(fā)明的抗體或其片段的應(yīng)用。附圖簡要說明圖I (A)是cl8/A2mAb特異性的圖，其中用cl8_27肽脈沖細(xì)胞觀察特異染色。圖I⑶顯示cl8/A2mAb的結(jié)合/識別能力沒有受到HBeAg抑制。圖2 (A)顯示用cl8/A2mAb檢測所需的cl8_27肽的最小濃度。低至IpM的cl8_27肽足以實(shí)現(xiàn)顯著的染色。圖2⑶證實(shí)C18/A2特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的cl8/A2mAb方法的靈敏度。圖2 (C)取自Gehring A. J等，2007，顯示用不同c 18-27肽濃度激活cl8/A2特異CTL。圖3為cl8/A2mAb的BIAcore分析結(jié)果。單體和cl8_A2mAb的結(jié)合分別以I. IXlO5M' S-1和2. 5X10^. S-1的結(jié)合和解離速率發(fā)生，產(chǎn)生的Kd (Koff/KJ為22. 6nM。圖4是細(xì)胞內(nèi)加工產(chǎn)生的C18/A2復(fù)合物的識別結(jié)果。(A)使用EBVB-核心細(xì)胞(組成型表達(dá)轉(zhuǎn)移的HBV核心蛋白)、EBV-pol細(xì)胞(對照)或DMS0(同種型對照)。用EBVB-核心細(xì)胞觀察到EBVB-pol細(xì)胞或同種型對照上方的顯著染色。(B)使用IFN-Y處理的表達(dá)HBV的IfepG2-117細(xì)胞。IfepG2-117細(xì)胞中觀察到cl8/A2mAb的顯著染色。這些結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)加工產(chǎn)生的C18/A2復(fù)合物被cl8/A2mAb識別。圖5是C18-27-MHC復(fù)合物的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。cl8/A2mAb能識別通過核心抗原HBcl8-27的天然胞內(nèi)加工呈遞的C18/A2復(fù)合物。圖6顯示cl8/A2mAb識別天然產(chǎn)生的具有逃逸CTL識別的HBcl8_27突變的能力。除了 E22和P21，cl8/A2mAb能識別數(shù)種CTL不能識別的突變肽。圖7是TCR樣抗體生產(chǎn)的示意圖。⑷如實(shí)施例所述的HLA-A2復(fù)合物合成、小鼠免疫、B細(xì)胞選擇和特異抗體生產(chǎn)的特征。表格報(bào)道篩選的雜交瘤的總數(shù)量；(B)代表B細(xì)胞雜交瘤上清的不同染色分布的柱狀圖。染色的細(xì)胞為用I PM各Flu Mp58-66或HBVC18-27肽脈沖處理的T2細(xì)胞。用50 ill雜交瘤上清或無關(guān)的IgGl小鼠抗體孵育細(xì)胞，然后清洗并用抗小鼠IgG_AF488孵育30分鐘。在流式細(xì)胞儀上清洗并分析細(xì)胞。示出三種不同分布(陰性、對HLA-A2分子特異和對核心18-27/HLA-A2復(fù)合物(c 18/A2)特異)。圖8是TCR樣抗體表征的結(jié)果。⑷評估選擇的TCR樣抗體的特異性用I U M各所述肽孵育T2細(xì)胞I小時(shí)、清洗3次并用0. 5 ii g的cl8/A2mAb或E183/A2mAb染色并如上分析。繪出平均熒光強(qiáng)度(MFI) ;(B)TCR樣抗體不受到循環(huán)HBV抗原的抑制cl8/A2Ab或el83/A2Ab用100 所述血清和產(chǎn)生HBV的H印G2-11細(xì)胞培養(yǎng)物上清預(yù)孵育。該預(yù)孵育的mAb-血清混合物用于染色加載C18-27或E183-91肽(I u M)的T2細(xì)胞。繪制用流式細(xì)胞分析和MFI分析的細(xì)胞。mAb的識別能力不受患者血清的循環(huán)抗原抑制；(C)兩種TCR樣Ab的結(jié)合特征。所述兩種TCR樣Ab的滴定濃度用肽脈沖的T2細(xì)胞測試。柱代表TCR樣 Ab的所述濃度下獲得的MFI值。圖9顯示TCR樣Ab特異性的精細(xì)作圖結(jié)果。(A)顯示核心18_27內(nèi)的AA突變和env 183-91表位對TCR樣Ab和⑶8T細(xì)胞識別的影響。在所述位置含有或不含(wt)丙氨酸取代時(shí)，用I U M核心18-27或env 183-91脈沖處理T2細(xì)胞。柱狀圖顯示W(wǎng)T核心18-27 (左四分之一)和env 183-91(右四分之一)肽上的丙氨酸取代誘發(fā)的TCR樣Ab結(jié)合(上四分之一)和CD8T細(xì)胞活化(下四分之一)的抑制。用下式計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)丙氨酸取代肽獲得的MFI (或⑶107表達(dá))值除以WT肽所得值XlOO ；⑶天然產(chǎn)生的核心18-27突變的cl8/A2 Ab識別。T2細(xì)胞用Iii M的wt cl8_27或氨基酸取代肽脈沖處理，然后用cl8/A2 Ab染色。柱代表流式細(xì)胞分析獲得的MFI值；(C)E183/A2 Ab專一特異于HBV gen A/C/D的envl83-91肽。T2細(xì)胞用I y M的187位置有所述取代的env 183-91肽脈沖處理。187R是HBV gen A/C/D分離物的特征，K 187是HBV基因型B/E/F的特征。

圖10顯示TCR樣抗體檢測pMHC復(fù)合物，與HBV特異性⑶8T細(xì)胞的靈敏度相似。T2細(xì)胞與所述濃度的C18-27或E183-91肽孵育I小時(shí)，并用于結(jié)合各抗體(柱)-或⑶8T細(xì)胞活化(線)。通過流式細(xì)胞分析檢測抗體結(jié)合。CD8 T細(xì)胞活化用與靶細(xì)胞孵育5小時(shí)后的表達(dá)CD107的CD8 T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)算。平行并重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)記表示兩次實(shí)驗(yàn)的均值。圖11描述細(xì)胞內(nèi)加工產(chǎn)生的pMHC復(fù)合物的檢測HepG2細(xì)胞為轉(zhuǎn)導(dǎo)有慢病毒載體的HBcAg(A)或HBsAg(B)?？蛰d體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞用作對照。存在或沒有多西環(huán)素條件下培養(yǎng)H印G2-117細(xì)胞并用cl8/A2 Ab(C)或el83/A2 Ab(D)染色。(E)觀察pMHC復(fù)合物。HepG2-117+Dox (無 HBV)和-Dox (HBV)細(xì)胞用 I % PFA 固定，并用 cl8/A2 Ab 和 el83/A2 Ab染色。Alexa Fluor-647-酪胺信號放大試劑盒用于觀察抗體結(jié)合(紅色，圖11中的亮灰色)。用DAPI染色核(藍(lán)色，圖11中的暗灰色)。圖12顯示純化自CHB肝活檢的細(xì)胞上pMHC的識別。點(diǎn)圖顯示衍生自CHB患者肝活檢的懸浮細(xì)胞的正面和側(cè)面散射。門控細(xì)胞上Ck-18(肝細(xì)胞特異性蛋白)的表達(dá)顯示于柱狀圖。超過90%的有所示形態(tài)的細(xì)胞表達(dá)Ck-18。為了檢測衍生自肝活檢的細(xì)胞上的特異性pMHC，機(jī)械加工的細(xì)胞用所述TCR樣抗體染色。顯示HLA-A2陽性和不同患者的臨床
/病毒學(xué)特征。圖13是pMHC和CTL活化的定量結(jié)果。為了獲得pMHC精確數(shù)量，等分細(xì)胞(用C18-27肽和el83-191肽濃度孵育)的MFI內(nèi)插到用校準(zhǔn)珠生成的顯示已知量小鼠IgG mAb的校準(zhǔn)曲線中。圖14是雜交瘤上清的篩選結(jié)果。T2細(xì)胞用IiiM的各envl83_91或無關(guān)的Ml肽脈沖處理I小時(shí)，清洗3次并用50 Ul雜交瘤培養(yǎng)物上清孵育，然后清洗并用抗小鼠IgG-AF488孵育30分鐘。在流式細(xì)胞儀上清洗并分析細(xì)胞。培養(yǎng)物上清特異性染色用env183-91而不是Ml肽脈沖處理的靶細(xì)胞。圖15A顯示E183/A2mAb的特異性。T2細(xì)胞與I ii M各所列肽孵育一小時(shí)，清洗3次并用0. 5 ii g mAb染色。清洗3次后，用抗小鼠IgG-PE abs孵育細(xì)胞30分鐘，清洗并在流式細(xì)胞儀上獲得。僅在envl83-91肽脈沖細(xì)胞中觀察到特異性染色。 圖15 (B)顯示E183/A2mAb的結(jié)合能力沒有受到HBeAg抑制。E183/A2mAb用單獨(dú)來自兩個(gè)不同患者的100 u I HBsAg+ve血清、產(chǎn)HBV的H印G2細(xì)胞的培養(yǎng)物上清和健康個(gè)體血清(AB血清)預(yù)孵育。該預(yù)孵育的mAb-血清混合物用于染色envl83-91脈沖處理的T2細(xì)胞。E183/A2mAb的識別能力不受到患者血清的HBsAg抑制。圖16顯示用E183/A2mAb檢測所需的最小envl83_91肽濃度。T2細(xì)胞用滴定量的envl83-91肽脈沖處理I小時(shí)并用TCR樣mAb染色。低至pM的肽足以實(shí)現(xiàn)顯著染色。圖17顯示肽圖。用I U M所述肽脈沖處理T2細(xì)胞I小時(shí)且細(xì)胞用E183/A2mAb孵育I小時(shí)。通過流式細(xì)胞分析檢測E183/A2抗體結(jié)合。氨基酸186和188是抗體用于識別復(fù)合物的殘基。圖18表示細(xì)胞內(nèi)加工產(chǎn)生的pMHC復(fù)合物的識別。用HBsAg(A)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)HepG2細(xì)胞?？蛰d體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞用作對照。細(xì)胞用E183/A2抗體孵育，然后用山羊抗小鼠IgG-APC孵育并用流式細(xì)胞儀分析。能清楚看到比空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞顯著的染色。⑶存在或沒有多西環(huán)素和IFN- y條件下培養(yǎng)產(chǎn)生HBV的HepG2-117細(xì)胞并如上所述用E183/A2mAb染色。兩種情況中均能清楚地看到比空載體對照細(xì)胞顯著的染色。圖19是E183/A2復(fù)合物的免疫細(xì)胞化學(xué)染色的照片。表達(dá)HBV的IfepG2細(xì)胞(HepG2-117)和載體對照IfepG2細(xì)胞用DMSO和IFN-Y處理并用I % PFA固定，用E183/A2mAb染色。采用酪胺信號放大試劑盒檢測所述結(jié)合。用DAPI染色核(藍(lán)色，圖19中的亮灰色)。E183/A2mAb能呈現(xiàn)HBV生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)由HBsAg的天然細(xì)胞內(nèi)加工呈遞的E183/A2復(fù)合物(紅色，圖19中的暗灰色)。圖20顯示E183/A2mAb識別含天然HBV整合的HCC細(xì)胞的能力。用表達(dá)HLA-A2的載體0fep3B-A2)轉(zhuǎn)導(dǎo)Ifep3B (表達(dá)HBV包被抗原的天然HCC細(xì)胞系)。如前所述細(xì)胞用或不用1000IU/ml IFN-y處理2天并用E183/A2mAb染色，且細(xì)胞在流式細(xì)胞儀上分析。圖21顯示免疫熒光物的靶向遞送的照片。IfepG2細(xì)胞用E183-91肽脈沖處理且且抗體-熒光物偶聯(lián)物孵育I小時(shí)，清洗并在蓋玻片上37°C孵育。孵育后的不同時(shí)間點(diǎn)，收集蓋玻片并與DiI紅孵育(圖21中所示的中等灰色)以標(biāo)記質(zhì)膜或與用LysoTracker染料以示蹤細(xì)胞中的溶酶體。用DAPI染色細(xì)胞核(藍(lán)色，圖21中的暗灰色)。蓋玻片上的細(xì)胞用1% PFA固定并裝配用于共聚焦成像。圖21中的綠/亮灰色顯示E183/A2mAb-熒光物。
發(fā)明詳述本說明書提及的參考書目為了方便以參考文獻(xiàn)的列表形式列出并加在實(shí)施例后。所述參考書目的全部內(nèi)容通過引用納入本文。定義方便起見，將本說明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求中使用的某些術(shù)語收集在此。本文所用的術(shù)語“抗體”指結(jié)合特定表位的任何免疫球蛋白或完整分子以及其片段。所述抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、完整抗體的Fab、Fab ’、F (ab) ’片段和/或F (v)部分。例如，抗體“ c 18/A2mAb ”可與“ HBc 18_27抗體”、“針對HBcl8-27的抗體”和“抗cl8/A2 TCR樣抗體”互換使用，其能特異性結(jié)合至少一種HBV衍生肽，包括但不限于HBcl8-27 (SEQ ID NO 3),或結(jié)合其變體或片段，且包括保留親本抗體的抗原結(jié)合能力的單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體和其片段。相似地，抗體“E183/A2mAb” 可與“HBel83-191 抗體”、“針對 HBel83_191 的抗體”和“抗 el83/A2mAb T CR樣抗體”互換使用，其能特異結(jié)合至少一種HBV衍生肽，包括但不限于HBel83-191 (SEQ IDNO :24)，或結(jié)合其變體或片段，且包括保留親本抗體的抗原結(jié)合能力的單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體和其片段。本文所用的術(shù)語“抗體片段”指保留親本抗體的抗原結(jié)合功能的抗體完整序列的不完整或分離部分?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和抗體片段形成的多特異性抗體。cl8/A2mAb和E183/A2mAb的片段包括在本發(fā)明中，只要其保留與全長抗體的所需親合力。具體地，其可縮短至少一個(gè)氨基酸。例如，cl8/A2mAb抗體片段包含能使其結(jié)合HBcl8_27 (SEQ ID NO :3)、或其變體或片段的抗原結(jié)合功能且E183/A2mAb抗體片段包含能使其結(jié)合HBel83_191 (SEQ ID NO :24)、或其變體或片段的抗原結(jié)合功能。本文所用的術(shù)語“抗原”指促使抗體生成并引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)。本發(fā)明中其可與術(shù)語“免疫原”互換使用。嚴(yán)格意義上，免疫原是引發(fā)免疫系統(tǒng)響應(yīng)的物質(zhì)，而抗原定義為結(jié)合特異抗體的物質(zhì)?？乖蚱淦慰蔀榻佑|具體抗體的分子(即表位)。蛋白或蛋白片段用于免疫宿主動物時(shí)，大量蛋白區(qū)域可誘導(dǎo)抗體生成(即引發(fā)免疫應(yīng)答)，其特異性結(jié)合所述抗原(蛋白上的給定區(qū)域或三維結(jié)構(gòu))。所述抗原可包括但不限于與“HBcl8-27肽”和“C18/A2 互換使用的 HBcl8-27、與“HBel83-191 肽”和“E183/A2 互換使用的 HBel83_191及其片段。本文術(shù)語“包含”定義為各種組分、成分或步驟可聯(lián)用于實(shí)施本發(fā)明。因此，術(shù)語“包含”涵蓋了限定性更強(qiáng)的術(shù)語“主要由組成”和“由組成”。術(shù)語“主要由組成”理解為本發(fā)明的表位/抗原“主要”包含所述序列作為“基本”元件。額外序列可包括在5端和/或3端。因此，鑒于已知多肽偶然包含序列X，“主要由序列X組成”的多肽可為新的。術(shù)語“由組成”理解為按照本發(fā)明的多肽、多核苷酸和/或抗原對應(yīng)于至少一種所述序列(例如SEQID編號所示的具體序列或其同源序列或片段)。本文所用的術(shù)語“衍生物”指至少一種HBV衍生肽、或編碼至少一種HBV衍生肽的多核苷酸序列、或與編碼至少一種HBV衍生肽的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的化學(xué)修飾。多核苷酸的化學(xué)修飾包括例如，用烷基、?；虬被〈鷼?。衍生多核苷酸編碼的多肽保留天然分子的至少一種生物學(xué)或免疫學(xué)功能。衍生多肽是通過糖基化、聚乙二醇化或任何相似過程修飾的多肽，它保留了其來源多肽的至少一種生物學(xué)功能或免疫學(xué)功能。短語“HBV衍生肽”指衍生自HBV的蛋白/肽。具體地，HBV衍生肽可包括但不限于核心抗原、包被抗原、表面抗原和/或其突變體。更具體地，HBV衍生肽可為HBcl8-27和/ 或 HBel83-191。本文術(shù)語“HBcl8_27定義為能刺激HLA I類限制性T細(xì)胞且和“cl8/A2互換使用的表位。所述表位的序列可為"FLPSDFFPSV”(SEQ ID NO :3)。本發(fā)明中，除非另有說明，術(shù)語HBcl8-27用于指白種人常見的基因型A/D的序列為SEQ ID NO 3的HBcl8_27表位。本文術(shù)語“HBel83-191定義為能刺激HLA I類限制性T細(xì)胞且和“E183/A2互換使用的表位。所述表位的序列可為"FLLTRILTI，，(SEQ ID NO :24)。本文所用的術(shù)語“片段”指至少一種HBV衍生肽的完整序列的不完整或分離部分，其包含賦予所述序列所述肽的特征和功能的活性位置。具體地，其可縮短至少一個(gè)核苷酸或氨基酸且可為免疫原性片段。例如HBcl8-27片段包含使cl8/A2mAb或其片段識別的活 性位置和/或HBel83-191的片段包含使E183/A2mAb或其片段識別的活性位置。片段還可指本發(fā)明任何方面的抗體的片段，其中所述抗體包含識別相應(yīng)抗原的活性位置。所述片段長度可至少為10氨基酸。本文所用的術(shù)語“人源化抗體”指至少一種抗體分子，其中非抗原結(jié)合區(qū)的氨基酸序列已改變從而所述抗體與人抗體更緊密相似，且仍保留其原始結(jié)合能力。如本文所用，術(shù)語“雜交瘤”指已工程改造成大量生產(chǎn)所需抗體的細(xì)胞。例如為了生產(chǎn)至少一種雜交瘤，B細(xì)胞從已用相關(guān)抗原刺激的動物脾中移出并與至少一種永生細(xì)胞融合。該融合通過使細(xì)胞膜更通透來實(shí)現(xiàn)。融合雜交細(xì)胞(成為雜交瘤)會快速和無限地增加且會產(chǎn)生至少一種抗體。按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系示例包括但不限于產(chǎn)生 HBcl8-27、cl8/A2mAb 的單抗的 cl8/A2mAb#l。本文所用的“永生細(xì)胞”還稱為轉(zhuǎn)化細(xì)胞即生長特性被改變的細(xì)胞。這并不一定表示這些是“癌”或“腫瘤”細(xì)胞(即引入實(shí)驗(yàn)動物時(shí)能形成腫瘤)，盡管在一些情況中它們可能是。永生細(xì)胞系包括但不限于NS1、Jurkat> HeLa、HepG2、SP2/0、Hep_3b等。本文術(shù)語“分離的”定義為與生物體細(xì)胞中其他生物組分充分隔離、分開產(chǎn)生或從中純化出的生物組分(如核酸、肽或蛋白)，其中所述組分天然產(chǎn)生即其他染色體和染色體外的DNA和RNA和蛋白。因此已分離的核酸、肽和蛋白包括由標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白。該術(shù)語還包括宿主細(xì)胞中重組表達(dá)制備的核酸、肽和蛋白以及化學(xué)合成的核酸。本文所用的術(shù)語“單體”包含至少一種抗原、重鏈和/或輕鏈。例如，本發(fā)明中，實(shí)施例I所用的單體包含HBcl8-27和至少一種HLA重鏈和輕鏈。具體地，所述單體可包含SEQ ID NO :3或其片段、重鏈和輕鏈。本發(fā)明中術(shù)語“單體”可與術(shù)語“C18/A2復(fù)合物”和“C18/A2單體”互換使用。術(shù)語HBV衍生肽的“突變體”在本文定義為具有通過取代、缺失或添加至少一種氨基酸而與至少一種參考病毒編碼序列不同的至少一種氨基酸序列的肽，但其保留結(jié)合和活化本發(fā)明抗體且可被非突變肽活化的能力。HBcl8-27的例子包括但不限于表2提供的SEQID NO :4-16。本文所用的術(shù)語“樣品”在本文中以最廣義使用。疑似含編碼至少一種HBV衍生肽或其片段的核酸的生物樣品，或至少一種HBV衍生肽自身可包含體液、細(xì)胞提取物、染色體、細(xì)胞器官、或分離自細(xì)胞的膜、細(xì)胞；基因組DNA、RNA、或cDNA(溶于溶液或結(jié)合于固體支持物)、組織、組織印跡等。如本文所用，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異地結(jié)合”指蛋白或肽和激動劑、抗體或拮抗劑之間的相互作用。具體地，所述結(jié)合在抗原和抗體之間。該相互作用依賴于結(jié)合分子(即抗原或表位)識別的蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)的存在。例如，若抗體對表位“A”特異，則含游離標(biāo)記A和抗體的溶液中存在的含表位A的多肽或存在的游離未標(biāo)記A會降低結(jié)合所述抗體的標(biāo)記A的量。例如，cl8/A2mAb可特異性結(jié)合抗原HBcl8_27且E183/A2mAb可特異性結(jié)合抗原 HBel83-191。本文所用的術(shù)語“對象”定義為脊椎動物，具體是哺乳動物，更具體是人。為了研究目的，所述對象可具體為至少一種動物模型，如小鼠、大鼠等。本文所用的術(shù)語“TCR樣單克隆抗體”指至少一種與T細(xì)胞受體(TCR)抗體性能相似的抗體。具體地，所述TCR樣單克隆抗體可指能識別MHC結(jié)合肽的抗體。TCR樣單克隆抗體的示例可包括但不限于cl8/A2mAb和E183/A2mAb。 如本文所用的至少一種HBV衍生肽的“變體”指一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變的氨基酸序列。所述變體可有“保守性”改變，其中取代的氨基酸具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性(如用異亮氨酸取代亮氨酸)。更少見的，變體可有“非保守性”變化(如用色氨酸替換甘氨酸)。類似的小變化還可包括氨基酸缺失或插入或兩者均有。使用本領(lǐng)域熟知計(jì)算機(jī)程序如DNASTAR軟件可發(fā)現(xiàn)確定可對哪一氨基酸殘基進(jìn)行取代、插入或缺失而不破壞生物學(xué)或免疫學(xué)活性的指南。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解本發(fā)明可實(shí)施而不需按照本文提供的方法進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)。所述方法、技術(shù)和化學(xué)品如給定參考文獻(xiàn)所述或來自標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)和分子生物學(xué)教科書中的實(shí)驗(yàn)方案。本發(fā)明第一方面，提供至少一種分離的T細(xì)胞受體(TCR)樣抗體或其片段，其中所述抗體或其片段能特異性結(jié)合至少一種HBV衍生的肽。所述HBV衍生肽可包括至少一種乙肝核心抗原和/或至少一種乙肝包被抗原。所述新抗體可具有靶向HBV感染細(xì)胞和HBV衍生的肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞的能力，這基于這些細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)重要抗原和其與人MHC I類的關(guān)聯(lián)(在稱為人白細(xì)胞抗原-HLA-A201的形式上特異)。所述HBV衍生肽可與主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類分子結(jié)合，尤其是HLA I類分子。所述HLA I類分子可為HLA-A2。更具體地，所述HBV衍生肽可為MHC-I肽復(fù)合物的部分，所述復(fù)合物包含HBV衍生肽和HLA I類分子。人類中MHC I類蛋白統(tǒng)稱為HLA且在人體幾乎全部有核細(xì)胞表面表達(dá)，其結(jié)合衍生自內(nèi)源產(chǎn)生的病毒的小肽(通常9-10氨基酸長)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中自身改變(腫瘤)的蛋白以產(chǎn)生復(fù)合物。HLA I類蛋白和其結(jié)合肽的復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到感染細(xì)胞的表面，這里其能被細(xì)胞毒性⑶8T淋巴細(xì)胞上呈遞的T細(xì)胞受體識別。不同HLA類型包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPAl、HLA-DPBl、HLA-DQAl、HLA-DQBU HLA-DRA、和 HLA-DRB1。細(xì)胞毒性⑶8T淋巴細(xì)胞上呈遞的T細(xì)胞受體和HLA I類分子呈遞的病毒肽之間的特異相互作用活化能破壞病毒感染細(xì)胞或產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子(TNF-a和IFN-y)的CD8T細(xì)胞，所述細(xì)胞因子能清除非細(xì)胞病變病毒感染的細(xì)胞。所述感染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的病毒蛋白不易為典型抗體進(jìn)入，但免疫系統(tǒng)通過CD8T淋巴細(xì)胞上呈遞的T細(xì)胞受體識別病毒感染細(xì)胞。因?yàn)楫a(chǎn)生病毒特異性CD8T細(xì)胞需要高度熟練的技術(shù)且該細(xì)胞體外極其不穩(wěn)，所以生成特異性識別病毒感染細(xì)胞表面上HLA限制性病毒肽配體的抗體可在體內(nèi)檢測人中的病毒感染細(xì)胞然后能遞送有治療或診斷效力的部分。因?yàn)镠LA I類/病毒肽復(fù)合物通常在不同個(gè)體中有差異，所以不同的TCR樣抗體僅在攜帶所定義HLA I類分子的選定人群中作用。定位于人染色體6上的基因復(fù)合物產(chǎn)生的HLA I類分子和這些基因在更大的程度上多樣化，因此各單一個(gè)體可呈遞不同HLA I類蛋白的具體組合。針對不同病毒肽選擇不同HLA I類分子的分子結(jié)構(gòu)且因此感染細(xì)胞上呈遞的HLA I類病毒肽復(fù)合物有極度的多樣性。約50 %的人群表達(dá)HLA I類分子HLA-A2，其代表許多HLA_A*02等位基因的基因產(chǎn)物產(chǎn)生的HLA I類分子家族，所述基因產(chǎn)物包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206和*0207基因產(chǎn)物。白種人和亞洲人群之間的亞型中有顯著差異。超過95%的HLA-A2陽性白種人群為 HLA-A0201，HLA-A2 陽性，中國人群可分為 23% HLA-A0201 ；45% HLA-A0207 ；8%HLA-A0206 ；23% HLA-A0203。 按照本發(fā)明的任何方面的TCR樣抗體可靶向HLA-A2分子不同等位基因呈遞的HBV衍生肽，且因此其可靶向約50%的HBV感染人群。按照本發(fā)明的任何方面的TCR樣抗體具有與病毒特異性CD8T淋巴細(xì)胞天然產(chǎn)生的T細(xì)胞受體相似的特異性，其能識別病毒感染的細(xì)胞且因此能被稱為T細(xì)胞受體(TCR)樣抗體。按照本發(fā)明的任何方面的TCR樣抗體具有與其相應(yīng)MHC肽復(fù)合物相當(dāng)高的結(jié)合親和性，且因此能識別天然產(chǎn)生的通常在其表面顯示極低量病毒肽/HLA I類配體的病毒感染細(xì)胞。這些TCR樣抗體還能識別HBV感染的人肝細(xì)胞。HBV衍生肽可包括但不限于乙肝核心抗原、包被抗原、表面抗原和/或其突變體。具體地，所述HBV衍生肽可包括至少一種乙肝核心抗原和/或乙肝包被抗原。具體地，所述HBV衍生肽可包括以下組分、由其組成或主要由其組成HBc 18-27和/或HBe 183-19、其變體、突變或片段。更具體地，HBcl8-27包括以下組分、由其組成或主要由其組成SEQ ID NO:3、其變體、突變體或片段，且HBel83-191包括以下組分、由其組成或主要由其組成SEQ IDNO :24、其變體、突變或片段。本發(fā)明的抗體可結(jié)合HBV感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的C18/A2和/或E183/A2單體且靶向它們用于免疫介導(dǎo)的裂解(即天然殺傷細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC))。所述抗體可選自下組(a)雜交瘤細(xì)胞系PTA-10167和/或PTA-11068生產(chǎn)的抗體；(b)具有雜交瘤細(xì)胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生產(chǎn)抗體的結(jié)合特征的抗體；(c)與能結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生產(chǎn)抗體的抗原結(jié)合的抗體；(d)結(jié)合包含SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :24、其變體、突變或片段的氨基酸序列的抗原的抗體；和(e)包含至少一種輕鏈和至少一種重鏈的抗體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :32、其變體、突變或片段的氨基酸序列且所述重鏈包含SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :33、其變體、突變或片段的氨基酸序列。
所述抗體可為至少一種人、人源化或嵌合抗體。所述抗體可為能高度特異性靶向HBV感染細(xì)胞的小鼠IgGl (含K輕鏈)，因?yàn)槠浒邢騂BV感染細(xì)胞表面專有呈遞的HLA-A201-HBV 核心 18-27 復(fù)合物和 / 或 HLA-A201-HBV 包被 183-191 復(fù)合物?？刹捎猛ㄟ^將有合適抗原特異性的小鼠抗體分子和有合適生物活性的人抗體分子基因一起剪接來產(chǎn)生“嵌合抗體”的開發(fā)技術(shù)(Morrison,等，1984通過引用全文納入本文)。例如，對自誘導(dǎo)物特異的小鼠抗體分子基因可與有合適生物活性的人抗體分子的基因一起剪接。嵌合抗體是其中不同部分衍生自不同動物種類的分子，如具有衍生自鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。此外，已開發(fā)用于生產(chǎn)人源化抗體的的技術(shù)(參見例如，US 5，585，089和/或US5，225，539，其通過引用全文納入本文)。免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(qū)由三個(gè)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)中斷的“框架”區(qū)組成。簡要地，人源化抗體是來自非人物種的抗體分子，其具有來自非人物種的一個(gè)或多個(gè)CDR以及來自人免疫球蛋白分子的框架區(qū)。
所述抗體可標(biāo)記有至少一種放射性核和/或熒光團(tuán)從而改善體內(nèi)HBV感染的腫瘤細(xì)胞至少在診斷和/或治療能力中的靶向。例如，通過正電子發(fā)射斷層顯像(PET)檢測HBV感染的HCC細(xì)胞。用放射性核標(biāo)記的抗體可就手術(shù)和/或放療而言更好地靶向疾病細(xì)胞?？贵w還可用至少一種毒素和/或化療劑標(biāo)記。具體地，標(biāo)記的抗體可用作使這些毒性劑更好靶向腫瘤細(xì)胞的“免疫毒素”。本發(fā)明任何方面的TCR樣抗體還可用于直接定量感染細(xì)胞或任何抗原呈遞細(xì)胞上的肽/HLA I類復(fù)合物的數(shù)量和位置，因此可用于評估不同細(xì)胞類型中HBV抗原的加工和
呈遞效率。所述抗體可識別HLA-A201環(huán)境中的cl8_27和/或envl83_91肽。該TCR樣mAb可代表HBV免疫學(xué)的兩個(gè)主要領(lǐng)域中有價(jià)值的新工具。首先，該mAb可用于通過流式細(xì)胞分析和免疫組織化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測和直接觀察PMHC復(fù)合物的存在。通過確定APC、肝細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上PMHC的表達(dá)，其可用于研究和分析抗原呈遞。有關(guān)抗原呈遞期間某些事件如何和在何處發(fā)生的問題可被直接解決，且可觀察并定量T細(xì)胞表位在APC上的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明任何方面的抗體提供了用作各種基于抗體的免疫治療方法中靶向部分的新可能。TCR樣mAb可與藥物連接，得到的‘a(chǎn)b-偶聯(lián)物’可用于遞送藥物到感染細(xì)胞。具體地，所述抗體可與至少一種藥物、抗病毒藥物、毒素和/或化療劑相連。具體地，所述抗體可用于遞送藥物到具有高度特異性的感染肝細(xì)胞中以抑制病毒感染和腫瘤。所述藥物可包括但不限于IFN-a、TLR-激動劑、阿德福韋、恩替卡韋、拉米夫定、瑞莫夫韋、替比夫定、替諾福韋等。本發(fā)明的抗體連接至少一種抗病毒藥物，可能增加HBV感染細(xì)胞的藥物可用性，其可提高對感染細(xì)胞的IFN-a效應(yīng)并同時(shí)降低系統(tǒng)性IFN-a暴露，因此降低抗病毒藥物通常引起的副作用。這可產(chǎn)生慢性HBV的新治療，可能阻止肝癌和其他有關(guān)HBV的并發(fā)癥。cl8/A2mAb和/或E183/A2mAb可與至少一種可示蹤劑連接且可能用于體外或體內(nèi)定量HBV感染的肝細(xì)胞。所述可示蹤劑可為任何可示蹤的生物或化學(xué)組分。所述可示蹤劑包括但不限于環(huán)境劑、血液標(biāo)記、抗原、農(nóng)藥、藥物、化學(xué)品、毒素、PCBS、PBBS、鉛、神經(jīng)毒素、血液電解質(zhì)、代謝物、分析物、NA+、K+、CA+、尿素氮、肌酸酐、生化血液標(biāo)記和組分、ChE,AChE, BuChe、腫瘤標(biāo)記、PSA、PAP、CA 125、CEA, AFP、HCG, CA 19-9, CA 15-3, CA 27-29、NSE、羥基丁酸鹽、乙酸乙酯、抗瘧疾藥物如阿莫待喹、蒿甲醚、青蒿素、青蒿酯、阿托伐醌、辛可寧、辛可尼定、氯奎、多西環(huán)素、鹵方特瑞(halofanthne)、甲氟喹、伯氨喹、乙卩密唳、奎寧、奎納定、和磺胺多辛；抗生素藥物如氨芐青霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素、紅霉素、青霉素、和四環(huán)素；抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物如阿巴卡韋、阿德福韋、地達(dá)諾新、恩替卡韋、茚地那韋、拉米夫定、奈韋拉平、瑞莫夫韋、利托那韋、甲磺酸沙奎那韋、替比夫定、替諾福韋、扎西他濱、和齊多夫定。根據(jù)本發(fā)明任何方面的TCR樣mAb可用于肝細(xì)胞癌(HCC)患者。HBV基因組整合到感染細(xì)胞中是HCC惡性腫瘤中最一致相關(guān)的因子。TCR樣mAb可用于解決HCC患者肝活檢上的抗原呈遞研究。連接至少一種藥物的TCR樣mAb制備的免疫偶聯(lián)物可具有殺死癌細(xì)胞的能力。HBV免疫治療的方法可產(chǎn)生殘余副作用最小的改良HBV患者治療的臨床應(yīng)用。cl8/A2mAb和E183/A2mAb可用于獲得有關(guān)病毒感染細(xì)胞的表面和專職抗原呈遞細(xì)胞上pMHC復(fù)合物的呈遞、表達(dá)模式和分布的精確信息。體外和體內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞的直接示蹤還可用cl8/A2mAb和/或E183/A2mAb進(jìn)行。cl8/A2mAb和E183/A2mAb還可用于 cl8/A2mAb和E183/A2mAb分別與抗病毒細(xì)胞因子或toll樣受體或抗病毒藥物的偶聯(lián)，作為新的免疫治療策略用于靶向遞送免疫偶聯(lián)物到感染細(xì)胞中。人源化mAb-藥物偶聯(lián)物能靶向在表達(dá)病毒抗原的HBV感染患者中產(chǎn)生的肝細(xì)胞癌。mAb還可通過將其連接合適的熒光團(tuán)或放射性核而用作診斷劑。按照另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)至少一種雜交瘤、乙肝病毒(HBV)特異抗體或其中片段的至少一種方法，所述方法包括以下步驟a.用至少一種MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽免疫至少一種非人哺乳動物，形成至少一種對MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的B細(xì)胞；b.選擇至少一種對MHC I類分子結(jié)合的聯(lián)HBV衍生肽特異的B細(xì)胞；和c.將所選B細(xì)胞與至少一種永生細(xì)胞融合以產(chǎn)生至少一種雜交瘤，其中所述雜交瘤能生產(chǎn)至少一種對MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的HBV特異抗體或其片段；和任選地從所述雜交瘤中分離所述KW特異抗體。按照本發(fā)明方法的步驟(b)可包含將對MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的至少一種B細(xì)胞和下述一起孵育i.至少一種生物素化抗原，所述抗原能結(jié)合對MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的B細(xì)胞；和ii.至少一種抗生物素偶聯(lián)珠。此生產(chǎn)雜交瘤、HBV特異抗體或其片段的新方法可開發(fā)TCR樣HLA/HBV特異單克隆抗體，其可靠性高于現(xiàn)有可能。為了制備本發(fā)明至少一種HBV特異抗體，可使用通過培養(yǎng)連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何方法，只要選擇對所述抗原特異的B細(xì)胞的步驟在與永生細(xì)胞融合前進(jìn)行。更具體地，步驟(b)可用新加坡的美天旎生物技術(shù)公司(Miltenyi Biotec)的磁激活細(xì)胞分選(MACS)進(jìn)行。所述HBV衍生肽可包含以下組分、由其組成或主要由其組成SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :24、其變體、突變或片段的氨基酸序列。用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的方法示例示于實(shí)施例I。實(shí)施例I提供用于生產(chǎn)對SEQ IDNO 3的肽特異的單克隆抗體的方法，所述肽衍生自用BALB/c小鼠的HBV核心抗原。按照另一方面，本發(fā)明提供按照本發(fā)明的任何方法生產(chǎn)的至少一種分離抗體或其片段。按照另一方面，本發(fā)明提供檢測和定量對象中至少一種HBV感染細(xì)胞的存在和分布的方法，所述方法包括a.將本發(fā)明任何方面的至少一種抗體或其片段與從至少一個(gè)對象獲得的至少一種樣品接觸；和b.檢測和定量抗體與所述HBV感染細(xì)胞的結(jié)合。所述抗體可特異性結(jié)合HBcl8-27、HBel83-191、其變體、突變或片段或HBV感染細(xì)胞的其片段。所述結(jié)合證實(shí)所述細(xì)胞可被HBV感染、所述樣品含至少一種HBV感染細(xì)胞和/或所述對象可為HBV陽性。更具體地，本方法可為體外檢測和定量的方法。 按照另一方面，本發(fā)明提供檢測對象中HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌(HCC)的方法，所述方法包括a.將本發(fā)明任何方面的至少一種抗體或其片段與從至少一個(gè)對象獲得的至少一種樣品接觸；和b.檢測抗體與所述HBV相關(guān)的HCC感染細(xì)胞的結(jié)合。本發(fā)明任何方面的檢測和定量方法可為診斷的非侵入性方法且還可用于研究HBV的數(shù)種免疫學(xué)方面。所述方法可通過流式細(xì)胞分析和免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)方法用于檢測和直接觀察抗原(PMHC)復(fù)合物的表型分析的存在，通過確定APC、HCC腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上pMHC的表達(dá)用于研究和分析抗原呈遞。本方法可用于確定抗原呈遞期間某些事件的存在及其背后的原因，且可觀察和定量T細(xì)胞表位在APC上的表達(dá)。按照其他方面，本發(fā)明提供至少一種治療HBV和/或至少一種HBV相關(guān)疾病的方法，所述方法包括給予需要的對象至少一種按照本發(fā)明任何方面的抗體或其片段。本發(fā)明的抗體可與靶向不同HLA型結(jié)合的不同HBV肽的其他相似抗體聯(lián)合給予。因此所述腫瘤細(xì)胞和病毒可能沒有機(jī)會應(yīng)用于此類治療中。按照另一方面，本發(fā)明提供按照本發(fā)明任何方面的至少一種抗體或其片段用于藥物應(yīng)用。按照另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明任何方面的抗體或其片段在制備用于治療HBV和/或至少一種HBV相關(guān)疾病的藥物中的至少一種應(yīng)用。BV相關(guān)疾病包括硬化、HCC等。所有HCC中的75%由慢性HBV引起。按照其他方面，本發(fā)明提供至少一種用于診斷HBV和/或至少一種HBV相關(guān)疾病的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種本發(fā)明的抗體或其片段。按照一個(gè)方面，本發(fā)明提供至少一種分離的核酸分子，其編碼(a)本發(fā)明任何方面的抗體或其片段的至少一種輕鏈，其中所述輕鏈包含SEQ IDNO USEQ ID NO :32、其變體、突變或片段；和/或(b)本發(fā)明任何方面的抗體或其片段的至少一種重鏈，其中所述重鏈包含SEQ IDN0:2、SEQ ID NO :33、其變體、突變或片段。按照另一方面，本發(fā)明提供確定對象中疫苗效力的方法，所述方法包括-給予所述疫苗后5-15天，將本發(fā)明任何方面的至少一種抗體或其片段與獲自所述對象的至少一種樣品接觸；和-檢測抗體或其片段與HBV感染細(xì)胞的結(jié)合；和-對比給予所述疫苗前后HBV感染細(xì)胞的數(shù)量，其中HBV感染細(xì)胞數(shù)量減少說明疫
苗有效。確定HCC細(xì)胞中HBV抗原的存在可用于檢測疫苗的抗原加工或不同個(gè)體中抗原加工的缺陷。按照本發(fā)明任何方面的TCR樣抗體還可用于疫苗驗(yàn)證，作為確定所需HBV-T細(xì)胞表位是否在細(xì)胞上展示的有用工具和作為理解體內(nèi)和體外抗原加工和呈遞的命運(yùn)的研究試劑，且可在實(shí)體瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞、接觸化學(xué)劑的細(xì)胞、接觸疫苗后的腫瘤細(xì)胞等之間評估這些過程。 按照另一方面，本發(fā)明提供確定細(xì)胞中抗原加工和呈遞的精確性的方法，所述方法包括用本發(fā)明任何方面的至少一種抗體或其片段與所述細(xì)胞接觸的步驟。按照另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明核酸的表達(dá)載體和包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。具體地，所述載體可包含但不限于慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體和單純皰疹病毒載體。更具體地，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于體外、離體或體內(nèi)遞送所述構(gòu)建體。按照本發(fā)明任何方面的TCR樣抗體可用作治療劑，作為抗體或雙特異性分子/雙特異性抗體，或者可用作藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載劑將有毒物質(zhì)載荷轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞和/或病毒感染細(xì)胞中。本發(fā)明任何方面的TCR樣抗體還可用于致癌物概況分析以提供癌癥檢測和治療的個(gè)體化方法。因此，術(shù)語“致癌物概況分析”指用TCR樣抗體篩選癌細(xì)胞以確定HLA I類分子呈遞的HBV肽是否展示在HCC的表面。目前總體描述了本發(fā)明內(nèi)容，通過參照以說明方式提供的以下實(shí)施例能更容易理解本發(fā)明，但這些實(shí)施例不應(yīng)限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解本發(fā)明可實(shí)施而不需按照本文提供的方法進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)。所述方法、技術(shù)和化學(xué)品如所附參考文獻(xiàn)所述或來自標(biāo)準(zhǔn)生物技術(shù)和分子生物學(xué)教科書中的實(shí)驗(yàn)方案。
實(shí)施例本領(lǐng)域已知且未具體描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)一般按照Sambrook和Russel,Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》)，紐約的冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory) (2001)所述。實(shí)施例I抗原/單體的制備靶向的HBV抗原為FLPSDFFPSV的HBc 18-27 (SEQ ID NO :3)。制備的單體為至少一種HLA-A201重鏈和輕鏈加SEQ ID NO :3抗原肽的FPLC純化重組、無膜、完全折疊的異源
三聚體復(fù)合物。人主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類HLA-A201重鏈(HC)和輕鏈(LC) (B2微球蛋白)在BL21大腸桿菌(E. coli)(德國，諾瓦基公司(Novagen))中表達(dá)為重組蛋白。所述重鏈和輕鏈分離為包含體并溶于8M尿素。然后選擇來自HBV的HBc 18-27的SEQ ID NO 3抗原肽并用HLA重鏈和輕鏈再折疊以形成體外C18/A2單體。采用陰離子交換色譜純化所述單體然后C18/A2單體四聚化?？筩l8/A2 TCR樣抗體的生成上述步驟的C18/A2單體用作抗原來源以刺激免疫的Balb/C小鼠中的抗體響應(yīng)。雌性Balb/c小鼠用完全弗氏佐劑中25ii g的純化C18/A2單體腹膜內(nèi)免疫(初次給藥)(美國西格瑪-艾爾德里奇公司(Sigma-Aldrich))，然后用相同單體加不完全弗氏佐劑加強(qiáng)給藥(3次加強(qiáng)給藥)(美國西格瑪-艾爾德里奇公司)。最后一次不含佐劑的加強(qiáng)給藥通過與NSl骨髓瘤細(xì)胞融合前3天的尾部注射進(jìn)行。處死該小鼠并通過溫和均質(zhì)化制備脾細(xì)胞。通過孵育所述脾細(xì)胞和生物素化cl8/A2單體來純化具有所需特異性的B細(xì)胞，所述單體結(jié)合對所述單體特異的B細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的特異性B細(xì)胞受體。然后偶聯(lián)免疫-磁珠的抗生物素(新加坡美天旎生物技術(shù)公司)用 于通過免疫磁性選擇法正選擇磁柱上結(jié)合的B細(xì)胞。免疫小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合前抗原特異B細(xì)胞的預(yù)純化采用連接免疫磁珠的生物素化形式單體，相較標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤方法大大改善具有校正特異性的雜交瘤百分比。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過PEG1500(美國西格瑪-奧德里奇公司)將所選的B細(xì)胞與NSl骨髓瘤細(xì)胞(新加坡的新加坡國立大學(xué)的Chan Soh Ha教授惠贈)融合。得到的雜交瘤細(xì)胞混合物接種在96孔板上并在HAT培養(yǎng)基(美國西格瑪-奧德里奇公司)中選擇2周。約篩選到1500個(gè)雜交瘤細(xì)胞用于經(jīng)流式細(xì)胞儀選擇所需mAb特異性。SEQ ID NO 3的cl8_27肽脈沖處理或SEQ ID NO 17的Ml肽(GILGFVFTL)脈沖處理的ClR細(xì)胞與雜交瘤上清4°C孵育30分鐘，清洗并與抗小鼠IgG-alexafluor-488 二抗(美國英杰公司(Invitrogen))再室溫孵育30分鐘，清洗并用細(xì)胞搜索軟件在BD FACSCAN流式細(xì)胞儀上分析。僅一個(gè)克隆(即cl8/A2mAb#449)展現(xiàn)限于cl8/A2單體的所需識別特征且與Ml肽脈沖處理細(xì)胞不顯示反應(yīng)性。此陽性克隆通過有限稀釋亞克隆2次，穩(wěn)定擴(kuò)增并大量收集培養(yǎng)物上清。這些上清中的cl8/A2mAb用蛋白G瓊脂糖柱純化。cl8/A2mAb 的特異性通過孵育獲自ATCC的T2細(xì)胞和衍生自HBV聚合酶、X和包被蛋白以及衍生自EBV、flu(尤其是H1N1)、CMV的不同HLA-A2限制性肽和各種腫瘤相關(guān)抗原表位來檢測cl8/A2mAb的特異性。所用的肽序列(即SEQ ID NO : 17-29)在表I中提供。T2細(xì)胞與I y M各肽孵育I小時(shí)，清洗3次并用0.5 iig cl8/A2mAb染色。清洗3次后，用抗小鼠IgG-AleXaFluor488抗體(美國英杰公司)孵育細(xì)胞30分鐘，清洗并在流式細(xì)胞儀上獲得。
"Ti序歹丨JSEQ ID NO
Ml肽 /FECl(Flu)GILGFVFTL17
HBV X,52-60HLSLRGLPV18
Mage A10,254-262GLYDGMEHL19
權(quán)利要求
1.一種分離的TCR樣抗體或其片段，其中所述抗體或其片段能特異性結(jié)合至少一種HBV衍生肽。
2.如權(quán)利要求I所述的抗體，其特征在于，所述HBV衍生肽包括至少一種乙肝核心抗原和/或至少一種乙肝包被抗原。
3.如權(quán)利要求I或2所述的抗體，其特征在于，所述HBV衍生肽與主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I類分子結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的抗體，其特征在于，所述MHCI類分子是人白細(xì)胞抗原(HLA)I類分子。
5.如權(quán)利要求4所述的抗體，其特征在于，所述HLAI類分子是HLA-A2。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述HBV衍生肽為MHC-I肽復(fù)合物的部分，所述復(fù)合物包含HBV衍生肽和HLA I類分子。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述HBV衍生肽含HBcl8-27和/或HBel83-191、其變體、突變或片段。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述抗體選自下組 a.雜交瘤細(xì)胞系PTA-IO167和/或PTA-11068生產(chǎn)的抗體； b.具有雜交瘤細(xì)胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生產(chǎn)抗體的結(jié)合特征的抗體； c.與能結(jié)合雜交瘤細(xì)胞系PTA-10167和/或PTA-11068所生產(chǎn)抗體的抗原結(jié)合的抗體； d.結(jié)合包含SEQID NO:3、SEQ ID NO :24、其變體、突變或片段的氨基酸序列的抗原的抗體；和 e.包含至少一種輕鏈和至少一種重鏈的抗體，其中所述輕鏈包含SEQID NO USEQ IDNO :32、其變體、突變或片段的氨基酸序列且所述重鏈包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO :33、其變體、突變或片段的氨基酸序列。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述抗體為至少一種人、人源化或嵌合抗體。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述抗體用至少一種放射性核和/或熒光團(tuán)標(biāo)記。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于，所述抗體連接至少一種藥物、抗病毒藥物、毒素和/或化療劑。
12.—種分離的雜交瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系以登錄號PTA-10167和/或PTA-11068保藏于 ATCC。
13.—種生產(chǎn)至少一種雜交瘤、乙肝病毒(HBV)特異性抗體或其片段的方法，所述方法包括以下步驟 a.用與MHCI類分子結(jié)合的至少一種HBV衍生肽免疫至少一種非人哺乳動物，形成至少一種對MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的B細(xì)胞； b.選擇至少一種對MHCI類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的B細(xì)胞；和 c.將所選B細(xì)胞與至少一種永生細(xì)胞融合以產(chǎn)生至少一種雜交瘤，其中所述雜交瘤能生產(chǎn)至少一種對MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的HBV特異性抗體或其片段；和 d.任選地從所述雜交瘤中分離所述HBV特異性抗體。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)包含對MHCI類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的至少一種B細(xì)胞和下述一起孵育 i.至少一種生物素化抗原，所述抗原能結(jié)合對MHC I類分子結(jié)合的HBV衍生肽特異的B細(xì)胞；和 .至少一種抗生物素偶聯(lián)珠。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述HBV衍生肽為HBcl8_27或HBel83-1910
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述HBcl8-27包含SEQID NO :3的氨基酸序列和/或HBel83-191包含SEQ ID NO :24、其變體、突變或片段的氨基酸序列。
17.如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述MHCI類分子是人白細(xì)胞抗原(HLA) I類分子。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述HLAI類分子是HLA-A2。
19.一種按照權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的分離的抗體或其片段。
20.一種檢測和定量對象中至少一種HBV感染細(xì)胞的存在和分布的方法，所述方法包括 a.將如權(quán)利要求1-11和19中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體或其片段與從至少一個(gè)對象獲得的至少一種樣品接觸；和 b.檢測和定量抗體與所述HBV感染細(xì)胞的結(jié)合。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述抗體特異性結(jié)合HBcl8-27、HBel83-191、其變體、突變或片段或HBV感染細(xì)胞的其片段。
22.—種檢測對象中HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌(HCC)的方法，所述方法包括 a.將如權(quán)利要求1-11和19中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體或其片段與 從至少一個(gè)對象獲得的至少一種樣品接觸；和 b.檢測抗體與所述HBV連接的HCC感染細(xì)胞的結(jié)合。
23.一種治療HBV和/或至少一種HBV相關(guān)疾病的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1_11和19中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體或其片段給予需要的對象。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述HBV相關(guān)疾病是HCC。
25.如權(quán)利要求1-11和19中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段，其特征在于，所述抗體或其片段用于藥物應(yīng)用。
26.如權(quán)利要求1-11和19中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段在制備治療HBV和/或至少一種HBV相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
27.—種診斷HBV和/或至少一種HBV相關(guān)疾病的藥盒，所述藥盒包括如權(quán)利要求1_11和19中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體或其片段。
28.一種確定對象中疫苗效力的方法，所述方法包括 a.給予所述疫苗后5-15天，將權(quán)利要求1-11和19中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體或其片段與從所述對象獲得的至少一種樣品接觸；和 b.檢測所述抗體或其片段與HBV感染細(xì)胞的結(jié)合；和 c.對比給予所述疫苗前后HBV感染細(xì)胞的數(shù)量，其中HBV感染細(xì)胞數(shù)量減少說明疫苗有效。
29.一種確定細(xì)胞中抗原加工和呈遞的精確性的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-11和19中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體或其片段與所述細(xì)胞接觸的步驟。
30.一種分離的核酸分子，所述分子編碼 a.如權(quán)利要求1-11和19中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段的至少一種輕鏈，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO=USEQ ID NO :32、其變體、突變或片段；和/或 b.如權(quán)利要求1-11和19中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段的至少一種重鏈，其中所述重鏈包含SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :33、其變體、突變或片段。
31.一種包含權(quán)利要求30所述核酸的表達(dá)載體。
32.—種包含權(quán)利要求31所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
全文摘要
提供至少一種分離的TCR樣抗體或其片段，其中所述抗體或其片段能特異性結(jié)合至少一種HBV衍生肽。
文檔編號A61K39/42GK102781961SQ201080053680
公開日2012年11月14日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者A·貝爾托萊蒂, P·A·麥卡利, S·K·西沙拉馬, 朱娟蒂, 陳蘇蝦 申請人:新加坡國立大學(xué), 新加坡科技研究局